專利名稱：用于預防和/或治療肝臟疾病的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥學領域，具體的，本發(fā)明涉及一種用于預防和/或治療乙型肝炎、肝硬化的，含有化學式1所示結構的鞣花酸衍生物的藥物組合物，<化學式1>
在上述化學式中，R1、R2、R3及R4相互獨立的是H、OH或C1～C3的烷氧基。
<化學式2>
背景技術人的乙型肝炎病毒(HBV)能夠誘發(fā)急性或慢性肝炎，并能夠轉化為自抑性急性肝炎、暴發(fā)性肝炎或慢性活動性肝炎。慢性活動性肝炎能夠誘發(fā)肝硬變及肝癌等，而且也能惡化成為伴有肝功能衰竭的嚴重疾病(Brechot，C.，J.Hepatol.，4，269-279，1987)。如果患上肝炎，大部分患者表現(xiàn)出持續(xù)性或活動性肝炎的癥狀，也有些患者沒有任何的癥狀。但是，上述病毒性肝炎的發(fā)病原因或誘發(fā)因子還沒有完全明確的研究結果。在發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒所導致的肝損傷是宿主的免疫細胞所傳遞的部分證據之后(Milich，D.R.et al.，J.Immunol.，143，3141-3147，1989)，積極開展了針對誘發(fā)肝細胞壞死的病毒性抗原和特定B細胞及T細胞的免疫反應，及病毒蛋白的直接細胞發(fā)病原因或腫瘤發(fā)病原因的研究(R.Zschke，O.et al.，Nature，348，252-254(1990))。
但是，不同患者表現(xiàn)出來不同癥狀的原因還沒有研究透澈。乙型肝炎因為其癥狀的嚴重性而引起了針對其治療的眾多關注和研究?，F(xiàn)在，雖然已開發(fā)出幾種藥物或疫苗，而且在臨床前實驗和臨床實驗中得到了較滿意的效果，但是幾乎沒有針對性治療的藥物，因此，到目前為止針對乙型肝炎病毒(HBV)性肝炎患者的唯一的治療方法是依靠人體免疫系統(tǒng)。HBV的人體免疫作用雖然能夠去除HBV粒子，但另一方面也破壞肝細胞，因此上述免疫作用的副作用也可能引發(fā)致命的疾病。另外，上述問題的存在也導致了難以預測疾病的進程，因此為了快速有效的治療肝炎，最好綜合使用抗病毒療法和免疫療法。
也就是說，在治療病毒性肝炎時，感染的肝細胞通過有細胞毒性的T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)而被破壞，對于遭到破壞的肝細胞所釋放出的病毒粒子，需要去除其中病毒的中和抗體，在防止對肝細胞再次感染的同時，也需要抑制病毒的增殖。到目前為止，為了治療乙型肝炎病毒，嘗試過干擾素、核酸衍生物或免疫調節(jié)物質等各種方法，其中只有干擾素-α有一定治療效果。因此，在美國目前只把干擾素-α作為肝炎治療劑使用。干擾素-α是在1970年代中期，由Sculled等人首先作為乙型肝炎的治療劑使用，發(fā)現(xiàn)其具有抑制HBV復制的效果。但是，干擾素-α需要一周用藥三次，至少要使用三個月的時間，才在20％左右的患者身上表現(xiàn)出抑制病毒增殖的治療效果，并且沒有表現(xiàn)出持續(xù)的抑制效果。對于東方人來說，許多母嬰之間垂直感染的患者或兒童對干擾素-α表現(xiàn)出一定的抗藥性，因此治療效果不佳。另外，最近的研究成果發(fā)現(xiàn)，被乙型肝炎病毒感染的急性或慢性患者中只有不足50％的患者適合采取干擾素-α的治療方法。也就是說，只有因病毒的影響而使肝所生成的各種酶(AST、SGOT、ALT、SGPT等)的酶量提高的患者，干擾素-α治療法才能取得一定療效。
因此，當務之急是開發(fā)出對干擾素-α產生抗藥性的乙型肝炎患者的治療劑。尤其是通過尋找阻礙病毒附著于收容體或特異性的阻礙病毒的活性蛋白或綜合酶的物質，開發(fā)出抑制乙型肝炎病毒增殖的方法。
在乙型肝炎病毒復制的過程中，生成三種主要抗原(c、s、e抗原)，其中c抗原(核心抗原)為結構性抗原的結晶體，而s抗原(表面抗原)為通過病毒表面蛋白質生成的抗原結晶體。e抗原是能夠檢測被乙型肝炎病毒感染與否的血液中的指示物質。e抗原不是乙型肝炎病毒繁殖所需的必要條件，其對乙型肝炎病毒有何影響還沒有準確的研究報告。但是，根據e抗原的遺傳因子能夠在類似動物的病毒中發(fā)現(xiàn)的情況推斷，上述抗原的作用非常重要。因此，e抗原是除去病毒的免疫學目標物，尤其是在去除病毒的過程中宿主起到重要的作用(Pignatelli，M.et al.，J.Hepal.4，15-16，1987)。
溶解性的e抗原具有在血液中循環(huán)并分泌的性質。e抗原于血清中分泌并存在，而且有通過胎盤由母親傳染給新生兒的可能性。但是，s抗原不存在上述可能性。如果e抗原通過循環(huán)系統(tǒng)到達胸腺，預計將會破壞輔助T細胞(T-helper cell)的功能。因此，呈陽性的母親所生出來的孩子，帶有c抗原/e抗原-特定輔助T細胞的耐受性(tolerance)的免疫性缺陷(Milich，D.R.，et al.，PNAS USA 87，6599-6603，1990)。因為呈陽性的母親所生的孩子具有輔助T細胞的耐受性，因此如果被HBV感染，很容易發(fā)展成慢性肝炎。
另外，還有報告稱各種蔬菜及水果中的苯酚化合物具有抗癌、抗病毒、防止脂質氧化及預防循環(huán)系統(tǒng)疾病等藥理活性(趙后宗、李春子、吳盛燦、徐研后著，具有藥理作用的食品，曉日文化社，1998)。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人從天然物質中提取了具有抗乙型肝炎病毒的活性的物質，開發(fā)出肝炎治療劑及肝硬化預防和治療劑，研究結果發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于植物中的鞣花酸的鞣花酸衍生物具有抑制乙型肝炎病毒e抗原的生成，從而可抑制免疫耐受性(immuno tolerance)，能夠有效地預防和治療肝炎和肝硬化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供了含有化學式1所示結構的鞣花酸衍生物在乙型肝炎、肝硬化的預防和/或治療中的應用。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了含有化學式1所示結構的鞣花酸(ellagic acid)的鞣花酸衍生物或其藥用鹽作為有效成分的，用于預防和治療乙型肝炎的藥物組合物。
下面，對本發(fā)明進行詳細說明。
本發(fā)明提供了含有化學式1所示結構的鞣花酸的鞣花酸衍生物或其藥用鹽作為有效成分的，用于預防和治療乙型肝炎的藥物組合物。
<化學式1>
其中R1、R2、R3及R4相互獨立的是H、OH或C1～C3的烷氧基。
本發(fā)明的鞣花酸衍生物包括下述化學式2所示的鞣花酸。具體而言，鞣花酸衍生物包括在化學式1中滿足R1、R2、R3、R4＝OH的下述化學式2的鞣花酸等。
<化學式2>
上述化學式1所示的本發(fā)明的鞣花酸衍生物，可以藥用鹽的形式使用，優(yōu)選上述鹽為與藥學上可用的游離酸所形成的酸加成鹽。所述游離酸可以是無機酸或有機酸。其中，無機酸包括鹽酸、溴酸、磺酸及磷酸等，有機酸包括檸檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸 葡糖酸、甲磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、格魯特倫酸 鹽本酸 谷氨酸和天冬氨酸等。另外，化學式1的鞣花酸衍生物可以是與堿形成的藥學可用的金屬鹽，尤其是堿金屬鹽，例如鈉鹽及鉀鹽。
本發(fā)明在評價上述鞣花酸衍生物對乙型肝炎病毒的抗病毒活性時，利用乙型肝炎病毒的代表物質HbeAg，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)進行測定，結果發(fā)現(xiàn)隨著鞣花酸衍生物濃度增加，HBeAg的量顯著減少。另外，分泌到細胞外部的e抗原得到了很大程度的抑制，但對于細胞內的e抗原的生成不產生影響(圖2)。另外，投放鞣花酸的試驗組中發(fā)生了T/B細胞反應(圖3)，而且促進了e抗體的生成和IgG形態(tài)的抗體的生成(圖5、圖6)。
本發(fā)明含有鞣花酸衍生物或其藥用鹽作為有效成分的藥物組合物可抑制將病毒性肝炎轉變?yōu)槁愿窝椎囊倚透窝撞《緀抗原的生成，從而抑制免疫耐受性，因此能夠有效地用于肝炎、肝硬化的預防和治療。
根據本發(fā)明，為了治療乙型肝炎病毒，將鞣花酸衍生物或其藥用鹽作為有效成分，并將其和藥劑學上可用的載體混合在一起，即可制出用于疾病的預防或治療的藥物組合物。本發(fā)明用于預防和/治療乙型肝炎的藥物組合物，可包括常規(guī)的賦形劑、甜味劑、潤滑劑及香味劑等，而且可通過常規(guī)的制藥方法制成顆粒劑、膠囊劑、散劑、乳劑或其他劑型。
具體的，可將本發(fā)明的藥物組合物制成常常用的錠劑、含片(troches)、糖錠、水性或油性懸浮液、粉劑或顆粒劑、乳劑、硬或軟膠囊、糖漿劑、酏劑等。為了制成錠劑或膠囊，可加入乳糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支鏈淀粉、纖維素或明膠等粘合劑；磷酸鉀鹽等賦形劑；玉米淀粉或紅薯淀粉等崩解劑；硬脂酸鎂、硬脂酸鉀、硬脂酰甲酸鈉或聚乙二醇系列等蠟狀物的潤滑劑。如果是膠囊，除了加入如上所述物質外，還可含有脂肪油等液體載體。
另外，本發(fā)明的藥物組合物可以通過非口服的方式使用，所述非口服方式是通過皮下注射、靜脈注射、肌肉內注射或胸內注射等注射方式。制備用于非口服方式的劑型時，可將上述化學式1所示的化合物與穩(wěn)定劑及緩沖劑一起用水混合，形成溶液或懸浮液，并利用罐和瓶制成單位劑量形式。
毒性實驗結果表明，將本發(fā)明的衍生物以5g/kg的容量通過口服的方式給試驗鼠使用時，幾乎沒有毒性，對包括肝在內的臟器沒有任何副作用。
另外，上述包含鞣花酸的鞣花酸衍生物不會對包括肝在內的臟器帶來任何副作用(Merck Index Vol.11th edition.1989)。本發(fā)明通過細胞毒性及口服急性毒性實驗證實了鞣花酸衍生物的安全性。
本發(fā)明有效成分鞣花酸衍生物的使用量根據活性成分在體內的吸收程度、非活化率及排泄速度、患者的年齡、性別及狀態(tài)、所需治療疾病的嚴重程度等決定，通常，化學式1所示化合物的成人日劑量為0.1-500mg/kg(體重)，可一次或分多次施用，優(yōu)選劑量為0.1-100mg/kg(體重)。
附圖簡要說明

圖1為本發(fā)明鞣花酸的化學式。
圖2為在被乙肝病毒感染的肝細胞中，鞣花酸在不改變s抗原內外部的量，也不改變e抗原內部生成的情況下抑制外部生成分泌的酶免疫反應示意圖。
圖3為對e抗原轉基因小鼠進行鞣花酸處理后，T/B淋巴細胞變化曲線圖。
圖4為對e抗原轉基因小鼠進行鞣花酸處理后，抑制e抗原生成的曲線圖。
圖5為對e抗原轉基因小鼠進行鞣花酸處理后，生成e抗體的曲線圖。
圖6為對e抗原轉基因小鼠進行鞣花酸處理后，生成IgG型免疫抗體的曲線圖。
圖7為對e抗原轉基因小鼠進行鞣花酸處理后，CTL反應亢進的曲線圖。
圖8為對e抗原轉基因小鼠進行鞣花酸處理后，促進IL-4生成的曲線圖。
圖9為對e抗原轉基因小鼠進行鞣花酸處理后，增進IFN-γ生成的曲線圖。
圖10為對肝硬化動物模型進行鞣花酸處理后，各種血清因子的變化曲線圖。
圖11為對肝硬化動物模型進行鞣花酸處理后，肝星狀細胞(Hepaticstellate cell)的變化曲線圖。
具體實施例方式
下面，對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細描述。
以下實施例僅用以說明本發(fā)明而不會限制本發(fā)明，盡管參照以下較佳實施例對本發(fā)明進行詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明進行修改、改變性或者等同替換而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求保護范圍之中。
本發(fā)明以化學式1的衍生物作為有效成分的藥物組合物可通過非口服或口服的方式使用，在下面的內容中，非口服方式采用注射劑，口服方式采用糖漿劑或錠劑。
實施例1鞣花酸抑制e抗原生成的作用對e抗原及s抗原所分泌的HepG2 2.2.15細胞用鞣花酸處理后，觀察各抗原是否在細胞內外部進行分泌。于24穴培養(yǎng)皿中培養(yǎng)適當量的細胞，在沒有血清的培養(yǎng)基中放置4-5小時。然后用不同濃度的鞣花酸對其進行處理，放置過夜。大約過16小時之后，取細胞上清液及細胞，采用ELISA法測定e抗原及s抗原。結果，細胞外部的s抗原及細胞內部的e抗原的分泌沒有變化，而細胞外部的e抗原的量顯著減少(附圖2)。
實施例2在e抗原轉基因小鼠上的T/B細胞反應培養(yǎng)e抗原轉基因小鼠并進行e抗原免疫，兩周之后再次進行免疫，并在兩周之后取脾臟進行T/B細胞增殖試驗(cell proliferationassay)。將脾臟用篩研磨，溶解紅血球后計算細胞數。在96穴培養(yǎng)皿中對規(guī)定量的細胞添加不同濃度的e抗原并培養(yǎng)過夜，之后在第二天添加MTT試驗溶液，并進行4個小時的反應。4小時后，添加增溶溶液并在450nm下測定OD。
在轉基因小鼠身上幾乎沒有產生反應，而在使用EA組中發(fā)生了與對照組類似的T/B細胞反應(附圖3)。
實施例3觀察e抗原轉基因小鼠體內e抗原和e抗體的生成培養(yǎng)e抗原轉基因小鼠并進行e抗原免疫，兩周之后再次進行免疫。之后，以三、四、五、六周為間隔取小鼠血液，分離血清之后，利用EnzygnostHBeAg ELISA試劑盒(DADE BEHRING)測定e抗原和e抗體。
在用鞣花酸處理的轉基因小鼠組中，在抑制e抗原的生成的同時產生了e抗體，但未用鞣花酸處理的小鼠不但持續(xù)分泌e抗原，而且也沒有產生抗體(附圖4、5)。
實施例4觀察e抗原轉基因小鼠的IgG同型(isotype)培養(yǎng)e抗原轉基因小鼠并進行e抗原免疫，兩周之后再次進行免疫，并在兩周之后取脾臟。所述的脾臟通過與T/B細胞試驗相同的方法進行分離之后，于96穴培養(yǎng)皿中用HBeAg(0.05ug/ml)處理并培養(yǎng)7天。7天之后，分離上清液并用ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping試劑盒I(PIERCE)測定是否同型。結果標明，轉基因小鼠組中沒有產生IgG型的抗體，但鞣花酸處理組產生了IgG型抗體(附圖6)。
實施例5觀察e抗原轉基因小鼠的CTL應答培養(yǎng)e抗原轉基因小白鼠并進行e抗原免疫，兩周之后再次進行免疫，并在兩周之后取脾臟。用上述方法從脾臟分離細胞后作為效應細胞(effector cell)使用，靶細胞(target cell)采用e抗原轉染的EL4細胞系。
將分離出的脾細胞中添加e抗原并進行一夜時間的再刺激(restimulation)后，第二天早晨將效應細胞與靶細胞之比分別調節(jié)為100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1后進行4-5小時的反應。然后，于上層各取100ul并添加LDH細胞毒性檢測試劑盒(TAKARA)的溶液，進行LDH試驗。
在轉基因小鼠組中發(fā)生了微弱的CTL應答，而鞣花酸處理組的小鼠發(fā)生了更為亢進的反應(附圖7)。
實施例6觀察e抗原轉基因小鼠體內細胞因子的生成在按上述方法分離的脾臟中，觀察IL-4、IFN-γ細胞因子發(fā)生何種變化。將所分離的脾臟細胞和與e抗原一起培養(yǎng)七天，在第4天和第7天取其上清液。之后用Titer Zyme EIA(Assay Desings，Inc)的IL-4、IFN-γ試劑盒對細胞因子進行定量測定。結果，在轉基因小鼠組中幾乎沒有發(fā)生反應，但鞣花酸處理組明顯的生成了細胞因子，而且輔助T細胞反應也相當活躍(附圖8、9)。
實施例7肝硬化動物模型中血清因子的變化將wister大鼠中用CCl4處理十三周，形成肝硬化動物模型。然后，施用鞣花酸4周。之后，取血并用酶聯(lián)免疫吸附分析法實施血液檢查。
用CCl4進行處理后，因為ALT、AST、膽固醇(colesterole)數值顯著上升，加劇了肝的損傷程度，而且發(fā)生了纖維化現(xiàn)象。另外，鞣花酸處理組中，上述數值幾乎達到了正常水平(附圖10)。
實施例8肝硬化動物模型中肝星狀細胞的變化從肝硬化組、經鞣花酸處理的肝硬化組和正常組等三組中分離出各自的肝，并對其進行兩步膠原酶灌注，然后用Nycodenz(Sigma)進行離心分離，分離出肝星狀細胞。之后在DMEM介質中培養(yǎng)并用MTT試驗觀察增殖的程度。與預計相同，發(fā)生肝硬化的肝星狀細胞產生了活躍的增殖。與之相比，鞣花酸處理組只產生了非常微弱的增殖(附圖11)。
如上所述，本發(fā)明的鞣花酸衍生物，可在不影響肝炎病毒的DNA整合酶活性的情況下大大抑制維持慢性肝炎狀態(tài)的e抗原的分泌，而且毒性較低，因此可用于乙型肝炎患者，尤其是免疫力低下的慢性肝炎患者的治療。
權利要求
1.一種用于預防和/或治療乙型肝炎和肝硬化的藥物組合物，其中含有化學式1所示結構的鞣花酸衍生物或其藥用鹽作為有效成分 <化學式1>其中R1、R2、R3和R4相互獨立的是H、OH或C1～C3的烷氧基。
2.按照權利要求1所述的用于預防和/或治療乙型肝炎和肝硬化的藥物組合物，其中所述的鞣花酸衍生物為其中的R1、R2、R3和R4均為OH的下述化學式2所示的鞣花酸 <化學式2>。
3.免疫增進劑，所述的免疫增進劑以一種權利要求1所述的鞣花酸衍生物或其藥用鹽，或其一種以上的混合物作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預防和/或治療乙型肝炎、肝硬化的，以化學式1所示結構的鞣花酸衍生物為有效成分的藥物組合物，在所述化學式1中，R
文檔編號A61P31/00GK1857259SQ20051006831
公開日2006年11月8日 申請日期2005年4月30日 優(yōu)先權日2005年4月30日
發(fā)明者李永翊, 姜銀華 申請人:韓國生命工學研究院