專利名稱：乙型肝炎病毒表面l蛋白相關(guān)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療乙型肝炎病毒(human hepatitis B virus，HBV)感染的HBV表面L蛋白衍生肽、去除這些多肽抗原性的篩選方法以及通過該方法篩選得到的去抗原性衍生肽。特別是本發(fā)明涉及來(lái)源于B基因型adw血清型、C基因型adr血清型以及D基因型ayw血清型HBV的L蛋白pre-S1區(qū)多肽。同樣特別地，本發(fā)明涉及去除HBV表面L蛋白衍生肽抗原性的篩選方法以及通過該方法獲得的可阻斷HBV感染卻不與抗體結(jié)合的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽。該去抗原性衍生肽可與抗HBV表面L蛋白抗體協(xié)同抑制HBV感染。
背景技術(shù)：
1.HBV的流行病學(xué)HBV感染是全球最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，是僅次于性病和水痘的第三常見疾病。全球約有20億人感染過HBV，75％的世界人口生活在乙型肝炎高發(fā)區(qū)，慢性HBV感染者超過3.5億。每年與HBV感染相關(guān)的死亡人數(shù)高達(dá)100萬(wàn)(1)，每年新增感染估計(jì)是HIV新增感染的2.5～4倍。世界上75％的HBV慢性感染者集中在亞洲(約為2.87億)，中國(guó)是乙型肝炎的高流行區(qū)，70年代末和90年代初兩次全國(guó)肝炎流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)感染過HBV者6.9億，感染率為57.6％，全國(guó)長(zhǎng)期攜帶HBV者1.2億，HBV表面抗原攜帶率9.75％，現(xiàn)有的慢性乙型肝炎患者2000余萬(wàn)，且自1995年開始，中國(guó)人群乙型肝炎發(fā)病比例呈逐年升高趨勢(shì)，因此在衛(wèi)生部《2005年衛(wèi)生工作要點(diǎn)》中已將乙型肝炎列入我國(guó)需要重點(diǎn)控制的四大疾病之一。
2.HBV感染的預(yù)防與治療現(xiàn)狀HBV的重要性早已在世界范圍內(nèi)得到廣泛公認(rèn)，其預(yù)防和治療也被置于優(yōu)先地位。但迄今尚缺乏可清除體內(nèi)HBV的藥物，療效相對(duì)確切的抗病毒藥物主要是α干擾素和核苷類似物(拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和特必夫定等)。α干擾素主要通過免疫調(diào)節(jié)和誘生靶細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白而發(fā)揮抗病毒作用；核苷類似物則作用于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶，抑制病毒DNA鏈的合成，從而抑制HBV DNA的復(fù)制。經(jīng)過1年的標(biāo)準(zhǔn)療程治療，約33％的α干擾素治療患者和約16％的拉米夫定治療患者可獲得徹底或部分血清學(xué)應(yīng)答(HBsAg轉(zhuǎn)陰、HBeAg均轉(zhuǎn)陰、出現(xiàn)或不出現(xiàn)抗-HBe抗體)、完全的病毒學(xué)應(yīng)答(HBV DNA轉(zhuǎn)陰)和生化應(yīng)答(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶間隔1個(gè)月連續(xù)2次檢測(cè)均正常，肝功能復(fù)常)。
自從1970年Krugman獲得最早的乙型肝炎疫苗后，各國(guó)相繼利用無(wú)癥狀HBsAg攜帶者的血漿提取血源性HBsAg制備HBV疫苗。血源性HBV疫苗經(jīng)過長(zhǎng)期使用被證明安全有效，但由于其來(lái)源有限，制備成本高昂，已被基因重組HBV疫苗取代。目前主要的重組疫苗包括酵母和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)的重組乙肝疫苗。這些疫苗免疫原性強(qiáng)，3針全程免疫后抗HBsAg抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率不低于85％。但其主要缺點(diǎn)是抗體應(yīng)答較遲，HBV感染產(chǎn)婦的新生兒初次免疫若超過7天以上，則失去HBV疫苗對(duì)新生兒阻斷垂直傳播的作用。而且10％～15％接種者不產(chǎn)生應(yīng)答或低應(yīng)答，該人群仍可被HBV感染。
乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)系用經(jīng)乙型肝炎疫苗免疫健康人后，采集的高效價(jià)血漿或血清分離提取制備的免疫球蛋白制劑，其抗體效價(jià)在100IU/ml以上。適用于突發(fā)意外感染人群、免疫功能低下者以及HBV感染產(chǎn)婦新生兒的被動(dòng)免疫預(yù)防。我國(guó)的慢性HBV感染者約有30％-50％通過母嬰傳播，為阻斷HBV母嬰圍產(chǎn)期傳播，普遍將HBIG與乙肝疫苗聯(lián)合應(yīng)用，雖然保護(hù)率可達(dá)80％以上，但HBIG提供的阻斷貢獻(xiàn)并不明顯，聯(lián)合應(yīng)用僅較乙肝疫苗單用提高5％～10％的阻斷率，而且聯(lián)合應(yīng)用后HBV感染產(chǎn)婦新生兒HBV感染率仍較健康產(chǎn)婦新生兒高4倍。近年發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)感染可能是母嬰傳播的重要途徑，HBV感染孕婦引產(chǎn)胎兒肝臟或血液的HBV感染標(biāo)志檢出率可達(dá)40％，HBsAg陽(yáng)性母親的嬰兒的宮內(nèi)感染率約16％。因此國(guó)內(nèi)有些醫(yī)院在妊娠的最后3～4個(gè)月中對(duì)HBV感染孕婦每月一次注射大于200IU的HBIG，以期預(yù)防胎兒HBV宮內(nèi)感染。但該方法宮內(nèi)傳播阻斷效果并不理想，且可能導(dǎo)致HBV S區(qū)變異株的出現(xiàn)和免疫復(fù)合物病理免疫反應(yīng)的發(fā)生。
HBIG還廣泛應(yīng)用于乙型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后HBV感染復(fù)發(fā)的預(yù)防。在沒有預(yù)防措施的情況下，乙型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后6個(gè)月內(nèi)HBV再感染率高達(dá)約40％，2年內(nèi)再感染率高達(dá)約60％。多數(shù)再感染病例歷經(jīng)急性、慢性肝炎而發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭，遠(yuǎn)期預(yù)后不佳，需再次肝移植。單獨(dú)采用拉米夫定預(yù)防肝移植術(shù)后乙型肝炎復(fù)發(fā)，其長(zhǎng)期HBV-DNA、HBeAg及HBsAg轉(zhuǎn)陰率約60～70％，且易發(fā)生HBV基因突變，YMDD耐藥變異率高達(dá)21％。加之患者移植前多長(zhǎng)期使用抗病毒藥物，多數(shù)出現(xiàn)抗病毒藥物抵抗現(xiàn)象，增加了移植后病毒感染復(fù)發(fā)率和預(yù)防的難度。因此國(guó)外加用大劑量HBIG以預(yù)防乙型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)。肝移植術(shù)后沒有接受HBIG治療的受者中，術(shù)后早期體內(nèi)出現(xiàn)不同滴度的HBsAb，隨后血清HBsAb逐漸消失，而使用HBIG的患者血清HBsAb能長(zhǎng)期維持較高滴度。高劑量無(wú)限制性HBIG單一治療能阻止65％～80％患者復(fù)發(fā)，但HBIG價(jià)格昂貴，費(fèi)用每年高達(dá)約130萬(wàn)元人民幣。國(guó)內(nèi)采用拉米夫定與小劑量HBIG聯(lián)合應(yīng)用阻止移植后HBV感染復(fù)發(fā)的療效雖然顯示良好，但未經(jīng)大樣本臨床試驗(yàn)證實(shí)。且長(zhǎng)期應(yīng)用HBIG帶來(lái)的免疫壓力會(huì)造成HBV基因變異而出現(xiàn)免疫逃逸現(xiàn)象，使HBIG用于乙型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后HBV再感染的預(yù)防受到很大限制。
綜上所述，目前用于防治HBV感染的手段主要限于核苷酸類似抑制物、抗病毒細(xì)胞因子和中和性抗體的主動(dòng)被動(dòng)免疫，缺少對(duì)HBV病毒其他感染環(huán)節(jié)的抑制手段。本發(fā)明所涉及的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽則可直接作用于HBV與肝細(xì)胞表面受體結(jié)合的最初感染環(huán)節(jié)，直接阻斷病毒對(duì)肝細(xì)胞的感染，為HBV感染的治療和預(yù)防提供新的手段。
3.HBV病毒學(xué)1)概述HBV屬嗜肝DNA病毒科非細(xì)胞溶破性病毒。其基因組為部分雙鏈的環(huán)狀DNA，僅長(zhǎng)約3.2kb，是已知最小的DNA病毒。高度重疊的4個(gè)基因區(qū)編碼至少8種蛋白，即S區(qū)基因編碼的L、M、S表面抗原HBs；C基因編碼的pre-C、HBc、HBe；P基因編碼的聚合酶和X基因編碼的HBx。通常情況下HBV的感染和復(fù)制不引起肝細(xì)胞明顯的病理性改變，產(chǎn)生的病毒顆粒以分泌方式釋放。HBV產(chǎn)生的相關(guān)顆粒主要有3種形態(tài)，包括直徑42-47nm的Dane顆粒、豐度高于Dane顆粒10,000-1,000,000倍的20nm球狀顆粒和少量直徑20nm長(zhǎng)度不等的絲狀纖維。其中只有Dane顆粒由基因組DNA、病毒DNA聚合酶、核衣殼和被膜構(gòu)成，是HBV唯一具有感染活性的病毒性顆粒。
2)HBV基因型、血清型及其流行病學(xué)分布目前HBV存在血清型和基因型兩種不同的分型體系。1972年Lebouvier等根據(jù)HBV表面蛋白HBsAg的共同抗原決定簇a以及相互排斥的兩對(duì)抗原決定簇d/y和w/r，將HBV分為adw，adr，ayw和ayr四個(gè)血清型。1978年Courouce Pauty等又將抗原決定簇w分為w1～4，加上新發(fā)現(xiàn)的抗原決定簇q，將HBV進(jìn)一步分為ayw1，ayw2，ayw3，ayw4，ayr，adw2，adw4，adrq+和adrq-等9個(gè)血清型(2)。1988年以來(lái)，依據(jù)HBV全基因系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果，以全基因核苷酸異源性≥8％為分型標(biāo)準(zhǔn)，將HBV分為8個(gè)基因型(A～H)(3，4)。各基因型之間的組合還可產(chǎn)生A/D、B/C、Ba和Bj等1不同重組體。HBV血清型和基因型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表1。
雖然HBV感染在世界各地均有不同程度的流行，國(guó)家間和國(guó)內(nèi)地區(qū)間卻存在非常明顯的差異(表1)。我國(guó)A、B、C、D等基因型HBV感染均呈不同程度的存在，北方地區(qū)以C基因型為主，由北至南B基因型感染率逐漸增高，深圳B基因型和C基因型感染率比例相當(dāng)，西藏等少數(shù)民族地區(qū)D基因型有較高的感染率。我國(guó)adr、adw2、ayr、ayw1、ayw2和ayw3等血清型HBV均有分布，但以adr和adw2為優(yōu)勢(shì)血清型。在我國(guó)B基因型與adw2血清型、C基因型與adr血清型存在明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。
表1.HBV基因型和血清學(xué)亞型、HBV蛋白、PC/BCP突變的關(guān)系及主要流行地域

4.介導(dǎo)HBV感染的表面L蛋白關(guān)鍵氨基酸序列及其衍生肽抑制病毒感染的機(jī)理HBV病毒包膜含有大(L)、中(M)、小(S)三種表面抗原蛋白，這些蛋白由具有3個(gè)不同翻譯起始位點(diǎn)的S區(qū)基因單一開放閱讀框編碼，即L(Pre-S1+Pre S2+S)、M(Pre S2+S)和S(S)。HBV S基因區(qū)801個(gè)堿基編碼S蛋白266個(gè)氨基酸，Pre-S2區(qū)165個(gè)堿基編碼M蛋白另外的55個(gè)氨基酸。Pre-S1區(qū)在A、B、C、F和H基因型為357個(gè)堿基，編碼L蛋白另外的119個(gè)氨基酸。D、G基因型在該區(qū)分別缺失33個(gè)和3個(gè)堿基，分別編碼L蛋白N末端的108和118個(gè)氨基酸。三種表面蛋白的表達(dá)量差異懸殊，且分布方式顯著不同。S蛋白表達(dá)量高，是HBV感染患者循環(huán)血中HBs的主要蛋白，而M和L蛋白則含量甚微，分別只占全部HBs蛋白的5～15％和1～2％。20nm球狀顆粒和絲狀纖維的包膜蛋白主要由S蛋白和數(shù)量不等的M蛋白組成，幾乎不含L蛋白，而Dane顆粒包膜的蛋白則主要為L(zhǎng)蛋白。
HBV的L蛋白Pre-S1區(qū)存在與肝細(xì)胞特異性受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸序列，定位于Pre-S1的第2到第77位氨基酸，Pre-S2區(qū)對(duì)病毒感染不發(fā)揮關(guān)鍵作用。L蛋白合成后在第2位甘氨酸進(jìn)行豆蔻?；g后修飾，如果該位置以不能被豆蔻?；谋彼崽娲拾彼?，其L蛋白則不能被翻譯后修飾，相應(yīng)的突變病毒株也即失去了對(duì)肝細(xì)胞的感染能力，可見L蛋白的翻譯后豆蔻酰化修飾對(duì)病毒感染的重要性。L蛋白特異地存在于Dane顆粒表面，而幾乎不存在于20nm顆粒和絲狀纖維，如此既可以避免20nm顆粒對(duì)肝細(xì)胞感染受體的競(jìng)爭(zhēng)，又可以利用20nm顆粒吸引體內(nèi)抗HBV表面蛋白的抗體，便于感染性Dane顆粒逃脫體液免疫的病毒清除作用。
依據(jù)競(jìng)爭(zhēng)原理，來(lái)自L蛋白2-78位氨基酸的N末端豆蔻酰化修飾短肽可以阻斷HBV對(duì)肝細(xì)胞和Hepa RG肝細(xì)胞系的感染，該短肽可進(jìn)一步縮短至L蛋白的2-48位氨基酸。鴨乙型肝炎病毒DHBV表面L蛋白preS第2到第41位氨基酸對(duì)應(yīng)的多肽對(duì)DHBV的感染也存在類似的阻斷效應(yīng)。狨猴乙型肝炎病毒W(wǎng)MHBV來(lái)源的類似短肽也可對(duì)HBV感染發(fā)揮交叉阻斷效應(yīng)。Pre-S1的該段序列具有很高的抗原性，含有與MA18/7、5a19等抗體結(jié)合的氨基酸序列。這些抗體可中和HBV病毒，阻斷病毒對(duì)人肝細(xì)胞、樹鼩(T.belangeri)肝細(xì)胞和Hepa RG肝細(xì)胞系的感染。其機(jī)理可能是抗體與該段序列結(jié)合，阻斷了L蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)，從而抑制了HBV對(duì)細(xì)胞的感染。臨床資料也證實(shí)，乙型肝炎病毒感染患者體內(nèi)可產(chǎn)生抗preS1抗體，且其出現(xiàn)與乙型肝炎的臨床預(yù)后密切相關(guān)。preS1抗體常出現(xiàn)于急性自限性HBV感染，而少見于慢性HBV感染病人，提示該類抗體在清除HBV和控制HBV感染慢性化過程中發(fā)揮重要作用。
5.本發(fā)明的意義和應(yīng)用的前景目前治療HBV慢性感染的藥物均作用于HBV細(xì)胞內(nèi)復(fù)制環(huán)節(jié)，而HBV表面L蛋白多肽可直接抑制HBV對(duì)細(xì)胞的感染，為HBV感染的防治提供新的策略。但是該類短肽具有強(qiáng)烈的抗原性，存在與中和性抗體結(jié)合的氨基酸序列，同時(shí)該段序列系HBV結(jié)合感染受體必須位點(diǎn)，也即L蛋白多肽抑制HBV對(duì)細(xì)胞感染受體的結(jié)合的關(guān)鍵序列?；颊唧w內(nèi)存在與該序列結(jié)合的中和性抗體，應(yīng)用該類多肽對(duì)HBV感染患者治療時(shí)，多肽將與抗體相結(jié)合，使多肽失去與肝細(xì)胞表面HBV受體結(jié)合的作用，阻礙多肽抑制HBV感染的效力。另一方面，與多肽的結(jié)合消耗了體內(nèi)的中和性抗體，反而有利于HBV的感染。此外還可能產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物免疫病理等其他不良反應(yīng)。
本發(fā)明一方面提供了東南亞(特別是中國(guó))廣泛流行的B基因型adw血清型、C基因型adr血清型HBV表面L蛋白13-59氨基酸序列多肽和D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白2-47氨基酸序列多肽對(duì)HBV感染的抑制作用，另一方面提供了去除HBV表面L蛋白多肽抗原性的篩選方法，并通過篩選獲得了可阻斷HBV感染卻又不與抗HBV表面L蛋白抗體結(jié)合的去抗原衍生肽。本發(fā)明還提供了該去抗原性衍生肽與抗HBV表面L蛋白抗體對(duì)HBV感染的協(xié)同抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明涉及一種HBV表面L蛋白的多肽，該多肽具有通式X-Y-Z，其中，X表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第1到第12個(gè)氨基酸序列，或自該序列N末端縮短的序列，或完全缺失，其中，X的N末端可被修飾；Y表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第13到第59個(gè)氨基酸序列，其中，Y的N末端和/或C末端可被修飾；Z表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第60到第89氨基酸序列，或自該序列C末端縮短的序列，或完全缺失，其中，Z的C末端可被修飾。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述Y序列的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻酰化修飾。在另一些實(shí)施例中，所述多肽選自SEQ ID NO2-7，其中SEQ ID NO3-7的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻?；揎?。
第二方面，本發(fā)明涉及一種HBV表面L蛋白的多肽，該多肽具有通式x-y-z，其中，x表示甲硫氨酸，其可被修飾，或者x不存在；y表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白的第2到第32個(gè)氨基酸序列，其中，y的N末端和/或C末端可被修飾；z表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白第33到第47氨基酸序列，或自該序列C末端縮短的序列或完全缺失，其中，z的C末端可被修飾。
在一個(gè)實(shí)施例中，該y序列的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻?；揎?。在另一實(shí)施例中，該多肽的序列為第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻?；揎椀腟EQ ID NO9。
第三方面，本發(fā)明涉及一種蛋白去抗原性衍生肽的篩選方法，用于去除抗原性而保留蛋白的特定屬性，該方法包括(A)在待篩選的病毒蛋白中引入隨機(jī)序列，建立該蛋白特定區(qū)域或全部蛋白隨機(jī)編碼的重組病毒庫(kù)；(B)在待篩選蛋白抗體存在的條件下，篩選仍具有感染能力的重組病毒亞群，并獲得該重組病毒亞群中該蛋白的氨基酸序列，即獲得該蛋白去抗原性候選肽序列；(C)按獲得的去抗原性候選肽序列合成相應(yīng)的去抗原性候選肽，篩選可調(diào)節(jié)病毒感染能力卻不與該病毒蛋白抗體結(jié)合的去抗原性的多肽，即獲得蛋白去抗原性衍生肽。
第四方面，本發(fā)明還涉及一種HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，它通過本發(fā)明第三方面所述的篩選蛋白去抗原性衍生肽的方法對(duì)本發(fā)明的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白多肽進(jìn)行篩選而得到，它具有通式α-β式中，α表示HBV表面L蛋白的第1到13位氨基酸序列，或自該序列N末端縮短的序列或僅為第13位氨基酸甘氨酸，其中，所述N末端和/或第13位氨基酸甘氨酸可被修飾；β表示應(yīng)用本發(fā)明第三方面所述的篩選方法對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到第58氨基酸序列進(jìn)行篩選獲得的氨基酸序列，其中，所獲得的氨基酸序列的N末端可被修飾和/或其C末端可被縮短或修飾。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，它含有本發(fā)明第一方面或第二方面所述的HBV表面L蛋白的多肽或第四方面所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，和藥學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物還可含有其他抗病毒物質(zhì)，如抗HBV抗體、細(xì)胞因子等。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述的HBV表面L蛋白的多肽或HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽在制備預(yù)防和/或治療乙型肝炎的藥劑中的用途。


圖1顯示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59對(duì)HBV肝細(xì)胞感染的抑制。
圖2顯示D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白衍生肽Myr 2-47對(duì)HBV肝細(xì)胞感染的抑制。
圖3顯示HBV表面L蛋白去抗原性候選肽與抗體的結(jié)合率。
圖4顯示HBV表面L蛋白去抗原性候選肽抑制HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染。
圖5顯示抗HBV表面L蛋白抗體對(duì)HBV表面L蛋白衍生肽及去抗原性衍生肽阻斷HBV感染作用的影響。
圖6顯示HBV表面L蛋白衍生肽及去抗原性衍生肽對(duì)抗HBV表面L蛋白抗體阻斷HBV感染作用的影響。
具體實(shí)施例方式
如上所述，本發(fā)明第一方面提供了來(lái)源于B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白的衍生肽，該衍生肽可抑制HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染。這些衍生肽序列可用通式X-Y-Z表示，這里X表示HBV表面L蛋白的第1到12位氨基酸序列，或自該序列的N末端縮短的序列或完全缺失，包括以上序列N末端修飾的衍生序列。所述“自該序列的N末端縮短”包括從該序列N末端的第1位氨基酸開始縮短，可縮短到只剩該序列第12位氨基酸，即X可以是所述序列的第a位到第12位氨基酸序列，其中a為1-11的整數(shù)，或者X僅為該第12個(gè)氨基酸。
Y表示B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白序列中第13到第59位氨基酸序列，并包括該序列N末端和/或C末端修飾的衍生序列。
Z表示B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第60到第89位氨基酸序列，或自C末端縮短的序列或完全缺失，包括以上序列C末端修飾的衍生序列。所述“自C末端縮短”包括從C末端的第1個(gè)氨基酸(即本發(fā)明所述的第89位氨基酸)開始縮短，可縮短到只剩該序列第60位氨基酸，即Z可以是所述序列的第60位到第b位氨基酸序列，其中，b為61-89的整數(shù)，或者Z僅為該第60個(gè)氨基酸。
本發(fā)明優(yōu)選的衍生肽包含N末端縮短的X序列和/或C末端縮短的Z序列，更優(yōu)選的衍生肽僅含有Y序列。
本發(fā)明提供的衍生肽，其序列優(yōu)選來(lái)源于B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第1到第89氨基酸序列。更優(yōu)選地來(lái)自于B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第13到59氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供的衍生肽其序列來(lái)源于SEQ ID NO1所述的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第1到第89氨基酸序列。更優(yōu)選地來(lái)自于SEQ ID NO1第13到59位氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
以上所述的衍生肽優(yōu)選地帶有化學(xué)修飾的疏水基團(tuán)，這些疏水基團(tuán)優(yōu)選地具有4個(gè)以上碳原子的飽和或不飽和脂肪酸的丙烯殘基，更優(yōu)選的是豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸或花生四烯酸。疏水基團(tuán)另外還優(yōu)選膽固醇及其類似基團(tuán)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，多肽的N末端經(jīng)豆蔻酰化修飾。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的HBV表面L蛋白衍生肽為SEQ ID NO1第13到第59氨基酸序列且第13位甘氨酸連接有豆蔻酰基團(tuán)的多肽Myr-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPKKDHWPEANQVG(Myr 13-59，SEQ ID NO3)。在另外一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供的多肽具有SEQ ID NO4、5、6和7序列，它們的第1個(gè)氨基酸甘氨酸經(jīng)豆蔻酰化修飾。
本發(fā)明第二方面提供來(lái)源于D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白的一組衍生肽，該組衍生肽可抑制HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染。這些衍生肽序列可用通式x-y-z表示，這里x表示HBV表面L蛋白序列中第1位氨基酸M或完全缺失，包括以上序列N末端修飾的衍生序列。y表示D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白序列中第2到第32位氨基酸序列，以及該序列N末端和/或C末端修飾的衍生序列。z表示D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白第33到第47氨基酸序列，或自C末端縮短的序列或完全缺失，包括以上序列C末端修飾的衍生序列。所述“自C末端縮短”包括從C末端的第1個(gè)氨基酸(即本發(fā)明所述的第47位氨基酸)開始縮短，可縮短到只剩該序列第33位氨基酸，即，z可以是所述序列的第33位到第c位氨基酸序列，其中，c表示34-47的整數(shù)，或者z僅為所述第33位氨基酸。
本發(fā)明包含來(lái)源于其他基因型血清型HBV表面L蛋白對(duì)應(yīng)序列，符合上述定義的HBV表面L蛋白衍生肽。
本發(fā)明優(yōu)選的衍生肽包含完全缺失的x序列，更優(yōu)選的衍生肽含有的z序列在不影響多肽抑制HBV感染活性的條件，其C末端盡量縮短。
本發(fā)明提供的衍生肽序列優(yōu)選來(lái)源于D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白第2到47氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供的衍生肽序列優(yōu)選來(lái)源于SEQ ID NO8所述的D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白第2到47氨基酸序列。
以上所述的衍生肽優(yōu)選地帶有化學(xué)修飾的疏水基團(tuán)，這些疏水基團(tuán)優(yōu)選地具有4個(gè)以上碳原子飽和或不飽和脂肪酸的丙烯殘基，更優(yōu)選的是豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸或花生四烯酸。疏水基團(tuán)另外還優(yōu)選膽固醇及其類似基團(tuán)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，多肽的N末端經(jīng)豆蔻酰化修飾。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的HBV表面L蛋白衍生肽為SEQ ID NO8第2到第47氨基酸序列且第1位甘氨酸連接有豆蔻?；鶊F(tuán)的多肽Myr-GQNLSTSNPLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNPNKDTWPDANKV(Myr 2-47，SEQ ID NO9)。
本發(fā)明包括符合本發(fā)明定義的其他基因型/血清型HBV和非人類HBV來(lái)源的衍生肽，特別包含以上衍生肽對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV感染的抑制作用。
本發(fā)明第三方面提供一種蛋白去抗原性衍生肽的篩選方法，用于去除抗原性而保留蛋白的特定屬性。該方法由A-B-C過程構(gòu)成。這里A過程表示在待篩選的病毒蛋白中引入隨機(jī)序列，建立該蛋白特定區(qū)域或全部蛋白隨機(jī)編碼的重組病毒庫(kù)。B過程表示在待篩選蛋白抗體存在的條件下，篩選仍具有感染能力的重組病毒亞群，并獲得該重組病毒亞群中該蛋白的氨基酸序列，即獲得該蛋白去抗原性候選肽序列。C過程表示按獲得的去抗原性候選肽序列合成相應(yīng)的去抗原性候選肽，篩選可調(diào)節(jié)病毒感染能力卻不與該病毒蛋白抗體結(jié)合的去抗原性的多肽，即獲得蛋白去抗原性衍生肽。
本發(fā)明的去抗原性衍生肽篩選方法的篩選對(duì)象包含任何形式的蛋白和多肽，其蛋白和多肽的來(lái)源包含人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等在內(nèi)的所有生物和微生物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，應(yīng)用本發(fā)明的篩選方法對(duì)HBV、人獲得性免疫缺陷病毒、流感A病毒和副粘液病毒(paramyxoviruses)等病毒蛋白的去抗原性衍生肽進(jìn)行篩選，進(jìn)一步優(yōu)選地對(duì)HBV的表面L蛋白的去抗原性衍生肽進(jìn)行篩選，更優(yōu)選地對(duì)HBV表面L蛋白Pre-S1區(qū)進(jìn)行去抗原性衍生肽篩選。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到58氨基酸序列的去抗原性衍生肽進(jìn)行篩選。更優(yōu)選地對(duì)如SEQID NO1所述B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到58氨基酸序列TNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPKKDHWPEANQV(SEQ ID NO10)的去抗原性衍生肽進(jìn)行篩選。
本發(fā)明的蛋白去抗原性衍生肽篩選方法中，A過程包含在基因脫氧核酸堿基水平、信使RNA核酸堿基水平、蛋白氨基酸殘基水平、多糖序列水平等生物分子水平引入隨機(jī)序列，并包含能在以上各水平引入隨機(jī)序列的方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明在病毒基因脫氧核酸堿基水平引入隨機(jī)序列，在進(jìn)一步的優(yōu)選方案中通過基因重組技術(shù)引入隨機(jī)序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，在B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第28到46氨基酸序列所對(duì)應(yīng)的基因序列利用基因重組技術(shù)引入隨機(jī)序列(NNS)19，這里N表示A、T、G、C任意隨機(jī)堿基，S表示G、C任意隨機(jī)堿基。更優(yōu)選地在SEQ ID NO1所述的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第28到46氨基酸序列HQLDPAFGANSNNPDWDFN(SEQ ID NO11)所對(duì)應(yīng)的基因序列(SEQ ID NO12)利用基因重組技術(shù)引入隨機(jī)序列(NNS)19，這里N表示A、T、G、C任意隨機(jī)堿基，S表示G、C任意隨機(jī)堿基。
本發(fā)明的蛋白去抗原性衍生肽篩選方法的B過程中，重組病毒亞群該蛋白氨基酸序列的獲得包含基因DNA測(cè)序、蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)序等任何測(cè)序手段。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中采用基因DNA測(cè)序獲得重組病毒亞群蛋白序列，即獲得病毒蛋白去抗原性候選肽序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，獲得四條B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白第13到58氨基酸序列(SEQ ID NO10)的去抗原性候選肽序列(SEQ ID NO15、16、17和18，其第1個(gè)氨基酸甘氨酸經(jīng)豆蔻酰修飾)。
本發(fā)明的蛋白去抗原性衍生肽篩選方法中，C過程包含多肽化學(xué)合成、基因重組表達(dá)等任何多肽的產(chǎn)生方式。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中采用化學(xué)合成法生產(chǎn)去抗原性候選肽。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，篩選獲得HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽(SEQID NO17)。
本發(fā)明第四方面提供可抑制HBV感染但不與表面L蛋白抗體結(jié)合的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，并提供了該去抗原性衍生肽與HBV表面L蛋白抗體抑制HBV肝細(xì)胞感染的協(xié)同效應(yīng)。
這些去抗原性衍生肽序列來(lái)源于應(yīng)用本發(fā)明提供的去抗原性衍生肽篩選方法對(duì)本發(fā)明第一方面定義的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽的篩選結(jié)果及與原有B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白氨基酸序列的組合。
本發(fā)明提供的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白去抗原性衍生肽可用通式α-β表示，這里α表示HBV病毒表面L蛋白的第1到13位氨基酸序列，或自該序列N末端縮短的序列或僅為第13位氨基酸甘氨酸，包括以上序列N末端修飾的衍生序列，其中，所述的“自該序列N末端縮短的序列”的定義與上文所述相同。β表示應(yīng)用本發(fā)明提供的去抗原性衍生肽篩選方法對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到第58氨基酸序列篩選獲得的氨基酸序列，并包括該序列N末端修飾的衍生序列和/或C末端的縮短序列或修飾衍生序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案提供的去抗原性衍生肽中，α為SEQ ID NO1序列中第1到13位氨基酸序列，或自該序列的N末端縮短的序列或僅為第13位氨基酸甘氨酸，包括以上序列N末端修飾的衍生序列。β表示應(yīng)用本發(fā)明提供的去抗原性衍生肽篩選方法對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白(SEQ IDNO1)第14到第58氨基酸序列TNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPKKDHWPEANQV(SEQ ID NO10)篩選獲得的氨基酸序列，并包括該序列N末端修飾的衍生序列和/或C末端的縮短序列或修飾衍生序列。
本發(fā)明包含經(jīng)降低或去除抗原性改造的病毒蛋白衍生序列，特別包含經(jīng)降低或去除抗原性改造的HBV病毒蛋白衍生序列，更特別地包含經(jīng)降低或去除抗原性改造的HBV表面L蛋白的衍生肽序列。這里的“改造”是指利用包括本發(fā)明提供的去抗原性衍生肽篩選方法、氨基酸刪除、氨基酸替換等在內(nèi)的任何以降低衍生肽抗原性為目的的技術(shù)方法。
以上所述的衍生肽優(yōu)選地帶有化學(xué)修飾的疏水基團(tuán)，這些疏水基團(tuán)優(yōu)選地指具有4個(gè)以上碳原子飽和或不飽和脂肪酸的丙烯殘基，更優(yōu)選的是豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸或花生四烯酸。疏水基團(tuán)另外還優(yōu)選膽固醇及其類似基團(tuán)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，多肽的N末端經(jīng)豆蔻?；揎?。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽是第1位甘氨酸連接有豆蔻?；鶊F(tuán)的多肽Myr-GTNLSVPNPLGFFPDCSLDWVWSWAPYFTPQWRTPKKDHWPEANQV(SEQ ID NO17)。
本申請(qǐng)所涉及多肽的任何同系物均為本申請(qǐng)的一部分，包括經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，如包括1-10個(gè)氨基酸、較佳1-8個(gè)氨基酸、更佳1-5個(gè)氨基酸、更佳1-3個(gè)氨基酸的刪除、保守/非保守氨基酸替換而獲得的多肽序列。更進(jìn)一步地包括通過一個(gè)或多個(gè)(如1-10個(gè)、1-8個(gè)、1-5個(gè)等)L氨基酸-D氨基酸替換等獲得的抗蛋白酶解的多肽修飾產(chǎn)物。本申請(qǐng)還包括以降低本申請(qǐng)多肽的抗原性為目的的修飾和改造。這里的“同系物”還包括與本申請(qǐng)涉及多肽具有大于30％(如40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更大)同源性的多肽或含有豆蔻酰修飾的甘氨酸和抗Pre-S1抗體的結(jié)合序列(或經(jīng)過去抗原篩選得到的抗Pre-S1抗體結(jié)合序列對(duì)應(yīng)的去抗原性序列)。這里的“同系物”還包括B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白相關(guān)多肽，這些多肽可在低于100mM的多肽濃度下產(chǎn)生大于50％的肝細(xì)胞HBV感染抑制率。
本申請(qǐng)還包括利用基因工程技術(shù)通過細(xì)胞表達(dá)的含有本申請(qǐng)?zhí)峁┬蛄卸嚯牡幕旌衔?。本申?qǐng)所涉及的SEQ ID NO3-7、9和15-18的第一個(gè)氨基酸甘氨酸都經(jīng)豆蔻?；揎?。
本申請(qǐng)?zhí)峁┒嚯牡挠猛景w內(nèi)外通過阻斷HBV顆粒對(duì)肝細(xì)胞的黏附或內(nèi)化而抑制HBV感染。本申請(qǐng)還包括將提供的多肽用作阻斷或防止HBV感染的藥物以及與適當(dāng)藥物載體組成的藥物制劑。本申請(qǐng)還包括含有所述多肽的疫苗組合物。
本申請(qǐng)?zhí)貏e包括所提供的多肽對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV肝細(xì)胞感染的阻斷作用，本申請(qǐng)還包括其他基因型/血清型HBV和非人類HBV來(lái)源的衍生多肽，特別是Pre-S1來(lái)源的衍生多肽對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV感染的抑制作用。
本申請(qǐng)也包括以所提供的多肽作為治療或預(yù)防HBV感染的措施，以及涉及本申請(qǐng)多肽在內(nèi)的患者所需要的任何預(yù)防、治療措施。本申請(qǐng)?zhí)貏e包含本申請(qǐng)多肽體內(nèi)抑制HBV感染的預(yù)防和治療措施，其中包括阻止HBV傳播到生物體未受感染的細(xì)胞中。這里的預(yù)防措施是指降低或避免患者感染HBV的可能性，治療措施是指改善或穩(wěn)定患者狀況的所有措施。所指的患者是任何被HBV感染、可能被HBV感染和可能即將被HBV感染的人。
本申請(qǐng)?zhí)峁┝薍BV表面L蛋白去抗原性衍生肽與其他抗病毒感染措施協(xié)同抗HBV感染的作用，這些抗病毒措施包括HBV疫苗免疫(包括預(yù)防性疫苗和治療性疫苗等任何與HBV相關(guān)的主動(dòng)、被動(dòng)免疫措施)、抗HBV抗體(包括抗HBV任何蛋白的單克隆抗體、多克隆抗體、HBV免疫球蛋白等任何與HBV病毒結(jié)合的抗體及抗體的成分)、細(xì)胞因子(包括α干擾素、白細(xì)胞介素等所有干預(yù)HBV的細(xì)胞因子及其組合物)、核苷類似物(拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和替比夫定等任何抑制病毒復(fù)制的化合物)以及其他所有干預(yù)HBV感染、復(fù)制、釋放等任何HBV過程的藥物及措施。在本申請(qǐng)的一個(gè)優(yōu)選方案中，HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽與抗HBV表面L蛋白抗體協(xié)同抑制病毒感染。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1源于B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽對(duì)HBV肝細(xì)胞感染的抑制1、B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽的制備N末端豆蔻酰修飾的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽(SEQ ID NO3第1位氨基酸甘氨酸經(jīng)豆蔻酰修飾，表示為Myr 13-59)以AB 431A型多肽合成儀按標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，以0.25mM HMP為起始樹脂，自羧基端向氨基端逐個(gè)殘基延伸合成。為增強(qiáng)多肽的穩(wěn)定性，多肽的C末端進(jìn)一步酰胺化。肽合成結(jié)束后，經(jīng)切割液切割，G6玻砂漏斗濾除樹脂，濾液真空抽干。無(wú)離子水溶解多肽切割產(chǎn)物，KTA explorer 100型中壓液相色譜儀C18柱純化，分步收集主峰。目標(biāo)峰收集樣以Delta 600型反相高壓液相色譜Symmetry C18分析柱純度鑒定，API2000 LC/MS/MS型質(zhì)譜儀分子量鑒定。中壓液相色譜純化所得的收集液凍干，溶于100μM DMSO形成多肽儲(chǔ)存液，0.20μM過濾除菌，-80℃凍存。
2、B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV基因型血清型的測(cè)定采集慢性HBV感染患者血清-70℃保存。取出50μl血清加310μl蛋白酶K裂解液[1mg/ml蛋白酶K，50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，200mmol/L NaCl，10mmol/LEDTA，2％SDS，1μg/ml poly(A)]。60℃裂解1小時(shí)后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀溶于無(wú)離子水中即為HBV DNA模板。PCR反應(yīng)體系50μl，含HBV DNA模板5μl、1×PCR Buffer、MgCl21.5mmol/L、上游引物(SEQ ID NO19，5’AGTCTAGACTCGTGGTGGAC-3’，在HBV基因組中的位置為247-266，下同)25pmol/L、下游引物(671-690，5’-T(G/T)GCACTAGTAAACTGAGCC-3’，SEQ ID NO20)25pmol/L、200μMol/L dNTPs、1.25U聚合酶TaqDNA。擴(kuò)增條件94℃30s、55℃30s、72℃45s、35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物443bp，直接測(cè)序獲得其序列。根據(jù)HBsAg DNA序列轉(zhuǎn)換的氨基酸序列，按122、127、134、159和160位氨基酸組成確定HBsAg的抗原決定簇序列特征，進(jìn)而確定HBV的血清型(Yotsumoto S，Okamoto H，Tsuda F，Miyakawa Y，Mayumi M，“Subtyping hepatitis B virus DNA in free orintegrated forms by amplification of the S-gene sequences by the polymerase chain reactionand single-track sequencing for adenine”，J Virol Methods，1990年5月，28(2)107-16；Norder H，Courouce AM，Magnius LO，“Molecular basis of hepatitis B virus serotypevariations within the four major subtypes”，J Gen Virol.，1992年12月，73(Pt 12)3141-5)，根據(jù)HBV S基因區(qū)型特異性核苷酸特征確定HBV基因型(Norder H，Courouce AM，Magnius LO，“Molecular basis of hepatitis B virus serotype variations within the fourmajor subtypes”，J Gen Virol.，1992年12月，73(Pt 12)3141-5；Norder H，Hammas B.J Gen Virol，1993，741341-1348；Kidd-Ljunggren K，Courouce AM，Oberg M，Kidd AH；“Genetic conservation within subtypes in the hepatitis B virus pre-S2 region”，J GenVirol.，1994年6月，75(Pt 6)1485-90，Erratum在J Gen Virol，1995年3月，76(Pt3)727)。
3、人原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)非HBV相關(guān)的肝癌患者外科手術(shù)腫瘤切除物相鄰的正常組織，按文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行分離〔Guguen-Guillouzo，C.，和A.Guillouzo，1986.Methods for preparation of adultand fetal hepatocytes，第1-12頁(yè)，在A.Guillouzo和C.Guguen-Guillouzo編輯的“Isolated and cultured hepatocytes”中.Les E′ditions INSERM Paris，John Libbey andCo.，Ltd.，英國(guó)倫敦〕，培養(yǎng)于添加了3.5×106M氫化可的松琥珀酸單酯(hydrocortisone hemisuccinate)、2％二甲基亞亞砜、5％人血清和5％胎牛血清的H培養(yǎng)基中。
4、B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒的培養(yǎng)。
將確定為B基因型adw血清型和C基因型adr血清型的HBV病毒血清2ml加入培養(yǎng)3天的人原代肝細(xì)胞，37℃孵育感染24小時(shí)。感染完成后移除感染血清，洗滌細(xì)胞3次，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)10天。收集培養(yǎng)上清，6％聚乙二醇(PEG8000)離心沉淀病毒顆粒，沉淀重懸于含有25％胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中，凍存于-80℃。
5、HBV感染后肝細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的檢測(cè)培養(yǎng)上清中的HBsAg通過三明治夾心法(in-house sandwich)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)檢測(cè)。1ug/ml抗HBsAg單克隆抗體37℃包被96孔板2小時(shí)。充分洗滌后(0.1％Tween 20 PBS洗滌3次、PBS洗滌2次)，10％胎牛血清37℃封閉1小時(shí)。去除封閉液，加入HBV感染的肝細(xì)胞培養(yǎng)上清100μl 4℃孵育12小時(shí)。去除培養(yǎng)上清，充分洗滌，加入過氧化物酶偶聯(lián)的抗HBsAg抗體37℃孵育1小時(shí)。去除多余抗體，加入苯二胺-H2O2反應(yīng)底物室溫反應(yīng)15分鐘，2N H2SO4中止反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的OD492，計(jì)算感染上清中HBsAg含量。
6、HBV表面L蛋白衍生肽(Myr 13-59，SEQ ID NO3)對(duì)HBV肝細(xì)胞感染的抑制人原代肝細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天，每孔約106細(xì)胞與L蛋白衍生肽Myr13-59預(yù)處理30分鐘，加入B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒感染24小時(shí)。移除感染上清，洗滌細(xì)胞3次。繼續(xù)培養(yǎng)10天后檢測(cè)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量。如圖1所示，以未受Myr 13-59預(yù)處理肝細(xì)胞的HBV感染為對(duì)照，HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59以劑量依賴性方式抑制HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染。5、10、20、40nM分別可抑制HBV對(duì)肝細(xì)胞感染的28％、74％、87％和95％，大于80nM的Myr 13-59可完全阻斷HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染。其50％感染抑制濃度(IC50)為7.63nM。
實(shí)施例二源于D基因型ayw血清型HBV病毒表面L蛋白衍生肽對(duì)HBV肝細(xì)胞感染的抑制1、N末端豆蔻酰修飾的D基因型ayw血清型HBV表面L蛋白衍生肽Myr 2-47(SEQ ID NO9)的合成及人原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)同實(shí)施例一。
2、D基因型ayw血清型HBV病毒的培養(yǎng)可分泌完整D基因型ayw血清型HBV感染病毒顆粒的2.2.15細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)10天。收集培養(yǎng)上清，6％聚乙二醇(PEG8000)離心沉淀病毒顆粒，沉淀重懸于含有25％胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中，凍存于-80℃。
3、HBV感染后肝細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的檢測(cè)(同實(shí)施例一)4、HBV表面L蛋白衍生肽Myr 2-47對(duì)HBV肝細(xì)胞感染的抑制人原代肝細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天，每孔約106細(xì)胞與L蛋白衍生肽Myr2-47預(yù)處理30分鐘，加入D基因型ayw血清型HBV病毒感染24小時(shí)。移除感染上清，洗滌細(xì)胞3次。繼續(xù)培養(yǎng)10天后檢測(cè)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg含量。如圖2所示，以未受Myr 2-47預(yù)處理肝細(xì)胞的HBV感染為對(duì)照，HBV表面L蛋白衍生肽Myr2-47以劑量依賴性方式抑制HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染。5、10、20、40nM分別可抑制HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染23％、69％、82％和97％，大于80nM的Myr 2-47可完全阻斷HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染。其IC50為8.33nM。
實(shí)施例三HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽的篩選1、B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒基因型血清型測(cè)定、病毒培養(yǎng)、人原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)(同實(shí)例一)。
2、攜帶HBV完整全基因組且具備HBV完整復(fù)制能力的重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
50μl HBV病毒培養(yǎng)懸液加入310μl蛋白酶K裂解液[1mg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，200mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，2％SDS，1μg/mlpoly(A)]。60℃裂解1小時(shí)后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀溶于H2O中為HBV DNA溶液。以上游引物(Pst I)5’ctgactgcagCACTGGATGGGGCTTGGCTATTGG(SEQ IDNO21，1202-1225)和下游引物(EcoR I)5’ttatggaattcCGACGCGGCGATTGAGACCTTC(2201-2180，SEQ ID NO22)擴(kuò)增含有完整EN II復(fù)制元件的C基因型adr血清型HBV基因組(1202-2201nt)。該擴(kuò)增片斷支持病毒完成復(fù)制，并含有大于單基因組的HBV基因序列(3996nt)。PCR反應(yīng)體系50μl，含HBV DNA模板5μl，1×PCR Buffer，MgCl21.5mmol/L，上下游引物25pmol/L，200μMol/L dNTPs，高保真TaqDNA聚合酶1.25U。擴(kuò)增條件94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4017bp。將擴(kuò)增的HBV DNA片段克隆入pUC18質(zhì)粒載體的Pst I和EcoR I酶切位點(diǎn)，形成pUC-HBV重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可產(chǎn)生具有感染能力的病毒顆粒。
3、表面L蛋白Pre-S1區(qū)隨機(jī)編碼的重組HBV庫(kù)的建立。
化學(xué)合成DNA片段(SEQ ID NO13和14)，對(duì)應(yīng)于HBV DNA基因組Bse59I和Bsu36 I限制性酶切位點(diǎn)之間片段，其中N代表A、T、G、C中的任何堿基，S代表G、C中的任何堿基。將兩條合成的互補(bǔ)DNA片段退火后克隆入pUC-HBV限制性酶切位點(diǎn)Bse59I和Bsu36I之間，從而在HBV表面L蛋白Pre-S1區(qū)抗體結(jié)合氨基酸序列HQLDPAFGANSNNPDWDFN對(duì)應(yīng)編碼區(qū)內(nèi)引入隨機(jī)序列。再將帶有隨機(jī)編碼區(qū)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)10天。重組質(zhì)粒在Hep G2細(xì)胞內(nèi)形成的病毒顆粒分泌到培養(yǎng)上清中，即形成了表面L蛋白(SEQ ID NO1)第28到46氨基酸HQLDPAFGANSNNPDWDFN對(duì)應(yīng)序列隨機(jī)編碼的重組HBV庫(kù)。其中DPAF和NSNNPDWDFN分別是抗HBV表面L蛋白中和性單克隆抗體MA18/7和5a19的結(jié)合序列。
4、HBV表面L蛋白抗體存在條件下，具有肝細(xì)胞感染能力的重組HBV亞群的篩選。
培養(yǎng)3天的人原代肝細(xì)胞加入10μg/ml抗HBV單克隆抗體MA18/7和5a19，孵育30分鐘。將上述含有隨機(jī)編碼序列重組HBV庫(kù)的Hep G2培養(yǎng)上清液加入肝細(xì)胞培養(yǎng)基中，感染24小時(shí)。移除感染上清，加入MA18/7和5a19抗體繼續(xù)培養(yǎng)10天。培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)的人原代肝細(xì)胞，在MA18/7和5a19抗體存在下繼續(xù)篩選培養(yǎng)2輪，以篩選在抗HBV表面L蛋白抗體存在下仍具有肝細(xì)胞感染能力的重組HBV亞群。
5、重組HBV表面L蛋白隨機(jī)區(qū)編碼序列，即去抗原性候選肽序列的測(cè)定。
50μl經(jīng)過3輪篩選含有重組HBV亞群的培養(yǎng)上清，加入310μl蛋白酶K裂解液[1mg/ml蛋白酶K，50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，200mmol/L NaCl，10mmol/LEDTA，2％SDS，1μg/ml poly(A)]。60℃裂解1小時(shí)后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀溶于H2O中為HBV DNA溶液。以上游引物(Pst I)5’ctgactgcagTTTCCGCACTCATTTACAAGA(1539-1561，SEQ ID NO23)和下游引物(EcoR I)5’ttatggaattcATGCTCCCGCTC CTACCTGATTT(2032-2010，SEQ ID NO24)擴(kuò)增HBV表面L蛋白Pre-S1編碼片段(494bp)。PCR反應(yīng)體系50μl，含HBV DNA模板5μl，1×PCRBuffer，MgCl21.5mmol/L，上下游引物25pmol/L，200μMol/L dNTPs，高保真TaqDNA聚合酶1.25U。擴(kuò)增條件94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物515bp。將擴(kuò)增的HBV DNA片段克隆入pUC 18質(zhì)粒載體的Pst I和EcoR I酶切位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，青霉素選擇條件下培養(yǎng)，挑取單菌落，抽提所攜帶的重組質(zhì)粒，對(duì)插入序列測(cè)序，獲得在抗HBV表面L蛋白抗體存在條件下仍具有肝細(xì)胞感染能力的重組HBV表面L蛋白基因編碼序列。
6、HBV病毒表面L蛋白去抗原性篩選肽的制備依據(jù)以上重組HBV表面L蛋白基因編碼序列，經(jīng)翻譯獲得對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，截取其第12到58氨基酸序列為去抗原性候選肽氨基酸序列，本實(shí)例經(jīng)過篩選獲得4條HBV表面L蛋白去抗原性候選肽編碼序列。以AB 431A型多肽合成儀按標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案合成N末端豆蔻酰修飾的候選肽(SEQ ID NO15、16、17和18)，具體方法同實(shí)施例一。
7、HBV病毒表面L蛋白去抗原性候選肽抗原性的檢測(cè)溶于0.1M碳酸緩沖液(pH9.6)、濃度為10μg/ml的HBV表面L蛋白去抗原性候選肽室溫包被Immulon II ELISA板過夜。酶聯(lián)板經(jīng)含有0.05％ Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，10％胎牛血清37℃封閉1小時(shí)。酶聯(lián)板PBS漂洗2次，加入單克隆抗體MA 18/7或5a19 4℃孵育過夜。清洗酶聯(lián)板，加入過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠二抗，37℃孵育1小時(shí)。漂洗多余二抗，加入含有苯二胺和H2O2的檸檬酸磷酸緩沖液(pH5.0)，室溫反應(yīng)5分鐘。2N H2SO4中止反應(yīng)，讀取反應(yīng)液OD492值，計(jì)算L蛋白去抗原性候選肽與抗L蛋白抗體的結(jié)合率。如圖3所示，HBV表面L蛋白去抗原性候選肽SEQ ID NO15和18分別單獨(dú)與5a19和M18/7有57％、34％的結(jié)合，而抗原性候選肽SEQ ID NO16和17與兩種抗體均不結(jié)合。因此進(jìn)一步檢測(cè)這兩個(gè)候選肽阻斷HBV感染肝細(xì)胞的能力。
8、HBV病毒表面L蛋白去抗原性候選肽對(duì)HBV感染的抑制效應(yīng)人原代肝細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天，每孔約106細(xì)胞與HBV病毒表面L蛋白去抗原性候選肽SEQ ID NO16或SEQ ID NO17預(yù)處理30分鐘，加入B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒感染24小時(shí)。移除感染上清，洗滌細(xì)胞3次，繼續(xù)培養(yǎng)10天后測(cè)定培養(yǎng)上清中HBsAg的濃度(測(cè)定方法同實(shí)施例一)。如圖4A、B所示，HBV表面L蛋白去抗原性候選肽SEQ ID NO16和SEQ ID NO17均以劑量依賴性方式抑制兩種基因血清型HBV對(duì)原代肝細(xì)胞的感染。兩個(gè)L蛋白去抗原性候選肽在160nM時(shí)均可完全阻斷HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染，其中HBV表面L蛋白候選肽SEQ ID NO16對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒的IC50分別為12.06nM和10.79nM。而HBV表面L蛋白候選肽SEQ ID NO17具有更高抑制HBV的活性，對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒的IC50分別為8.34nM和7.89nM，因此獲得SEQ ID NO17為HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽。
實(shí)施例四HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽與抗體協(xié)同抑制HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染1、HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽對(duì)HBV感染抑制效應(yīng)不受抗HBV表面L蛋白抗體干擾。
人肝細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天，每孔約106細(xì)胞，1∶1加入抗HBV表面L蛋白Pre-S1單克隆抗體M18/7和5a19，孵育30分鐘后，加入HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽SEQ ID NO17或自然序列的HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59(SEQ IDNO3)，孵育30分鐘，移除上清，洗滌細(xì)胞3次，加入HBV病毒感染10小時(shí)。移除感染上清，洗滌細(xì)胞3次，繼續(xù)培養(yǎng)10天后測(cè)定培養(yǎng)上清中HBsAg的濃度(同實(shí)施例一)。如圖5A所示，具有自然序列的HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59(SEQ IDNO3)在抗體存在條件下，其阻斷HBV感染的能力明顯下降，且下降程度與抗體的濃度存在依賴關(guān)系，2μg/ml的抗體使80nM Myr 13-59的病毒阻斷效果下降50％，而8μg/ml的抗體則完全阻斷160nM HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59的病毒感染阻斷效應(yīng)，顯示HBV表面L蛋白衍生肽對(duì)HBV感染抑制效應(yīng)明顯受到抗HBV表面L蛋白抗體的干擾。而HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽SEQ ID NO17在0、2、4、8μg/ml抗體預(yù)先存在的條件下，仍然以劑量依賴性方式抑制HBV對(duì)原代肝細(xì)胞的感染(圖5B)，其抑制曲線沒有明顯差別，各條件下IC50相近，可見HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽消除了抗HBV表面L蛋白Pre-S1抗體對(duì)病毒感染阻斷效應(yīng)的干擾。
2、HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽與HBV表面L蛋白抗體發(fā)揮協(xié)同阻斷HBV感染的效應(yīng)。
人原代肝細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天，每孔約106細(xì)胞，1∶1加入抗HBV表面L蛋白Pre-S1單克隆抗體M18/7和5a19，孵育30分鐘后，加入HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽SEQ ID NO17或自然序列的HBV表面L蛋白衍生肽Myr13-59(SEQ ID NO3)，孵育30分鐘，加入HBV病毒感染24小時(shí)。移除培養(yǎng)上清，洗滌細(xì)胞3次，繼續(xù)培養(yǎng)10天后測(cè)定培養(yǎng)上清中HBsAg的濃度(同實(shí)施例一)。如圖6A所示，在沒有Myr 13-59衍生肽條件下，抗HBV表面L蛋白Pre-S1抗體對(duì)HBV感染具有中和作用，且對(duì)病毒感染的抑制具有劑量依賴性。但是隨著多肽濃度的增加，Myr 13-59劑量依賴性地降低了抗體的病毒中和作用，在20nM處幾乎完全抵消抗體的病毒中和能力。這種病毒中和作用的抵消是由于HBV表面L蛋白衍生肽與抗體結(jié)合，使抗體消耗而不能與病毒結(jié)合。在抗體低濃度時(shí)出現(xiàn)的病毒感染阻斷作用是由相對(duì)過量的Myr 13-59提供的，此時(shí)加入的Myr 13-59超過了抗體的結(jié)合能力，出現(xiàn)了Myr 13-59的過剩。隨著抗體濃度的增加，當(dāng)達(dá)到Myr 13-59與抗體結(jié)合能力相當(dāng)時(shí)，多肽和抗體的混合物對(duì)HBV感染的抑制作用幾乎消失。因此可見，HBV表面L蛋白衍生肽Myr 13-59與HBV表面L蛋白抗體之間存在明顯相互抵消現(xiàn)象。
而HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽SEQ ID NO17與HBV表面L蛋白抗體之間的作用明顯不同于前者。如圖6B所示，SEQ ID NO17劑量依賴性地增強(qiáng)HBV表面L蛋白抗體阻斷HBV感染的作用，隨著SEQ ID NO17濃度的逐漸增加，完全阻斷HBV感染所需HBV表面L蛋白抗體的劑量逐漸降低。2μg/ml抗體+10nM去抗原性衍生肽和4μg/ml抗體+5nM去抗原性衍生肽均可完全阻斷HBV病毒對(duì)肝細(xì)胞的感染，抗體與去抗原性衍生肽之間存在明顯的協(xié)同作用和互補(bǔ)關(guān)系。其原因是去抗原性衍生肽不與抗體結(jié)合，使兩者抑制病毒感染的作用互不干擾。此外，去抗原性衍生肽與抗體抑制HBV感染的機(jī)理不同，前者結(jié)合于肝細(xì)胞病毒感染受體，而后者則與病毒結(jié)合，封閉病毒與肝細(xì)胞結(jié)合的Pre-S1關(guān)鍵序列。可見，HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽與HBV表面L蛋白抗體能夠發(fā)揮協(xié)同阻斷HBV感染的作用。
序列表<110>上海汐群生物科技有限公司<120>乙肝炎病毒表面L蛋白相關(guān)肽<130>055004<160>24<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>119<212>PRT<213>HBV表面L蛋白<400>1Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu1 5 10 15Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro20 25 30Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Lys35 40 45Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly50 55 60Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln65 70 75 80Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Val Ala Pro Pro Pro Ala Ser85 90 95Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu100 105 110Arg Asp Ser His Pro Gln Ala115<210>2<211>47<212>PRT<213>HBV表面L蛋白<400>2Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His1 5 10 15Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp20 25 30Phe Asn Pro Lys Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly35 40 45<210>3<211>47<212>PRT<213>HBV表面L蛋白衍生肽<400>3Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His1 5 10 15Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp
20 25 30Phe Asn Pro Lys Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly35 40 45<210>4<211>47<212>PRT<213>HBV表面L蛋白衍生肽<400>4Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His1 5 10 15Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp20 25 30Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly35 40 45<210>5<211>47<212>PRT<213>HBV表面L蛋白衍生肽<400>5Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His1 5 10 15Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp20 25 30Phe Asn Pro Asn Lys Ala His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly35 40 45<210>6<211>47<212>PRT<213>HBV表面L蛋白衍生肽<400>6Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His1 5 10 15Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp20 25 30Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Lys Ala Asn Gln Val Gly35 40 45<210>7<211>47<212>PRT<213>HBV表面L蛋白衍生肽<400>7Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His1 5 10 15Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp20 25 30Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Lys Ala Lys Gln Val Gly35 40 45<210>8
<211>108<212>PRT<213>HBV表面L蛋白<400>8Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp1 5 10 15His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp20 25 30Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala His Lys Val Gly35 40 45Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu50 55 60Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn65 70 75 80Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro85 90 95Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala100 105<210>9<211>46<212>PRT<213>HBV表面L蛋白衍生肽<400>9Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His1 5 10 15Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp20 25 30Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val35 40 45<210>10<211>45<212>PRT<213>HBV病毒表面L蛋白<400>10Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln1 5 10 15Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe20 25 30Asn Pro Lys Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val35 40 45<210>11<211>19<212>PRT<213>HBV病毒表面L蛋白<400>11His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp1 5 10 15Asp Phe Asn<210>12
<211>57<212>DNA<213>HBV病毒表面L蛋白編碼序列<400>12caccagttgg accctgcgtt cggagccaac tcaaacaatc cagattggga cttcaac57<210>13<211>268<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc feature<222>(1)..(268)<223>n＝a，t，c，或g<400>13gtcaccatat tcttgggaac aagagctaca gcatgggagg ttggtcttcc aaacctcgac 60aaggcatggg gacgaatctt tctgttccca atcctctggg attctttccc gatnnsnnsn120nsnnsnnsnn snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn snnsnnsnns cccaaaaagg180atcactggcc agaggcaaat caggtaggag cgggagcatt cgggccaggg ttcaccccac240cacacggcgg tcttttgggg tggagccc 268<210>14<211>266<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(266)<223>n＝a，t，c，或g<400>14tgagggctcc accccaaaag accgccgtgt ggtggggtga accctggccc gaatgctccc 60gctcctacct gatttgcctc tggccagtga tcctttttgg gsnnsnnsnn snnsnnsnns120nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn snnsnnsnns nnsnnsnnat cgggaaagaa tcccagagga180ttgggaacag aaagattcgt ccccatgcct tgtcgaggtt tggaagacca acctcccatg240ctgtagctct tgttcccaag aatatg 266<210>15<211>46<212>PRT<213>HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽<400>15Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp Thr1 5 10 15Arg Gly Asp Arg Gly Gln Asn Leu Ala Ala Gly Val Ala Leu Lys Asp20 25 30Phe Gly Pro Lys Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val35 40 45<210>16<211>46<212>PRT
<213>HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽<400>16Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp Ala1 5 10 15Leu Gly Asp Leu Ser Phe Ser Arg Phe Gln Leu Tyr Thr Thr Asp Leu20 25 30Ser Gly Pro Lys Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val35 40 45<210>17<211>46<212>PRT<213>HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽<400>17Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp Cys1 5 10 15Ser Leu Asp Trp Val Trp Ser Trp Ala Pro Tyr Phe Thr Pro Gln Trp20 25 30Arg Thr Pro Lys Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val35 40 45<210>18<211>46<212>PRT<213>HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽<400>18Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp Phe1 5 10 15Ser Ser Asp Pro Lys Ser Arg Phe Ala Arg Arg Val Pro Val Ala Ala20 25 30Pro Val Pro Lys Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val35 40 45<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>19agtctagact cgtggtggac 20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>20tkgcactagt aaactgagcc 20<210>21<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>23ctgactgcag tttccgcact catttacaag a31<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>24ttatggaatt catgctcccg ctcctacctg attt 3權(quán)利要求
1.一種HBV表面L蛋白的多肽，其特征在于，它具有通式X-Y-Z，其中，X表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第1到第12個(gè)氨基酸構(gòu)成的序列，或自該序列N末端縮短的序列，或完全缺失，其中，X的N末端可被修飾；Y表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第13到第59個(gè)氨基酸序列，其中，Y的N末端和/或C末端可被修飾；Z表示B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第60到第89氨基酸序列，或自該序列C末端縮短的序列或完全缺失，其中，Z的C末端可被修飾。
2.如權(quán)利1所述的多肽，其特征在于，所述Y序列的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻?；揎棥?br> 3.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述序列選自SEQ ID NO2-7，其中SEQ ID NO3-7的第1個(gè)氨基酸甘氨酸被豆蔻?；揎?。
4.一種HBV表面L蛋白的多肽，其特征在于，該多肽具有通式x-y-z，其中，x表示甲硫氨酸，其可被修飾，或者x不存在；y表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白的第2到第32個(gè)氨基酸序列，其中，y的N末端和/或C末端可被修飾；z表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白第33到第47氨基酸序列，或自該序列C末端縮短的序列或完全缺失，其中，z的C末端可被修飾。
5.如權(quán)利4所述的多肽，其特征在于，其y序列的第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻?；揎棥?br> 6.如權(quán)利4或5所述的多肽，其特征在于，所述多肽的序列為SEQ ID NO9，其第1位氨基酸甘氨酸被豆蔻?；揎?。
7.一種蛋白去抗原性衍生肽的篩選方法，用于去除抗原性而保留蛋白的特定屬性，其特征在于，該方法包括(A)在待篩選的病毒蛋白中引入隨機(jī)序列，建立該蛋白特定區(qū)域或全部蛋白隨機(jī)編碼的重組病毒庫(kù)；(B)在待篩選蛋白抗體存在的條件下，篩選仍具有感染能力的重組病毒亞群，并獲得該重組病毒亞群中該蛋白的氨基酸序列，即獲得該蛋白去抗原性候選肽序列；(C)按獲得的去抗原性候選肽序列合成相應(yīng)的去抗原性候選肽，篩選可調(diào)節(jié)病毒感染能力卻不與該病毒蛋白抗體結(jié)合的去抗原性的多肽，即獲得蛋白去抗原性衍生肽。
8.一種HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，它通過權(quán)利7所述方法對(duì)權(quán)利1所述的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白多肽進(jìn)行篩選而得到，其特征在于，它具有通式α-β式中，α表示HBV表面L蛋白的第1到13位氨基酸序列，或自該序列N末端縮短的序列或僅為第13位氨基酸甘氨酸，其中，所述N末端和/或第13位氨基酸甘氨酸可被修飾；β表示應(yīng)用權(quán)利要求7所述的篩選方法對(duì)B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到第58氨基酸序列進(jìn)行篩選獲得的氨基酸序列，其中，所獲得的氨基酸序列的N末端可被修飾和/或其C末端可被縮短或修飾。
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1或4所述的HBV表面L蛋白的多肽或權(quán)利要求8所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，和藥學(xué)上可接受的載體。
10.權(quán)利要求1或4所述的HBV表面L蛋白的多肽或權(quán)利要求8所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽在制備預(yù)防和/或治療乙型肝炎的藥劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的HBV表面L蛋白衍生肽、去除這些多肽抗原性的篩選方法以及通過該方法篩選得到的去抗原性衍生肽。HBV表面L蛋白pre－S1區(qū)含有病毒黏附細(xì)胞表面受體的關(guān)鍵性氨基酸序列以及與抗L蛋白抗體結(jié)合的抗原性氨基酸序列。本申請(qǐng)?zhí)峁┑腍BV表面L蛋白pre－S1區(qū)的多肽可抑制HBV對(duì)細(xì)胞的感染。本發(fā)明同時(shí)提供了去除這些多肽抗原性的篩選方法，并篩選出既可抑制HBV感染又不與抗體結(jié)合的去抗原性衍生肽，不僅解決了天然L蛋白衍生肽與抗L蛋白抗體之間在抑制HBV感染時(shí)的相互干擾，而且使去抗原性衍生肽與抗HBV表面L蛋白抗體發(fā)揮協(xié)同抑制HBV感染的作用。
文檔編號(hào)A61P31/20GK1733798SQ20051002872
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日
發(fā)明者劉宏利, 汪裕, 尹穎 申請(qǐng)人:上海汐群生物科技有限公司