專利名稱：以知母總皂苷元為活性成分的藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，知母總皂苷元由知母藥材經(jīng)水解提取的總皂苷元精制而成，具有清熱瀉火，生津潤(rùn)燥，止渴除煩作用。但關(guān)于以知母總皂苷元為活性成分的藥物組合物及其醫(yī)藥用途未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了以知母總皂苷元為活性成分的藥物組合物本發(fā)明提供了知母總皂苷元在制備治療或預(yù)防更年期綜合征的藥物中的用途。
本發(fā)明提供了知母總皂苷元在制備治療或預(yù)防女性更年期綜合征和男性更年期綜合征的藥物中的用途。
本發(fā)明提供了知母總皂苷元在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了知母總皂苷元在制備治療或預(yù)防血管性癡呆的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的藥物組合物，知母總皂苷元中含有薩爾薩皂苷元和知母皂苷元等，總皂苷元含量在50％以上，優(yōu)選在70％以上。
本發(fā)明所述的知母總皂苷元由知母總皂苷經(jīng)酸水解制得，知母總皂苷與酸的比例為1∶20～100，水解反應(yīng)溫度為65～95℃，反應(yīng)時(shí)間0.5～2小時(shí)。酸可以是鹽酸、硫酸或高氯酸中的一種或幾種。知母總皂苷是由知母藥材加入5～10倍量的20％～80％乙醇提取后，用正丁醇萃取或大孔吸附樹脂柱分離獲得。
知母總皂苷元用于上述用途時(shí)的有效劑量范圍為12～1200mg。
具體實(shí)施例方式
制備例1制備知母總皂苷元取知母藥材，加入5～10倍量的20％～80％乙醇，優(yōu)選7～8倍量，乙醇濃度優(yōu)選50％～60％，提取知母總皂苷，可提取1次，也可提取2～3次。合并提取液，濃縮，回收乙醇。殘留液體用正丁醇萃取知母總皂苷，回收正丁醇后的膏狀物經(jīng)過(guò)干燥，獲得知母總皂苷(A)。也可以用回收乙醇的殘留液體加水稀釋后，通過(guò)大孔吸附樹脂柱，再用水洗脫至無(wú)明顯成分后，用50％～95％乙醇洗脫，回收含乙醇的洗脫液，濃縮，干燥，獲得知母總皂苷(A)。
取A樣品，用稀鹽酸或稀硫酸水溶液水解，即1份A，加20～100份的稀鹽酸或稀硫酸，稀酸重量百分比濃度為1～10％。A樣加熱攪拌水解，加熱溫度控制在65～95℃，水解反應(yīng)時(shí)間控制在0.5～2小時(shí)之間，濾取沉淀物，干燥，得知母總皂苷元(B)。B主要含有薩爾薩皂苷元，知母總皂苷元。經(jīng)紫外分光光度法檢測(cè)，B中總皂苷元含量在50％以上。
薩爾薩皂苷元 知母皂苷元試驗(yàn)例1 知母總皂苷元對(duì)去卵巢大鼠內(nèi)分泌功能紊亂的治療作用1材料知母總皂苷元按制備例1制備。
乙烯雌酚上海利生制藥廠生產(chǎn)；動(dòng)物普通級(jí)Wistar大鼠，雌性，體重250g-280g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)；血清雌二醇放免測(cè)定試劑盒天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。
2方法大鼠60只，按體重分為假手術(shù)組、模型組、乙烯雌酚組、知母總皂苷元小劑量組(2mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(50mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(100mg/kg)；大鼠進(jìn)行切除雙側(cè)卵巢手術(shù)，制作大鼠去卵巢模型。假手術(shù)不切除卵巢。手術(shù)7天后開始i.g.給藥，1次/天，連續(xù)28天。末次給藥后24h，大鼠水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，檢測(cè)血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，血清促黃體生成素(LH)，雌二醇(E2)含量。數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
3結(jié)果如表1所示，去卵巢大鼠血漿ACTH明顯高于假手術(shù)組，血清E2含量顯著低于假手術(shù)組，LH明顯高于假手術(shù)組；知母總皂苷元能明顯抑制去卵巢大鼠ACTH、LH的升高和E2的降低。
表1知母總皂苷元對(duì)去卵巢大鼠內(nèi)分泌功能紊亂的影響

**P＜0.01VS假手術(shù)組；△P＜0.05，△△P＜0.01，VS△△△P＜0.01模型對(duì)照組試驗(yàn)例2知母總皂苷元對(duì)去卵巢小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用1材料知母總皂苷元由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心提供。
動(dòng)物清潔級(jí)級(jí)昆明種小鼠，雌性，體重22g～25g，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證魯動(dòng)質(zhì)字200106003號(hào)；更年安天津樂(lè)仁堂制藥廠生產(chǎn)；小鼠自主活動(dòng)記錄儀中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn)。
2方法與結(jié)果2.1知母總皂苷元對(duì)去卵巢小鼠睡眠時(shí)間的影響60只小鼠，按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、更年安組、知母總皂苷元小劑量組(4mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(100mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(200mg/kg)；對(duì)小鼠進(jìn)行切除雙側(cè)卵巢手術(shù)，制作小鼠去卵巢模型。假手術(shù)不切除卵巢。手術(shù)7天后開始i.g.給藥，1次/天，連續(xù)28天。末次給藥后24h，各組小鼠分別i.p 35mg/kg戊巴比妥鈉，以翻正反射消失為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，觀察其催眠入睡時(shí)間及睡眠持續(xù)時(shí)間。數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
結(jié)果如表2所示，知母總皂苷元明顯延長(zhǎng)小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉催眠的睡眠時(shí)間。
表2知母總皂苷元對(duì)去卵巢小鼠睡眠時(shí)間的影響

**P＜0.01VS假手術(shù)組；△P＜0.05，△△P＜0.01，VS△△△P＜0.01模型對(duì)照組2.2知母總皂苷元對(duì)苯丙胺引起去卵巢小鼠自主活動(dòng)增加的影響60只小鼠，按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、更年安組、知母總皂苷元小劑量組(4mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(100mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(200mg/kg)；對(duì)小鼠進(jìn)行切除雙側(cè)卵巢手術(shù)，制作小鼠去卵巢模型。假手術(shù)不切除卵巢。手術(shù)7天后開始i.g.給藥，1次/天，連續(xù)28天。末次給藥后24h，各組小鼠分別i.p苯丙胺3mg/kg，20min后在自主活動(dòng)記錄儀中記錄其5min內(nèi)自主活動(dòng)次數(shù)。數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。結(jié)果如表3所示，知母總皂苷元能抑制苯丙胺引起的去卵巢小鼠自主活動(dòng)的增加。
表3知母總皂苷元對(duì)苯丙胺所致去卵巢小鼠自主活動(dòng)的影響

**P＜0.01VS假手術(shù)組；△P＜0.05，△△P＜0.01，VS△△△P＜0.01模型對(duì)照組2.3知母總皂苷元對(duì)4-氨基吡啶誘發(fā)去卵巢小鼠激怒發(fā)生率的影響120只小鼠，按體重隨機(jī)均分為假手術(shù)組、模型組、更年安組、知母總皂苷元小劑量組(4mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(100mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(200mg/kg)；對(duì)小鼠進(jìn)行切除雙側(cè)卵巢手術(shù)，制作小鼠去卵巢模型。假手術(shù)不切除卵巢。手術(shù)7天后開始i.g.給藥，1次/天，連續(xù)28天。末次給藥后24h，各組小鼠分別i.p 6mg/kg 4-氨基吡啶，放入8×8×6cm3的木盒內(nèi)，觀察10min內(nèi)小鼠激怒(活動(dòng)增多、豎耳對(duì)峙、相互追逐、抓打撕咬)發(fā)生率。
結(jié)果如表4顯示，知母皂苷元?jiǎng)┝恳蕾囆詼p少去卵巢小鼠因4-氨基吡啶誘發(fā)激怒的發(fā)生率。
表4知母總皂苷元對(duì)4-氨基吡啶所致去卵巢小鼠激怒發(fā)生率的影響

**P＜0.01VS假手術(shù)組；△P＜0.05，△△P＜0.01，VS△△△P＜0.01模型對(duì)照組2.4知母總皂苷元對(duì)去卵巢小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響60只小鼠，按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、更年安組、知母總皂苷元小劑量組(4mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(100mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(200mg/kg)；對(duì)小鼠進(jìn)行切除雙側(cè)卵巢手術(shù)，制作小鼠去卵巢模型。假手術(shù)不切除卵巢。手術(shù)7天后開始i.g.給藥，1次/天，連續(xù)28天。末次給藥后24h，進(jìn)行小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)測(cè)定，計(jì)錄平臺(tái)停留期(T)及錯(cuò)誤次數(shù)(N)。數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
結(jié)果如表5顯示，模型組小鼠較正常對(duì)照組小鼠平臺(tái)停留期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加，知母總皂苷元兩個(gè)劑量組可顯著延長(zhǎng)小鼠平臺(tái)停留期，減少錯(cuò)誤次數(shù)。
表5知母總皂苷元對(duì)去卵巢小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響

***P＜0.01VS假手術(shù)組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型對(duì)照組試驗(yàn)例3知母總皂苷元對(duì)雄性去勢(shì)大鼠內(nèi)分泌功能紊亂的治療作用1材料知母總皂苷元由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心提供。
動(dòng)物普通級(jí)Wistar大鼠，雌性，體重250g-280g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)。
血清睪酮放免測(cè)定試劑盒天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。
2方法大鼠50只，按體重分為假手術(shù)組、模型組、知母總皂苷元小劑量組(2mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(50mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(100mg/kg)；對(duì)大鼠進(jìn)行去勢(shì)手術(shù)，制作大鼠去勢(shì)模型手術(shù)7天后開始i.g.給藥，1次/天，連續(xù)28天。末次給藥后24h，大鼠水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，檢測(cè)血清促黃體生成素，睪酮含量。數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
3結(jié)果結(jié)果如表6所示，知母總皂苷元能明顯抑制去勢(shì)大鼠促黃體生成素和睪酮的降低。
表6知母總皂苷元對(duì)雄性去勢(shì)大鼠內(nèi)分泌功能紊亂

*P＜0.05，**P＜0.01VS正常對(duì)照組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型對(duì)照組試驗(yàn)例4知母總皂苷元對(duì)氫化可的松所致陽(yáng)虛小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)及抗應(yīng)激能力的影響1材料知母總皂苷元由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心提供。
動(dòng)物清潔級(jí)級(jí)昆明種小鼠，雌性，體重22g～25g，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證魯動(dòng)質(zhì)字200106003號(hào)。
小鼠自主活動(dòng)記錄儀中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn)2方法與結(jié)果
2.1知母總皂苷元對(duì)氫化可的松所致陽(yáng)虛小鼠睡眠時(shí)間的影響50只小鼠，按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、知母總皂苷元小劑量組(4mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(100mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(200mg/kg)；小鼠肌注氫化可的松1mg/只/天，連續(xù)10天，制作小鼠陽(yáng)虛模型。正常對(duì)照組注射等容量生理鹽水。同時(shí)動(dòng)物i.g.給藥，1次/天，連續(xù)28天。末次給藥后24h，各組小鼠分別i.p 35mg/kg戊巴比妥鈉，以翻正反射消失為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，觀察其催眠入睡時(shí)間及睡眠持續(xù)時(shí)間。數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
結(jié)果如表7所示，知母總皂苷元明顯延長(zhǎng)陽(yáng)虛小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉催眠的睡眠時(shí)間。
表7知母總皂苷元對(duì)氫化可的松所致陽(yáng)虛小鼠睡眠時(shí)間的影響

**P＜0.01VS正常對(duì)照組；△P＜0.05，△△P＜0.01，VS△△△P＜0.01模型對(duì)照組2.2知母總皂苷元對(duì)氫化可的松所致陽(yáng)虛小鼠抗應(yīng)激能力的影響按2.1所述方法給藥、造模，末次給藥后24h，每只小鼠尾部負(fù)重為體重10％的鉛塊，放入水深25cm，水溫(36±0.5)℃的水糟中，從入水開始至鼻孔沉下水面所需時(shí)間(min)計(jì)為小鼠游泳時(shí)間。數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
按2.1所述方法給藥、造模，末次給藥后24h，將小鼠放入盛有鈉石灰的25ml密閉玻璃瓶?jī)?nèi)，每瓶放小鼠一只，瓶蓋周圍涂凡士林，小鼠缺氧死亡時(shí)間表示為常壓耐缺氧時(shí)間。數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
結(jié)果如表8所示，知母總皂苷元明顯延長(zhǎng)陽(yáng)虛小鼠游泳時(shí)間和存活時(shí)間表8知母總皂苷元對(duì)氫化可的松所致陽(yáng)虛小鼠抗應(yīng)激能力的影響

**P＜0.01VS正常對(duì)照組；△P＜0.05，△△P＜0.01，VS△△△P＜0.01模型對(duì)照組試驗(yàn)例5知母總皂苷元對(duì)維甲酸所致雌性大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用1.材料知母總皂苷元由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心提供。
維甲酸膠囊，重慶華邦制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)990701；低鈣飼料，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所生產(chǎn)。
普通級(jí)Wistar大鼠，雌性，3～4月齡，體重150～210g，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)。
SX-2.5-10型馬福爐(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn))；BP210S型電子分析天平(德國(guó)sartorius公司生產(chǎn))；QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀(美國(guó)HOLOGIC公司生產(chǎn))；CSS-1101C電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)研究所生產(chǎn))。
2.方法2.1大鼠骨質(zhì)疏松模型的制備、動(dòng)物分組及用藥取健康3～4月齡雌性大鼠，隨機(jī)分為6組正常對(duì)照組，骨質(zhì)疏松模型組，知母總皂苷元小劑量組(2mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(50mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(100mg/kg)，每組10只。除正常對(duì)照組外，各組大鼠均以維甲酸70mg/kg劑量灌胃給藥，1次/日，連續(xù)三周。造模三周后，停服維甲酸，各組動(dòng)物分別按上述藥物劑量灌胃給藥。1次/日，連續(xù)給藥一個(gè)月。正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松模型組給予與給藥組等容量的生理鹽水(10ml/kg)。飼養(yǎng)室溫度22℃～25℃，濕度50％～70％，喂以低鈣飼料(含鈣量＜0.3％)，自由飲水。
2.2大鼠活動(dòng)能力的測(cè)定末次給藥24h后，取大鼠置于實(shí)驗(yàn)盒中，記錄5min內(nèi)大鼠自主活動(dòng)次數(shù)。
2.3大鼠骨密度測(cè)定末次給藥24h后，以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀探頭下，仰位固定于檢測(cè)臺(tái)上，頭與身體呈直線，線球管對(duì)準(zhǔn)身體縱軸中點(diǎn)，選擇大鼠骨質(zhì)疏松敏感區(qū)域單側(cè)(左側(cè))股骨中點(diǎn)(F50)的皮質(zhì)骨和第三腰椎骨測(cè)定骨密度。
2.4大鼠骨指數(shù)、骨礦成分(骨Ca、P)的測(cè)定末次給藥24h后，取大鼠右側(cè)股骨于120℃烘箱中干燥2h，電子天平測(cè)定骨重量(W)、游標(biāo)卡尺測(cè)定骨長(zhǎng)(L)、骨直徑(D)，計(jì)算表觀線密度(W/L)，表觀面密度(W/LD)。將上述股骨置于800℃馬福爐中灰化8h，使骨呈白色粉末狀，稱灰重(Wash)，其灰重即為無(wú)機(jī)物質(zhì)重量。用等離子光量計(jì)測(cè)定骨灰中鈣、磷等元素的含量，并計(jì)算骨灰分的灰分表觀線密度(Wash/L)及灰分表觀面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力學(xué)的測(cè)定末次給藥24h后，左側(cè)股骨、脛骨剔除肌肉和周圍組織，放入液體石蠟中7天之內(nèi)測(cè)定其生物力學(xué)特征，用電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)做三點(diǎn)折斷試驗(yàn)，參數(shù)為標(biāo)定1/50，加載速度6mm/min，最大負(fù)荷200牛頓(N)，跨距20mm，描記負(fù)荷—變形曲線，計(jì)算最大負(fù)荷及結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(引起1mm變形需要的負(fù)荷，相當(dāng)于曲線上的斜率)。
2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
3結(jié)果3.1知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)的影響由表9可見，與正常組相比，模型組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)顯著下降；知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)。
表9知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組3.2知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響由表10可見，與正常組相比模型組大鼠股骨密度和椎骨密度顯著下降，知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度和椎骨密度。
表10知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組3.3知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨指數(shù)的影響由表11可見，與正常組相比模型組大鼠股骨重量、長(zhǎng)度、表觀線密度、表觀面密度均明顯下降，知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度和椎骨密度。
表11知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨灰分指數(shù)的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組3.4知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨礦成分含量的影響由表12可見，與正常組相比模型組大鼠股骨Ca、P含量顯著降低，知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨Ca、P含量。
表12知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨灰分指數(shù)的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組3.5知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的測(cè)定由表13可見，與正常組相比模型組大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度顯著降低，知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。
表13知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組試驗(yàn)例6知母總皂苷元對(duì)切除睪丸所致大鼠腎虛骨質(zhì)疏松癥的治療作用1.材料知母總皂苷元按制備例制備。
維甲酸膠囊，重慶華邦制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)990701；低鈣飼料，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所生產(chǎn)。
普通級(jí)Wistar大鼠，雄性，3～4月齡，體重150～210g，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)。
SX-2.5-10型馬福爐(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn))；BP210S型電子分析天平(德國(guó)sartorius公司生產(chǎn))；QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀(美國(guó)HOLOGIC公司生產(chǎn))；CSS-1101C電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)研究所生產(chǎn))。
2.方法2.1大鼠骨質(zhì)疏松模型的制備、動(dòng)物分組及用藥動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組，骨質(zhì)疏松模型組，知母總皂苷元小劑量組(2mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(50mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(100mg/kg)，每組10只。大鼠水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，仰位固定，碘酒消毒陰囊部，沿陰囊正中縱行切開一小口，分開切口，卵圓形睪丸即露出，絲線結(jié)扎，在結(jié)扎線與睪丸之間剪下睪丸，縫合切口，用75％酒精棉球消毒。假手術(shù)組動(dòng)物用同法剝離出睪丸，但不摘除，放回縫合。手術(shù)三周后各組動(dòng)物分別按上述藥物劑量灌胃給藥。1次/日，連續(xù)給藥一個(gè)月。正常對(duì)照組和骨質(zhì)疏松模型組給予與給藥組等容量的生理鹽水(10ml/kg)。飼養(yǎng)室溫度22℃～25℃，濕度50％～70％，喂以低鈣飼料(含鈣量＜0.3％)，自由飲水。
2.2大鼠活動(dòng)能力的測(cè)定末次給藥24h后，取大鼠置于實(shí)驗(yàn)盒中，記錄5min內(nèi)大鼠自主活動(dòng)次數(shù)。
2.3大鼠骨密度測(cè)定末次給藥24h后以10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，置于QDR-4000型雙能線骨密度測(cè)定儀探頭下，仰位固定于檢測(cè)臺(tái)上，頭與身體呈直線，線球管對(duì)準(zhǔn)身體縱軸中點(diǎn)，選擇大鼠骨質(zhì)疏松敏感區(qū)域單側(cè)(左側(cè))股骨中點(diǎn)(F50)的皮質(zhì)骨和第三腰椎骨測(cè)定骨密度。
2.4大鼠骨指數(shù)、骨礦成分(骨Ca、P)的測(cè)定末次給藥24h后，取大鼠右側(cè)股骨于120℃烘箱中干燥2h，電子天平測(cè)定骨重量(W)、游標(biāo)卡尺測(cè)定骨長(zhǎng)(L)、骨直徑(D)，計(jì)算表觀線密度(W/L)，表觀面密度(W/LD)。將上述股骨置于800℃馬福爐中灰化8h，使骨呈白色粉末狀，稱灰重(Wash)，其灰重即為無(wú)機(jī)物質(zhì)重量。用等離子光量計(jì)測(cè)定骨灰中鈣、磷等元素的含量，并計(jì)算骨灰分的灰分表觀線密度(Wash/L)及灰分表觀面密度(Wash/LD)。
2.5大鼠骨生物力學(xué)的測(cè)定末次給藥24h后，左側(cè)股骨、脛骨剔除肌肉和周圍組織，放入液體石蠟中7天之內(nèi)測(cè)定其生物力學(xué)特征，用電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)做三點(diǎn)折斷試驗(yàn)，參數(shù)為標(biāo)定1/50，加載速度6mm/min，最大負(fù)荷200牛頓(N)，跨距20mm，描記負(fù)荷—變形曲線，計(jì)算最大負(fù)荷及結(jié)構(gòu)強(qiáng)度(引起1mm變形需要的負(fù)荷，相當(dāng)于曲線上的斜率)。
2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
3.結(jié)果3.1知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)的影響由表14可見，與正常組相比，模型組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)顯著下降；知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)。
表14知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠自主活動(dòng)次數(shù)的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組
3.2知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響由表15可見，與正常組相比模型組大鼠股骨密度和椎骨密度顯著下降，知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度和椎骨密度。
表15知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組3.3知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨指數(shù)的影響由表16可見，與正常組相比模型組大鼠股骨重量、長(zhǎng)度、表觀線密度、表觀面密度均明顯下降，知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨密度和椎骨密度。
表16知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨灰分指數(shù)的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組3.4知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨礦成分含量的影響由表17可見，與正常組相比模型組大鼠股骨Ca、P含量顯著降低，知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨Ca、P含量。
表17知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨灰分指數(shù)的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組3.5知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的測(cè)定由表18可見，與正常組相比模型組大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度顯著降低，知母總皂苷元各劑量組均能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠股骨和脛骨的最大負(fù)荷、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。
表18知母總皂苷元對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨、脛骨生物力學(xué)的影響

**P＜0.01VS正常組；△P＜0.05，△△P＜0.01VS模型組試驗(yàn)例7知母總皂苷元對(duì)東莨菪堿所致小鼠記憶獲得性障礙的影響1材料知母總皂苷元按制備例制備。
氫溴酸東莨菪堿上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為0005017。
哈伯因(石杉?jí)A甲，Huperzine A)，河南竹林眾生制藥股份有限公司豫中制藥廠產(chǎn)品，批號(hào)為0008036。
YYE50小鼠跳臺(tái)儀，北京醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn)。
Y型水迷宮裝置，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所生產(chǎn)。
動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體重22g～25g，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證魯動(dòng)質(zhì)字200106003號(hào)。
2方法與結(jié)果2.1知母總皂苷元對(duì)東莨菪堿所致記憶獲得性障礙小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響取小鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，知母總皂苷元小劑量組(4mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(100mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(200mg/kg)，哈伯因組(0.2mg·kg-1)，分別灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)30天。末次給藥后1h，小鼠腹腔注射東莨菪堿2mg/kg，正常對(duì)照組注射等容量生理鹽水。20min后按文獻(xiàn)潘思源，韓怡凡，徐秋萍，等.莨菪類生物堿對(duì)18、28及38日齡小鼠的行為和記憶障礙作用.中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，1998，19(2)112～6所述小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，記錄平臺(tái)停留期(T)及錯(cuò)誤次數(shù)(N)。數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
結(jié)果如表19所示，模型組小鼠較正常對(duì)照組小鼠平臺(tái)停留期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加，知母總皂苷元可顯著延長(zhǎng)小鼠平臺(tái)停留期，減少錯(cuò)誤次數(shù)。
表19知母總皂苷元對(duì)東莨菪堿所致記憶獲得性障礙小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響

**P＜0.01vs正常對(duì)照組；△P＜0.05，△△P＜0.01vs模型對(duì)照組試驗(yàn)例8知母總皂苷元對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響1材料知母總皂苷元按制備例1制備。
尼莫地平片由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)000605，每片20mg。
硝普鈉由北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)005071。
大鼠跳臺(tái)裝置，北京醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn)。
Y型水迷宮裝置，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所產(chǎn)品。
動(dòng)物普通級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體重250g-280g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)。
2方法與結(jié)果2.1知母總皂苷元對(duì)血管性癡呆大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響取大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，尼莫地平組(10mg/kg)，知母總皂苷元小劑量組(2mg/kg)、知母總皂苷元中劑量組(50mg/kg)、知母總皂苷元大劑量組(100mg/kg)，分別灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，3天后按文獻(xiàn)周小青，劉旺華，李花，等.丹龍醒腦片對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織興奮性氨基酸影響的實(shí)驗(yàn)研究.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，22(2)4-7所述血管性癡呆大鼠模型建立方法，將水合氯醛麻醉的大鼠腹腔注射0.05％硝普鈉(5ml/kg)，常規(guī)消毒，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉，10min后，再通10min，再夾閉10min。再通后，傷口嚴(yán)格消毒，縫合，回籠室溫(27±0.5)℃飼養(yǎng)并灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)30天。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過(guò)程同模型組，但不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不注射硝普鈉。
造模后第11天開始按文獻(xiàn)周小青，劉旺華，李花，等.丹龍醒腦片對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化和鈣超載的影響.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，22(3)1-5所述方法進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練。訓(xùn)練前先將動(dòng)物放入箱中自由活動(dòng)3min，熟悉環(huán)境，然后將動(dòng)物置于圓臺(tái)上，接通銅柵電源，記錄動(dòng)物3min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)(動(dòng)物跳下圓臺(tái)次數(shù))及受電擊總時(shí)間，作為學(xué)習(xí)訓(xùn)練成績(jī)。24h后直接將動(dòng)物置于圓臺(tái)上，記錄其放入至第1次下臺(tái)受到電擊的時(shí)間(潛伏期)、3min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)及受電擊總時(shí)間，作為記憶測(cè)試成績(jī)。
數(shù)據(jù)以X±s表示，組間t-test檢驗(yàn)。
結(jié)果如表20顯示，模型組大鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)、記憶成績(jī)與假手術(shù)組相比，錯(cuò)誤次數(shù)及受電擊時(shí)間顯著增多，潛伏期(記憶成績(jī))明顯縮短。中、大劑量知母總皂苷元組、尼莫地平組與模型組比較，錯(cuò)誤次數(shù)、受電擊時(shí)間均明顯減少；潛伏期(記憶成績(jī))明顯延長(zhǎng)。
表20知母總皂苷元對(duì)血管性癡呆大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響

**P＜0.01vs假手術(shù)組；△P＜0.05，△△P＜0.01vs模型對(duì)照組
權(quán)利要求
1.以知母總皂苷元為活性成分的藥物組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，知母總皂苷元中含有薩爾薩皂苷元，知母皂苷元，總皂苷元含量在50％以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，總皂苷元含量在70％以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的藥物組合物，知母總皂苷元由知母總皂苷經(jīng)酸水解制得，知母總皂苷與酸的比例為1∶20～100，水解反應(yīng)溫度為65～95℃，反應(yīng)時(shí)間0.5～2小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，酸可以是鹽酸、硫酸或高氯酸中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，知母總皂苷是由知母藥材加入5～10倍量的20％～80％乙醇提取后，用正丁醇萃取或大孔吸附樹脂柱分離獲得。
7.知母總皂苷元在制備治療或預(yù)防更年期綜合癥的藥物中的應(yīng)用。
8.知母總皂苷元在制備治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
9.知母總皂苷元在制備治療或預(yù)防血管性癡呆的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的應(yīng)用，知母總皂苷元的有效劑量范圍為12～1200mg。
全文摘要
本發(fā)明提供了以知母總皂苷元為活性成分的藥物組合物，以及以知母總皂苷元為活性成分的藥物組合物的制備方法，本發(fā)明還提供了其在制備藥物方面的用途，具體提供了其在制備治療或預(yù)防更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松和血管性癡呆的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P19/00GK1732955SQ20051008924
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月3日
發(fā)明者姜永濤, 田京偉, 孫芳, 馬雙剛, 白景, 范秀玉, 傅風(fēng)華, 劉珂 申請(qǐng)人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司