專利名稱：藤梨根抗腫瘤提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種藤梨根抗腫瘤提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
藤梨根為獼猴桃科落葉大藤本獼猴桃(Actinidia chinensis Planch.)的根，具有解毒活血、清熱利濕之功效。陳貫誠等人在“獼猴桃”，中藥材科技，1981，4(1)30中指出，藤梨根含熊果酸、齊墩果酸、維生素C、糖類、色素及氨基酸。陳德軒等人在“抗腫瘤植物藥藤梨根”，中藥材，2004，27(2)86～87中報道，藤梨根具有抗癌作用，其乙醇提取物的腹腔給藥對S180的抑制率為30～40％。鄒益友等人在“獼猴桃根抑制腫瘤細胞的實驗研究”，湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報，1999，5(4)37～38中，對藤梨根的成分進行研究，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯提取物對白血病細胞和結(jié)腸癌低分化腺癌細胞的抑制率分別達到54％和60％。李昊，楊慧萍，楊凡等人在“藤梨根對胃癌抑制的實驗研究”，河北中醫(yī)，2004，26(4)314～315中研究報道，藤梨根的乙酸乙酯提取物在1.3mg/ml濃度時對胃癌細胞的抑瘤率達88.19％，但未對其抗腫瘤有效部位和成分分離方法作進一步的研究。
公開號為CN1478495A、CN1093594A的中國發(fā)明專利公開了藤梨根配伍其它中藥用于抗癌癥治療，但其有效成分分離及腫瘤治療應(yīng)用未見相關(guān)專利，也沒有關(guān)于藤梨根抗腫瘤有效部位和成分分離方法、制劑技術(shù)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，提供一種可有效地純化中藥藤梨根的有效部位、便于工業(yè)化生產(chǎn)的藤梨根抗腫瘤提取物制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述方法制備的藤梨根抗腫瘤提取物。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種上述藤梨根抗腫瘤提取物的用途。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)本藤梨根抗腫瘤提取物的制備方法包括下述步驟(1)用水或有機溶劑在70～100℃溫度下浸提藤梨根藥材，得到浸出液；(2)將浸出液減壓濃縮至熱比重1.03～1.1，也可以是常壓濃縮。然后將pH值調(diào)節(jié)至2～5，靜置、沉淀，取得上清液；(3)用乙酸乙酯萃取上清液，回收溶劑，得到萃取物；(4)將萃取物進行聚酰胺層析，再用溶劑洗脫，得到洗脫液；(5)將洗脫液濃縮、回收溶劑、干燥，得到藤梨根抗腫瘤提取物。
步驟(1)中，所述有機溶劑為30～70％(V/V)乙醇；所述藤梨根藥材可為藤梨根塊狀物或粉碎物；所述浸提溫度優(yōu)選70～80℃。
步驟(1)中，所述浸提次數(shù)為1～3次；每次浸提時間為1～2小時；第一次浸提的藤梨根與水或有機溶劑的重量比為1∶8～10；第二次和第三次浸提的藤梨根與水或有機溶劑的重量比為1∶4～5。
步驟(2)中，采用酸性試劑來調(diào)節(jié)浸出液的pH值，優(yōu)選鹽酸或醋酸；所述沉淀可采用過濾或離心分離沉淀。
步驟(3)中，所述乙酸乙酯的用量為上清液的1～3倍體積量。
步驟(4)中，可將萃取物水溶后再進行聚酰胺層析。
步驟(4)中，可將萃取物醇溶后再進行聚酰胺層析。
步驟(4)中，可將萃取物與少量聚酰胺混合，再進行聚酰胺層析。
步驟(4)中，可將萃取物醇溶后并與少量聚酰胺混合，再進行聚酰胺層析。
步驟(4)中，所述溶劑的濃度為0～80％(V/V)；優(yōu)選30～70％(V/V)乙醇；所述溶劑洗脫為乙醇或丙酮梯度洗脫，分部收集得到洗脫液。
步驟(5)中，所述干燥可為真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。
采用上述方法制備得到藤梨根抗腫瘤提取物；所制備的藤梨根抗腫瘤提取物有效成分(蒽醌類)含量可達80～90％。
該藤梨根抗腫瘤提取物作為活性成分與可接受的藥物載體結(jié)合制成可用于治療各種腫瘤的口服或注射單方以及復(fù)方制劑。如以淀粉等為輔料制成的片劑、以微晶纖維素為輔料制成的膠囊劑、以甘露醇為支架制成的注射劑等。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點和效果(1)本發(fā)明對原料藥材采用高溫、多次、長時間浸提，浸提效果好，原料藥材中抗腫瘤有效成分轉(zhuǎn)移率高；
(3)采用調(diào)酸法除去酸不溶物，提高萃取效果，產(chǎn)品純度高；(4)采用聚酰胺精制提取活性成分，有效純化藤梨根抗腫瘤有效部位，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1將1Kg的藤梨根藥材，加入8L的水，保持在100℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入4L的水，保持在100℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；合并兩次浸出液。
將浸出液濃縮至熱比重1.05(5L)，用10％鹽酸將浸出液的pH值調(diào)至2，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；用5L的乙酸乙酯萃取上清液2次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得到萃取物；將萃取物用等倍體積量水溶解，上樣聚酰胺柱進行層析，再用30～70％乙醇進行梯度洗脫，分部收集洗脫液；最后將70％乙醇洗脫液減壓濃縮、回收乙醇，再真空干燥，得到28g的藤梨根抗腫瘤提取物。其蒽醌類的含量為87％。
實施例2將1Kg的藤梨根藥材粉碎成粗粉，加入9L的水，保持在90℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入5L的水，保持在90℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；合并兩次浸出液。
將浸出液濃縮至熱比重1.05(6L)，用5％鹽酸將浸出液的pH值調(diào)至3，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；用12L的乙酸乙酯萃取上清液2次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得到萃取物；將萃取物用等倍體積量乙醇溶解，與2倍重量聚酰胺拌樣，上樣聚酰胺柱進行層析，再用0～50％乙醇進行梯度洗脫，分部收集洗脫液；最后將50％乙醇洗脫液常壓濃縮回收乙醇，再噴霧干燥，得到30g的藤梨根抗腫瘤提取物。其蒽醌類的含量為83％。
實施例3將1Kg的藤梨根藥材粉碎成粗粉，加入10L的水，保持在80℃溫度下浸提120分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入5L的水，保持在80℃溫度下浸提120分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；再在濾渣中加入5L的水，保持在80℃溫度下浸提120分鐘，然后過濾得到第三次浸出液；合并三次浸出液。
將浸出液濃縮至熱比重1.03(10L)，用20％醋酸將浸出液的pH值調(diào)至5，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；用10L的乙酸乙酯萃取上清液1次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得到萃取物；將萃取物用等體積量水溶解，上樣聚酰胺柱進行層析，再用30～80％乙醇進行梯度洗脫，分部收集洗脫液；最后將80％乙醇洗脫液減壓濃縮回收乙醇，再冷凍干燥，得到35g的藤梨根抗腫瘤提取物。其蒽醌類的含量為90％。
實施例4將1Kg的藤梨根藥材粉碎成粗粉，加入10L的30％乙醇，保持在70℃溫度下浸提120分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入5L的30％乙醇，保持在70℃溫度下浸提120分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；合并二次浸出液。
將浸出液濃縮至熱比重1.03(8L)，用20％醋酸將浸出液的pH值調(diào)至5，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；用24L的乙酸乙酯萃取上清液1次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得到萃取物；將萃取物用等體積量水溶解，上樣聚酰胺柱進行層析，再用30～80％丙酮進行梯度洗脫，分部收集洗脫液；最后將80％丙酮洗脫液常壓濃縮回收丙酮，再冷凍干燥，得到33g的藤梨根抗腫瘤提取物。其蒽醌類的含量為92％。
實施例5將1Kg的藤梨根藥材，加入9L的50％乙醇，保持在80℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入5L的50％乙醇，保持在80℃溫度下浸提90分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；合并二次浸出液。
將浸出液濃縮至熱比重1.03(6L)，用5％鹽酸將浸出液的pH值調(diào)至3，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；用12L的乙酸乙酯萃取上清液2次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得到萃取物；將萃取物用等體積量乙醇溶解，上樣聚酰胺柱進行層析，再用0～70％乙醇進行梯度洗脫，分部收集洗脫液；最后將洗70％乙醇脫液減壓濃縮回收乙醇，再噴霧干燥，得到30g的藤梨根抗腫瘤提取物。其蒽醌類的含量為89％。
實施例6將1Kg的藤梨根藥材，加入8L的70％乙醇，保持在70℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第一次浸出液；再在濾渣中加入4L的70％乙醇，保持在70℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第二次浸出液；再在濾渣中加入4L的70％乙醇，保持在70℃溫度下浸提60分鐘，然后過濾得到第三次浸出液；合并三次浸出液。
將浸出液濃縮至熱比重1.05(6L)，用10％鹽酸將浸出液的pH值調(diào)至2，然后靜置、離心去沉淀，取得上清液；用6L的乙酸乙酯萃取上清液3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得到萃取物；將萃取物用等重量聚酰胺拌樣，上樣聚酰胺柱進行層析，再用0～70％丙酮進行梯度洗脫，分部收集洗脫液；最后將70％丙酮洗脫液常壓濃縮回收丙酮，再真空干燥，得到36g的藤梨根抗腫瘤提取物。其蒽醌類的含量為94％。
實施例7藤梨根有效部位抑制腫瘤的細胞實驗方法將腫瘤細胞(2×106/ml)，放入無菌的96孔培養(yǎng)平板，每孔加腫瘤細胞懸液50μl，加含15％小牛血清的1640培養(yǎng)液50μl，加入實施例1～3制備的藤梨根抗腫瘤提取物的水溶液10μl，每組3孔，孔內(nèi)加等量的生理鹽水振蕩混勻，然后放入5％的CO2培養(yǎng)箱(37℃)培養(yǎng)24h，加入四唑鹽(MTT)磷酸緩沖液，每孔10μl(每ml含MTT5mg)繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后加二甲砜100ml，終止反應(yīng)，用酶膠免疫檢測儀，分別于波長570nm，630nm處測定光密度OD值，計算結(jié)果。
計算公式 結(jié)果在胃癌RF細胞株和直腸癌LS174T細胞株腫瘤細胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，藤梨根抗腫瘤提取物對兩種腫瘤的抑制率顯著高于其藥材的水提取物(未經(jīng)過調(diào)酸、萃取和聚酰胺層析的水提濃縮液)，隨著劑量遞增，抑瘤效果提高。結(jié)果見附表1。
附表1藤梨根有效部位對胃癌和直腸癌細胞的抑制實驗

實施例8藤梨根有效部位抑制腫瘤的動物實驗方法取小鼠S180瘤塊，勻漿后稀釋并調(diào)整細胞數(shù)(1×107/ml)，以0.2ml注入小鼠右腋皮下，24小時后隨機分組給藥，其中，將生理鹽水作為對照組灌胃給藥；CTX(環(huán)磷酰胺)組腹腔給藥；藤梨根藥材的水提取物(未經(jīng)過調(diào)酸、萃取和聚酰胺層析的水提濃縮液)和實施例3、6制備的藤梨根抗腫瘤提取物均為灌胃給藥，于第11天稱重處死小鼠取瘤塊，稱瘤重和測瘤體積，計算抑瘤率。
結(jié)果藤梨根藥材的水提取物對S180抑瘤率為33.6％，而等劑量的本發(fā)明制備的藤梨根抗腫瘤提取物的抑瘤率為64.6％，與對照組有顯著差異，而與CTX的差異不顯著，提示它具有良好的抗腫瘤作用。結(jié)果見附表2。
附表2藤梨根有效部位對S180肉瘤的抑制動物實驗

權(quán)利要求
1.一種藤梨根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用水或有機溶劑在70～100℃溫度下浸提藤梨根藥材，得到浸出液；(2)將浸出液減壓濃縮至熱比重1.03～1.1，也可以是常壓濃縮；然后將pH值調(diào)節(jié)至2～5，靜置、沉淀，取得上清液；(3)用乙酸乙酯萃取上清液，回收溶劑，得到萃取物；(4)將萃取物進行聚酰胺層析，再用溶劑洗脫，得到洗脫液；(5)將洗脫液濃縮、回收溶劑、干燥，得到藤梨根抗腫瘤提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藤梨根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述有機溶劑為30～70％乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藤梨根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述浸提溫度為70～80℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藤梨根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(1)中，所述浸提次數(shù)為1～3次；每次浸提時間為1～2小時；第一次浸提的藤梨根與水或有機溶劑的重量比為1∶8～10；第二次和第三次浸提的藤梨根與水或有機溶劑的重量比為1∶4～5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藤梨根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(2)中，采用鹽酸或醋酸調(diào)節(jié)浸出液的pH值。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藤梨根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(3)中，所述乙酸乙酯的用量為上清液的1～3倍體積量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藤梨根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中，先將萃取物水溶、或醇溶、或與少量聚酰胺混合、或醇溶后再與少量聚酰胺混合，然后再進行聚酰胺層析。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藤梨根抗腫瘤提取物的制備方法，其特征在于步驟(4)中，采用溶劑梯度洗脫，分部收集得到洗脫液；所述溶劑為30～70％乙醇或丙酮。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1～8任一項所述方法制備的藤梨根抗腫瘤提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藤梨根抗腫瘤提取物的應(yīng)用，其特征在于將藤梨根抗腫瘤提取物作為活性成分與可接受的藥物載體結(jié)合制成用于治療各種腫瘤的口服或注射單方以及復(fù)方制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藤梨根抗腫瘤提取物及其制備方法和用途。該藤梨根抗腫瘤提取物可通過水或有機溶劑在70～100℃溫度下浸提、然后減壓濃縮、調(diào)酸、萃取、聚酰胺層析、溶劑洗脫，濃縮干燥制得。該藤梨根抗腫瘤提取物可作為活性成分與可接受的藥物載體制成用于治療各種腫瘤的口服或注射單方以及復(fù)方制劑。本發(fā)明浸提效果好，原藥材中抗腫瘤有效成分轉(zhuǎn)移率高；采用調(diào)酸法除去酸不溶物，提高萃取效果，產(chǎn)品純度高；采用聚酰胺精制提取活性成分的精制，有效純化藤梨根抗腫瘤有效部位，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P35/00GK1679797SQ200510032668
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月4日
發(fā)明者葉勇 申請人:華南理工大學(xué)