專利名稱：一種用于肝纖維化及門脈高壓癥的中藥組合物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物及其制備方法，特別是涉及一種治療肝纖維化及門脈高壓癥的中藥組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，治療肝纖維化的藥物研究焦點(diǎn)集中于逆轉(zhuǎn)肝纖維化和改善肝纖維化導(dǎo)致的肝功能損害等方面，其中，認(rèn)為臨床有效的藥物如秋水仙堿、甘草酸鹽等，近年來，丹參提取物的研究也取得了令人矚目的結(jié)果。但是，這些藥物多只是在肝纖維化病理過程的某一階段或某一環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，而針對(duì)慢性肝損傷肝纖維化特別是炎癥、壞死、增生(肝細(xì)胞、膠原纖維)并存的復(fù)雜病理過程來說，這些藥物的作用立顯局限，而對(duì)于慢性肝炎特別是早期纖維化則顯得作用單純，而有效阻斷這一階段的病理進(jìn)程較之逆轉(zhuǎn)肝纖維化的治療更為重要。
近年來，針對(duì)肝纖維化以健脾利濕、活血化瘀立法開發(fā)的中成藥有很多種，能夠在一定階段緩解肝纖維化的癥狀，但尚不能有效地阻斷病理進(jìn)程。近年來，關(guān)于慢性肝炎肝纖維化早期的中醫(yī)病機(jī)認(rèn)識(shí)獲得了深入，認(rèn)為“毒損肝絡(luò)”病機(jī)是慢性肝炎炎癥、壞死、增生(肝細(xì)胞、膠原纖維)并存的復(fù)雜病理過程的集中體現(xiàn)，解毒通絡(luò)有可能成為阻抑這一病理過程的有效手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種中藥組合物；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該中藥組合物的制備方法；本發(fā)明的目的還在于提供該中藥組合物的在制藥上的用途。
本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明中藥組合物是由如下重量份的原料藥制成的甘草浸膏∶丹參＝1∶2-7。上述本發(fā)明組合物原料藥的重量份優(yōu)選為甘草浸膏∶丹參＝1∶3，1∶4，1∶5或1∶6。其中丹參由經(jīng)過常規(guī)提取方法制成的丹參干浸膏替代。
取上述本發(fā)明原料藥加入常規(guī)輔料或賦形劑，可制備成臨床可接受的任何劑型，包括但不限于下述劑型當(dāng)中的一種片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸或口服液體制劑如口服溶液劑、糖漿劑、膏劑等，優(yōu)選固體口服制劑，以顆粒劑最合適。
在本發(fā)明中藥組合物中甘草浸膏的藥效物質(zhì)為甘草酸；丹參的藥效物質(zhì)為丹酚酸。所述甘草浸膏是指《中華人民共和國藥典》2005年版一部274頁收載的甘草浸膏，含甘草酸(C42H62O16)不少于8.0％(w/w)，一般在10％(w/w)；所述的丹參是指《中華人民共和國藥典》2005年版一部52頁收載的丹參，含丹酚酸B(C36H30O16)不得少于3.0％。
本發(fā)明中藥組合物的制備方法為取丹參粉碎成粗粉，90℃熱水提取1～3次，每次加5～8倍量水，每次提取2～4小時(shí)，第1次提取時(shí)先用水浸泡6～24小時(shí)；合并提取液，5～10℃冷凍10～14小時(shí)，過濾；濾液通過大孔吸附樹脂柱，樹脂柱填充與生藥等重的樹脂，待濾液全部通過大孔吸附樹脂后，用4～6倍生藥量(單位是V/W即ml/g)的水洗柱，棄去洗脫液；然后用5～7倍生藥量的35～45％乙醇洗脫，收集洗脫液；減壓濃縮至干，得丹參干浸膏；將丹參干浸膏與甘草浸膏混合，加入常規(guī)輔料或賦形劑，可制備成臨床可接受的任何劑型，包括但不限于下述劑型當(dāng)中的一種片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸或口服液體制劑等。上述提取液優(yōu)選300目濾布過濾。上述大孔吸附樹脂優(yōu)選1400-I型大孔吸附樹脂。
本發(fā)明中藥組合物還可以由如下重量份的原料藥制成甘草酸∶丹酚酸＝1∶0.8-1.2。上述原料藥的優(yōu)選重量比為甘草酸∶丹酚酸1∶1，1∶0.9或1∶1.1。所述甘草酸可以是甘草酸鹽，優(yōu)選甘草酸單胺鹽，更優(yōu)選甘草酸二胺鹽；丹酚酸可以是按常規(guī)方法得到的各種丹酚酸鹽，優(yōu)選丹酚酸B鹽。取上述本發(fā)明原料藥，可制備成臨床可接受的任何劑型，包括但不限于下述劑型當(dāng)中的一種片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸或口服液體制劑如口服溶液劑、糖漿劑、膏劑等，優(yōu)選固體口服制劑，以顆粒劑最合適。
本發(fā)明針對(duì)慢性肝損傷后肝細(xì)胞間質(zhì)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的纖維增生與膠原沉積這-“毒損肝絡(luò)”核心病理過程，解決阻抑肝纖維化發(fā)展及其門脈高壓形成的核心問題。所采用的技術(shù)方案是從絡(luò)脈論治，以“解毒通絡(luò)”立法，建立解毒通絡(luò)、益氣和血的藥物配伍原則，解毒以祛除內(nèi)生毒性物質(zhì)損害，則絡(luò)脈易和；通絡(luò)以改善肝臟的微環(huán)境，暢通氣血的滲灌使毒易祛，益氣和血、柔順肝絡(luò)、益于肝絡(luò)之修復(fù)，從而阻斷“毒損肝絡(luò)”的惡性循環(huán)損傷病理過程。
本發(fā)明藥物組合物及其制劑在肝損傷炎癥反應(yīng)、膠原纖維增生與膠質(zhì)沉積的多個(gè)病理環(huán)節(jié)阻斷肝纖維化的級(jí)聯(lián)病理損傷過程，從而阻斷了肝纖維化的形成和門靜脈高壓的發(fā)展，是一種針對(duì)慢性肝炎肝纖維化早期及其門脈高壓癥的有效治療藥物。
藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明組方與秋水仙堿比較，針對(duì)大鼠慢性肝損傷病理過程，在回升TP、Alb方面具有與秋水仙堿相近似的療效，但是，在降低ALT、回升A/G、回降TBil、回降HA和Hyp，以及阻抑膠原纖維面積比的升高等方面，優(yōu)于秋水仙堿的療效。同時(shí)，本發(fā)明組方與兩藥單用時(shí)比較，產(chǎn)生的新功效是顯著降低了肝纖維化的門靜脈壓力，是一項(xiàng)新的突破性發(fā)明。與血管活性藥物卡多普利、奧馬曲拉比較，本發(fā)明組方在有效降低肝纖維化的門靜脈壓力時(shí)，對(duì)全身血壓無顯著影響。這項(xiàng)功效對(duì)于慢性肝炎肝纖維化、肝硬化患者伴發(fā)的門脈高壓癥來說，具有非常重要的臨床價(jià)值，填補(bǔ)了該病理狀態(tài)藥物治療的空白。
下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1丹酚酸與甘草酸配伍比例的篩選將丹酚酸鹽與甘草酸鹽按照初篩有效水平，進(jìn)行單用與配伍設(shè)計(jì)，共形成A、B、C、D四個(gè)組，進(jìn)行多指標(biāo)設(shè)計(jì)的CCl4-橄欖油大鼠肝損傷模型的藥效篩選。
A甘草單胺鹽10克加丹酚酸鹽10克B甘草二胺鹽10克加丹酚酸鹽10克C甘草單胺鹽20克D甘草二胺鹽20克結(jié)果如下
1、體重變化及肝、脾臟器系數(shù)(1)對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠生長曲線的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表1，結(jié)果表明①實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分組后各組體重?zé)o明顯差異。②模型組大鼠體重增長減慢，在5、6、7周體重顯著輕于正常組(P＜0.05)。③各治療組大鼠體重增長減慢好轉(zhuǎn)，其中B、C、D組在5、6、7周體重明顯高于模型組(P＜0.05)。④結(jié)合生長曲線下面積和實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诘捏w重情況，各組體重從高到低的排序?yàn)榍锼蓧A組＞正常組＞B組＞D組＞C組＞模型組＞A組。提示B組在防治體重降低上較為突出。
表1對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠生長曲線的影響(x±s，n＝10)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01(2)對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝臟系數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表2，結(jié)果表明①模型組大鼠肝臟系數(shù)高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②秋水仙堿組大鼠肝臟系數(shù)回降，而低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。③A、B、C、D各組大鼠肝臟系數(shù)高于秋水仙堿組，A組大鼠肝臟系數(shù)還高于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。④B組大鼠肝臟系數(shù)低于A組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組肝臟系數(shù)從低到高的排序?yàn)檎＝M＞秋水仙堿組＞模型組＞B組＞C組＞D組＞A組。提示B組在降低肝臟系數(shù)方面較為突出。
表2對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝臟系數(shù)的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01(3)對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠脾臟系數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表3，結(jié)果表明①模型組大鼠脾臟系數(shù)高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②秋水仙堿組大鼠脾臟系數(shù)回降，而低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。③A、B、C、D各組大鼠脾臟系數(shù)高于秋水仙堿組，C、D組大鼠脾臟系數(shù)還高于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。④A、B、C、D各組大鼠脾臟系數(shù)相似，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別無顯著性意義(P＞0.05)。⑤各組脾臟系數(shù)從低到高的排序?yàn)檎＝M＞秋水仙堿組＞B組＞A組＞模型組＞C組＞D組。提示B組在降低脾臟系數(shù)方面較為突出。
表3對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠脾臟系數(shù)的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；2、血清肝功能(1)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT活性采用ALT測定試劑盒在TRACE CB171自動(dòng)生化分析儀上測定ALT的活性(U/L，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表4，結(jié)果表明①模型組大鼠ALT高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②A組和秋水仙堿組大鼠ALT高于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)；B、C組大鼠ALT低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③A組大鼠ALT高于秋水仙堿組，B、C組大鼠ALT低于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。④B組大鼠ALT最低，C組較低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。⑤各組ALT從低到高的排序?yàn)檎＝M＞B組＞C組＞模型組＞秋水仙堿組＞D組＞A組。提示B組在降低ALT方面較最突出，秋水仙堿無此治療效果。
表4對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01
(2)血清門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST活性采用AST測定試劑盒在TRACE CB171自動(dòng)生化分析儀上測定AST的活性(U/L，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表5，結(jié)果表明①模型組大鼠AST高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②A、B、C、D各組和秋水仙堿組大鼠AST低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③A組大鼠AST高于秋水仙堿組，B、C組大鼠ALT低于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。④B組大鼠AST最低，C組較低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。⑤各組AST從低到高的排序?yàn)檎＝M＞B組＞C組＞秋水仙堿組＞D組＞A組＞模型組。提示B組在降低AST方面較最突出，明顯優(yōu)于秋水仙堿。
表5對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠血清門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05.◇◇P＜0.01(3)血清總蛋白(TP含量采用TP測定試劑盒，在TRACE CB171自動(dòng)生化分析儀上，測定TP含量(g·L-1)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表6，結(jié)果表明①模型組大鼠TP低于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②用藥各組和秋水仙堿組大鼠TP高于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③B組大鼠TP與秋水仙堿組相似，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別無顯著性意義(P＞0.05)。④B組大鼠TP較高與其他組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組TP從高到低的排序?yàn)檎＝M＞秋水仙堿組＞B組＞A組＞D組＞C組＞模型組。提示B組在回升TP方面最突出，達(dá)到秋水仙堿的療效。
表6對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠血清總蛋白含量的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋 水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01(4)血清白蛋白(Alb含量采用Alb測定試劑盒，在TRACE CB171自動(dòng)生化分析儀上，測定Alb含量(g·L-1)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表7，結(jié)果表明①模型組大鼠Alb低于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②用藥各組和秋水仙堿組大鼠Alb高于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③A、B組大鼠Alb與秋水仙堿組相似，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別無顯著性意義(P＞0.05)。④A、B組大鼠Alb顯著高于它組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組大鼠Alb從高到低的排序?yàn)檎＝M＞D組＞B組＞A組＞秋水仙堿組＞C組＞模型組。提示B組在回升大鼠Alb方面最突出，達(dá)到秋水仙堿的療效。
表7對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠血清白蛋白含量的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01(5)血清A/G比值實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表8，結(jié)果表明①模型組大鼠A/G低于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②D組大鼠A/G高于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③A、B、D組大鼠A/G高于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別無顯著性意義(P＞0.05)。④A、B、D組增高最顯著，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組A/G從高到低的排序?yàn)檎＝M＞D組＞A組＞B組＞模型組＞C組＞秋水仙堿組。提示A、B、D組在回升A/G方面較最突出，優(yōu)于秋水仙堿的療效。
表8對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠血清A/G比值的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01(6)血清總膽紅素(TBil含量采用TBil測定試劑盒，在TRACE CB171自動(dòng)生化分析儀上，測定TBil含量(μmol·L-1)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表9，結(jié)果表明①模型組大鼠TBil高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②用藥各組和秋水仙堿組大鼠Tbil低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③A、B組大鼠Tbil低于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別無顯著性意義(P＞0.05)。④A、B組大鼠TBil低于其他兩組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組大鼠TBi l從低到高的排序?yàn)檎＝M＞B組＞A組＞C組＞秋水仙堿組＞D組＞模型組。提示B、A組在回降大鼠TBil方面較為突出，優(yōu)于秋水仙堿的療效。
表9對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠血清總膽紅素的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.013、血清透明質(zhì)酸血清透明質(zhì)酸(HA含量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表10，結(jié)果表明①模型組大鼠HA高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②用藥各組和秋水仙堿組大鼠HA低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③B、C、D組大鼠HA低于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。④以B、C、D組大鼠HA較低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組大鼠HA從低到高的排序?yàn)檎＝M＞B組＞C組＞D組＞A組＞秋水仙堿組＞模型組。提示B、C、D組在回降大鼠HA方面較最突出，優(yōu)于秋水仙堿的療效。
表10對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠血清透明質(zhì)酸含量的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.014、肝組織羥脯氨酸含量肝組織羥脯氨酸(Hyp含量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表11，結(jié)果表明①模型組大鼠Hyp高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②用藥各組和秋水仙堿組大鼠Hyp低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③A、B、C組大鼠Hyp低于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。④A、B、C組大鼠Hyp較低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組大鼠Hyp從低到高的排序?yàn)檎＝M＞B組＞C組＞秋水仙堿組＞A組＞D組＞模型組。提示A、B、C組在回降大鼠Hyp方面較最突出，達(dá)到秋水仙堿的療效；其中，B組在回降大鼠Hyp的作用優(yōu)于秋水仙堿。
表11對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝組織羥脯氨酸的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.015、肝臟組織學(xué)病變特征光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色切片標(biāo)本，充分顯示了各組大鼠肝臟和脾臟的組織學(xué)病變特征①對(duì)照組可見正常組大鼠肝組織無異常表現(xiàn)。肝臟正常結(jié)構(gòu)肝臟被膜為薄層結(jié)締組織。實(shí)質(zhì)由肝小葉和匯管區(qū)組成。肝小葉為類園形小體，其中心為中央靜脈，其周為放射狀排列的肝細(xì)胞索；肝小葉邊緣為肝小葉界板是連續(xù)封閉的一層；肝細(xì)胞索間或與肝細(xì)胞界板間相互吻合成網(wǎng)狀。肝細(xì)胞條索之間為肝血竇，其內(nèi)皮細(xì)胞分布規(guī)則，可找到枯否氏細(xì)胞。肝細(xì)胞索與肝血竇之比約為5∶2。肝細(xì)胞為多邊形細(xì)胞，胞漿較豐富嗜酸性染色；核園形，染色質(zhì)稀疏且沿核膜分布，可見核仁。匯管區(qū)主要為結(jié)締組織，含有小葉間肝動(dòng)脈、門靜脈和小膽管，可有一定量的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞分布。偶爾在肝小葉內(nèi)可出現(xiàn)累及1～2個(gè)肝細(xì)胞范圍的肝細(xì)胞壞死及該處的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(點(diǎn)狀壞死)。
②模型組增生的膠原纖維條索相互連接而完全分隔正常的肝小葉形成肝硬化；此時(shí)，形成了許多類園形的肝細(xì)胞團(tuán)為假小葉；其肝細(xì)胞索排列紊亂而不呈放射狀，中央靜脈異位(偏位、不出現(xiàn)或出現(xiàn)幾個(gè))，肝細(xì)胞團(tuán)內(nèi)出現(xiàn)匯管區(qū)結(jié)構(gòu)，假小葉內(nèi)的肝細(xì)胞仍有嚴(yán)重的變性(脂肪變性和細(xì)胞水腫)、壞死以及被膠原纖維間隔再分隔的趨勢，可出現(xiàn)毛細(xì)膽管內(nèi)瘀膽及膽栓形成在假小葉之間的纖維間隔連續(xù)、均勻、厚薄不均，可有較多的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)明顯增寬、增粗，有明顯的纖維束形成，較粗而密，相鄰的匯管區(qū)或中央靜脈之間已形成明顯的纖維間隔，分隔包繞肝組織。
③秋水仙堿組部分大鼠增生的膠原纖維條索未相互連接而沒能完全分隔肝小葉為肝纖維化。部分大鼠增生的膠原纖維條索相互連接而完全分隔正常的肝小葉為肝硬化。
④A組病變特征與模型對(duì)照組相似，但炎性細(xì)胞浸潤減少，肝細(xì)胞壞死及脂肪變性較輕，匯管區(qū)增生的結(jié)締組織不均勻。
⑤B組除部分動(dòng)物出現(xiàn)模型組大鼠的基本病變外，多數(shù)大鼠以廣泛的肝細(xì)胞變性壞死和肝血竇瘀血出血等肝臟損傷性改變?yōu)樘卣?。具體表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性、肝細(xì)胞細(xì)胞水腫、肝細(xì)胞溶解壞死(包括碎屑狀壞死、橋接壞死)、肝細(xì)胞嗜酸性變和嗜酸性小體形成、肝血竇明顯瘀血出血。同時(shí)匯管區(qū)可有一定的充血水腫及纖維組織增生。部分大鼠呈現(xiàn)肝纖維化病變。
⑥C組如A。
⑦D組如A。
6、肝臟組織學(xué)變化(1)肝臟增生膠原纖維病變的分級(jí)分析1級(jí)正常肝臟或無明顯膠原纖維增生；2級(jí)膠原纖維增生，匯管區(qū)增寬，無明顯纖維索形成；3級(jí)膠原纖維增生，中央靜脈、匯管區(qū)結(jié)締組織變厚，有纖維索向四周放射，但無明顯間隔形成；4級(jí)膠原纖維增生明顯，中央靜脈、匯管區(qū)結(jié)締組織向四周放射出纖維索較明顯，形成不完全間隔；1級(jí)膠原纖維大量增生，間隔較明顯，粗而致密，相鄰的中央靜脈或匯管區(qū)之間形成明顯的間隔。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表12，結(jié)果表明①模型組大鼠分級(jí)評(píng)分高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②用藥各組和秋水仙堿組大鼠分級(jí)評(píng)分低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③A、B、C組大鼠分級(jí)評(píng)分低于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。④A、B、C組大鼠分級(jí)評(píng)分較低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組大鼠分級(jí)評(píng)分從低到高的排序?yàn)檎＝M＞B組＞D組＞C組＞秋水仙堿組＞A組＞模型組。提示A、B、C組在回降大鼠分級(jí)評(píng)分方面較最突出，達(dá)到秋水仙堿的療效；其中，B組在回降大鼠分級(jí)評(píng)分的作用優(yōu)于秋水仙堿。
表12對(duì)肝纖維化病變分級(jí)程度的影響

H檢驗(yàn)；Hc＝78.778，N＝70，K＝7；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01(2)肝臟增生膠原纖維病變的形態(tài)計(jì)量用BL-420E生物形態(tài)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，在10倍目鏡下，計(jì)量分析單位面積肝臟組織中膠原纖維面積比，反映肝纖維化程度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表13，結(jié)果表明①模型組大鼠膠原纖維面積比高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②B、C、D組和秋水仙堿組大鼠膠原纖維面積比低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.05)。③B組大鼠膠原纖維面積比低于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。④B組大鼠膠原纖維面積比較低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。⑤各組大鼠膠原纖維面積比從低到高的排序?yàn)檎＝M＞B組＞秋水仙堿組＞D組＞C組＞模型組＞A組。提示B組在回降大鼠膠原纖維面積比方面較最突出，優(yōu)于秋水仙堿的療效。
表13對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝臟膠原纖維面積百分比的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VSA組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.017、總體療效評(píng)價(jià)按各觀察指標(biāo)排序和權(quán)衡系數(shù)的乘積作為總體療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。對(duì)影響各組的評(píng)價(jià)指標(biāo)由低到高排列，及其組間比較實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表14，結(jié)果表明①模型組大鼠分級(jí)評(píng)分高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②用藥各組和秋水仙堿組大鼠分級(jí)評(píng)分低于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③B組大鼠分級(jí)評(píng)分低于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。④BC組大鼠分級(jí)評(píng)分較低，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組大鼠分級(jí)評(píng)分從低到高的排序?yàn)檎＝M＞B組＞秋水仙堿組＞C組＞D組＞A組＞模型組。提示B組在回降大鼠分級(jí)評(píng)分方面最為突出，B組在回降大鼠分級(jí)評(píng)分的作用優(yōu)于秋水仙堿。
表14對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠總體療效評(píng)價(jià)積分的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.018、結(jié)論采用CCl4皮下注射8周誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，以秋水仙堿作對(duì)照，于造模同時(shí)灌胃給藥8周進(jìn)行治療結(jié)果顯示①秋水仙堿具有顯著的抗肝纖維化作用。提示模型復(fù)制和治療時(shí)期選擇合適。
②A、B、C、D配伍組在13類指標(biāo)中分別能使造模病變指標(biāo)好轉(zhuǎn)，其中B逆轉(zhuǎn)病變指標(biāo)的次數(shù)最多，程度最大。用總體療效評(píng)價(jià)積分對(duì)各組療效進(jìn)行總體評(píng)價(jià)顯示B組療效相對(duì)最佳。
實(shí)驗(yàn)例2丹酚酸與甘草酸的作用特點(diǎn)與配伍的療效優(yōu)勢研究1、丹酚酸、甘草酸單用與本發(fā)明合方配伍對(duì)肝纖維化大鼠療效的評(píng)價(jià)(1)對(duì)肝臟系數(shù)的影響與正常組比較，模型組肝臟系數(shù)(肝重g/鼠重100g)升高了100.08％(P＜0.01)，秋水仙堿組升高了84.01％(P＜0.01)，丹酚酸組升高了78.47％(P＜0.01)，甘草酸組升高了93.36(P＜0.01)，合方組升高了73.23％(P＜0.01，見表15)；與模型組比較，秋水仙堿組降低了8.03％，丹酚酸組降低了10.80％，甘草酸組降低了3.36％，合方組降低了13.42％(P＜0.05)；與秋水仙堿組比較，丹酚酸組降低了3.01％，甘草酸組升高了5.08％，合方組降低了5.86％；與丹酚酸組比較，甘草酸組升高了8.34％，合方組降低了2.94％；與甘草酸組比較，合方組降低了10.41％。
可見在降低肝臟系數(shù)方面，合方療效最佳(P＜0.05)，丹酚酸也有一定的療效，甘草酸療效較差。
表15肝纖維化大鼠肝臟系數(shù)、血漿HA、肝組織Hyp的組間比較(x±s，n＝8)

VS對(duì)照組△P＜0.05，△△P＜0.01；VS模型組*P＜0.05，**P＜0.01；VS秋水仙堿組▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS丹酚酸組P＜0.05，P＜0.01；VS甘草酸組P＜0.05，P＜0.01.
(2)對(duì)血漿白蛋白(ALB)的影響與正常組比較，模型組降低了11.08％(P＜0.01)，秋水仙堿組降低了9.71％(P＜0.05)，丹酚酸組降低了11.27％，甘草酸組降低了5.96％，合方組降低了8.02％(見表15)；與模型組比較，秋水仙堿組升高了1.55％，丹酚酸組降低了0.21％，甘草酸組升高了5.76％，合方組升高了3.44％；與秋水仙堿組比較，丹酚酸組降低了1.74％，甘草酸組升高了4.15％，合方組升高了1.86％；與丹酚酸組比較，甘草酸升高了5.99％，合方組升高了3.66％；與甘草酸比較，合方組降低了2.19％。
說明在升高血漿白蛋白(ALB)方面，甘草酸與合方療效最佳，丹酚酸次之。
(3)對(duì)血漿透明質(zhì)酸(HA)含量的影響與正常組比較，模型組升高240.44％(P＜0.01，見表15)，秋水仙堿組升高89.11％(P＜0.01)，丹酚酸組升高87.22％(P＜0.01)，甘草酸組升高93.02％(P＜0.01)，合方組升高68.66％(P＜0.01)；與模型組比較，秋水仙堿組降低44.45％(P＜0.01)，丹酚酸組降低45.01％(P＜0.01)，甘草酸組降低43.30％(P＜0.01)，合方組降低50.46％(P＜0.01)；與秋水仙堿組比較，丹酚酸組降低1.00％，甘草酸組升高2.06％，合方組降低10.82％與丹酚酸組比較，甘草酸組升高3.10％，合方組降低9.91％；與甘草酸組比較，合方組降低12.62％。
說明在降低透明質(zhì)酸方面，各藥均有一定的療效，合方應(yīng)用具有顯著優(yōu)勢(P＜0.01)。
(4)肝組織病理改變i.大體形態(tài)觀察正常組大鼠肝臟色紅，邊緣銳利，表面光滑細(xì)膩；模型組大鼠肝臟呈蠟黃色，表面凸凹不平，可見細(xì)小的結(jié)節(jié)；給予治療藥物各組大鼠肝臟或有細(xì)小結(jié)節(jié)或結(jié)節(jié)不明顯但是表明凹凸不平。
ii.組織病理學(xué)改變光學(xué)顯微鏡下觀察HE/Masson染色切片標(biāo)本，充分顯示了各組大鼠肝臟和脾臟的組織學(xué)病變特征正常組可見正常組大鼠肝組織無異常表現(xiàn)。肝臟正常結(jié)構(gòu)肝臟被膜為薄層結(jié)締組織；實(shí)質(zhì)由肝小葉和門管區(qū)組成。肝小葉呈多角棱柱體，其中心為中央靜脈，其周圍為放射狀排列的肝細(xì)胞索；肝小葉邊緣為肝小葉界板，是連續(xù)封閉的一層肝細(xì)胞；肝細(xì)胞索間或與肝細(xì)胞界板間相互吻合成網(wǎng)狀。肝細(xì)胞條索之間為肝血竇，其內(nèi)皮細(xì)胞分布規(guī)則，可找到庫普弗氏(Kupffer)細(xì)胞。肝細(xì)胞索與肝血竇之比約為5∶2。肝細(xì)胞為多邊形細(xì)胞，胞質(zhì)較豐富嗜酸性染色；核圓形，染色質(zhì)稀疏且沿核膜分布，可見核仁。門管區(qū)主要為結(jié)締組織，含有小葉間動(dòng)脈、靜脈和膽管，可有一定量的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞分布。偶爾在肝小葉內(nèi)可出現(xiàn)累及1-2個(gè)肝細(xì)胞范圍的肝細(xì)胞壞死及該處的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(點(diǎn)狀壞死)。Masson染色顯示肝門管區(qū)出現(xiàn)少量藍(lán)色膠原纖維。
模型組HE染色可見肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，增生的膠原纖維條索相互連接，完全分隔正常的肝小葉形成肝硬化；此時(shí)，形成了許多類圓形的肝細(xì)胞團(tuán)為假小葉；其肝細(xì)胞索排列紊亂而不呈放射狀，中央靜脈異位(偏位、不出現(xiàn)或出現(xiàn)幾個(gè))，肝細(xì)胞團(tuán)內(nèi)出現(xiàn)門管區(qū)結(jié)構(gòu)；肝索與肝竇的比例約為8∶1；假小葉內(nèi)的肝細(xì)胞出現(xiàn)大量的顆粒樣變性、胞質(zhì)疏松化和細(xì)胞水腫，部分肝細(xì)胞可區(qū)分為脂肪空泡，散在灶性肝細(xì)胞溶解壞死，仍有被膠原纖維間隔再分隔的趨勢；可出現(xiàn)毛細(xì)膽管內(nèi)瘀膽及膽栓形成。在假小葉之間的纖維間隔連續(xù)、厚薄不均，膽管增生不明顯，可有較多的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，原有門管區(qū)明顯增寬、增粗，有明顯的纖維束形成，較粗而密，相鄰的門管區(qū)或中央靜脈之間已形成明顯的纖維間隔，分隔包繞肝組織，無充血、無水腫、無肝細(xì)胞增生。肝竇狹窄、扭曲。Masson染色纖維間隔內(nèi)有大量膠原沉積。
秋水仙堿組肝索與肝竇的比例約為6∶1；部分大鼠增生的膠原纖維條索未相互連接；未能完全分隔肝小葉為肝纖維化；部分大鼠增生的膠原纖維條索相互連接而完全分隔正常的肝小葉為肝硬化。
丹酚酸組病變特征與模型組相似，但炎性細(xì)胞浸潤減少，肝細(xì)胞壞死及脂肪變性較輕；肝索與肝竇的比例約為7∶1。門管區(qū)增生的結(jié)締組織不均勻。
甘草酸組病變特征與模型組相似，多數(shù)大鼠以廣泛的肝細(xì)胞變性壞死和肝血竇瘀血出血等肝臟損傷性改變?yōu)樘卣?。具體表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性、細(xì)胞水腫、溶解壞死(包括碎屑狀壞死、橋接壞死)、嗜酸性變和嗜酸性小體形成，肝血竇明顯瘀血、出血；肝索與肝竇的比例約為6∶1。同時(shí)門管區(qū)可有一定的充血水腫及纖維組織增生。2只大鼠呈肝纖維化病變。
合方組出現(xiàn)模型組大鼠的基本病變，但炎性細(xì)胞浸潤減少，肝細(xì)胞損傷較輕，纖維增生減輕且不均一致；肝索與肝竇的比例在5∶1到5∶2之間；膽管增生不明顯。
2、丹酚酸、甘草酸單用與本發(fā)明合方配伍對(duì)肝纖維化大鼠肝組織膠原面積的影響與正常組比較，模型組及各藥物組膠原面積均呈現(xiàn)為極顯著的升高(P＜0.01，見表16)；與模型組比較，秋水仙堿組降低14.80％(P＜0.05)，丹酚酸組降低14.28％(P＜0.05)，甘草酸組降低23.12％(P＜0.05)，合方組降低39.44％(P＜0.01)；與秋水仙堿組比較，丹酚酸組升高0.62％，甘草酸組降低9.76％，合方組降低28.91％(P＜0.01)；與丹酚酸組比較，甘草酸組降低10.31％，合方組降低29.35％(P＜0.01)；與甘草酸組比較，合方組降低21.22％(P＜0.05)。
在降低膠原面積方面合方組療效最佳(P＜0.01)，甘草酸療效次之(P＜0.05)，丹酚酸亦有較好的療效(P＜0.05)。
表16肝纖維化大鼠肝組織膠原面積、PDGF和TGF β1的組間比較(x±s，n＝8)

VS對(duì)照組△P＜0.05，△△P＜0.01；VS模型組*P＜0.05，**P＜0.01；VS秋水仙堿組▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS丹酚酸組P＜0.05，P＜0.01；VS甘草酸組P＜0.05，P＜0.01.
3、丹酚酸、甘草酸單用與本發(fā)明合方配伍對(duì)肝纖維化大鼠肝組織PDGF含量的影響(1)肝組織PDGF陽性細(xì)胞分布特征光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化(HIC)顯色為棕褐色顆粒，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，在各組中陽性細(xì)胞分布各有特征，PDGF免疫組化陰性對(duì)照為陰性。
正常組肝小葉內(nèi)為血竇內(nèi)皮細(xì)胞陽性，門管區(qū)為膽管上皮陽性。
模型組肝小葉內(nèi)主要是肝細(xì)胞陽性，尤其是結(jié)節(jié)狀再生的肝細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)陽性，血竇內(nèi)皮細(xì)胞弱陽性仍然存在，部分肝星狀細(xì)胞和庫普弗氏細(xì)胞出現(xiàn)弱陽性；纖維間隔部位的膽管上皮細(xì)胞強(qiáng)陽性，新增生的成纖維細(xì)胞弱陽性，門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)陽性，部分浸潤的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞陽性。
秋水仙堿組肝細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞和庫普弗氏細(xì)胞出現(xiàn)較為一致的弱陽性；膽管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)陽性。
丹酚酸組變性的肝細(xì)胞、結(jié)節(jié)狀再生的肝細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)陽性，肝星狀細(xì)胞和庫普弗氏細(xì)胞出現(xiàn)陽性；膽管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞陽性，門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)陽性。
甘草酸組再生肝細(xì)胞強(qiáng)陽性，肝細(xì)胞陽性、血竇內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞和庫普弗氏細(xì)胞出現(xiàn)陽性；膽管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞強(qiáng)陽性，門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)弱陽性。
合方組再生而又出現(xiàn)變性的肝細(xì)胞出現(xiàn)陽性，血竇內(nèi)皮細(xì)胞弱陽性；膽管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞弱陽性，門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞陽性。
比較組間陽性顯色狀態(tài)，體現(xiàn)了合方降低PDGF定性含量(抑制表達(dá)或促進(jìn)降解)、陽性細(xì)胞分布(增生肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)和控制PDGF促進(jìn)肝纖維化的顯著優(yōu)勢。
(2)肝組織PDGF陽性顆?；叶雀谓M織石蠟切片PDGF免疫組化結(jié)果(見表16)顯示與正常組比較，模型組升高1.63％，秋水仙堿組升高1.88％，丹酚酸組升高1.54％，甘草酸組升高0.44％，合方組降低0.61％；與模型組比較，秋水仙堿組升高0.24％，丹酚酸組降低0.09％，甘草酸組降低1.17％，合方組降低2.21％(P＜0.05)；與秋水仙堿組比較，丹酚酸在降低0.34％，甘草酸組降低1.41％，合方組降低2.44％(P＜0.05)；
與丹酚酸組比較，甘草酸組降低1.08％，合方組降低2.12％(P＜0.05)；與甘草酸組比較，合方組降低1.05％。
通過本研究發(fā)現(xiàn)甘參復(fù)方可以顯著降低肝臟中PDGF含量(P＜0.05)，作用明顯優(yōu)于秋水仙堿與丹酚酸(P＜0.05)；甘草酸組也具有一定的降低PDGF作用，但效果稍差；丹酚酸組幾乎不具有降低PDGF作用。兩者配伍降低肝組織PDGF含量，是其抗肝纖維化的重要有效機(jī)制之一。
4、丹酚酸、甘草酸單用與本發(fā)明合方配伍對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF β1含量的影響(1)肝組織TGF β1陽性細(xì)胞分布特征光學(xué)顯微鏡下觀察HIC顯色為棕褐色顆粒，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，TGF β1免疫組化陰性對(duì)照為陰性。在各組中陽性細(xì)胞分布各有特征。
正常組肝小葉內(nèi)為肝細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞，門管區(qū)少數(shù)巨噬細(xì)胞弱陽性。
模型組肝臟組織中再生肝細(xì)胞、庫普弗氏細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞TGF β1陽性，隨病變程度的加重染色逐漸加深，且范圍廣；纖維間隔區(qū)或門管區(qū)部分纖維母細(xì)胞、部分浸潤的巨噬細(xì)胞、門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及部分膽小管上皮弱陽性。
秋水仙堿組主要為變性的肝細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞和庫普弗氏細(xì)胞弱陽性；膽管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞陽性。
丹酚酸組變性的肝細(xì)胞、結(jié)節(jié)狀再生的肝細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)弱性，肝星狀細(xì)胞和庫普弗氏細(xì)胞出現(xiàn)陽性。
甘草酸組再生肝細(xì)胞、變性肝細(xì)胞陽性、血竇內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞和庫普弗氏細(xì)胞弱陽性；膽管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞強(qiáng)陽性，門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)弱陽性。
合方組再生而又出現(xiàn)變性的肝細(xì)胞出現(xiàn)陽性，血竇內(nèi)皮細(xì)胞弱陽性；膽管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞因陰性，門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞弱陽性。
(2)肝組織TGF β1陽性顆粒灰度肝組織石蠟切片TGF β1免疫組化結(jié)果(見表16)顯示與正常組比較模型組升高3.06％(P＜0.01)，秋水仙堿組升高0.70％，丹酚酸組升高0.04％，甘草酸組降低0.02％，合方組降低1.45％(P＜0.05)；與模型組比較秋水仙堿組降低2.29％(P＜0.05)，丹酚酸組降低2.94％(P＜0.05)，甘草酸組降低2.99％(P＜0.05)，合方組降低4.38％(P＜0.0)；與秋水仙堿組比較丹酚酸組降低0.66％，甘草酸組降低0.71％，合方組降低2.14％(P＜0.05)；與丹酚酸組比較甘草酸組降低0.05％，合方組降低1.48％；與甘草酸組比較合方組降低1.43％。
通過本研究發(fā)現(xiàn)甘參復(fù)方降低肝組織TGF β1含量效果最佳(P＜0.01)，顯著優(yōu)于秋水仙堿(P＜0.05)，甘草酸效果次之(P＜0.05)，丹酚酸效果亦顯著(P＜0.05)；比較組間陽性染色狀態(tài)，體現(xiàn)了合方降低TGF β1含量(抑制表達(dá)或促進(jìn)降解)、陽性細(xì)胞分布(增生肝細(xì)胞程度減弱和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)為陰性)，從而強(qiáng)力抑制TGF β1的促發(fā)肝纖維化作用。
5、丹酚酸、甘草酸單用與本發(fā)明合方配伍對(duì)肝纖維化大鼠肝組織MMP-13含量的影響與正常組比較模型組降低21.00％(P＜0.01，見表17)，秋水仙堿組降低19.64％(P＜0.05)，丹酚酸組降低16.94％(P＜0.05)，甘草酸組降低8.62％，合方組降低10.40％；與模型組比較秋水仙堿組升高1.72％，丹酚酸組升高5.14％，甘草酸組升高15.67％(P＜0.05)，合方組升高13.42％(P＜0.05)；與秋水仙堿組比較丹酚酸組升高3.36％，甘草酸組升高13.71％，合方組升高11.50％；與丹酚酸組比較甘草酸組升高10.01％，合方組升高7.87％；與甘草酸組比較合方組降低1.95％。
本研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸與合方可顯著促進(jìn)MMP-13合成與分泌(P＜0.05)，丹酚酸基本不具有這個(gè)作用。MMP-13是鼠類主要的間質(zhì)性膠原酶，增進(jìn)過度沉積膠原的降解，起到抗肝纖維化的作用。
表17肝纖維化大鼠肝組織MMP-13、Col_IV、LN含量的組間比較(x±s，n＝8)

VS對(duì)照組△P＜0.05，△△P＜0.01；VS模型組*P＜0.05，**P＜0.01；VS秋水仙堿組▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS丹酚酸組P＜0.05，P＜0.01；VS甘草酸組P＜0.05，P＜0.01.
6、丹酚酸、甘草酸單用與本發(fā)明合方配伍對(duì)肝竇毛細(xì)血管化作用(1)對(duì)肝纖維化大鼠肝組織IV型膠原(Col_IV)含量的影響與正常組比較模型組降低14.81％(P＜0.05)，秋水仙堿組降低17.43％(P＜0.05)，丹酚酸組降低3.58％，甘草酸組升高24.70％(P＜0.05)，合方組升高21.32％(P＜0.05)；與模型組比較秋水仙堿組降低3.08％，丹酚酸組升高13.18％，甘草酸組升高46.38％(P＜0.01)，合方組升高42.42％(P＜0.01，見表17)；與秋水仙堿組比較丹酚酸組升高16.78％，甘草酸組升高51.03％(P＜0.01)，合方組升高46.94％(P＜0.01)；與丹酚酸組比較甘草酸組升高29.33％(P＜0.01)，合方組升高25.83％(P＜0.05)；與甘草酸組比較合方組降低2.71％。
(2)對(duì)肝纖維化大鼠肝組織層粘蛋白(LN)含量的影響與正常組比較模型組降低11.87％(P＜0.05)，秋水仙堿組降低22.45％(P＜0.01)，丹酚酸組降低39.78％(P＜0.01)，甘草酸組降低27.37％(P＜0.01)，合方組降低5.44％(見表17)；與模型組比較秋水仙堿組降低12.01％，丹酚酸組降低31.67％(P＜0.01)，甘草酸組降低17.59％(P＜0.05)，合方組升高7.29％；與秋水仙堿組比較丹酚酸組降低22.34％(P＜0.01)，甘草酸組降低6.34％，合方組升高21.94％(P＜0.05)；與丹酚酸組比較甘草酸組升高20.61％(P＜0.05)，合方組升高57.02％(P＜0.01)；與甘草酸組比較合方組升高30.19％(P＜0.01)。
本研究顯示，兩者合方配伍可以有效地促進(jìn)IV型膠原(P＜0.01)與LN合成，有利于功能性基底膜的修復(fù)。
實(shí)驗(yàn)例3本發(fā)明丹酚酸、甘草酸配伍對(duì)在體門靜脈壓力和離體門靜脈反應(yīng)性變化的影響丹酚酸、甘草酸配伍后，與兩藥單用時(shí)比較，產(chǎn)生的新功效是顯著降低了肝纖維化的門靜脈壓力，是一項(xiàng)新的突破性發(fā)現(xiàn)。這項(xiàng)功效對(duì)于慢性肝炎肝纖維化、肝硬化患者伴發(fā)的門脈高壓癥來說，具有非常重要的臨床價(jià)值，填補(bǔ)了該病理狀態(tài)藥物治療的空白。
1.配伍復(fù)方對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠在體門靜脈壓的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表18，結(jié)果表明①造模組門靜脈壓(PVP，mmHg顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)；而卡多普利組(P＜0.05)、奧馬曲拉組(P＜0.01)和復(fù)方高劑量組(P＜0.01)的門靜脈壓低于正常對(duì)照組。②各治療組的門靜脈壓低于模型組(P＜0.01)。③復(fù)方高劑量組的門靜脈壓低于復(fù)方中劑量組(P＜0.01)和復(fù)方低劑量組(P＜0.01)，復(fù)方高、中、低劑量組的門靜脈壓分別是模型組門靜脈壓的43.5％、61.0％和55.8％；提示配伍復(fù)方能顯著降低門靜脈高壓。
表18本發(fā)明復(fù)方對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠門靜脈壓的影響(Mean±SD，ni＝10)

表7對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠血清白蛋白含量的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS A組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS B組，P＜0.05，P＜0.01；VS C組，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01(5)血清A/G比值實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表8，結(jié)果表明①模型組大鼠A/G低于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。②D組大鼠A/G高于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有高度顯著性意義(P＜0.01)。③A、B、D組大鼠A/G高于秋水仙堿組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別無顯著性意義(P＞0.05)。④A、B、D組增高最顯著，統(tǒng)計(jì)學(xué)差別有顯著性意義(P＜0.05)。⑤各組A/G從高到低的排序?yàn)檎＝M＞D組＞A組＞B組＞模型組＞C組＞秋水仙堿組。提示A、B、D組在回升A/G方面較最突出，優(yōu)于秋水仙堿的療效。
表8對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠血清A/G比值的影響(x±s)

t檢驗(yàn)；VS對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表20，結(jié)果表明奧馬曲拉組大鼠門脈對(duì)PE反應(yīng)曲線下總面低于正常組(P＜0.05)、模型組(P＜0.01)、秋水仙堿組(P＜0.01)和卡多普利組(P＜0.01)；復(fù)方中劑量組門脈對(duì)PE反應(yīng)性的曲線下總面積低于模型組(P＜0.05)和秋水仙堿組(P＜0.05)；復(fù)方低劑量組門脈對(duì)PE反應(yīng)性的曲線下總面積低于模型組(P＜0.05)。提示復(fù)方通過降低門靜脈平滑肌細(xì)胞對(duì)收縮物質(zhì)的總體反應(yīng)狀態(tài)而調(diào)節(jié)肝纖維化病理過程中的門靜脈高壓。
表20本發(fā)明復(fù)方對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化門靜脈對(duì)PE反應(yīng)性總面積的影響(Mean±SD，ni＝10)

t檢驗(yàn)；VS正常對(duì)照組，※P＜0.05，※※P＜0.01；VS模型組，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；VS秋水仙堿組，P＜0.05，P＜0.01；VS卡多普利組，△P＜0.05，△△P＜0.01；VS奧馬曲拉組，P＜0.05，P＜0.01；VS復(fù)方高劑量組，●P＜0.05，●●P＜0.01；VS復(fù)方中劑量組，○P＜0.05，○○P＜0.01下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果。
實(shí)施例1本發(fā)明糖漿劑取按《中華人民共和國藥典》2005年版一部制備的甘草浸膏100克；取丹參200克，經(jīng)過常規(guī)提取方法制成丹參干浸膏；與甘草浸膏一起加入常規(guī)輔料或賦形劑，制備成糖漿劑。
實(shí)施例2本發(fā)明混懸劑取按《中華人民共和國藥典》2005年版一部制備的甘草浸膏300克；取丹參1500克，經(jīng)過常規(guī)提取方法制成丹參干浸膏；與甘草浸膏一起加入常規(guī)輔料或賦形劑，制備成混懸劑。
實(shí)施例3本發(fā)明顆粒劑取甘草浸膏100克；丹參浸膏200克，加入常規(guī)輔料或賦形劑，制備成顆粒劑。
實(shí)施例4本發(fā)明膠囊劑取甘草浸膏100克；丹參浸膏400克，加入常規(guī)輔料或賦形劑，制備成膠囊劑。
實(shí)施例5本發(fā)明口服液取甘草酸鹽200克，丹酚酸鹽200克，加入常規(guī)輔料，制備成口服液。
實(shí)施例6本發(fā)明片劑取甘草酸鹽200克，丹酚酸鹽B220克，加入常規(guī)輔料，制備成片劑。
實(shí)施例7本發(fā)明膏劑甘草酸二胺鹽300克，丹酚酸B鹽360克，加入常規(guī)輔料，制備成膏劑。
實(shí)施例8本發(fā)明注射劑甘草酸二胺鹽100克，丹酚酸B鹽90克，加入常規(guī)輔料，制備成注射劑。
實(shí)施例9本發(fā)明顆粒劑取甘草浸膏275g，丹參1100g；丹參粉碎成粗粉，加8倍量的水浸泡12小時(shí)，90℃熱提二次，第一次3小時(shí)，第二次加5倍量的水熱提3小時(shí)。合并兩次提取液，置于冷庫(5～10℃)12小時(shí)，過濾；濾液通過大孔吸附樹脂(1400-I型)柱(填充與生藥等重的樹脂)，待濾液全部通過大孔吸附樹脂后，用約5倍生藥量的水洗柱，棄去洗脫液；然后改用6倍生藥量的40％乙醇洗脫，收集洗脫液減壓濃縮至干，得干浸膏55g。干浸膏粉碎，過60目篩，與甘草浸膏混合，加麥芽糊精至總量為1000g，混合，用乙醇為潤濕劑，濕法制成14目制粒，45℃通風(fēng)干燥，得干顆粒，包裝，每袋2g，即得。
實(shí)施例10本發(fā)明膠囊劑取甘草浸膏275g，丹參1100g；丹參粉碎成粗粉，加8倍量的水浸泡12小時(shí)，90℃熱提二次，第一次3小時(shí)，第二次加5倍量的水熱提3小時(shí)。合并兩次提取液，置于冷庫(5～10℃)12小時(shí)，過濾。濾液通過大孔吸附樹脂(1400-I型)柱(填充與生藥等重的樹脂)，待濾液全部通過大孔吸附樹脂后，用約5倍生藥量的水洗柱，棄去洗脫液；然后改用6倍生藥量的40％乙醇洗脫，收集洗脫液減壓濃縮至干，得干浸膏55g。干浸膏粉碎，過60目篩，與甘草浸膏混合，填充膠囊，每粒裝165mg。
權(quán)利要求
1.一種用于肝纖維化及門脈高壓癥的中藥組合物，其特征在于該組合物是由如下重量份的原料藥制成甘草浸膏∶丹參＝1∶2～7。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該組合物是由如下重量份的原料藥制成甘草浸膏∶丹參＝1∶3，1∶4，1∶5或1∶6。
3.如權(quán)利要求1或2所述的中藥組合物，其特征在于該組合物是加入常規(guī)輔料或賦形劑，制備成片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服溶液劑、糖漿劑或膏劑。
4.如權(quán)利要求1或2所述的中藥組合物，其特征在于丹參由經(jīng)過常規(guī)提取方法制成的丹參干浸膏替代；取甘草浸膏和丹參干浸膏，加入常規(guī)輔料或賦形劑，制備成片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服溶液劑、糖漿劑或膏劑。
5.如權(quán)利要求3所述的中藥組合物，其特征在于該組合物是由如下方法制成的取丹參粉碎成粗粉，90℃熱水提取1～3次，每次加5～8倍量水，每次提取2～4小時(shí)，第1次提取時(shí)先用水浸泡6-24小時(shí)；合并提取液，5～10℃冷凍10～14小時(shí)，過濾；濾液通過大孔吸附樹脂柱，樹脂柱填充與生藥等重的樹脂，待濾液全部通過大孔吸附樹脂后，用4～6倍生藥量的水洗柱，棄去洗脫液；然后用5～7倍生藥量的35～45％乙醇洗脫，收集洗脫液；減壓濃縮至干，得丹參干浸膏；將丹參干浸膏與甘草浸膏混合，加入常規(guī)輔料或賦形劑，制備成下述劑型當(dāng)中的一種片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服溶液劑、糖漿劑或膏劑。
6.如權(quán)利要求5所述的中藥組合物，其特征在于該組合物是由如下方法制成的丹參粉碎成粗粉，加8倍量的水浸泡12小時(shí)，90℃熱提二次，第一次3小時(shí)，第二次加5倍量的水熱提3小時(shí)；合并兩次提取液，5～10℃冷凍12小時(shí)，過濾；濾液通過1400-I型大孔吸附樹脂柱，樹脂柱填充與生藥等重的樹脂，待濾液全部通過大孔吸附樹脂后，用5倍生藥量的水洗柱，棄去洗脫液；然后用6倍生藥量的40％乙醇洗脫，收集洗脫液減壓濃縮至干，得丹參干浸膏；將丹參干浸膏粉碎，過60目篩，與甘草浸膏混合，得混合浸膏；取混合浸膏，填充膠囊，即得膠囊劑；或取混合浸膏，加麥芽糊精至總量，混合，用乙醇為潤濕劑，濕法制成14目制粒，45℃通風(fēng)干燥，得干顆粒，包裝，即得顆粒劑。
7.如權(quán)利要求5或6所述的中藥組合物，其特征在于大孔吸附樹脂是1400-I型大孔吸附樹脂。
8.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該組合物由如下重量份的原料藥制成甘草酸∶丹酚酸＝1∶0.8～1.2。
9.如權(quán)利要求8所述的中藥組合物，其特征在于該組合物由如下重量份的原料藥制成甘草酸∶丹酚酸＝1∶0.9，1∶1或1∶1.1。
10.如權(quán)利要求8所述的中藥組合物，其特征在于甘草酸為甘草酸鹽，丹酚酸為丹酚酸鹽。
11.如權(quán)利要求9所述的中藥組合物，其特征在于甘草酸為甘草酸鹽，丹酚酸為丹酚酸鹽。
12.如權(quán)利要求10所述的中藥組合物，其特征在于甘草酸鹽為甘草酸二胺鹽。
13.如權(quán)利要求12所述的中藥組合物，其特征在于丹酚酸鹽為丹酚酸B鹽。
14.如權(quán)利要求1、2、8、9、10、11、12或13所述的中藥組合物在制備治療肝損傷藥物中的應(yīng)用。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于治療肝損傷是指治療肝纖維化。
16.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于治療肝損傷是指降低肝臟系數(shù)、降低脾臟系數(shù)、降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、降低血清門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、回升血清總蛋白含量、回升血清白蛋白含量、回升血清A/G比值、回降血清總膽紅素含量、回降血清透明質(zhì)酸、回降肝組織羥脯氨酸含量或回降膠原纖維面積比。
17.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其特征在于治療肝纖維化是指降低肝組織血小板衍化生長因子陽性細(xì)胞含量、降低肝組織轉(zhuǎn)化生長因子β1陽性細(xì)胞含量、促進(jìn)肝組織MMP-13合成與分泌或促進(jìn)肝組織IV型膠原與層粘蛋白的合成。
18.如權(quán)利要求1、2、8、9、10、11、12或13所述的中藥組合物在制備具有降低肝纖維化的門靜脈壓力作用的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于肝纖維化及門脈高壓癥的中藥組合物，該組合物以甘草浸膏1重量份，丹參2～7重量份為原料藥制成。制備方法為取丹參粉碎，熱水提?。缓喜⑻崛∫?，冷凍，過濾；濾液通過大孔吸附樹脂柱，用水洗柱，棄去洗脫液；然后用40％乙醇洗脫，收集洗脫液；減壓濃縮至干，得丹參干浸膏；將丹參干浸膏與甘草浸膏混合，加入常規(guī)輔料，制備成臨床可接受的劑型。本發(fā)明還可以甘草酸鹽與丹酚酸鹽直接作原料藥制備得到。本發(fā)明組合物能夠顯著降低肝纖維化的門靜脈壓力，這對(duì)于慢性肝炎肝纖維化、肝硬化患者伴發(fā)的門脈高壓癥來說，具有非常重要的臨床價(jià)值，填補(bǔ)了該病理狀態(tài)藥物治療的空白。
文檔編號(hào)A61P1/16GK1772042SQ20051011566
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月9日
發(fā)明者李澎濤, 秦森邦, 陸輝, 蔡大勇, 唐卉玲, 賀勇 申請(qǐng)人:北京華信萬邦醫(yī)藥技術(shù)有限公司