專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種多聚肽、其制備方法、包含它的藥物組合物和疫苗及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物、所述多聚肽的制備方法、含有所述多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物的藥物組合物和疫苗、應(yīng)用所述多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物來(lái)治療、預(yù)防或改善EBV病毒感染或與EBV相關(guān)的癌癥，尤其是鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)的方法以及所述多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物在制備治療、預(yù)防和改善EBV病毒感染或與EBV相關(guān)的癌癥的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：鼻咽癌(NPC)在整個(gè)東南亞，特別在南中國(guó)、香港、新加波和臺(tái)灣是常見(jiàn)的腫瘤。年發(fā)病率在萬(wàn)分之一到萬(wàn)分之五(Ref1-4)。在該病的早期，放療是有效的手段，然而在轉(zhuǎn)移階段，聯(lián)合應(yīng)用順鉑和5-氟尿嘧啶(5-Fluoro-uracil；5-FU)作化療通常只能起到大致減輕作用(Ref5，6)。一旦這些疾病復(fù)發(fā)或惡化，沒(méi)有更有效的療法可被采用，接近85％的病人在1年內(nèi)病逝，在3年內(nèi)幾乎全部死亡(Ref1，7)。因此，在技術(shù)上迫切需要一個(gè)與包括放療與化療的傳統(tǒng)方法相比更安全和有效的治療方法來(lái)處理晚期鼻咽癌。另外，也存在對(duì)健康個(gè)體為預(yù)防鼻咽癌進(jìn)行疫苗接種的技術(shù)上的需要。EBV是普遍存在的γ-螺旋病毒，它與某些惡性疾病相關(guān)，包括鼻咽癌(Ref8-10)。感染有EBV的大多數(shù)人群是終身感染的，CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)在保持這樣的一個(gè)病毒-宿主平衡中起重要作用(Ref11)。在健康EBV攜帶者的血液中存在著數(shù)量眾多的EBV潛在抗原(Latentantigen)特異性CTLs，其在體外能與用同種異體病毒變形的淋巴毒細(xì)胞系反應(yīng)(Ref12-13)。給移植病人進(jìn)行抑制T細(xì)胞的治療增加了EBV相關(guān)的B細(xì)胞擴(kuò)增(Post-transplantBcelllymphoproliferativedisorder；PTLD)的風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)體外輸入反應(yīng)性EBV-特異性CTLs能治療這種疾病(Ref14-17)。帶有EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞表達(dá)有至少三種B病毒蛋白LMP1，LMP2及EBNA1(Ref18-20)。重要的是在受HLA(humanleukocyteantigen)限制的LMP2上幾個(gè)靶表位已得到確認(rèn)通過(guò)HLA等位基因，如HLA-A11、HLA-A24、和HLA-B40。這些等位基因在中國(guó)南方人中普遍存在(HLA-A11，40-60％；HLA-A24，30-35％；HLA-B40，32％)(Ref21-24)。這樣的反應(yīng)，雖然有時(shí)是可測(cè)的，但NPC病人比健康對(duì)照組更弱。很多的中國(guó)健康EBV攜帶者都可檢測(cè)到對(duì)LMP2反應(yīng)的CTL。體外研究表明NPC腫瘤細(xì)胞能遞呈內(nèi)源性L(fǎng)MP2表位。雖然NPC病患自發(fā)產(chǎn)生的對(duì)抗EB病毒(EBV)HLA限制的LMP2(latentmembraneprotein2)表位的單價(jià)免疫效應(yīng)肽CLGGLLTMV、YLLEMLWRL、YLQQNWWTL、SSCSSCPLSK、TYGPVFMSL或IEDPPFNSI的CTL反應(yīng)水平比一般正常人低，但它們包括了受HLA等位基因(HLA-A11，HLA-A24和HLA-B40)限制的反應(yīng)，而這些等位基因在南亞人群中通常普遍出現(xiàn)(Ref23-24)。因此，基于這些表位的免疫治療途徑在NPC高發(fā)地域中應(yīng)該有廣泛的適用性。為評(píng)估EBV潛在抗原-特異性CTL免疫在NPC病人上的有效性，發(fā)明人曾運(yùn)用病人自體之樹(shù)突狀細(xì)胞(DendriticCells；DCs)(Ref25)，一種特異性抗原遞呈細(xì)胞，用單價(jià)體LMP2特異性肽HLA-A11-restricted“SSCSSCPLSK”、HLA-A24-restricted“TYGPVFMSL”或HLA-B40-restricted“IEDPPFNSI”(Ref22)于體外刺激培養(yǎng)自病患的樹(shù)突細(xì)胞后于16個(gè)患有晚期NPC病人淋巴結(jié)(表1)進(jìn)行多次注射樹(shù)突狀細(xì)胞以產(chǎn)生抗腫瘤CTL反應(yīng).在病人體內(nèi)誘導(dǎo)的反應(yīng)最早可在第一次注射后2周檢測(cè)到，并可持續(xù)3個(gè)月，之后反應(yīng)水平逐漸降低，6個(gè)月內(nèi)幾乎恢復(fù)到疫苗接種前的水平(Figure1)。第二次淋巴結(jié)內(nèi)注射后，外周血液中的表位特異性CTLs數(shù)目達(dá)到峰值。表1在同一個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)中的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)研究表明，疫苗接種后3個(gè)月時(shí)，與A24應(yīng)答性患者相比，A11應(yīng)答性患者在外周血液中出現(xiàn)表位特異性CTLs的頻率更高(Ref.26)。用取自病人體內(nèi)經(jīng)過(guò)充分富集的細(xì)胞群體測(cè)試，這些CTLs具有即刻表位特異性細(xì)胞毒功能(Ret.26)。在接受疫苗接種后產(chǎn)生部分臨床反應(yīng)的兩位病人(2號(hào)和3號(hào)病人)在CTL分析中都是對(duì)A1101肽的強(qiáng)烈應(yīng)答者。臨床反應(yīng)包括骨中和肺中轉(zhuǎn)移性腫瘤的消退(表2和Ref.26)，血液中可檢測(cè)到的疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的A1101表位特異性效應(yīng)細(xì)胞向腫瘤部位浸潤(rùn)和/或在腫瘤部位發(fā)揮活性。表2表2是接種后免疫學(xué)分析和臨床反應(yīng)的概要。在DC接種后，病人2、3、6、8和14(HLA-A1101)及病人4、9、13、和16(HLA-A2402)在ELISPLT分析中有表位特異性T細(xì)胞應(yīng)答頻率增加，CD8+/IFNγCTLs的頻率也增加。病人2、3、6、8的T細(xì)胞效應(yīng)對(duì)有表位包被靶細(xì)胞的溶解能力增加。病人2有臨床可檢測(cè)到的腫瘤退縮。病人3開(kāi)始有部分臨床應(yīng)答，但接下來(lái)腫瘤復(fù)長(zhǎng)。*PR部分應(yīng)答，PD進(jìn)行性臨床疾病#(+)數(shù)量或功效增加，(-)沒(méi)改變?cè)谝粋€(gè)第一期人體試驗(yàn)里，發(fā)明人用HLA-A11，HLA-A24，及HLA-B40限制之LMP2表位單體肽(即SSC-，TYG-，與IED肽)刺激自體樹(shù)突細(xì)胞(DendriticCells)后再注射入16位末期鼻咽癌病人體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這16位病人并沒(méi)有產(chǎn)生任何重大的副作用。此外，有9位病人在注射完3個(gè)月后，周邊血中的LMP2肽表位特異性的殺死型細(xì)胞的頻率有意義顯著升高，其中有2位病人的鼻咽癌轉(zhuǎn)移到腰椎與肺部的腫瘤體積明顯縮小(LinCLetal.CancerResearch2002，626952-6958)。這些結(jié)果顯示利用LMP2特異性表位肽，確實(shí)可用于增強(qiáng)人體的功能性L(fǎng)MP2表位肽特異性之T細(xì)胞反應(yīng)，並且不具有任何副作用。
發(fā)明內(nèi)容由上述結(jié)果可知，已有的以L(fǎng)MP2單聚體刺激人體免疫系統(tǒng)的免疫療法並非所有病患皆有明顯的免疫反應(yīng)。其中一個(gè)原因是使用的LMP2單聚體本身的免疫性(Immunogenecity)不夠強(qiáng)。依免疫學(xué)原理，如果抗原蛋白或抗原勝肽以多聚體型式存在，對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激性或本身所具有的免疫性一般會(huì)較單聚型式高出甚多，本發(fā)明之目的即是開(kāi)發(fā)LMP2HLA-A11，-A24，-B40表位勝肽的多聚體，並成功驗(yàn)證此類(lèi)多聚體確實(shí)具有比單體更高之免疫刺激性。因此，本發(fā)明涉及一種多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物，其中所述多聚肽為選自得自EB病毒特有的LMP2蛋白的片段SSCSSCPLSK(簡(jiǎn)寫(xiě)為SSC)；TYGPVFMSL(簡(jiǎn)寫(xiě)為T(mén)YG)；或IEDPPFNSI(簡(jiǎn)寫(xiě)為IED)的二-八聚體，所述多聚體由相應(yīng)的多肽片段通過(guò)選自如下的接頭連接其中上述接頭中的“-”表示K中的氨基端與片段SSCSSCPLSK；TYGPVFMSL；或IEDPPFNSI羧基端連接的鍵，“K”、“A”和“C”均為氨基酸的縮寫(xiě)。在上述接頭中，優(yōu)選選自下述的接頭接頭的結(jié)構(gòu)舉例說(shuō)明如下上述的所有接頭都是本領(lǐng)域已知的，并且可從例如AdvancedChemtech公司(USA)商購(gòu)得到。在本發(fā)明的多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物中，優(yōu)選片段SSCSSCPLSK；TYGPVFMSL；或IEDPPFNSI的四-八聚體，更優(yōu)選四或八聚體，更優(yōu)選四聚體。最優(yōu)選的四聚體選自本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物的制備方法，包括選用Fmoc氨基酸策略的肽固相合成方法，通過(guò)使用預(yù)涂覆有賴(lài)氨酸核的Wang樹(shù)脂通過(guò)交替地使氨基去保護(hù)及偶聯(lián)下一個(gè)氨基酸使肽鏈增長(zhǎng)，以及最后從樹(shù)脂上裂解肽的步驟。此外，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其中包含至少一種本發(fā)明的多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物，以及常規(guī)的藥物載體或賦型劑。本發(fā)明組合物還任選包含另一種活性組分，例如另一類(lèi)EBV特異性蛋白(例如EBNA(EpsteinBarrNuclearAntigen-1)等)和細(xì)胞因子(例如GM-CSF(粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子)等)。本發(fā)明還涉及一種治療和預(yù)防EpsteinBarr病毒感染或者與EpsteinBarr病毒相關(guān)的癌癥的方法，包括給受施個(gè)體直接施用本發(fā)明的多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物；或者注射本發(fā)明的多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物刺激后的樹(shù)突狀細(xì)胞，優(yōu)選來(lái)自于自體或同種異體的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞；或注射受本發(fā)明的多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物刺激后體外擴(kuò)增的T細(xì)胞，優(yōu)選細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的步驟。用本發(fā)明方法可治療的癌癥包括胃癌、乳腺癌、B細(xì)胞淋巴癌、移植后B細(xì)胞擴(kuò)增病變和鼻咽癌，優(yōu)選用于治療鼻咽癌。另外，本發(fā)明涉及一種疫苗，其中包含本發(fā)明的多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物。任選地，本發(fā)明的疫苗還包含一起其它的活性成分。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多聚肽、其可藥用鹽、類(lèi)似物或衍生物用于制備治療和預(yù)防EpsteinBarr病毒感染或者與EpsteinBarr病毒相關(guān)的癌癥的藥物或者用于制備疫苗的用途。所述與EpsteinBarr病毒相關(guān)的癌癥選自胃癌、乳腺癌、B細(xì)胞淋巴癌、移植后B細(xì)胞擴(kuò)增病變和鼻咽癌。優(yōu)選用于制備治療鼻咽癌的藥物。本發(fā)明的多聚肽分別對(duì)應(yīng)于下述分子結(jié)構(gòu)LMP2扇形HLA-A11表位的四聚肽LMP2扇形HLA-A24表位的四聚肽；和LMP2扇形HLA-B40表位的四聚肽。下面舉例說(shuō)明本發(fā)明的多聚肽的制備路線(xiàn)反應(yīng)路線(xiàn)1和2表示的是以和為例說(shuō)明固相肽合成的反應(yīng)路線(xiàn)。反應(yīng)路線(xiàn)1用于所述固相肽合成的Fmoc和側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸如下Fmoc-K(BOC)、Fmoc-S(tBu)、Fmoc-L、Fmoc-P，F(xiàn)moc-C(Trt)。序列中側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸用下劃線(xiàn)注明。鏈增長(zhǎng)步驟通過(guò)常規(guī)的Fmoc氨基酸肽合成策略進(jìn)行。1.Activationoftheprotectedpeptidebyformationofthepeptidesuccinimidylcarboxylate2.Couplingofpolylysinebackbonewithactivatedprotectedpeptide反應(yīng)路線(xiàn)2aFmoc-保護(hù)的氨基酸[Fmoc-K(BOC)、Fmoc-S(tBu)、Fmoc-L，F(xiàn)moc-P，F(xiàn)moc-C(Trt)]用于固相肽合成，以制備側(cè)鏈保護(hù)的肽。序列中側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸用下劃線(xiàn)注明。在側(cè)鏈不去保護(hù)的條件下將所述肽從固體載體上裂解下來(lái)。反應(yīng)條件所述保護(hù)的肽的羧酸在室溫下，于DMF(1mL)中，通過(guò)加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(DIC，1當(dāng)量)、1-羥基苯并三唑(HOBT，1當(dāng)量)和N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu，1當(dāng)量)并攪拌4小時(shí)而活化。向其中加入Fmoc保護(hù)的四聚賴(lài)氨酸骨架(0.2當(dāng)量)并攪拌16小時(shí)。加入哌啶(0.25mL)并在室溫下攪拌20分鐘以除去Fmoc保護(hù)。減壓出去溶劑。在室溫下將殘余物重新懸浮于15mL含三氟乙酸、苯酚、TIS、水、DTT和茴香硫醚的混合物(88∶5∶2∶5∶0.05∶0.5，v/v)中并攪拌2小時(shí)以除去四聚肽的側(cè)鏈保護(hù)基。終產(chǎn)物通過(guò)用截留值為1.2kDa的滲透膜滲析純化。這樣的肽固相合成方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的，例如參照參考文獻(xiàn)1和2。本發(fā)明還涉及應(yīng)用本發(fā)明的多聚肽、其衍生物或類(lèi)似物來(lái)處理患者，例如體外擴(kuò)增毒性殺手型T細(xì)胞(cytotoxicTcells)，然后再輸入病患體內(nèi)，或應(yīng)用本發(fā)明的的多聚肽、其衍生物或類(lèi)似物用來(lái)刺激樹(shù)突細(xì)胞，然后再注射回病患，或直接應(yīng)用本發(fā)明的多聚肽、其衍生物或類(lèi)似物，用于治療、預(yù)防和改善患者的EBV相關(guān)腫瘤或EBV病毒感染。本發(fā)明方法也可與其它治療方法一起治療EBV相關(guān)癌癥或EBV病毒感染。本發(fā)明的目的是提供使用EBV特異性L(fǎng)MP2蛋白片段的多聚肽或它們的類(lèi)似物通過(guò)注射這些肽刺激過(guò)后的樹(shù)突狀細(xì)胞或體外擴(kuò)增的特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫再輸入病患體內(nèi)，來(lái)治療和預(yù)防EBV病毒感染和EBV相關(guān)癌癥(如鼻咽癌)。在本發(fā)明中，應(yīng)用HLA限制的LMP2HLA-A11表位的四聚肽來(lái)體外刺激培養(yǎng)得自病患的DC，然后注入晚期NPC病人腹股溝淋巴結(jié)(lymphnodes)。本發(fā)明的多聚肽被用于人身上，來(lái)治療或預(yù)防癌癥或病毒感染。結(jié)果顯示，本發(fā)明描述的四聚肽經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有比單價(jià)肽更強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)，引發(fā)或增強(qiáng)了外周血液中可檢測(cè)到的表位特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，因此可運(yùn)用于EBV相關(guān)腫瘤免疫治療。在該治療方法中，病人體內(nèi)的功能性表位特異性CTLs的動(dòng)力學(xué)變化情況可以通過(guò)疫苗接種的進(jìn)度來(lái)調(diào)整。本發(fā)明提供了EBV特異性L(fǎng)MP2的特殊抗原結(jié)構(gòu)分子用于可以誘導(dǎo)針對(duì)NPC上表達(dá)的EBV表位的持續(xù)性T細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明涵蓋了用賴(lài)氨酸或其他可用于連接單體肽SSCSSCPLSK，TYGPVFMSL或IEDPPFNSI成為多聚體之物理或化學(xué)方法，把三種EBV病毒特異性，HLA-A11，HLA-A24與HLA-B40限制性的LMP2肽合成為多聚體。單分子的氨基酸序列分別是SSCSSCPLSK，TYGPVFMSL與IEDPPFNSI。在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求中S代表Serine，絲氨酸C代表Cysteine，半胱氨酸P代表Proline，脯氨酸L代表Leucine，亮氨酸K代表Lysine，賴(lài)氨酸T代表Threonine，蘇氨酸Y代表Tyrosine，酪氨酸G代表Glycine，甘氨酸V代表Valine，纈氨酸F代表Phenylalanine，苯丙氨酸M代表Methionine，甲硫氨酸I代表Isoleucine，異亮氨酸E代表Glutamicacid，谷氨酸D代表Asparaticacid，天冬氨酸N代表Asparagine，精氨酸。本發(fā)明的多聚肽類(lèi)似物或衍生物的是指對(duì)本發(fā)明的多聚肽進(jìn)行個(gè)別的氨基酸替換或?qū)Χ嘶M(jìn)行修飾或保護(hù)得到的類(lèi)似功能的產(chǎn)物。本發(fā)明提供了通過(guò)施用，尤其是注射治療劑量或預(yù)防劑量的本發(fā)明的多聚肽來(lái)治療或預(yù)防癌癥的方法，所述的癌癥包括但不限于neoplasms，轉(zhuǎn)移性腫瘤或其他以細(xì)胞失控生長(zhǎng)為特征的疾病或功能紊亂。所指的治療和/或預(yù)防癌癥包括但不限于，減輕癌癥相關(guān)的癥狀，抑制癌癥的進(jìn)程，促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)歸以及增強(qiáng)免疫反應(yīng)。本發(fā)明的多聚肽可以單獨(dú)使用或與其他癌癥治療方法(如，放療，化療，激素療法，免疫療法和抗腫瘤試劑)聯(lián)合使用?？鼓[瘤試劑的實(shí)例包括但不限于順鉑、異環(huán)磷酰胺、紫杉醇(paclitaxel)，紫杉烷類(lèi)(taxanes)、拓?fù)涿窱抑制物(如CPT-11、topotecan(喜樹(shù)堿衍生物)、9-AC(蒽-9-羧酸)和GG-211)、吉西他濱(gemcitabine)、長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氫葉酸、替莫唑胺(temodal)和紅豆杉醇(taxol)。在一種應(yīng)用中，將本發(fā)明的多聚肽注射到外科手術(shù)切除了癌癥的動(dòng)物體內(nèi)，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在另一種應(yīng)用中，將本發(fā)明的多聚肽對(duì)動(dòng)物給藥，與化療或放療聯(lián)合使用，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在另一種應(yīng)用中，為了預(yù)防或治療癌癥，將本發(fā)明的多聚肽在抗血清之前(如，1分鐘，15分鐘，30分鐘，45分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，2天，或1周之前)或之后(如，1分鐘，15分鐘，30分鐘，45分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，2天，或1周之后)對(duì)動(dòng)物給藥，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的應(yīng)用中，為預(yù)防或治療癌癥，將本發(fā)明的多聚肽在IgG、IgM和/或一種或多種補(bǔ)體成分之前或之后或同時(shí)對(duì)動(dòng)物給藥，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的應(yīng)用中，將本發(fā)明的多聚肽在特異性抗一種或多種癌細(xì)胞抗原的抗體之前或之后或同時(shí)對(duì)動(dòng)物給藥，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在本發(fā)明的又一種優(yōu)選應(yīng)用中，為預(yù)防或治療癌癥，將本發(fā)明的多聚肽在目前用于癌癥治療的抗體之前或之后或同時(shí)對(duì)動(dòng)物給藥，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在本發(fā)明的一些優(yōu)選應(yīng)用中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后重復(fù)注射本發(fā)明的多聚肽。在某些應(yīng)用中，每2個(gè)月，3個(gè)月，4個(gè)月，5個(gè)月，6個(gè)月，7個(gè)月，8個(gè)月，9個(gè)月，10個(gè)月，11個(gè)月或12個(gè)月至少重復(fù)注射一次本發(fā)明的多聚肽。在另一些應(yīng)用中，將本發(fā)明的多聚肽重復(fù)注射2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次，9次，或10次。本發(fā)明提供了治療或預(yù)防動(dòng)物體內(nèi)的病毒感染的方法，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。所述方法包括注射治療劑量或預(yù)防劑量的本發(fā)明的多聚肽。根據(jù)本發(fā)明可以治療或預(yù)防的病毒感染的實(shí)例包括但不限于EB病毒引起的病毒感染。對(duì)病毒感染的治療和/或預(yù)防包括但不限于，減輕與所說(shuō)的感染相關(guān)的癥狀，完全或部分抑制病毒復(fù)制，以及增強(qiáng)免疫反應(yīng)。本發(fā)明的多聚肽可以單獨(dú)使用或與其他類(lèi)型的抗病毒試劑聯(lián)合使用?？共《驹噭┑膶?shí)例包括但不限于細(xì)胞因子(如，IFN-α，IFN-β，IFN-γ)；反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(如，AZT，3TC，D4T，ddC，ddI，d4T，3TC，阿地福韋(adefovir)，施多寧(efavirenz)，地拉韋定(delavirdine)，奈韋拉平(nevirapine)，阿巴卡韋(abacavir)，以及其他雙脫氧核苷酸或dideoxyfluoronucleosides)；抑制病毒mRNA的試劑如三(氮)唑核苷；蛋白酶抑制物如HIV蛋白酶抑制物(如，安普那韋(amprenavir)，佳息患(indinavir)，奈非那韋(nelfinavir)，利托那韋(ritonavir)，和沙奎那維(saquinavir))；兩性霉素B；抑制糖蛋白加工的栗精胺(castanospermine)；神經(jīng)氨(糖)酸苷酶抑制物如流感病毒神經(jīng)氨(糖)酸苷酶抑制物(如，扎納米韋(zanamivir)和達(dá)菲膠囊(oseltamivir))；拓?fù)涿窱抑制物(如，喜樹(shù)堿(camptothecins)及其可藥用鹽、類(lèi)似物)；金剛(烷)胺和金剛乙胺(rimantadine)。在一種應(yīng)用中，為預(yù)防或治療病毒感染，將本發(fā)明的多聚肽在抗血清之前或之后或同時(shí)對(duì)動(dòng)物給藥，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的應(yīng)用中，為預(yù)防或治療病毒感染，將本發(fā)明的多聚肽在IgG，IgM和/或一種或多種補(bǔ)體成分之前或之后或同時(shí)對(duì)動(dòng)物給藥，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在本發(fā)明的另一種應(yīng)用中，為預(yù)防或治療病毒感染，將本發(fā)明的多聚肽在特異性抗一種或多種病毒抗原的抗體之前或之后或同時(shí)對(duì)動(dòng)物給藥，該動(dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。免疫特異性抗病毒抗原的抗體的實(shí)例包括但不限于，Synagis，PRO542，Ostavir，和Protovir。對(duì)待測(cè)多聚肽可以檢測(cè)其減小腫瘤患者(即動(dòng)物)體內(nèi)腫瘤形成的能力；還可以檢測(cè)其減少感染性疾病患者體內(nèi)的病毒或細(xì)菌數(shù)量的能力；亦可以檢測(cè)其減輕癌癥或病毒感染相關(guān)的一種或多種癥狀的能力；還可以檢測(cè)其縮短感染性疾病病程的能力。進(jìn)一步，可以檢測(cè)待測(cè)多聚肽延長(zhǎng)癌癥患者或感染性疾病(如，病毒感染)患者的生存時(shí)間的能力?？蓱?yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢測(cè)待測(cè)多聚肽在患者體內(nèi)的功能水平。在本發(fā)明不同的應(yīng)用中，體外分析可用于確定注射一種特定的多聚肽是否顯示出效果，分析方法包括細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)，即，將病人的組織樣本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，然后令其接觸該多聚肽，或者向樣本中注射該多聚肽，然后觀(guān)察多聚肽對(duì)組織樣本的作用效果。在人體上試驗(yàn)之前，用于治療的多聚肽可先在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型系統(tǒng)上測(cè)試，動(dòng)物模型包括但不限于小鼠，大鼠，雞，牛，猴，狗，貓，豬，兔，等等。對(duì)于活體內(nèi)試驗(yàn)，在注射到人體內(nèi)之前，可以先在任何一種以了解得非常透徹的動(dòng)物模型系統(tǒng)上試用該多聚肽。本發(fā)明提供了通過(guò)向動(dòng)物(如牛，豬，馬，雞，貓，狗，人，等)體內(nèi)注射有效劑量的本發(fā)明的多聚肽來(lái)預(yù)防和治療癌癥，病毒性感染和微生物感染的方法。本發(fā)明的多聚肽可用作疫苗，用于提高有需要的受試者對(duì)EBV特異性肽及其衍生物，類(lèi)似物或其片段的免疫能力。本發(fā)明的疫苗和方法既可用于預(yù)防疾病或機(jī)能紊亂，又可用于治療特定的疾病或功能失調(diào)。本發(fā)明的方法和疫苗可用于誘導(dǎo)受試者體內(nèi)產(chǎn)生抗EBV特異性肽及其衍生物、類(lèi)似物或其片段的體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在一種具體的應(yīng)用中，本發(fā)明的方法和疫苗誘導(dǎo)受試者體內(nèi)產(chǎn)生抗EBV特異性肽及其衍生物、類(lèi)似物或其片段的體液反應(yīng)。在另一種具體的應(yīng)用中，本發(fā)明的方法和疫苗誘導(dǎo)受試者體內(nèi)產(chǎn)生抗EBV特異性肽及其衍生物、類(lèi)似物或其片段的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在本發(fā)明推薦的一種優(yōu)選應(yīng)用中，本發(fā)明的方法和疫苗誘導(dǎo)受試者體內(nèi)同時(shí)產(chǎn)生體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。已知多種傳遞系統(tǒng)可用于向患者給予本發(fā)明的多聚肽，如脂質(zhì)體，微粒，微囊，可表達(dá)該復(fù)合物的重組細(xì)胞，受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用(參見(jiàn)，如，WuandWu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)，構(gòu)建核酸片段作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體的一部分，等等。導(dǎo)入體內(nèi)的方法包括但不限于，皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，硬腦膜上和口腔途徑。多聚肽可用任何一種方便的途徑給予患者，例如，灌輸或大丸藥注射，上皮或黏膜與皮膚內(nèi)層的吸附(如，口腔黏膜，直腸和腸黏膜，等)，也可同其他生物活性試劑一同給予。給藥可以是系統(tǒng)化的或是局部的。而且，通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩娇梢詫⒈景l(fā)明的多聚肽導(dǎo)入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射可以通過(guò)心室內(nèi)導(dǎo)管進(jìn)行。還可采用肺部給藥，如，使用吸入器或噴霧器，配方中則加入一種霧化試劑。在一種具體的應(yīng)用中，如果希望將本發(fā)明的多聚肽在需要治療的部位局部給藥，則可通過(guò)，例如但不限于以下的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，如，外科手術(shù)中進(jìn)行局部灌輸，局部表面應(yīng)用如外科手術(shù)后敷在傷口上，然后包扎傷口，注射，使用導(dǎo)管，栓劑，或植入物，所指的植入物是含孔隙的、實(shí)心的、或凝膠狀的材料，包括膜，如sialastic膜，或纖維。在另一種應(yīng)用中，本發(fā)明的多聚肽可以裹在顆粒內(nèi)，尤其是脂質(zhì)體內(nèi)，來(lái)進(jìn)行傳遞。(參見(jiàn)Langer，1990，Science2491527-1533；Treatetal.，inLiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer，Lopez-BerestcinandFidler(eds.)，Liss，NewYork，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestcin，ibid.，pp.317-327；seegenerallyibid.)在又一種應(yīng)用中，本發(fā)明的多聚肽可在一個(gè)受控釋放或持續(xù)釋放的系統(tǒng)中進(jìn)行傳遞。有一種應(yīng)用可以使用泵(參見(jiàn)，Langer，supra；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwaldetal.，1980，Surgery88507；Saudeketal.，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一種應(yīng)用中，受控釋放系統(tǒng)可以使用聚合體材料(參見(jiàn)，MedicalApplicationsofControlledRelease，LangerandWise(eds.)，CRCPres.，BocaRaton，F(xiàn)lorida(1974)；ControlledDrugBioavailablility，DrugProductDesignandPerformance，SmolenandBall(eds.)，Wiley，NewYork(1984)；RangerandPeppas，J.，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；Levyetal.，1985，Science228190；Duringetal.，1989，Ann.Neurol.25351；Howardetal.，1989，J.Neurosurg.71105)。Langer的綜述中討論了其他受控釋放系統(tǒng)(1990，Science2491527-1533)，將其引入本文作為本發(fā)明公開(kāi)的一部分。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括有效預(yù)防劑量或治療劑量的本發(fā)明的多聚肽以及制藥學(xué)上可接受的載體。“載體”是指稀釋液，佐劑，賦型劑，或給藥的媒介物。這些藥物載體可以是無(wú)菌液體，如水和油，包括來(lái)自石油、動(dòng)物、植物或合成的油類(lèi)，例如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油之類(lèi)。當(dāng)藥劑成分要通過(guò)靜脈內(nèi)給藥時(shí)，水是首選的載體。鹽溶液，葡萄糖和甘油的水溶液也可用作液體載體，尤其適用作為注射溶液。適宜的藥劑賦性劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，白明膠，麥芽，米粉，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鈉。若有需要，組合物中還可包括少量的潤(rùn)濕劑、乳化劑或pH緩沖試劑。本發(fā)明的組合物可以是溶液，懸浮液，乳劑，片劑，丸劑，膠囊，粉劑，持續(xù)釋放的劑型，等等。也可將本發(fā)明組合物制成栓劑，例如采用傳統(tǒng)的基質(zhì)如甘油三酯?？诜苿┛砂?biāo)準(zhǔn)的載體如制藥級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂，等等。E.W.Martin在其《Remington’sPharmaceuticalSciences》一文中描述了適宜的藥劑載體的實(shí)例，將其引入本文作為本發(fā)明公開(kāi)的一部分。這些制劑包含治療有效量的本發(fā)明的多聚肽，以及適量的載體以提供適宜的給藥形式。制劑的配方應(yīng)與給藥方式相適應(yīng)。在一種優(yōu)選的應(yīng)用中，將本發(fā)明的多聚肽制成適于按常規(guī)途徑給病人靜脈給藥的藥劑。典型的靜脈給藥的藥劑成分是以無(wú)菌等滲水劑緩沖液作溶劑的溶液。如有需要，治療藥劑還可以包含一種加溶劑和一種局部麻醉劑如利諾卡因來(lái)緩解注射部位的疼痛。一般來(lái)說(shuō)，這些添加成分可以分開(kāi)提供或以單位劑量形式相混合，例如，裝在密封的帶刻度容器中的凍干粉劑或無(wú)水濃縮物，容器可以是安瓿或sachette，能指示所裝活性試劑的量。輸液給藥時(shí)，就可以將之加到盛有制藥級(jí)的無(wú)菌水或鹽溶液的輸液瓶中。若采用注射給藥，可以提供一安瓿的注射用無(wú)菌水或鹽溶液，這樣在給藥前可以將各成分混合起來(lái)。本發(fā)明的多聚肽可以是中性形式或其可藥用鹽的形式。制藥學(xué)上可接受的鹽形式包括陰離子鹽如鹽酸鹽，磷酸鹽，乙酸鹽，草酸鹽，酒石酸鹽等，以及陽(yáng)離子鹽如鈉鹽，鉀鹽，銨鹽，鈣鹽以及與異丙胺，三乙胺，2-乙基氨基乙醇，組氨酸，普魯卡因(一種局部麻醉劑)的鹽，等等。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明療法的疫苗組合物，該疫苗組合物適于給藥以引起抗特定抗原的保護(hù)性免疫(體液或細(xì)胞介導(dǎo)的)反應(yīng)，目的是治療或預(yù)防疾病，等。在優(yōu)選的應(yīng)用中，適宜的疫苗組合物包括可注射的溶液或懸浮液；適于注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式。組合物還可以乳化，或?qū)⒃摱嚯难b入脂質(zhì)體中形成膠囊狀?；钚悦庖咴煞殖Ｅc制藥學(xué)上可接受的、并且可與活性成分相容的賦型劑混合在一起。適宜的賦型劑有水，鹽，磷酸鹽緩沖液，葡萄糖，甘油，乙醇，無(wú)菌等滲水劑緩沖液等等，及其混合物。此外，在需要的時(shí)候，疫苗組合物還可以包括少量的附加成分如潤(rùn)濕或乳化試劑，pH緩沖試劑，和/或促進(jìn)疫苗效能的佐劑。可能有效的佐劑的實(shí)例包括但不限于氫氧化鋁，N-乙酰基-胞璧?；?L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙?；?降-胞璧?；?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺，N-乙酰基-胞璧?；?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’，2’-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺。本發(fā)明的組合物或疫苗對(duì)癌癥或病毒感染的有效治療或預(yù)防劑量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)來(lái)確定。此外，也可以采用體外試驗(yàn)來(lái)幫助確定最佳劑量范圍。組合物中所用的精確劑量隨給藥途徑和疾病或機(jī)能紊亂的程度不同而不同，還要根據(jù)醫(yī)生的判斷和病人的具體情況來(lái)確定。本發(fā)明還提供了一種藥劑包裝或試劑盒，包括一個(gè)或多個(gè)容器，其中裝有本發(fā)明的多聚肽或其藥物組合物，任選的其它活性組分以及說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析(ELISPOT)測(cè)定了單體肽SSCSSCPLSK；TYGPVFMSL；IEDPPFNSI；本發(fā)明的LMP2扇形HLA-A11表位的四聚肽、八聚肽；LMP2扇形HLA-A24表位的四聚肽、八聚肽；LMP2扇形HLA-B40表位的四聚肽、八聚肽；線(xiàn)型LMP2HLA-A11表位的四聚肽、八聚肽；線(xiàn)型LMP2HLA-A24表位的四聚肽、八聚肽；線(xiàn)型LMP2HLA-B40表位的四聚肽、八聚肽；以及非相關(guān)肽的活性(見(jiàn)附圖1A-1C和2A-2C)。結(jié)果表明，不論是用什么形狀的接頭連接的A11SSC，A24TYG或B40IED得到的四聚肽均比八聚肽更能有效刺激產(chǎn)生分泌IFN-gamma之肽特異性之毒性T細(xì)胞(CytotoxicTCells)。而八聚肽又比單體肽有效。這說(shuō)明本發(fā)明的多聚肽比單體肽更有效。圖1.通過(guò)ELISPOTassay測(cè)定的線(xiàn)型LMP2HLA-A11(圖A)，-A24(圖B)，-B40(圖C)的活性結(jié)果。表位四聚物在體外刺激T細(xì)胞24小時(shí)后，比單體物及八聚物誘導(dǎo)產(chǎn)生更高頻率之LMP2特異性的T細(xì)胞，這些T細(xì)胞可制造IFN-r。Irrelevantpeptide做為negativecontrol。圖2.通過(guò)ELISPOTassay測(cè)定的扇形LMP2HLA-A11(圖A)，-A24(圖B)，-B40(圖C)的活性結(jié)果。表位四聚物在體外刺激T細(xì)胞24小時(shí)后，比單體物及八聚物誘導(dǎo)產(chǎn)生更高頻率之LMP2特異性的T細(xì)胞，這些T細(xì)胞可制造IFN-r。Irrelevantpeptide做為negativecontrol。結(jié)論不論是扇形(Fanshaped)或線(xiàn)形(LinearShaped)連接的A11SSC，A24TYG或B40IED四聚體比八聚體更能有效刺激產(chǎn)生分泌IFN-gamma之勝肽特異性之毒性T細(xì)胞(CytotoxicTcells)。而八聚體又比單體有效。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例用以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明方法，但該發(fā)明不受限于這些實(shí)施例。材料和實(shí)驗(yàn)材料所有溶劑均為AR級(jí)或同級(jí)溶劑。使用肽合成級(jí)品質(zhì)的二甲基甲酰胺(DMF)。二氯甲烷(DCM)使用前在氫化鈣存在下蒸餾。哌啶使用前在粒狀氫氧化鉀存在下新蒸餾。使用HPLC級(jí)溶劑進(jìn)行HPLC分析，所述HPLC級(jí)溶劑在使用前先經(jīng)孔隙為0.45μm的尼龍膜過(guò)濾。從AdvancedChemTechInc.(其地址為5609FernValleyRoad，Louisville，KY40228)購(gòu)得Fmoc-保護(hù)的氨基酸、Wang樹(shù)脂、三苯甲游基氯樹(shù)脂和具有賴(lài)氨酸核的Wang樹(shù)脂。從AldrichChemicalCompanyLtd.(其地址為1001WestStreet，PaulAvenue，Milwaukee，WI53233)購(gòu)得其余化學(xué)試劑。使用ChemSpeedWSM500平行合成機(jī)進(jìn)行肽固相合成(SPPS)。使用SpeedvacSC250DDA(ThermoSavant)對(duì)合成的肽進(jìn)行凍干。扇形多聚肽的合成采用常規(guī)肽固相合成的Fmoc氨基酸策略，按照文獻(xiàn)方法來(lái)合成多聚肽26-27。將預(yù)先包被有賴(lài)氨酸核的Wang樹(shù)脂(參見(jiàn)反應(yīng)路線(xiàn)1)用作固體載體。肽鏈的增長(zhǎng)通過(guò)重復(fù)下述的去保護(hù)(DeFmoc步驟)和偶聯(lián)(Coupling步驟)步驟完成DeFmoc步驟于室溫下，將新制備的20％(v/v)哌啶溶液(0.6mL哌啶溶于2.4mL二甲基甲酰胺中)加到Wang樹(shù)脂(0.2mmol/g，100mg)中，并攪動(dòng)20分鐘。過(guò)濾樹(shù)脂，用DMF∶茴香硫醚混合物(100∶0.5，每次3mL，3次)和二氯甲烷(DCM，每次2mL，3次)清洗，然后在N2下干燥。通過(guò)茚三酮測(cè)試28確定Fmoc去保護(hù)是否成功。偶聯(lián)步驟將溶于DMF-茴香硫醚混合物(100∶0.5，2mL)中的Fmoc保護(hù)的氨基酸(1mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBT，1.0mmol)和1，3-二異丙基碳化二亞胺(DIC，1.0mmol)的溶液加到前述去保護(hù)的樹(shù)脂中。于室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)。過(guò)濾樹(shù)脂，用DMF∶茴香硫醚混合物(100∶0.5，每次3mL，3次)和二氯甲烷(DCM，每次2mL，3次)清洗，然后在N2下干燥。用茚三酮試驗(yàn)檢測(cè)Fmoc-保護(hù)的氨基酸與樹(shù)脂的偶聯(lián)是否完全。由C-端開(kāi)始，重復(fù)去保護(hù)和偶聯(lián)步驟得到下述具體氨基酸序列的希望的肽。從樹(shù)脂上裂解肽為了從Wang樹(shù)脂上裂解所述肽，首先通過(guò)DeFmoc步驟使多聚肽去保護(hù)，然后在室溫下，將與樹(shù)脂連接的去保護(hù)的肽加到4mL含三氟乙酸、苯酚、三異丙基甲硅烷(TIS)、水、二硫蘇糖醇(DTT)和茴香硫醚的混合物中(TFA∶苯酚∶TIS∶H2O∶DTT∶茴香硫醚，88∶5∶2∶5∶0.05∶0.5，v/v)并攪拌2小時(shí)。過(guò)濾混合物除去樹(shù)脂，用三氟乙酸(3mL，3次)清洗。將濾液合并，然后通過(guò)減壓將濾液濃縮至約5mL。將殘余的溶液逐滴加到叔丁基甲基醚(40mL)中使肽沉淀。將得到的懸浮體保持在-20℃24小時(shí)，以使沉淀得以完全。離心收集白色的沉淀物(2500rpm/分鐘，15分鐘)，傾析，用叔丁基甲基醚(7mL)重新懸浮。重復(fù)離心-再懸浮步驟3次，通過(guò)在真空下靜置過(guò)夜，除去微量溶劑。使用截留值(cutoff)為1.2kDa的滲透膜并在10％乙酸的去離子水溶液中滲析(2×3L)，然后用去離子水滲析(3×3L)得到的淺黃色或白色固體。將所得的溶液凍干，得到白色的固體(29.3mg，6.41×10-3mmol)，即LMP2扇形HLA-A11表位的四聚肽。所得到的多聚肽通過(guò)ESI-MS和氨基酸序列分析進(jìn)行表征。線(xiàn)形多聚肽的合成線(xiàn)型多聚肽通過(guò)偶聯(lián)側(cè)鏈保護(hù)的肽與低聚賴(lài)氨酸骨架進(jìn)行合成(參見(jiàn)反應(yīng)路線(xiàn)2).低聚賴(lài)氨酸骨架的合成Fmoc-保護(hù)的四聚賴(lài)氨酸骨架通過(guò)固相肽合成方法進(jìn)行制備。具有側(cè)鏈保護(hù)基的肽的合成A11(SSCSSCPLSK)、A24(TYGPVFMSL)和B40(IEDPPFNSI)肽是應(yīng)用三苯甲游基氯樹(shù)脂作為固體載體通過(guò)常規(guī)固相肽合成方法制備的。肽的裂解條件如下在室溫下，將與樹(shù)脂連接的肽加到4mL含三氟乙酸、苯酚、三異丙基甲硅烷、水、二硫蘇糖醇、茴香硫醚和乙酸的混合物中(TFA∶苯酚∶TIS∶H2O∶DTT∶茴香硫醚，1∶5∶2∶5∶0.05∶0.5∶87，v/v)并攪拌2小時(shí)。過(guò)濾混合物除去樹(shù)脂，用乙酸(3mL，3次)清洗。將濾液合并，然后通過(guò)減壓將濾液濃縮至約5mL。保護(hù)的肽與低聚賴(lài)氨酸骨架的連接將保護(hù)的肽溶于DMF中，并與N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu，1當(dāng)量)、HOBT(1當(dāng)量)和DIC(1當(dāng)量)一起攪拌4小時(shí)。然后通過(guò)加入乙醇使反應(yīng)停止。減壓除去反應(yīng)混合物中的溶劑。向其中加入低聚賴(lài)氨酸骨架(0.2當(dāng)量)并在室溫下重新溶解于DMF(1mL)中并攪拌16小時(shí)。加入哌啶(0.25mL)以除去Fmoc保護(hù)基并靜置反應(yīng)混合物20分鐘。后處理步驟如下減壓出去溶劑，在室溫下將殘余物重新溶于15mL含三氟乙酸、苯酚、TIS、水、DTT和茴香硫醚的混合物(88∶5∶2∶5∶0.05∶0.5，v/v)中并攪拌2小時(shí)。通過(guò)減壓將反應(yīng)混合物濃縮至約5mL。將殘余的溶液逐滴加到叔丁基甲基醚(40mL)中使肽沉淀。將得到的懸浮體保持在-20℃24小時(shí)，以使沉淀得以完全。離心收集白色的沉淀物(2500rpm/分鐘，15分鐘)，傾析，用叔丁基甲基醚(7mL)重新懸浮。重復(fù)離心-再懸浮步驟3次，通過(guò)在真空下靜置過(guò)夜，除去微量溶劑。使用截留值為1.2kDa的滲透膜并在10％乙酸的去離子水溶液中滲析(2×3L)，然后用去離子水滲析(3×3L)得到的淺黃色或白色固體。將所得的溶液凍干，得到白色的固體(22mg，5.0×10-3mmol)，即LMP2線(xiàn)形HLA-A11表位的四聚肽。所得到的多聚肽通過(guò)ESI-MS和氨基酸序列分析進(jìn)行表征。類(lèi)似地，通過(guò)上述步驟合成了扇型LMP2HLA-A11表位的八聚肽、扇型LMP2HLA-A24表位的四聚肽、八聚肽、扇型LMP2HLA-B40表位的四聚肽、八聚肽，以及線(xiàn)型LMP2HLA-A11表位的八聚肽、線(xiàn)型LMP2HLA-A24表位的四聚肽、八聚肽、線(xiàn)型LMP2HLA-B40表位的四聚肽、八聚肽。上述合成的肽的氨基酸序列和分子量(用MassSpectrometry分析)，分別為線(xiàn)型LMP2HLA-A11表位的四聚肽，分子量4450kDa線(xiàn)型LMP2HLA-A11表位的八聚肽，分子量8880kDa線(xiàn)型LMP2HLA-A24表位的四聚肽，分子量4512kDa線(xiàn)型LMP2HLA-A24表位的八聚肽，分子量9006kDa線(xiàn)型LMP2HLA-B40表位的四聚肽，分子量4580kDa線(xiàn)型LMP2HLA-B40表位的八聚肽，分子量9140kDa扇型LMP2HLA-A11表位的四聚肽，分子量4568kDa扇型LMP2HLA-A11表位的八聚肽，分子量9000kDa扇型LMP2HLA-A24表位的四聚肽，分子量4635kDa扇型LMP2HLA-A24表位的八聚肽，分子量9120kDa扇型LMP2HLA-B40表位的四聚肽，分子量4701kDa扇型LMP2HLA-B40表位的八聚肽，分子量9260kDa。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析(ELISPOT)為檢測(cè)準(zhǔn)備的PBMC中LMP2表位特異的IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞，進(jìn)行ELISPLT操作。簡(jiǎn)單地說(shuō)，96孔板(Millipore，MA)預(yù)先用15ug/ml的抗-IFN-γ(Endogen，MA，USA)單抗包被。在接種前和后采集的PBMCs以1×106/孔加三個(gè)平行孔，然后加入相應(yīng)的肽(2μg/ml)。這平板過(guò)夜孵育(37℃，5％CO2)。在第二天洗板后加入1μg/ml生物素?；目笽FN-γ單抗(Endogen，MA，USA)，然后置室溫2-3小時(shí)，接著加入親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(Serotec，USA)再放二小時(shí)。個(gè)別的IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞檢測(cè)到是黑點(diǎn)在與底物(5-溴-4-氯-3-碘磷酸鹽和硝基四唑嗡藍(lán))作用30分鐘后。這斑點(diǎn)在分析顯微鏡下被計(jì)數(shù)。有特異性應(yīng)答的的T細(xì)胞數(shù)在減去陰性(用DMSO溶劑控制的孔)對(duì)照后被計(jì)算。主要參考文獻(xiàn)1.Teo，P.M.，Kwan，W.H.，Lee，W.Y.，Leung，S.F.，andJohnson，P.J.Prognosticatorsdeterminingsurvivalsubsequenttodistantmetastasisfromnasopharyngealcarcinoma.Cancer772423-2431，19962.HongLongCancerRegistryReport，HongKongGovernment，SAR，China，20003.Shu-Chen，H.Nasopharyngealcancerareviewof1605patientstreatedradicallywithcobalt60.Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.6401-407，19804.Yu，M.Nasopharyngealcarcinomaepidemiologyanddietaryfactors，IARCSci，Publ.10539-47，19915.Choo，R.，Tannock，I.Chemotherapyforrecurrentormetastaticcarcinomaofthenasopharynx.AreviewofthePrincessMargaretHospitalexperience.Cancer682120-2124，19916.Altun，M.，F(xiàn)andi，A.，Dupuis，O.，Cvitkovic，E.，Krajina，Z.，andEschwege，F(xiàn).Undifferentiatednasopharyngealcancer(UCNT)currentdiagnosticandtherapeuticaspects.Int.J，Radiat.Oncol.Biol.Phys.32859-877，19957.Lee，A.W.，Poon，Y，F(xiàn).，F(xiàn)oo，W.，Law，S，C.，Cheung，F(xiàn).K.，Chan，D.K.，Tung，S.Y.，Thaw，M.，andHo，J.H.Retrospectiveanalysisof5037patientswithnasopharyngealcarcinomatreatedduring1976-1985overallsurvivalandpatternsoffailure.Int.J.Radiat.Oncol.Biol，Phys.23261-270，19928.Rickinson，A.B.，Kieff，E.Epstein-Barrvirus.InFields，B.N.，Knipe，D.M.，andHowley，P.M.(eds.)，F(xiàn)ieldsVirology，pp.2397-2446，PhiladelphiaLippincott-Raven，19969.Lin，C.T.，Lin，C.R.，Tan，G，K.，Chen，W.，Dee，A.N.，andChan，W.Y.ThemechanismofEpstein-BarrVirusinfectioninnasopharyngealcarcinoma.Am.J，Pathol.1501745-1756，199710.Busson，P.，McCoy，R.，Sadler，R.，Gilligan，K.，Tursz，T.，andRaab-Traub，N.ConsistenttranscriptionoftheEpstein-Barrvirusgeneinnasopharyngealcarcinoma.J.Virol，663257-3262，199211.Rickinson，A.B.，Lee，S.P.，andSteven，N.M.CytotoxicTlymphocyteresponsestoEpstein-Barrvirus.Curr.Opin.Immunol.8429-497，199612.Khanna，R.，Burrows，S.R.，Kurilla，M.G.，Jacob，C.A.，Misko，I.S.，ScullyT.B.，Kieff，E.，andMoss，D.J.LocalizationofEpstein-BarrviruscytotoxicTcellepitopesusingrecombinantvacciniaimplicationsforvaccinedevelopment.J.Exp.Med.176169-178，199213.Murray，R.J.，Kurilla，M.G.，Brooks，J.M.，Thomas，W.A.，Rowe，M.，Kieff，E.，andRickinson，A.B.IdentificationoftargetantigensforthehumancytotoxicTcellresponsetoEpstein-Barrvirus(EBV)implicationsfortheimmunecontrolofEBV-positivemalignancies.J.Exp.Med.176157-168，199214.Shapiro，R.S.，McClain，K.，F(xiàn)rizzera，G.，GajlPeczalska，K.J.，Kersey，J.H.，Blazar，B.R.，Arthur，D.C.，Pat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