專利名稱：使用改進(jìn)量的氯和鉀在微藻類中產(chǎn)生高水平的dha的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及通過海洋微生物在培養(yǎng)基中使用改進(jìn)量的氯和鉀離子產(chǎn)生高度不飽和的脂肪酸的方法。更具體地，本發(fā)明直接涉及通過培養(yǎng)海洋微藻類(microalage)，包括異養(yǎng)的海洋溝鞭藻類，隱甲藻(Crypthecodinium)，在發(fā)酵罐中在無腐蝕性的條件下產(chǎn)生高水平的二十二碳六烯酸(DHA)的方法，包括在低氯離子和高鉀離子環(huán)境中培養(yǎng)。本發(fā)明也涉及通過海洋微生物在低pH水平產(chǎn)生高度不飽和的脂肪酸，包括DHA的方法。
背景技術(shù)：
已充分證明增加人體內(nèi)長鏈omega-3脂肪酸的飲食攝入量的有益效果，所述有益效果包括減少心血管疾病(cardiovascular)和炎性疾病(inflammatorydiseases)(即關(guān)節(jié)炎(arthritis)和動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis))，減少抑郁(depression)，增加在妊娠末三個(gè)月的懷孕期(gestation)長度，和抑制腫瘤生長。已發(fā)現(xiàn)幾種異養(yǎng)的海洋微生物產(chǎn)生高水平的這些重要的必需脂肪酸，所述海洋微生物包括隱甲藻屬的海洋微生物(Jiang和Chen，Process Biochemistry 35(2000)1205-1209；Jiang和Chen，Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，(1999)Vol.23，508-513；Vazhappilly和Chen，Journal of theAmerican Oil Chemists Society，(1998)Vol.75，No.3 p 393-397；Kyle，美國專利No.5,407,957；美國專利No.5,397,591；美國專利No.5,492,938；和美國專利No.5,711,983)。
寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)是用于產(chǎn)生DHA(C226n-3)的最理想的生物體之一，所述的DHA是最重要的長鏈omega-3脂肪酸之一。C.cohnii是有利的因?yàn)镈HA是唯一的通過此生物體以可感知的(appreciable)量產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸(PUFA)。其他生物體在它們的脂質(zhì)中產(chǎn)生兩種或更多的多不飽和脂肪酸(PUFAs)，而且它們的脂質(zhì)分布(profile)的復(fù)雜性可限制它們的油在一些食物和藥物應(yīng)用中的用途(例如由于在油中存在其他不合需要的PUFAs或由于不同的PUFAs的比例落于具體應(yīng)用的理想范圍之外)。在海洋環(huán)境中，寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)通常存在于滿鹽度(full salinity)海水中并且，同樣地適于在具有高氯濃度的環(huán)境中生長。實(shí)際上，在已發(fā)表的關(guān)于C.cohnii的研究中大多數(shù)培養(yǎng)物顯示生長和DHA生產(chǎn)在鹽度大于海水的大約20％中最佳(Jiang和Chen)。相當(dāng)于20％海水的氯離子濃度為大約3870ppm氯離子或3.87g/l氯離子(Horne 1969)。
Tuttle和Loeblich(1975)開發(fā)了C.cohnii的最佳的生長培養(yǎng)基。所公開的培養(yǎng)基包含342毫摩爾(mM)的氯化鈉濃度。在342mM氯化鈉溶液中鈉離子和氯離子的等效的克每升為7.86g/L鈉離子和12.12g/L的氯離子。
Beach&Holz(1973)報(bào)道當(dāng)在NaCl濃度的范圍中(0.3％、1.8％和5.0％(分別為1.82g/l、10.9g/l和30.3g/l氯離子))培養(yǎng)C.cohnii時(shí)，脂質(zhì)產(chǎn)量(表示為mg每109個(gè)細(xì)胞)隨著NaCl濃度減少而下降。在0.3％NaCl的脂質(zhì)產(chǎn)量為在5.0％NaCl的脂質(zhì)產(chǎn)量的大約三分之一。新近，Jiang和Chen(1999)用三種寇氏隱甲藻菌株測定了鹽度對(duì)于細(xì)胞生長和DHA含量的影響，并發(fā)現(xiàn)在所有情況下，最佳的細(xì)胞生長速率和DHA產(chǎn)量為5g/L至9g/L氯化鈉，其分別對(duì)應(yīng)于3.0和5.5g/L氯離子。
海水的天然氯濃度(19,353ppm或19.35g/l氯離子)(Horne 1969，151頁)加速不銹鋼發(fā)酵罐中的腐蝕。例如，在用于制造發(fā)酵罐的兩種普通等級(jí)的不銹鋼中，當(dāng)氯水平超過300ppm(0.3g/l氯離子)時(shí)304-不銹鋼是容易腐蝕的，且當(dāng)氯水平超過1000ppm(1g/l氯離子)時(shí)316-不銹鋼是容易腐蝕的。存在其他等級(jí)的對(duì)氯腐蝕更有抵抗力的不銹鋼，但它們非常昂貴且通常只用于生產(chǎn)非常貴重的化合物的發(fā)酵設(shè)備。
雖然可以預(yù)測通過降低培養(yǎng)基中的氯濃度可以使不銹鋼發(fā)酵罐的腐蝕實(shí)現(xiàn)最小化，但是實(shí)際上這并不是簡單的任務(wù)。當(dāng)源自大海的海洋微藻類在培養(yǎng)物中生長時(shí)，通常需要一定量的氯離子，優(yōu)選如氯化鈉，以保持生長和脂質(zhì)產(chǎn)生。
然而，至今在低氯濃度生長海洋微藻類同時(shí)保持omega-3多不飽和的脂肪酸如DHA的產(chǎn)生水平的嘗試還不成功。Jiang和Chen(1999)不能證明在NaCl水平小于5g/L，對(duì)應(yīng)于大約3033ppm或3g/L的氯水平時(shí)顯著的DHA產(chǎn)量。
2002年6月25日頒布給Barclay的美國專利No.6,410,281提供了在低氯培養(yǎng)基中在降低氯化鈉水平時(shí)通過以非氯化物鈉鹽取代以補(bǔ)償鈉的損失而生長廣鹽性生物(euryhaline organism)如破囊壺菌屬菌種(Thraustochytrium sp.)和Schizochytrium sp.的方法需要能由寇氏隱甲藻產(chǎn)生高產(chǎn)量DHA，同時(shí)抑制或防止在商業(yè)上最理想的生產(chǎn)容器，不銹鋼發(fā)酵罐中腐蝕的方法。此方法必須能使所述微生物在含有優(yōu)選小于300ppm氯的培養(yǎng)基中有效地生長。三百ppm氯代表比由Jiang&Chen(1999)證明的對(duì)隱甲藻的菌株的生產(chǎn)反而更好的最低氯水平低10-18倍的水平。
微生物發(fā)酵的另一個(gè)理想的特性是在低pH(小于或等于大約pH＝5.0)生長細(xì)胞以抑制真菌發(fā)酵中細(xì)菌生長的能力。然而，文獻(xiàn)表明隱甲藻在中性pH(大約pH 7)生長最佳。Tuttle和Loeblich在Phycologia Vol.14(1)1-8(1975)中，公開了隱甲藻生長的最適pH為6.6，而低于pH 5.5生長是“非常慢”的。需要在低pH生長隱甲藻同時(shí)保持正常生長和DHA產(chǎn)生的菌株(strain)和/或方法。

發(fā)明內(nèi)容
在隱甲藻用的培養(yǎng)基中最小化氯化鈉水平的嘗試中，其中氯化鈉導(dǎo)致腐蝕發(fā)酵罐的問題，本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)可以通過在培養(yǎng)基中控制鈉鹽和優(yōu)選鉀鹽以補(bǔ)償氯離子的減少(降至300ppm或0.3g/L氯離子)而降低氯化鈉水平，同時(shí)保持與在大約4.5g/L NaCl(對(duì)應(yīng)于2.73g/l氯離子)所獲得的相似的DHA產(chǎn)量。
本發(fā)明人已確定了培養(yǎng)條件，所述培養(yǎng)條件允許隱甲藻在具有顯著降低的氯水平(降至大約0.3g/l氯離子)的培養(yǎng)基中生長而當(dāng)與在正常的“高氯”培養(yǎng)基中的生長進(jìn)行比較時(shí)沒有對(duì)干重、脂肪含量或DHA含量的不良影響。獲得可比較的DHA產(chǎn)量不僅僅是在培養(yǎng)基中用其他鈉鹽代替氯化鈉的問題。實(shí)際上，用來自其他鈉鹽(即硫酸鈉)的等量(equivalent amount)的鈉代替氯化鈉不導(dǎo)致與高氯對(duì)照情況可比較的DHA產(chǎn)量，卻實(shí)際上導(dǎo)致培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量進(jìn)一步降低。然而本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)當(dāng)鉀濃度(相對(duì)于在4.5g/lNaCl的海水中或17％的海水中)顯著增加時(shí)得到最佳的DHA產(chǎn)量。出乎意料，鈉量的基本減少和鉀濃度的增加在補(bǔ)償培養(yǎng)基的氯含量減少中是有效的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)甲藻綱(Dinophyceae)的異養(yǎng)的微藻類(heterotrophic microalage)產(chǎn)生二十二碳六烯酸(DHA)的方法。所述培養(yǎng)基包含濃度小于或等于大約2g/l的氯離子和濃度大于或等于大約0.25g/l的鉀離子。在此實(shí)施方案中，所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04g DHA每升7天培養(yǎng)物(0.04g DHA per liter of 7 day culture)。7天培養(yǎng)物通常具有大約5×106個(gè)細(xì)胞/ml或大約5×109個(gè)細(xì)胞/升。因此，在第7天具有大約0.2g/lDHA的培養(yǎng)物含有大約0.04gDHA/109個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微藻類是隱甲藻屬的。更優(yōu)選的微藻類是寇氏隱甲藻。優(yōu)選地，氯離子的濃度為小于或等于大約1g/l，甚至更優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l。優(yōu)選地，鉀離子為大于或等于大約0.4g/l，并甚至更優(yōu)選等于或大于大約0.8g/l。優(yōu)選地，鉀離子的來源是硫酸鉀。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含鈉離子的來源以使鈉離子濃度為大約1g/l至大約8g/l。更優(yōu)選地，鈉離子為大約1.5g/l至大約5g/l。鈉離子的優(yōu)選的來源是硫酸鈉。通過此方法產(chǎn)生的生物量(biomass)包含于本發(fā)明中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)甲藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生DHA的方法。所述培養(yǎng)基包含濃度小于或等于大約2g/l的氯離子，濃度大于或等于大約0.25g/l的鉀離子和以鈉∶鉀小于或等于大約27∶1重量比的比例存在的鈉離子。在此實(shí)施方案中，所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.2gDHA每升7天培養(yǎng)物或0.04g DHA/109個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微藻類是隱甲藻屬的。更優(yōu)選的微藻類是寇氏隱甲藻。優(yōu)選地，氯離子濃度為小于或等于大約1g/l，甚至更優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l。優(yōu)選地，鉀離子為大于或等于大約0.4g/l，和甚至更優(yōu)選為等于或大于大約0.8g/l。優(yōu)選地，鉀離子的來源是硫酸鉀。所述培養(yǎng)基還包含鈉離子的來源以使鈉離子以小于鉀離子重量的27倍(重量)(表示為27∶1的鈉∶鉀重量比)的比例存在于培養(yǎng)基中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，鈉∶鉀比例為小于大約15∶1。更優(yōu)選的是大約4∶1的鈉∶鉀比例。鈉離子的優(yōu)選的來源是硫酸鈉。通過此方法產(chǎn)生的生物量包含于本發(fā)明中。
本發(fā)明人也已確定了培養(yǎng)基條件和菌株，所述培養(yǎng)基條件和菌株允許隱甲藻在具有顯著降低的pH水平的培養(yǎng)基中生長，同時(shí)仍保持商業(yè)上可實(shí)現(xiàn)的生長速率和脂質(zhì)，包括DHA的生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)甲藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生DHA的方法，其中所述培養(yǎng)基具有低于大約6的pH，而且其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04g DHA/109個(gè)細(xì)胞。所述培養(yǎng)基可進(jìn)一步包含濃度小于或等于大約2g/l的氯離子，濃度大于或等于大約0.25g/l的鉀離子和以鈉∶鉀小于或等于大約27∶1重量比的比例存在的鈉離子。在此實(shí)施方案中，所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04g DHA/109個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微藻類是隱甲藻屬的。更優(yōu)選的微藻類是寇氏隱甲藻。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH小于或等于大約pH 5.5，更優(yōu)選小于或等于大約5.0，和甚至更優(yōu)選小于或等于大約4.5。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包含小于或等于大約2g/l，優(yōu)選小于或等于大約1g/l，甚至更優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l的氯離子濃度。所述培養(yǎng)基也包含濃度大于或等于大約0.25g/l，大于或等于大約0.4g/l，和甚至更優(yōu)選大于或等于大約0.8g/l的鉀離子。優(yōu)選地，鉀離子的來源是硫酸鉀。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包含鈉離子的來源以使鈉離子濃度為大約1g/l至大約8g/l。更優(yōu)選地，鈉離子為大約1.5g/l至大約5g/l。鈉離子的優(yōu)選的來源是硫酸鈉。通過此方法產(chǎn)生的生物量包含于本發(fā)明中。
本發(fā)明也包括選擇甲藻綱的耐受低pH的異養(yǎng)的微藻類的方法，其包括將所述的微藻類在低pH培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)(subculture)直到DHA的產(chǎn)量大于或等于大約0.04g DHA/109個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH小于或等于大約6，小于或等于大約5，小于或等于大約4.5。通過此方法產(chǎn)生的微藻類和生物量包含于本發(fā)明中。
通過如下的最佳方式說明、附圖和權(quán)利要求，本發(fā)明的這些和其他目的、特點(diǎn)和優(yōu)勢會(huì)變得顯而易見。


圖1是在pH 6.3和3g/l氯離子中(表示為pH 6.3 SSM)生長的C.cohnii菌株T-HF和適于低pH，在pH 5和1g/l氯離子中(表示為pH 5.0 LCSSI)生長C.cohnii菌株T-HF的重復(fù)的DHA產(chǎn)量的時(shí)間過程圖示。
圖2是在pH 6.3和3g/l氯離子中(表示為pH 6.3 SSM)生長的C.cohnii菌株T-HF和適于低pH，在pH 4.5和1g/l氯離子中(表示為pH 5.0 LCSSI)生長的C.cohnii菌株T-HF的重復(fù)的DHA產(chǎn)量的時(shí)間過程圖示。
發(fā)明詳述本發(fā)明解決了前面確定的由于生長甲藻綱的海洋微藻類的高氯化鈉水平而引起的發(fā)酵罐腐蝕的問題。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過在培養(yǎng)基中使用改進(jìn)量的氯離子和鉀離子發(fā)現(xiàn)了培養(yǎng)基組分，所述組分在低氯化鈉條件下允許生長商業(yè)上可行的水平的甲藻綱的海洋微藻類和產(chǎn)生DHA。更具體地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)由于將氯化鈉降低至非-腐蝕的水平而引起的鈉的損失可至少部分地通過在培養(yǎng)基中增加鉀水平而補(bǔ)償。
本發(fā)明也解決了前面確定的允許生長甲藻綱的海洋微藻類同時(shí)阻礙細(xì)菌生長的問題。更具體地，本發(fā)明提供培養(yǎng)海洋生物的方法以使它們變?yōu)槟褪艿蚿H。本發(fā)明也提供耐受低pH的上述微生物的菌株。由本發(fā)明人提供的耐受低pH的菌株，可在低pH水平生長至細(xì)胞稠密(cell densities)并獲得DHA產(chǎn)生水平，該DHA產(chǎn)生水平可與在更中性的pH水平生長的菌株獲得的DHA產(chǎn)生水平相比較。由于本發(fā)明的概念可容易地應(yīng)用于其他生產(chǎn)生物體和如下詳述的其他需要的PUFAs，這只是本發(fā)明包含的技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)甲藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，所述培養(yǎng)基包含如下的組分濃度小于大約2g/L的氯離子，和濃度大于大約0.25g/L的鉀離子，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.2g DHA每升7天培養(yǎng)物。所述7天培養(yǎng)物通常具有5×106個(gè)細(xì)胞/ml，導(dǎo)致大約0.04g DHA/109個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生至少大約0.04g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.06g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.08g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.10g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.12g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.14g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.16g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.18g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.20gDHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.22g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.24g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.26g DHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.28g DHA/109個(gè)細(xì)胞，或至少大約0.30g DHA/109個(gè)細(xì)胞。如本文中使用的，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)濃度(neutrient concentration)是指在培養(yǎng)步驟一開始培養(yǎng)基中的營養(yǎng)濃度，其包括從所述方法中之前的階段，如接種物的制備帶來的任何營養(yǎng)物。
適合于本發(fā)明的微生物包括異養(yǎng)的微藻類，其包括甲藻綱成員(溝鞭藻類)。此綱的優(yōu)選的成員是隱甲藻屬的成員。隱甲藻屬的優(yōu)選的成員是C.cohnii?？苁想[甲藻是專性異養(yǎng)生物(obligate heterotroph)，其需要減少的碳源用于生長，并含有脂肪酸分布(profile)，其中DHA是唯一以可感知的量存在的多不飽和脂肪酸?？蓮脑S多可公開利用的來源，包括通過從自然環(huán)境收集而獲得合適的生物體。例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)目前列出了45株可用的寇氏隱甲藻的菌株，其鑒定為ATCC Nos.30021、30334-30348、30541-30543、30555-30557、30571、30572、30772-30775、30812、40750、50050-50060和50297-50300。如本文中使用的，任何微生物或生物體的任何具體類型，包括野生菌株、突變體或重組類型。
除去作為本發(fā)明主題并在下面更充分討論的鈉、氯和鉀濃度之外，本發(fā)明的培養(yǎng)基的其他組分可為本技術(shù)領(lǐng)域已知的促進(jìn)生長和以商業(yè)上可實(shí)用的水平生產(chǎn)DHA的任何組分，并包括如在美國專利5,130,242，美國專利No.5,407,957，美國專利No.5,397,591；美國專利No.5,492,938；和美國專利No.5,711,983中公開的那些組分，上述所有專利都全部并入本文作為參考。更具體地，可使用碳源，如葡萄糖、各種淀粉、糖蜜、磨碎的玉米(ground corn)等。培養(yǎng)基中也包括可吸收的(assimilable)有機(jī)或無機(jī)氮的來源。氮源可包括硝酸鹽、尿素、銨鹽、氨基酸等。也可提供可吸收的磷的來源。所述培養(yǎng)基也可含有微生物生長因子的來源，該生長因子是未指明的或指明的化合物，其增強(qiáng)單細(xì)胞微生物的異養(yǎng)的生長，并可包括酵母或其他提取物，土壤提取物等。C.cohnii和相關(guān)生物體的生長培養(yǎng)基的具體實(shí)例，例如，可見于Jiang和Chen，Process Biochemistry 35(2000)1205-1209；Jiang和Chen，Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology，(1999)Vol.23，508-513；Vazhappilly和Chen，Journal of the American Oil Chemists Society，(1998)Vol.75，No.3 p393-397。本發(fā)明中使用的優(yōu)選培養(yǎng)基的具體實(shí)施例可見于，例如，本文中下面的實(shí)施例部分。
在本發(fā)明的培養(yǎng)基的一個(gè)方面，氯離子濃度以小于或等于大約2000ppm或大約2克每升培養(yǎng)物，更優(yōu)選小于或等于大約1.9g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.8g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.7g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.6g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.5g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.4g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.3g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.2g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.1g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.0g/l，更優(yōu)選小于或等于大約0.9g/l，更優(yōu)選小于或等于大約0.8g/l，更優(yōu)選小于或等于大約0.7g/l，更優(yōu)選小于或等于大約0.6g/l，更優(yōu)選小于或等于大約0.5g/l，更優(yōu)選小于或等于大約0.4g/l，和最優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l的濃度存在。在可替換的實(shí)施方案中，最小氯濃度為至少大約0.025g/l，至少大約0.05g/l，或至少大約0.1g/l。培養(yǎng)基的氯離子組分是優(yōu)選由氯化物鹽得到的，其優(yōu)選的鹽為氯化鈉。培養(yǎng)基中氯的其他來源包括氯化鉀和氯化鈣。氯離子的來源可包括培養(yǎng)基中的多于一種的含氯化合物，并可包括用來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH的氫氯酸，以及MnCl2和FeCl3。
在本發(fā)明的培養(yǎng)基的另一個(gè)方面，鉀離子濃度為大于大約0.25g/L。鉀離子通常以低水平存在于海水中，為大約0.38g/l海水。本領(lǐng)域已知的用于生長海洋微藻類的培養(yǎng)基嚴(yán)格(closely)遵循海水的組成，具有通常相同或更少的鉀離子水平。例如，Tuttle和Loeblich(1975)公開了9mM KCl，其相當(dāng)于大約0.35g/l鉀離子。在藻類學(xué)方法手冊(cè)(Handbook of Phycological Methods)(JanetR.Stein，Ed.，Cambridge University Press，1973)中，公開了培養(yǎng)基中的鉀離子作為氯化鉀為9.83mM，其相當(dāng)于大約0.36g/l鉀離子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括濃度為大于大約0.39g/l的鉀離子。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)一旦鉀離子大于閾值(threshold level)，培養(yǎng)對(duì)于鉀離子的精確濃度、在鉀離子濃度的范圍生長良好且產(chǎn)生商業(yè)上可行的水平的DHA相對(duì)不敏感。優(yōu)選地，鉀離子濃度的下界為至少大約0.2g/l，至少大約0.25g/l，至少大約0.3g/l，至少大約0.35g/l，至少大約0.4g/l，至少大約0.45g/l，至少大約0.5g/l，至少大約0.6g/l和至少大約0.7g/l。優(yōu)選地，鉀離子濃度的上界為至多大約10g/l，至多大約6g/l，至多大約4g/l，至多大約3g/l，至多大約2.8g/l，至多大約2.6g/l，至多大約2.4g/l，至多大約2.2g/l，至多大約2g/l，至多大約1.9g/l，至多大約1.8g/l，至多大約1.7g/l，至多大約1.6g/l，至多大約1.5g/l，和至多大約1g/l。鉀離子的最優(yōu)選的濃度為大約0.75g/l、0.8g/l、0.85g/l、0.9g/l和0.95g/l。鉀離子的優(yōu)選范圍為大約0.45g/l至大約1.5g/l；更優(yōu)選大約0.5g/l至大約1.2g/l；更優(yōu)選大約0.6g/l至大約1g/l；甚至更優(yōu)選大約0.7g/l至大約0.9g/l；和最優(yōu)選大約0.8g/l。
鉀離子的來源可來自適合細(xì)胞培養(yǎng)并尤其適合甲藻綱的微藻類的任何鉀鹽。鉀離子可源自培養(yǎng)基中的鹽的混合物。優(yōu)選的鉀鹽包括氯化鉀、硫酸鉀、乙酸鉀、碳酸氫鉀、磷酸鉀等。優(yōu)選的鉀離子來源是硫酸鉀。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，從培養(yǎng)物收獲的(at harvest)DHA產(chǎn)量大于不在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長的培養(yǎng)物中的DHA產(chǎn)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用低氯濃度使用本發(fā)明的方法的DHA產(chǎn)量為至少0.2克DHA每升7天培養(yǎng)物或0.04g DHA/109個(gè)細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述培養(yǎng)基也會(huì)包含除氯化鈉之外附加的鈉離子來源。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)鈉離子水平對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵性的。本發(fā)明的海洋生物的培養(yǎng)對(duì)于鈉離子的精確濃度、在鈉離子濃度的范圍生長良好且產(chǎn)生商業(yè)上可行的水平的DHA相對(duì)不敏感。許多不同來源的鈉離子適合本發(fā)明，其包括硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉和乙酸鈉。附加的鈉離子的優(yōu)選的來源是硫酸鈉。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含至少大約1g/l鈉離子直至大約8g/l鈉離子。在該范圍的下界，優(yōu)選的鈉離子濃度為至少大約1g/l，至少大約1.5g/l，至少大約2g/l，和至少大約2.5g/l。優(yōu)選地，鈉離子濃度的上界為至多大約15g/l，至多大約12g/l，至多大約10g/l，至多大約9g/l，至多大約8g/l，至多大約7g/l，至多大約6g/l，至多大約5.5g/l，至多大約5g/l，至多大約4.5g/l，至多大約4g/l。最優(yōu)選的鈉離子濃度為大約2.75g/l、3g/l、3.25g/l、3.5g/l和3.75g/l。鈉離子的優(yōu)選范圍是大約1.5g/l直至大約7.5g/l，甚至更優(yōu)選的是大約2.0g/l直至大約6g/l，和甚至更優(yōu)選的是大于大約2.5g/l直至大約5g/l。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，鈉離子為至少大約3g/l至大約3.5g/l。最優(yōu)選的鈉的水平為大約3.25g/l。如前所述，培養(yǎng)對(duì)于鈉的精確水平相對(duì)不敏感，并由此可使用甚至更高的水平。然而，一旦使用大于大約8g/l的鈉水平，培養(yǎng)產(chǎn)量開始輕微下降。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)甲藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生DHA的方法。所述培養(yǎng)基包含濃度小于或等于大約2g/l的氯離子，濃度大于或等于大約0.25g/l的鉀離子和以鈉∶鉀小于或等于大約27∶1重量比的比例存在的鈉離子。在此實(shí)施方案中，所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.2gDHA每升7天培養(yǎng)物或0.04g DHA/109個(gè)細(xì)胞。在此實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基含有鈉離子，其與鉀離子的比例小于或等于大約27∶1重量比。在海水中，鈉離子與鉀離子的比例為大約27.3∶1。換言之，鈉離子的量比鉀離子的量高大約27.3倍。在本發(fā)明中，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)相對(duì)于鈉離子增加鉀離子增加了培養(yǎng)物中的DHA產(chǎn)量。優(yōu)選的鈉離子與鉀離子的比例為小于或等于大約27∶1，小于或等于大約25∶1，小于或等于大約23∶1，小于或等于大約21∶1，小于或等于大約19∶1。更優(yōu)選的是小于或等于大約17∶1，小于或等于大約15∶1，小于或等于大約13∶1，小于或等于大約11∶1的比例。甚至更優(yōu)選的是小于或等于大約9∶1，小于或等于大約7∶1，或小于或等于大約5∶1的比例。優(yōu)選的比例為大約4∶1。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)甲藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生DHA的方法，其中所述培養(yǎng)基具有小于大約6的pH，且其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.2g DHA每升7天培養(yǎng)物或0.04g DHA/109個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH為小于或等于大約5.5，和更優(yōu)選小于或等于大約5。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH為小于或等于大約4.5。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包含小于或等于大約2g/l，優(yōu)選小于或等于大約1g/l，甚至更優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l的氯離子濃度。所述培養(yǎng)基也優(yōu)選包含濃度大于或等于大約0.25g/l，大于或等于大約0.4g/l，和甚至更優(yōu)選大于或等于大約0.8g/l的鉀離子。優(yōu)選地，鉀離子的來源是硫酸鉀。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包含鈉離子的來源以使鈉離子濃度為大約1g/l至大約8g/l。更優(yōu)選地，鈉離子為大約1.5g/l至大約5g/l。優(yōu)選的鈉離子的來源是硫酸鈉。通過此方法產(chǎn)生的生物量包含于此實(shí)施方案中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制備甲藻綱的菌種的耐受低pH的菌株的方法和由此產(chǎn)生的菌株。方法包括低pH培養(yǎng)基的制備和理想的甲藻綱菌種的傳代培養(yǎng)直到所述培養(yǎng)產(chǎn)生所需量的DHA。可用如下的方式進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將理想的甲藻綱菌種的接種物置于低pH培養(yǎng)基中并允許生長限定的時(shí)間，優(yōu)選7天。此時(shí)間長度不是關(guān)鍵性的，但應(yīng)進(jìn)行選擇以使菌株在到達(dá)衰老之前具有足夠的時(shí)間生長。計(jì)算培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量。如果小于所需的量，以如下的方式進(jìn)行附加的傳代培養(yǎng)。制備新鮮的低pH培養(yǎng)基并用低pH培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種，而且溫育合適的時(shí)間。計(jì)算培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量。如果DHA產(chǎn)量小于所需的量，重復(fù)傳代培養(yǎng)直到獲得所需的DHA產(chǎn)量。優(yōu)選的用于選擇耐受性的pH為大約6或以下，更優(yōu)選為大約5.5或以下，甚至更優(yōu)選為大約5或以下，和甚至更優(yōu)選為4.5或以下。實(shí)施此方法的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的pH調(diào)節(jié)至所需水平的任何培養(yǎng)基。其中進(jìn)行傳代培養(yǎng)的優(yōu)選的培養(yǎng)基是實(shí)施例1中描述的培養(yǎng)基。
本發(fā)明也包括通過本發(fā)明的方法之一產(chǎn)生的生物量。
與本發(fā)明的生物體和方法相一致的培養(yǎng)條件可通過本領(lǐng)域已知的方法獲得，并包括在美國專利5,130,242，美國專利No.5,407,957，美國專利No.5,397,591；美國專利No.5,492,938；和美國專利No.5,711,983中公開的方法，而且本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可容易地確定最佳條件。簡單地，可在任何合適的發(fā)酵罐，優(yōu)選在攪拌釜(stirred tank)發(fā)酵罐或氣升式(air lift)發(fā)酵罐中完成培養(yǎng)，所述的發(fā)酵罐給微生物提供氧的來源。應(yīng)將微生物的攪拌保持在一定水平以使在溶氧濃度足夠支持培養(yǎng)物生長和DHA產(chǎn)生的同時(shí)，所述攪拌不剪切或以另外的方式損害微生物。優(yōu)選的溶氧水平為至少10％的空氣飽和水平。更優(yōu)選地，將溶氧水平保持為大約10％至大約50％的空氣飽和水平。
可在任何維持生命的溫度進(jìn)行培養(yǎng)。通常，微生物將在大約15℃至大約34℃的溫度范圍生長。優(yōu)選將溫度保持在大約20℃至大約28℃。
可通過本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的常規(guī)手段收獲生物體，所述手段諸如離心、絮凝或過濾，并可立即處理或進(jìn)行干燥用于將來的加工。無論哪一樣都可提取脂質(zhì)。如本文中使用的，術(shù)語“脂質(zhì)”包括磷脂；游離脂肪酸；脂肪酸的酯類；三酰甘油(triacylglycerol)；二?；视王?diacylglyceride)；單?；视王?monoacylglyceride)；溶血磷脂(lysophospholipid)；肥皂(soap)；磷脂(phosphatide)；固醇(sterol)和固醇酯(sterol ester)；類胡蘿卜素(carotenoids)；葉黃素(xanthophyll)(例如，氧合類胡蘿卜素(oxycarotenoids))；碳?xì)浠衔?hydrocarbons)；和本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其他脂質(zhì)。如技術(shù)人員充分理解的，本發(fā)明涉及的DHA可為這些不同脂質(zhì)的形式，并且不限于游離的脂肪酸。依賴于使用的提取技術(shù)，可提取脂質(zhì)的不同形式或組分。可用有效量的溶劑提取脂質(zhì)。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可確定合適的溶劑。通常用極性溶劑(例如，氯仿/甲醇)提取極性脂質(zhì)(例如，磷脂)而且通常用非極性溶劑(例如，己烷)提取中性脂質(zhì)(例如，三酰甘油)。優(yōu)選的溶劑是純己烷。己烷與干生物量(dry biomass)的合適的比例為大約4升己烷每千克干生物量。優(yōu)選將己烷與生物量在攪拌反應(yīng)容器在大約50℃的溫度混合大約2小時(shí)?；旌虾?，將生物量過濾并與含油的己烷分離。通過本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的蒸餾技術(shù)從油中移除己烷。常規(guī)的含油種子(oilseed)加工設(shè)備適于進(jìn)行過濾、分離和蒸餾。如果具體應(yīng)用要求或需要，可進(jìn)行本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的附加的加工步驟。在如下的參考文獻(xiàn)中描述了脂質(zhì)回收的可替換的方法，所述參考文獻(xiàn)整體并入作為參考PCT Publication WO 0176715，題目是“Method for theFractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials”；PCTPublication WO0176385，題目是“Method For The Fractionation Of Oil and PolarLipid-Containing Native Raw Materials Using Alcohol and Centrifugation”；PCTPublication WO0153512，題目是“Solventless Extraction Process”。
本發(fā)明，雖然是依據(jù)具體的生物體和方法公開的，但意欲包括所有這樣的方法和菌株，它們可根據(jù)在本文中公開的教導(dǎo)得到而且是有用的，所述的教導(dǎo)包括所有替換、修飾和優(yōu)化，其對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是可利用的手段。為了說明的目的而不是限制本發(fā)明的范圍提供了如下的實(shí)施例和試驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例1此實(shí)施例描述了含4.5g/l NaCl的標(biāo)準(zhǔn)篩選培養(yǎng)基(Standard ScreeningMedium)(SSM)的制備。為了制備該培養(yǎng)基，第一步包括將如下化合物加入蒸餾水至90％的最終需要的體積，如表1所示。所有化合物可從Sigma Aldrich，St.Louis，MO得到。
表1.高壓滅菌之前培養(yǎng)基的量和終濃度


1二水合氯化鈣為244g/mol，含氯28.7％。
2將儲(chǔ)液單獨(dú)高壓滅菌并以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基；每兩周制備新鮮的。
3將儲(chǔ)液通過0.2微米過濾器過濾除菌；在黑暗中貯存于4℃。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。
4將儲(chǔ)液單獨(dú)高壓滅菌。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。
用無菌水使高壓滅菌的培養(yǎng)基達(dá)到100％體積。對(duì)于篩選實(shí)驗(yàn)，將35ml的SSM培養(yǎng)基加入無菌的250ml錐形瓶(Erlenmeyer flask)。每個(gè)錐形瓶加入1ml的接種物用于1×105個(gè)細(xì)胞每ml的初始細(xì)胞濃度。接種物為5-6天的培養(yǎng)物。在26.5℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以135rpm生長培養(yǎng)物。
實(shí)施例2此實(shí)施例描述了含1.41g/l NaCl(其連同氯化鈣和氯化鉀產(chǎn)生大約1000ppm，1g/l氯離子)的1000ppm氯離子篩選培養(yǎng)基(SSM)的制備。為了制備該培養(yǎng)基，第一步包括將如下化合物加入去離子的蒸餾水至90％的最終需要的體積，如表2所示。所有化合物可從SigmaAldrich，St.Louis，MO得到。
表2.高壓滅菌之前培養(yǎng)基的量和終濃度


1將儲(chǔ)液單獨(dú)高壓滅菌并以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基；每兩周制備新鮮的。
2將儲(chǔ)液通過0.2微米過濾器過濾除菌；在黑暗中貯存于4℃。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。
3將儲(chǔ)液單獨(dú)高壓滅菌。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。
用無菌水使高壓滅菌的培養(yǎng)基達(dá)到100％體積。對(duì)于篩選實(shí)驗(yàn)，將35ml的SSM培養(yǎng)基加入無菌的250ml錐形瓶。每個(gè)錐形瓶加入1ml的接種物用于1×105個(gè)細(xì)胞每ml的初始細(xì)胞濃度。接種物為5-6天的培養(yǎng)物。在26.5℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以135rpm生長培養(yǎng)物。
實(shí)施例3此實(shí)施例描述了含0.211g/l NaCl(其連同氯化鈣和氯化鉀產(chǎn)生大約0.3g/l氯離子)的300ppm氯離子篩選培養(yǎng)基(SSM)的制備。為了制備該培養(yǎng)基，第一步包括將如下化合物加入去離子的蒸餾水至90％的最終需要的體積，如表3所示。所有化合物可從Sigma Aldrich，St.Louis，MO得到。
表3.高壓滅菌之前培養(yǎng)基的量和終濃度

1將儲(chǔ)液單獨(dú)高壓滅菌并以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基；每兩周制備新鮮的。
2將儲(chǔ)液通過0.2微米過濾器過濾除菌；在黑暗中貯存于4℃。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。
3將儲(chǔ)液單獨(dú)高壓滅菌。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。
用無菌水使高壓滅菌的培養(yǎng)基達(dá)到100％體積。對(duì)于篩選實(shí)驗(yàn)，將35ml的SSM培養(yǎng)基加入無菌的250ml錐形瓶。每個(gè)錐形瓶加入1m1的接種物用于1×105個(gè)細(xì)胞每ml的初始細(xì)胞濃度。接種物為5-6天的培養(yǎng)物。在26.5℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以135rpm生長培養(yǎng)物。
實(shí)施例4此實(shí)施例描述了在pH 6.3 SSM中生長和收獲寇氏隱甲藻的步驟。
依據(jù)將哪種培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例1-3之一所述制備SSM培養(yǎng)基。如實(shí)施例1-3所述制備附加的培養(yǎng)基組分并加入培養(yǎng)基。收獲之前的所有步驟在無菌條件進(jìn)行。
為了制備接種培養(yǎng)物，使用如下的步驟。向250ml錐形瓶中，將49mlSSM(實(shí)施例1中所述)加入250ml錐形瓶。加入1ml C.cohnii菌株T-HF(菌株T-HF鑒定為已被重復(fù)培養(yǎng)的生物體ATCC 40750)的五天培養(yǎng)物。將培養(yǎng)瓶放置在27℃無光的培養(yǎng)箱中以135rpm旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)器上。生長三天后，將培養(yǎng)物移至無菌防護(hù)罩(sterile hood)，移出1ml并使用庫爾特計(jì)數(shù)器(CoulterCounter)(Coulter Z2 Particle Count and Size Analyzer，由Beckman Coulter，Inc.得到)計(jì)數(shù)。使用細(xì)胞數(shù)計(jì)算接種培養(yǎng)物的量，所述接種培養(yǎng)物的量必須用于開始新的50ml培養(yǎng)物，其細(xì)胞密度為1.0×105個(gè)細(xì)胞每ml。
為了測試不同的培養(yǎng)基組分，如下所述配制適合的培養(yǎng)基并導(dǎo)入無菌的250ml錐形瓶。將如前計(jì)算的接種物的量導(dǎo)入含有在錐形瓶中制備的培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶。將所述培養(yǎng)瓶放置在27℃無光的培養(yǎng)箱中以135rpm旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)器上。7天的生長之后，如下收獲培養(yǎng)物。
對(duì)于每種培養(yǎng)物而言，將50ml離心管(從VWR Scientific得到)作標(biāo)記并稱重。對(duì)于每種培養(yǎng)物而言，標(biāo)記另一個(gè)50ml離心管，但不稱重。然后將培養(yǎng)物注入標(biāo)記的50ml管。記錄體積并用Coulter Z2 Particle Count and SizeAnalyzer進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。測量pH。
將一半培養(yǎng)物注入配衡的(tared)50ml管，并加入擦洗用異丙醇(isopropylrubbing alcohol)(IPA)的70％溶液以使管內(nèi)的總體積達(dá)到50ml。通過將管倒轉(zhuǎn)2-3次混合培養(yǎng)物。然后使用Sorvall General Purpose RC-3 Centrifuge將培養(yǎng)物在4000rpm離心5分鐘。倒掉上清。將另一半培養(yǎng)物注入上述沉淀(pellet)上并從IPA的70％溶液開始重復(fù)上述步驟。然后以39％IPA使用如下步驟將沉淀洗滌兩次將35mL 39％IPA加入細(xì)胞沉淀；(使用來自VWR Scientific的Vortex Genie-2)將管以全速渦旋10秒；收集后，將沉淀冷凍-干燥至少48小時(shí)。
將含有沉淀(生物量)的管稱重并計(jì)算生物量的干重。如下計(jì)算干重確定含有生物量的管的重量減去管的自重。將此數(shù)字除以收獲時(shí)記錄的培養(yǎng)物的體積，除以1000。
可根據(jù)在Morrison和Smith，″Preparation of Fatty Acid Methyl Esters和Dimethylacetals from Lipid with Boron Fluoride-Methanol″，Journal of LipidResearch，Vo.5，1964，和the American Oil Chemist′s Society Official Methodsused to quantitate long chain Fatty Acid and eicosapentaenoic acid(EPA)和DHAin marine oils(Method CeIb-89)中公開的步驟測定脂肪酸組成(和％DHA)。簡單地，將樣品與標(biāo)準(zhǔn)量的油(內(nèi)標(biāo))混合，用0.5N甲醇化氫氧化鈉(methanolicsodium hydroxide)皂化，并用三氟化硼(boron trifluoride)/甲醇衍生。提取脂肪酸甲酯并在氣相色譜上用火焰離子化檢測器(使用30m×0.25mm×0.25μmRestek FAMEWAX#12497柱的Hewlett Packard 5890 Series II Plus氣相色譜)分析。
實(shí)施例5此實(shí)施例描述了使用現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基在低NaCl水平生長C.cohnii并產(chǎn)生DHA。
制備1升不含NaCl的SSM并高壓滅菌。制備4種濃縮的NaCl的貯存物(135g/l、90g/l、45g/l和22.5g/l)。在每個(gè)含有48.75ml無NaCl的SSM培養(yǎng)基的搖瓶中加入1.25ml適合的NaCl貯存物。建立兩種對(duì)照4.5g/l NaCl使用如實(shí)施例1中所述的正常SSM，和無NaCl使用不加NaCl的SSM。使用每個(gè)NaCl水平的重復(fù)。
如實(shí)施例4所述進(jìn)行生長和收獲。表5描述了此實(shí)施例的結(jié)果。所有給出的數(shù)字為兩次培養(yǎng)的平均值。
表5.在含有減少量的NaCl的SSM中生長的C.cohnii的生物量、％DHA、％脂肪和DHA產(chǎn)量。

1表明只來自氯化鈉的氯離子的量(0.20g/l)。參見實(shí)施例1-3。
表5顯示在含有減少量的NaCl的SSM中生長的C.cohnii的生物量的產(chǎn)量、％脂肪、和DHA產(chǎn)量?？梢钥闯鲭S著加入培養(yǎng)物的NaCl量的減少，生物量產(chǎn)量和脂肪水平都下降，導(dǎo)致DHA的產(chǎn)量降低。
實(shí)施例6此實(shí)施例描述了用實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基中的4.5g/l NaCl獲得的DHA產(chǎn)量。
如實(shí)施例4所述生長培養(yǎng)物。表6顯示此實(shí)施例的結(jié)果。
表6.在實(shí)施例1的SSM中生長的C.cohnii的生物量、％DHA、％脂肪和DHA產(chǎn)量。

1表明只來自氯化鈉的氯離子的量。
實(shí)施例7此實(shí)施例描述了使用以硫酸鉀和硫酸鈉形式的鉀離子和鈉離子的不同濃度，在低氯培養(yǎng)基中增強(qiáng)的C.cohnii生長和DHA產(chǎn)生。
使用0.18g/l乙酸鈣并省去氯化鈣和氯化鉀，以實(shí)施例3中描述的方式制備低氯SSM。使用二維矩陣相對(duì)于4.9g/l，9.8g/l，14.7g/l，19.6g/l和24.5g/l的Na2SO4濃度測試0.16g/l，0.80g/l，1.6g/l，3.2g/l和4.8g/l的K2SO4濃度的每種可能的組合。如實(shí)施例4所述生長所有的培養(yǎng)物。結(jié)果顯示于表7中。
表7.在含有變化濃度的硫酸鉀和硫酸鈉的培養(yǎng)基中生長的C.cohnii得到的生物量、％DHA、％脂肪和DHA產(chǎn)量的比較


1包括由0.45g/l氯化鈉或0.18g/l鈉離子加入的鈉離子。
表7中顯示的結(jié)果表明增加的鉀水平使C.cohnii的生長和DHA的產(chǎn)量可與在高氯水平獲得的情況相比較。此實(shí)施例中的增強(qiáng)效果出現(xiàn)在0.8g/l硫酸鉀，其為測定的第二低的水平，并且其后對(duì)于硫酸鉀的量相對(duì)地不敏感。在測定的硫酸鉀的最高水平4.8g/l，好像產(chǎn)量有輕微的下降。生長和DHA產(chǎn)量也顯得對(duì)于使用的硫酸鈉的量相對(duì)不敏感，然而，從大約19.6g/l硫酸鈉開始，隨著使用的硫酸鈉的量的增加，生長和產(chǎn)量輕微地降低?；贒HA以g/L表示的量的最佳組合是那些使用0.8g/L K2SO4和9.8g/L Na2SO4，其代表在(實(shí)施例3中描述的)正常的低氯SSM之上鉀的5x增加和鈉的2x增加；和1.6g/L K2SO4和9.8g/L Na2SO4，其代表在(實(shí)施例3中描述的)正常的低氯SSM之上鉀的10x增加和鈉的2x增加。
實(shí)施例8此實(shí)施例說明使用含有0.32g/l，0.64g/l，0.96g/l，1.28g/l，1.60g/l和1.9g/l的硫酸鉀和4.9g/l和9.8g/l的硫酸鈉的范圍的培養(yǎng)基的C.cohnii生長和DHA產(chǎn)生的增強(qiáng)。
以實(shí)施例7中描述的方式制備低氯SSM，并如實(shí)施例4所述生長所有的培養(yǎng)物。結(jié)果顯示于表8中。
表8.在含有變化濃度的硫酸鉀和硫酸鈉的培養(yǎng)基中生長的C.cohnii得到的生物量、％DHA、％脂肪和DHA產(chǎn)量的比較

1包括由0.45g/l氯化鈉或0.18g/l鈉離子加入的鈉離子。
表8所示的結(jié)果顯示最佳的DHA產(chǎn)量出現(xiàn)在K2SO4濃度為1.28g/L及Na2SO4濃度為9.8g/L。表8所示的結(jié)果說明在硫酸鉀水平低至0.32g/l時(shí)可看出附加鉀的效果，并呈現(xiàn)相對(duì)的恒定直到1.90g/l。對(duì)于4.9g/l或9.8g/l的硫酸鈉水平而言，生長和產(chǎn)量相對(duì)不敏感。
實(shí)施例9如下實(shí)施例描述了傳代培養(yǎng)C.cohnii以獲得適于在pH 5生長的菌株。
以實(shí)施例4中描述的方式在搖瓶中，在實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)C.cohnii菌株T-HF，除了在培養(yǎng)開始時(shí)培養(yǎng)基的pH為pH 5。7天之后，使用來自該培養(yǎng)物的接種物在相同條件下在pH 5開始新的培養(yǎng)。起初在pH 5生長是緩慢的，但在多次傳代(multiple transfers)后，DHA產(chǎn)量開始增加而且一段時(shí)間后已經(jīng)達(dá)到在pH 6.3生長的培養(yǎng)物中所見的產(chǎn)量，從而產(chǎn)生低pH菌株。參見圖1。注意到在7天生長期的結(jié)尾所述培養(yǎng)物的pH為5.4。由于檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、乙酸鹽和乳酸鹽緩沖液對(duì)于菌株T-HF的毒性作用(toxiceffect)，使用這些緩沖液以使所述菌株適應(yīng)(adapt)的嘗試是不成功的。
然后在前述的pH 5培養(yǎng)基中生長低pH菌株，但將pH保持在5.0。所述適應(yīng)低pH的菌株在pH 5和在pH 5.4同樣生長良好。
實(shí)施例10如下的實(shí)施例描述了來自在pH 6.3和2730ppm氯離子培養(yǎng)基中生長的C.cohnii菌株T-HF的DHA產(chǎn)量與在pH 5在1000ppm氯離子培養(yǎng)基中的低pH菌株的DHA產(chǎn)量的比較。
在如實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基中，如實(shí)施例4所述生長C.cohnii菌株T-HF。在添加了硫酸鉀和硫酸鈉的如實(shí)施例2所述的低氯培養(yǎng)基中生長C.cohnii菌株。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行，每天收獲所有的搖瓶以測定DHA產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示于圖1中。圖1顯示在兩種不同的培養(yǎng)基條件下DHA產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)幾乎相同。
實(shí)施例11如下的實(shí)施例描述了使C.cohnii菌株T-HF適應(yīng)于在pH 4.5在2730ppm氯離子培養(yǎng)基中生長的嘗試。
以實(shí)施例10中描述的方式生長C.cohnii菌株T-HF，除了將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到pH 4.5并用賴氨酸代替一半的MSG，同時(shí)保持培養(yǎng)基中有機(jī)氮的恒定水平。
重復(fù)培養(yǎng)后，得到的DHA產(chǎn)量為在pH 5或pH 6.3所見產(chǎn)量的大約三分之一。
實(shí)施例12如下的實(shí)施例描述了通過控制鉀濃度限定在pH 4.5 C.cohnii生長和DHA產(chǎn)量的條件的嘗試。
A.在pH 4.5在2.73g/l氯離子進(jìn)行析因?qū)嶒?yàn)(factorial experiment)以評(píng)估鉀離子的效果(0.16g/l至3.2g/l)。結(jié)果顯示鉀離子的更高水平使DHA產(chǎn)量增加到在pH 6.3及如實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基生長的C.cohnii得到的產(chǎn)量的大約三分之二。
B.以上述A部分所述的方式進(jìn)行析因?qū)嶒?yàn)，除了將氯離子水平保持恒定在1.0g/l。結(jié)果顯示鉀離子的更高水平使DHA產(chǎn)量增加到在pH 6.3及如實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基生長的C.cohnii得到的產(chǎn)量的大約三分之二。在2.73g/l氯離子(上面A部分所述)和在1.0g/l氯離子得到的DHA產(chǎn)量是可以比較的。
實(shí)施例13此實(shí)施例描述了比較使用實(shí)施例12中所述的pH 4.5菌株和菌株T-HF在pH 6.3，1.0g/l氯離子得到的DHA的產(chǎn)量的時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)。
在如表9具體說明的低氯，pH 4.5培養(yǎng)基中以實(shí)施例4所述的方式后，在搖瓶中生長實(shí)施例12的pH 4.5菌株。使用實(shí)施例1中所述的培養(yǎng)基以實(shí)施例4所述的方式生長C.cohnii菌株T-HF。在pH 4.5制備用于pH 4.5實(shí)驗(yàn)的接種物，并由于細(xì)胞在pH 4.5聚結(jié)(clumping)而估計(jì)接種物的量。
表9.低氯，pH 4.5培養(yǎng)基


每天收獲搖瓶以測定DHA產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖2)顯示在pH 4.5的DHA產(chǎn)量總是低于在pH 6.3的產(chǎn)量，但是DHA產(chǎn)量增加的速率作為時(shí)間的函數(shù)在每個(gè)pH是大約相同的。這說明在pH 4.5，所述培養(yǎng)物能夠以與pH 6.3的培養(yǎng)物相同的速率積累DHA，然而，與pH 6.3相比，在pH 4.5生長的培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量存在遲滯。
此結(jié)果說明給定額外的時(shí)間，即大約24小時(shí)，在pH 4.5的DHA產(chǎn)量與在pH 6.3相同。不清楚所述的遲滯是否是由于在pH 4.5DHA積累的延遲引起，并作為結(jié)果，所述pH 4.5培養(yǎng)物總是具有低于相同菌齡(same age)的pH 6.3培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量，或所述的遲滯是否是由于所述pH 4.5培養(yǎng)物未接受等量的接種物引起。在pH 4.5，菌株T-HF細(xì)胞聚結(jié)以致不可能得到培養(yǎng)物的準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，而且必須估計(jì)使用的接種物的量。因此，可能所述pH 4.5培養(yǎng)物接受較少的接種物并因此在DHA產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)中產(chǎn)生明顯的遲滯。
無論如何，這些數(shù)據(jù)表明通過使用所述適應(yīng)低pH的C.cohnii菌株和直接的(instant)pH 4.5培養(yǎng)基，如果延長培養(yǎng)時(shí)間，可獲得與在pH 6.3的培養(yǎng)基相同的DHA產(chǎn)量。
實(shí)施例14使用實(shí)施例10中描述的技術(shù)，進(jìn)行上面實(shí)施例13中描述的離子濃度的進(jìn)一步優(yōu)化和已經(jīng)適應(yīng)pH 5的C.cohnii菌株T-HF的進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，以減少遲滯時(shí)間，導(dǎo)致在pH 4.5的7天DHA產(chǎn)量可與在pH 6.3及如實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基中生長的C.cohnii得到的產(chǎn)量相比較。
在前述說明書中已經(jīng)描述了本發(fā)明的原理、優(yōu)選的實(shí)施方案和操作模式。然而，不應(yīng)將意欲在本文中被保護(hù)的本發(fā)明理解為局限于公開的具體形式，因?yàn)樗鼈儗⒈徽J(rèn)為是說明性的而不是限制性的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的精神的前提下進(jìn)行變化和改變。因此，應(yīng)將前述實(shí)施本發(fā)明的最佳方式認(rèn)為實(shí)際上是說明性的，并且不作為如在所附的權(quán)利要求中列出的本發(fā)明的范圍和精神的限制。
權(quán)利要求
1.通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述的培養(yǎng)基包含(a)濃度小于或等于大約2g/l的氯離子；和(b)濃度大于或等于大約0.25g/L的鉀離子；其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04g DHA每109個(gè)細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微藻類是隱甲藻屬的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述微藻類是寇氏隱甲藻菌種的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中氯離子的濃度小于或等于大約1.0g/l。
5.權(quán)利要求1的方法，其中氯離子的濃度小于或等于大約0.3g/l。
6.權(quán)利要求1的方法，其中鉀離子的濃度大于或等于大約0.4g/L。
7.權(quán)利要求1的方法，其中鉀離子的濃度大于或等于大約0.8g/L。
8.權(quán)利要求1的方法，其中鉀離子的來源是硫酸鉀。
9.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步包括濃度為大約1g/L至大約8g/l的鈉離子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中鈉離子的濃度為大約1.5g/l至大約5g/L。
11.權(quán)利要求9的方法，其中鈉離子的來源是硫酸鈉。
12.權(quán)利要求9的方法，其中鉀離子的濃度為大約0.8g/L和鈉離子的濃度為大約3.2g/L。
13.通過權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的生物量。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.10g DHA每109個(gè)細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.20g DHA每109個(gè)細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1的方法，還包括從所述微藻類中回收含DHA的脂質(zhì)。
17.通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述的培養(yǎng)基包含(a)濃度小于或等于大約2g/l的氯離子；(b)濃度大于或等于大約0.25g/L的鉀離子；和(c)鈉∶鉀比例為小于或等于大約27∶1重量比的鈉離子；其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04g DHA每109個(gè)細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述微藻類是隱甲藻屬的。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述微藻類是寇氏隱甲藻菌種的。
20.權(quán)利要求17的方法，其中鉀離子的來源是硫酸鉀。
21.權(quán)利要求17的方法，其中鈉離子的來源是硫酸鈉。
22.權(quán)利要求17的方法，其中氯離子的濃度小于或等于大約1.0g/l。
23.權(quán)利要求17的方法，其中氯離子的濃度小于或等于大約0.3g/l。
24.權(quán)利要求17的方法，其中鉀離子的濃度大于或等于大約0.4g/L。
25.權(quán)利要求17的方法，其中鉀離子的濃度大于或等于大約0.8g/L。
26.權(quán)利要求17的方法，其中鈉∶鉀比例為小于或等于大約15∶1重量比。
27.權(quán)利要求17的方法，其中鉀離子的濃度為大約0.8g/L而鈉∶鉀比例為大約4∶1重量比。
28.通過權(quán)利要求17的方法產(chǎn)生的生物量。
29.權(quán)利要求17的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.10g DHA每109個(gè)細(xì)胞。
30.權(quán)利要求17的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.20g DHA每109個(gè)細(xì)胞。
31.權(quán)利要求17的方法，還包括從所述微藻類中回收含DHA的脂質(zhì)。
32.通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述培養(yǎng)基具有小于大約6.0的pH，和其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04g DHA每升7天培養(yǎng)物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述微藻類是隱甲藻屬的。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述微藻類是寇氏隱甲藻菌種的。
35.權(quán)利要求32的方法，其中pH小于或等于大約5.5。
36.權(quán)利要求32的方法，其中pH小于或等于大約5.0。
37.權(quán)利要求32的方法，其中pH或等于大約4.5。
38.權(quán)利要求32的方法，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括(a)濃度小于或等于大約2g/l的氯離子；和(b)濃度大于或等于大約0.25g/L的鉀離子。
39.權(quán)利要求38的方法，其中氯離子的濃度為小于或等于大約1.0g/l。
40.權(quán)利要求38的方法，其中氯離子的濃度為小于或等于大約0.3g/l。
41.權(quán)利要求38的方法，其中鉀離子的濃度為大于或等于大約0.4g/L。
42.權(quán)利要求38的方法，其中鉀離子的濃度為大于或等于大約0.8g/L。
43.權(quán)利要求38的方法，其中鉀離子的來源是硫酸鉀。
44.權(quán)利要求38的方法，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步包含濃度為大約1g/L至大約8g/l的鈉離子。
45.權(quán)利要求44的方法，其中鈉離子的濃度為大約1.5g/l至大約5g/L。
46.權(quán)利要求44的方法，其中鈉離子的來源是硫酸鈉。
47.權(quán)利要求44的方法，其中鉀離子的濃度為大約0.8g/L，鈉離子的濃度為大約3.2g/L且pH為大約5.0。
48.權(quán)利要求44的方法，其中鉀離子的濃度為大約0.8g/L，鈉離子的濃度為大約3.2g/L且pH為大約4.5。
49.通過權(quán)利要求32的方法產(chǎn)生的生物量。
50.權(quán)利要求32的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.10g DHA每109個(gè)細(xì)胞。
51.權(quán)利要求32的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.20g DHA每109個(gè)細(xì)胞。
52.權(quán)利要求32的方法，還包括從所述微藻類中回收含DHA的脂質(zhì)。
53.選擇耐受低pH的甲藻綱的異養(yǎng)微藻類的方法，其包括將所述的微藻類在低pH培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)直到DHA的產(chǎn)量大于或等于大約0.04g DHA每109個(gè)細(xì)胞。
54.權(quán)利要求53的方法，其中pH小于或等于大約6。
55.權(quán)利要求53的方法，其中pH小于或等于大約5。
56.權(quán)利要求53的方法，其中pH小于或等于大約4.5。
57.通過權(quán)利要求53的方法產(chǎn)生的生物量。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過海洋微生物，包括異養(yǎng)的海洋溝鞭藻類隱甲藻，使用低水平的氯離子產(chǎn)生高度不飽和的脂肪酸的方法。具體地，通過控制鈉離子和鉀離子水平在低氯培養(yǎng)基中生長海洋微生物增加高度不飽和的脂肪酸產(chǎn)量的方法。本發(fā)明也涉及通過海洋生物在低pH水平產(chǎn)生高度不飽和的脂肪酸的方法，并包括產(chǎn)生耐受低pH的菌株的方法。
文檔編號(hào)A61K36/02GK1890376SQ200480035685
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2004年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日
發(fā)明者保羅·W·貝倫斯, 約翰·M·湯普森, 柯克·阿普特, 約瑟夫·W·法伊弗第三, 詹姆斯·P·溫, 詹姆斯·C·利普邁耶, 賈奧亞德·菲克塔里, 喬恩·漢森 申請(qǐng)人:馬泰克生物科學(xué)公司