專利名稱：一種從野山參中制備有抗癌活性的純化提取物的方法及含有其的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從野山參(wild ginseng)中制備有抗癌活性的純提取物的方法以及含有其的組合物。
背景技術(shù)：
癌癥是由在細胞周期中紊亂而導致的通過啟動，促進和演進這三個階段，異常分化和發(fā)育產(chǎn)生的惡性腫瘤。癌癥的啟動可能主要由于足夠量的致癌物質(zhì)而發(fā)生，而小量的啟動子導致細胞突變，突變細胞數(shù)量的增殖和最終對腫瘤啟動子的刺激而促進異常細胞的分化導致癌癥組織的形成。
至今，在開發(fā)用于治療癌癥的抗癌藥物上已經(jīng)有大量的嘗試和方法，例如，近來集中地研究了用于篩選直接作用于癌癥細胞的細胞毒性物質(zhì)的方法，用于篩選機體免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法，用于篩選癌癥細胞轉(zhuǎn)移的抑制物質(zhì)的方法，用于篩選抑制血管生成的物質(zhì)的方法等等。
常規(guī)應(yīng)用的抗癌藥物可以分成三類即，生物藥物，例如基因或者酶制劑，疫苗等；化學治療藥劑(純合成抗癌藥物)，例如紫杉醇，長春堿等；以及來源于自然資源的天然產(chǎn)物藥物。然而，生物藥物尚未達到臨床使用的要求。而且，化學治療藥劑盡管具有有效的抗癌活性，但由于它們多種副作用而被限制使用，這些副作用例如對特異抗癌藥劑發(fā)生不能耐受，骨髓功能障礙，胃功能紊亂例如嘔吐，惡心，脫發(fā)(Gillman et al.，Maxwell Macmillan.，18，pp1202，1986；Chung et al.，J.Wonkwang Medical Sci.，3，pp13-34，1987)。有報道稱因為大多數(shù)抗癌類藥物的抗癌藥物分子量小，抗癌藥物可以滲入到正常細胞，特別是活躍的分化細胞以及癌細胞而導致正常細胞的損傷并輕易地通過尿素排泄，而這需要相當量的藥物(Yamazaki et al.，Biosci，Biotech.Biochem.，56(1)，pp149，1992；Tompson et al.，Exp.Cell Res.，41，pp411-427，1996；Ellem et al，Devel.Biol.，118，pp311-330，1968)。
近來，在從生藥或天然產(chǎn)物中開發(fā)具有預防和治療癌癥疾病的抗癌藥劑方面有大量的嘗試。
因此，至今迫切地需要從自然資源中找到可提供功效被證實的以及低的或者最小毒性的有效物質(zhì)。近來，替代醫(yī)學，尤其地，基于免疫增強機制的中藥療法作為傳統(tǒng)西藥的替代方法以消除化學治療的副作用被關(guān)注。在這些中藥療法中，聯(lián)合使用從表現(xiàn)出免疫增強活性和低毒性的中藥中提取的植物提取物以及使用有效提取物的針灸療法在韓國逐漸被關(guān)注，這一療法由下述步驟組成選擇對于單個疾病具有最有效活性的植物或者其他天然資源；從具有最大功效且最低毒性的提取物中提取有效成分；接種或者注射上述成分到適宜針灸的位置或者身體疼痛部位并且由于針灸的作用和成分的藥理作用而因此賦予其協(xié)同效應(yīng)。然而，生藥可以在注射或者針灸時將其毒性表現(xiàn)出來，例如發(fā)燒，疼痛，水腫等等，故而還需要獲得更多具有比生藥形式毒性更低的純化的提取物。
對于從有抗癌活性的野山參中制備純化的提取物的方法以及含有其的組合物，在上述引用文獻中尚沒有報道或者公開，對于他們的公開在此被整體引用作為參考。
為了調(diào)查利用本發(fā)明的方法從野山參中制備的純化提取物對于癌癥和腫瘤細胞的作用效果，本發(fā)明的發(fā)明人集中地開展了一些體內(nèi)和體外模型實驗，并且最終通過確認純化的提取物表現(xiàn)出抗癌活性和免疫刺激效應(yīng)而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的可以通過本文提供的本發(fā)明的具體內(nèi)容而顯而易見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于從對于癌癥疾病具有治療和預防活性的野山參中制備純化提取物的方法。
本發(fā)明提供了一種含有有效量的按上述方法制備的野山參純化提取物作為活性成分的藥物組合物，通過其抗癌活性用于治療和預防癌癥疾病。
本發(fā)明還提供了上述提取物通過對哺乳動物或者人類的抗癌活性而在制備用于治療和預防癌癥疾病的藥物組合物的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于從野山參中制備純化提取物的方法，所述方法由下述步驟組成將野山參材料用提取溶劑反復進行蒸餾提??；冷凍蒸餾制得的提取物以獲得冷凍的純化提取物；溶化提取物并過濾以獲得純化的提取物。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種含有有效量的按上述方法制備的野山參純化提取物作為活性成分的藥物組合物，通過其抗癌活性用于治療和預防癌癥疾病。
本發(fā)明的又一個目的是提供按上述方法制備的野山參純化提取物通過對哺乳動物或者人類的抗癌活性而在制備用于治療和預防癌癥疾病的治療藥劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種通過對哺乳動物或者人類的抗癌活性而治療或者預防癌癥疾病的方法，所述方法包括對所述哺乳動物或者人類給予有效量的按上述方法從野山參中制備的純化提取物，以及其藥學上可接受的載體。
本發(fā)明公開的術(shù)語“提取溶劑”包含水，低級醇，例如甲醇，乙醇，優(yōu)選水。
本發(fā)明公開的術(shù)語“野山參材料(wild ginseng material)”包含所有栽培的野山參(wild ginseng cultivated)或在世界上自然生長的野山參(naturallygrown wild ginseng)，例如，韓國，日本，俄羅斯，中國，歐洲，美國等。
本發(fā)明的藥物組合物可以含有基于組合物總重量的大約按重量計0.01～50％的上述提取物。
一種野山參的純化提取物可以按照下面優(yōu)選的實施方式制備。
在下文中，本發(fā)明將被具體描述。
一種新發(fā)明的野山參純化提取物可以按照下面步驟具體制備，所述新發(fā)明的野山參純化提取物可以按照下面步驟制備；具體地，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于從野山參中制備純化提取物的方法，所述方法由下述步驟組成步驟1將野山參材料用提取溶劑進行第一次蒸餾提取以獲得第一蒸餾物；步驟2將第一蒸餾物用提取溶劑進行第二次蒸餾提取以獲得第二蒸餾物；步驟3冷凍第二蒸餾物以獲得冷凍的純化提取物；步驟4溶化提取物并過濾以獲得過濾提取物；步驟5使用雙層蒸鍋加熱過濾物并再次冷凍；步驟6溶化提取物并滅菌以獲得本發(fā)明的純化提取物。
具體地，在步驟1中，優(yōu)選將野山參材料倒入極性溶劑中，所述極性溶劑選自水，低級醇例如甲醇，乙醇，丙醇以及它們的混合溶劑，更優(yōu)選水，尤其優(yōu)選比率為每升水含有1.0～3.0kg的材料并將其獨自置于室溫1～4小時，優(yōu)選3小時。隨后，在60～120℃使用蒸餾裝置加熱，優(yōu)選80～100℃，更優(yōu)選100℃，加熱時間為6～24小時，優(yōu)選逐漸加熱8～10小時，以獲得第一蒸餾物。
在步驟2中，優(yōu)選地將第一蒸餾物加入到裝備了蒸餾裝置的含有沸石的燒瓶中并在60～120℃加熱，優(yōu)選80～100℃，更優(yōu)選100℃，加熱時間為7～24小時，優(yōu)選逐漸加熱8～12小時并且加熱過程持續(xù)到濃縮物的體積減小到70～90(v/v)％的程度以獲得第二蒸餾物。
在步驟3中，優(yōu)選地將第二蒸餾物在-5～-15℃進行冷凍，優(yōu)選-8～-12℃并且該過程持續(xù)到未冷凍部分的體積減小到小于總體積5％的程度。移出未冷凍部分并且將余下的蒸餾物進行溶化?？梢灾貜屠鋬龊鸵瞥蠢鋬霾糠值倪^程，優(yōu)選重復3～6次，以獲得本發(fā)明的冷凍純化提取物。通過步驟3，在步驟1的野山參材料中的毒性物質(zhì)幾乎或者全部被移除而得到純化的提取物。
在步驟4中，優(yōu)選地將步驟3冷凍的純化提取物進行室溫溶化處理和隨后使用孔徑為0.1～0.6μm的濾紙過濾處理，優(yōu)選0.4μm，以獲得濾液。
在步驟5中，使用雙層蒸鍋在60～120℃對上述步驟制備的濾液加熱，優(yōu)選80～100℃，更優(yōu)選100℃，加熱時間為20～40分鐘，優(yōu)選30分鐘，和在-30-10℃進行完全地再冷凍，優(yōu)選-15℃以獲得冷凍的純化提取物。
在步驟6中，將冷凍的濾液溶化并滅菌以獲得本發(fā)明的最終純化提取物。
在上面描述的步驟1中，根據(jù)本發(fā)明的目的，第一蒸餾物的濃度可以通過改變材料的比率而控制。
在上面描述的純化過程中，按照具體成分的不同，提取物可以被分成兩部分，即冷凍部分和未冷凍部分。因為凝固點低，所以在提取物中帶有較大毒性的成分比毒性小的成分冷凍得慢，使得含有絕大部分毒性成分的未冷凍部分可以通過重復上述冷凍過程而被移除。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供含有有效量的按上述方法制備的野山參純化提取物作為活性成分的藥物組合物，通過其抗癌活性用于治療和預防癌癥疾病。
本發(fā)明的一個目的是提供按上述方法制備的野山參純化提取物通過對哺乳動物或者人類的抗癌活性而在制備用于治療和預防癌癥疾病的治療藥劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種通過保護哺乳動物或者人類的神經(jīng)元細胞而治療或預防退化性腦病的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物或者人類有效量的按上述方法從野山參中制備的純化提取物，以及其藥學上可接受的載體。
通過體內(nèi)和體外模型實驗證實了本發(fā)明的純化提取物對于癌癥和腫瘤細胞的作用，發(fā)明人確信純化的提取物具有抗癌活性和免疫刺激效果。
因此，本發(fā)明的純化提取物在治療和預防癌癥疾病上是有用的。
除了功效以外，本發(fā)明的純化提取物由于多年前已經(jīng)被用于商業(yè)生藥，而可以安全地長期給藥。
發(fā)明的用于治療和預防癌癥疾病的組合物可以含有基于組合物總重量的按重量計0.01～50％上述提取物。
發(fā)明的組合物可以另外包含和本領(lǐng)域公知的使用方法相一致的常規(guī)載體，輔料或稀釋劑。根據(jù)用法優(yōu)選所述載體作為適宜物質(zhì)使用，但并不局限于此。Remington’s pharmaceutical Science(Mack Publishing co，Easton PA)記載了適宜的稀釋劑。
在本文中，下述的配制方法和賦型劑僅僅作為實例而并不以任何方式限制本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以作為藥物組合物提供，所述藥物組合物含有藥學上可接受的載體，輔料或稀釋劑，例如，乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤蘚糖醇，麥芽糖醇，淀粉，洋槐膠，藻酸鹽，凝膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，聚乙烯吡咯酮，水，羥基苯甲酸甲酯，羥基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。制劑可以另外含有填充物，抗凝劑，潤滑劑，濕潤劑，香味劑，乳化劑，防腐劑等等。本發(fā)明的組合物可以制成制劑以便于通過任何本領(lǐng)域公知的方法將其給藥于患者后提供活性成分的速效，或緩釋形式。
例如，本發(fā)明的組合物可以溶解于油，丙二醇或者其它用于制造注射劑的溶劑中，適宜的載體實例包括生理鹽水，聚乙二醇，乙醇，植物油，十四烷酸異丙酯等，但并不局限于它們。對于局部給藥，本發(fā)明的提取物可以制成軟膏和霜的形式。
含有本發(fā)明組合物的藥物制劑可以制成任何形式，例如口服劑量形式(粉末，片劑，膠囊，軟膠囊，液體藥劑，糖漿，酏劑，香粉，小顆粒)，或者局部制劑(霜，軟膏，乳液，凝膠，油膏，塞片，噴霧液，氣溶膠等)，注射制劑(溶液，懸浮劑，乳劑)或者針灸注射制劑。
藥物劑型的本發(fā)明組合物可以以其藥學上可接受鹽的形式使用，也可以單獨或者以適宜的結(jié)合體，以及與其它藥學上的活性化合物結(jié)合使用。
發(fā)明的提取物或者組合物的期望劑量根據(jù)患者的狀況和體重，嚴重性，藥物形式，給藥途徑和時間的變化而不同，并且可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇。然而，為了獲得期望效果，通常建議以10g/kg左右量給藥，優(yōu)選地，按重量/天計為1～3g/kg本發(fā)明的提取物或者化合物。所述劑量可以一次或者分成每日多次給藥。就組合物而言，本發(fā)明的提取物的量按重量計應(yīng)為基于組合物總重量的0.01～50％，優(yōu)選按重量計的0.5～40％。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過不同途徑給藥于患病動物，例如哺乳動物(小鼠，大鼠，家畜或者人)。可以使用所有類型的給藥方式，例如可以通過口服，直腸給藥或者通過靜脈注射，肌肉注射，皮下注射，皮內(nèi)注射，鞘內(nèi)注射，硬腦膜外注射，或者腦室內(nèi)注射或者在適宜針灸的部位進行針灸注射。
本發(fā)明的發(fā)明提取物無毒性和無副作用，因此可以安全使用。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，很顯然可以在不背離本發(fā)明的精神或范圍下，對本發(fā)明的組合物，制備和使用本發(fā)明進行各種改變和修飾。


通過下面詳細描述并結(jié)合附圖，可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其他目的，特性以及其他優(yōu)點。
圖1顯示HPLC對自然生長的野山參未純化提取物的分析；圖2顯示HPLC對自然生長的野山參純化提取物的分析。
具體實施例方式
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，很顯然可以在不背離本發(fā)明的精神或范圍下，對本發(fā)明的組合物，制備和使用本發(fā)明進行各種改變和修飾。
通過下面的實施例更具體的解釋了本發(fā)明。然而，應(yīng)當理解為這些實施例并不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例下述參考實例，實施例以及試驗例均為了進一步闡述本發(fā)明而并不限于其范圍。
比較例1.從自然生長的野山參中制備未純化的提取物將2.5kg源于自然生長野山參的Sangyang野山參用鹽水沖洗并撕成寬為3mm的碎片，加入到含有1升水的燒瓶中并于100℃加熱8小時。使用孔徑大小為0.1～0.6μm的濾紙對蒸餾物進行過濾。室溫冷卻濾液，滅菌并保存于無菌瓶中以備下面試驗中作為樣品使用，維持其溫度低于4℃。
比較例2.從栽培野山參中制備未純化的提取物將2.0kg源于自然生長的野山參的栽培野山參用鹽水沖洗并撕成寬為3mm的碎片，加入到含有1升水的燒瓶中并于100℃加熱8小時。使用孔徑大小為0.1～0.6μm的濾紙對蒸餾物進行過濾。室溫冷卻濾液，滅菌并保存于無菌瓶中以備下面試驗中作為樣品使用，維持其溫度低于4℃。
實施例1.從自然生長野山參中制備純化提取物將2.5kg源于自然生長野山參的Sangyang野山參用鹽水沖洗并撕成寬為3mm的碎片，加入到含有1升水的燒瓶中，并在20℃放置3小時。
裝備有蒸餾裝置的燒瓶在100℃加熱8小時以獲得第一蒸餾物。將5g沸石連同第一蒸餾物倒入裝備有蒸餾裝置的燒瓶中，于100℃進一步加熱10小時以獲得第二蒸餾物。將第二蒸餾物在-10℃冷凍直到未冷凍部分的體積小于總體積的5％的程度，然后廢棄未冷凍部分。保留的冷凍部分于室溫溶化。上述冷凍和溶化步驟進一步重復2次。當冷凍部分溶化后，使用孔徑大小為0.1～0.6μm的濾紙對其進行過濾，并且在90℃于雙層蒸鍋中將濾液加熱30分鐘。冷卻濾液并在-15℃完全冷凍。冷凍了的純化提取物于室溫溶化，滅菌并保存于無菌瓶中以備下面試驗中作為樣品使用，維持其溫度低于4℃。
實施例2.從栽培野山參中制備純化提取物將Kyunghee大學(韓國首爾)提供的2.0kg栽培野山參用鹽水沖洗并撕成寬為3mm的碎片，加入到含有1升水的燒瓶中，并在20℃放置3小時。
進一步的步驟按照與實施例1類似的方法進行以獲得栽培野山參的純化提取物，并在下面試驗中作為樣品使用。
實施例3.對上面比較例1和實施例1的含量分析使用HPLC對上述比較例1和實施例1中的皂甙含量進行測定(柱Phenomenex Nuna C18(5μm，150×2.0mm)，流速0.3ml/min，檢測波長UV203nm，展開劑起始溶劑；CH3CN∶H2O＝15∶85并且在大于70分鐘內(nèi)，在CH3CH∶H2O＝80∶20中從0％到30％，室溫)。
如圖1和圖2所示，檢測到的上述含量分析的結(jié)果為上述比較例1和實施例1的皂甙含量顯著不同。
參考例1.細胞培養(yǎng)U937細胞(人白血病細胞系)，A549細胞(人肺癌細胞系)以及MDA-MB-231細胞(人乳腺癌細胞系)在含有RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco BRLCo.，Ltd.，USA)的直徑為100mm的培養(yǎng)皿(TPP Co.，Ltd.，Switzerland)中生長，并追加10％的胎牛血清，于37℃，5％CO2和95％空氣的濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
試驗例1.細胞毒性測定通過MTT法(3-[4.5-二甲基噻唑-2-基]-2.5-溴化二苯基四唑)測定U937細胞(人白血病細胞系)，A549細胞(人肺癌細胞系)以及MDA-MB-231細胞(人乳腺癌細胞系)中的野山參細胞毒性。
將10mm培養(yǎng)皿中的細胞用500μl胰蛋白酶-EDTA(Gibco BRL Co.，Ltd.，USA)處理以使其從培養(yǎng)皿中分離，然后向其中加入10ml新鮮培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶-EDTA溶液并獲得懸浮細胞。
在培養(yǎng)24小時后，向96孔板中加入1×104細胞/孔。用在比較例1，2和實施例1，2中制備的不同濃度的提取物100μl/孔處理上面這些細胞，并再培養(yǎng)48小時，提取物濃度分別即0，125，250，500和1000μg/ml。48小時后，棄培養(yǎng)基并在每個細胞中加入10μl經(jīng)PBS緩沖液稀釋后調(diào)整濃度為5mg/ml的MTT溶液，37℃培養(yǎng)4小時。用PBS沖洗培養(yǎng)基以移除殘留的MTT試劑并在每孔中滴入100μl的DMSO(二甲亞砜)。室溫培養(yǎng)平板20分鐘然后用微孔讀數(shù)板(ELISA reader，DENLEY Co.，Japan)測定樣品紫外吸光度以計算570nm處的細胞活性。
將僅僅用培養(yǎng)基處理的陰性對照組的細胞活性率計為100％，并對其他樣品和陽性對照的數(shù)值進行計算。
作為陽性對照組，將100μl/孔不同濃度的亞德里亞霉素加入到96孔板中，所述濃度即0，3.125，6.25，12.5，25，培養(yǎng)48小時并用稀釋后濃度為5mg/ml的MTT處理。
測定的吸光度顯示MTT法中現(xiàn)有細胞酶的減少量與存活細胞密度成比例。用于抑制50％癌癥細胞存活的樣品濃度表示為IC50。
在結(jié)果中，對于U937，A549以及MDA-MB-231癌細胞，比較例1，2和實施例1，2處理組(IC50，＞300μl/ml)顯示出低細胞毒性效應(yīng)而亞德里亞霉素處理組顯示出相對強的細胞毒性效應(yīng)(IC50，3μg/ml)(見表1，2，3)。




試驗例2.對于癌細胞黏附到細胞質(zhì)的抑制如果癌癥細胞從首先發(fā)生的部位轉(zhuǎn)移到其他組織，癌癥細胞需要在細胞質(zhì)中有對于特異物質(zhì)的細胞黏著能力，所述細胞物質(zhì)即膠原，層粘連蛋白，凝膠等或者用于代謝的內(nèi)皮細胞。
為了測定本發(fā)明提取物的對細胞黏著能力的抑制效果，將MDA-MB-231細胞(1×106細胞/孔)加入到由0.1％凝膠包被的96孔板中，并且向其中用不同濃度的比較例1，2以及實施例1，2(0，62.5，125，250和500μg/ml)處理以致各自濃度為100μl/孔。細胞在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至細胞附著到培養(yǎng)板底部并用PBS緩沖液小心清洗培養(yǎng)板。附著細胞用結(jié)晶紫染色試劑染色并用微板讀數(shù)器(ELISA reader，DENLEY Co.，Japan)測定620nm處的OD值。
在結(jié)果中證實，比較例1，2和實施例1，2處理組顯示出以劑量依賴方式抑制MDA-MB-231細胞黏附到凝膠上(見表4)。



試驗例3.MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)為了測定本發(fā)明提取物對癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制效果，孔徑大小為8μm的聚碳酸酯膜被50μg的matrigel充分地包被1小時并在空氣中干燥24小時。將含有0.1％BSA的條件培養(yǎng)基各30μ加入到Boyden chamber的下室中。用加入了含有0.1％BSA的RPMI1640(FBS-free)培養(yǎng)基的50μl的MDA-MB-231細胞(1×106細胞/孔)處理50μl由比較例1，2和實施例1，2制備的提取物，并分別加入到Boyden chamber的上室中。在37℃，5％CO2和95％空氣的濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時后，用MeOH固定膜并用Quic溶液(Diffco Co.Ltd.)染色。通過分光法計算從上室進入到下室的細胞數(shù)。
在結(jié)果中證實，用實施例1和2的提取物的處理組相比于用比較例1和2的提取物處理組，表現(xiàn)出對于MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)移的更強烈的劑量依賴型抑制(見表5)。



試驗例4.使用Lewis肺癌細胞測定癌細胞體積增加的抑制效應(yīng)為了測定對于癌細胞體積增加的抑制效應(yīng)，通過改變文獻中公開的方法(Teruhiro et al.，Cancer Res.，56，pp2809-14，1996)進行了下述試驗。
將已經(jīng)在實驗鼠體內(nèi)繼代培養(yǎng)的Lewis肺癌細胞(1×106細胞/孔)調(diào)整劍1×106細胞/孔的濃度，然后注射到BDF-1雄性小鼠(6-周-齡)的左腋。24小時后，將濃度為0.5和1mg/小鼠的亞德里亞霉素以及濃度為50和100μl/小鼠的比較例1，2和實施例1，2所制備的提取物腹腔注射到小鼠中。樣品注射持續(xù)2周直到作為對照的非處理組的腫瘤體積達到2cm3。2周后，使用下述公式1和2計算出腫瘤體積并測定腫瘤體積的抑制率。
Tumor volume(cm3)=L×w22]]>L(cm)腫瘤長度W2(cm2)腫瘤寬度[數(shù)學公式2]Inhibition of tumor volume(%)=A-BA×100]]>A對照組的腫瘤體積(cm3)B樣品處理組的腫瘤體積(cm3)在結(jié)果中證實，使用實施例1和2提取物的處理組相比于用比較例1和2的提取物處理組，顯示出對Lewis肺癌細胞的體積增長更強烈的劑量依賴型抑制作用(見表6)。


試驗例5.體重的測定使用自動重量測量設(shè)備(Jenix，Dongsintonsang，Korea)在試驗期間對由上述試驗例4制備的小鼠的體重進行測定。
在結(jié)果中，實施例1和2處理組表現(xiàn)出體重的顯著增加而大多數(shù)的常規(guī)抗癌藥物由于其副作用而表現(xiàn)出體重減少。
試驗例6.B16-F10黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)為了測定對于癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)，將B16-F10黑色素瘤細胞(2.5×lO5細胞/孔)注射到C57BL/6小鼠的尾部側(cè)靜脈。24小時后，以濃度為100μl/小鼠/天分別注射由比較例l，2和實施例1，2制備的提取物。注射14天后，殺死上述試驗小鼠并用肉眼觀察從小鼠中轉(zhuǎn)移的肺轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的菌落。
在結(jié)果中證實，由實施例1和2制備的提取物相比于由比較例l和2制備的提取物表現(xiàn)出對B16-F10黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)移的更強烈抑制作用(見表7)。



試驗例7.BALB.c小鼠脾臟白細胞的免疫刺激效應(yīng)為了測定本發(fā)明提取物的免疫刺激效應(yīng)，將BALB.c小鼠的脾臟白細胞(1×106細胞/ml)懸浮于加入了100μg/ml鏈霉素，100U/ml青霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(Gibco BRL Co.，Ltd.，USA)，并用其處理各200μl/ml的比較例1，2和實施例1，2的提取物。將溶液在37℃，5％CO2和95％空氣的濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天并用流式細胞儀測定白細胞的形成。使用經(jīng)200μg/ml亞德里亞霉素處理組作為對照組。
在結(jié)果中證實，亞德里亞霉素處理組使得免疫力下降了26.1％，而實施例1和2以及比較例1和2處理組表現(xiàn)為白細胞合成增加，并且實施例1和2處理組的增加更多(見表8)。


試驗例8.毒性試驗方法(1)對ICR小鼠(平均體重25±5g)和Sprague-Dawley大鼠(235±10g，Jung-Ang Lab Animal Inc.)使用實施例1的提取物進行急性毒性試驗。對4組含有10只大鼠或小鼠的試驗組分別口服或腹腔注射給予250mg/kg，500mg/kg，1000mg/kg和5000mg/kg的測試樣品或溶劑(0.2ml i.p.)并觀察2周。
方法(2)對ICR小鼠和Sprague-Dawley大鼠使用實施例2的提取物進行急性毒性試驗。對4組含有10只大鼠或小鼠的試驗組分別腹腔注射給予25mg/kg，250mg/kg，500mg/kg和725mg/kg的測試樣品或溶劑(0.2mli.p.)并觀察24小時。
結(jié)果在任何的組或者性別中，對于死亡率，臨床癥狀，體重變化以及總重的結(jié)果部沒有和處理相關(guān)的效應(yīng)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的提取物是有效并安全的。
在下文中，將對制備方法和各種賦形劑進行描述，但是本發(fā)明并不局限于它們。典型的制劑實例如下所述。
粉劑制備實施例1的干燥粉末50mg乳糖100mg滑石10mg通過混合上述組分并裝入密封包中制備粉末制劑。
片劑制備實施例1的干燥粉末50mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸鎂2mg通過混合上述組分并壓片制備片劑。
膠囊制備實施例1的干燥粉末50mg乳糖100mg玉米淀粉100mg硬脂酸鎂2mg通過混合上述組分并用常規(guī)的膠制備方法裝入膠質(zhì)膠囊中制備膠囊。
注射劑制備實施例2的干燥粉末50mg注射用蒸餾水適量
pH調(diào)節(jié)劑適量通過溶解活性組分，控制pH到大約7.5并將所有組分加入到2ml安瓿中，使用常規(guī)的注射劑制備方法滅菌而制備注射劑。
液體制備實施例2的干燥粉末0.1～80g蔗糖 5～10g檸檬酸 0.05～0.3％焦糖 0.005～0.02％維生素C 0.1～1％蒸餾水79～94％CO20.5～0.82％通過溶解活性組分，裝入所有組分，并用常規(guī)液體制劑制備方法滅菌制備液體制劑。
顯而易見，本發(fā)明如此的描述，可以以多種方式變化。這些變化不被認為背離本發(fā)明的精神和范圍，并且這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯見的改變包括在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
產(chǎn)業(yè)利用性正如本發(fā)明所描述，根據(jù)發(fā)明的方法制備的野山參純化提取物具有抗癌活性效力，例如抑制癌細胞黏附，抑制癌細胞轉(zhuǎn)移和免疫刺激效應(yīng)，因此，其可以作為治療藥物被用于治療和預防各種癌癥疾病。
權(quán)利要求
1.一種從野山參中制備純化提取物的方法，所述方法由下述步驟組成將野山參材料用提取溶劑反復進行蒸餾提?。焕鋬稣麴s制得的提取物以獲得冷凍的純化提取物；溶化提取物并過濾以獲得純化的提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述提取溶劑選自水，C1-C4低級醇或者它們的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，所述提取溶劑為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述野山參包括栽培參和天然生長的野山參。
5.一種用于從野山參中制備純化提取物的方法，所述方法由下述步驟組成步驟1將野山參材料用提取溶劑進行第一次蒸餾提取以獲得第一蒸餾物；步驟2將第一蒸餾物用提取溶劑進行第二次蒸餾提取以獲得第二蒸餾物；步驟3冷凍第二蒸餾物以獲得冷凍的純化提取物；步驟4溶化提取物并過濾以獲得過濾提取物；步驟5使用雙層蒸鍋加熱過濾物并再次冷凍；步驟6溶化提取物并滅菌以獲得本發(fā)明的純化提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，所述步驟1由下述步驟組成將水以每升水含有1.0～3.0kg的材料的比率加入到所述材料；獨自置于室溫1～4小時；隨后，在低于100℃使用蒸餾裝置加熱6～24小時，以獲得第一蒸餾物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，所述步驟2由下述步驟組成將第一蒸餾物加入到裝備有蒸餾裝置的含有沸石的燒瓶中；100℃逐漸加熱7～24小時，直至濃縮物的體積減小到70～90(v/v)％的程度以獲得第二蒸餾物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，所述步驟3由下述步驟組成將第二蒸餾物在-5～-15℃進行冷凍直到未冷凍部分的體積減小到小于總體積5％的程度；移出未冷凍部分；溶化余下蒸餾物；重復冷凍和移除未冷凍部分的過程3～6次，以獲得本發(fā)明的冷凍純化提取物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，所述步驟4由下述步驟組成將步驟3冷凍的純化提取物于室溫溶化；和隨后使用孔徑為0.1～0.6μm的濾紙過濾以獲得濾液。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，所述步驟4由下述步驟組成用雙層蒸鍋在100℃對上述步驟制備的濾液加熱20～40分鐘；和再冷凍以獲得冷凍的純化提取物。
11.一種藥物組合物，所述組合物含有有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的野山參純化提取物作為活性成分，通過其抗癌活性治療并預防癌癥疾病。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述組合物包括口服劑量形式，例如粉末，片劑，膠囊，軟膠囊，液體藥，糖漿，酏劑，香粉，小顆粒或氣溶膠。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述組合物包括局部用藥制劑，例如霜，軟膏，乳液，凝膠，油膏，塞片，噴霧液，氣溶膠，以及注射制劑，例如針灸注射制劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所述組合物通過口服給藥，直腸給藥或者通過靜脈，肌肉，皮下，皮內(nèi)，鞘內(nèi)，硬腦膜外，或者腦室內(nèi)注射或者在適宜針灸的部位進行針灸注射。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述組合物通過在適宜針灸的部位進行針灸注射給藥。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法制備的野山參純化提取物通過對人類或哺乳動物的抗癌活性在制備用于治療和預防癌癥疾病的藥物上的應(yīng)用。
17.一種利用對人類或哺乳動物具有抗癌活性治療或者預防癌癥疾病的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物或人類有效量的根據(jù)權(quán)利要求1制備的野山參提取物，以及其藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備具有抗癌活性的野山參純化提取物的方法，所述抗癌活性例如抑制癌細胞黏附，抑制癌細胞轉(zhuǎn)移和免疫刺激效應(yīng)，本發(fā)明還涉及含有根據(jù)發(fā)明的方法制備的提取物的組合物。組合物具有有效的抗癌活性，因此，可以作為治療藥物被用于治療和預防各種癌癥疾病。
文檔編號A61P35/00GK1988911SQ200480043583
公開日2007年6月27日 申請日期2004年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月15日
發(fā)明者樸容珍, 沈寅燮, 宋圭鏞 申請人:石山醫(yī)療有限公司