專(zhuān)利名稱(chēng)：神經(jīng)酰胺酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有來(lái)源于植物的處理物、例如提取物的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑、含有該抑制劑的藥品、準(zhǔn)藥、化妝品、食品。
背景技術(shù)：
鞘脂(鞘糖脂、鞘磷脂以及它們的代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺等)作為控制細(xì)胞增殖、分化、編程性細(xì)胞死亡等的信息分子，近年來(lái)迅速受到人們的關(guān)注。在癌癥、自身免疫疾病、感染癥等疾病中，鞘脂代謝發(fā)生很大變化，因此鞘脂作為制藥的目標(biāo)，受到人們的強(qiáng)烈關(guān)注。其中，可以認(rèn)為神經(jīng)酰胺是鞘脂的基本骨架脂質(zhì)，是調(diào)控細(xì)胞的生與死的重要因子。目前已知至少有三種神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生路徑。它們是1)由絲氨酸與棕櫚酰CoA的縮合反應(yīng)起始的從頭合成路徑、2)鞘磷脂的分解體系、3)葡糖神經(jīng)酰胺的分解體系。其中，鞘磷脂的分解體系通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的TNF-α、Fas等細(xì)胞因子、血清枯竭(血清枯渴)、紫外線(xiàn)、放射線(xiàn)照射、氧化脅迫而被激活。其它通過(guò)維生素D3、干擾素γ、白細(xì)胞介素1β等分化因子來(lái)分解鞘磷脂，由此使神經(jīng)酰胺的生成亢進(jìn)。另外，通過(guò)由細(xì)胞外添加神經(jīng)酰胺類(lèi)似物--C2-神經(jīng)酰胺(D-赤型-N-乙酰基鞘氨醇)誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)分化、抑制增殖等現(xiàn)象，或者通過(guò)用細(xì)菌的鞘磷脂酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，由于鞘磷脂酶的分解而使神經(jīng)酰胺蓄積、與添加C2-神經(jīng)酰胺同樣地，可抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，因此可認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺發(fā)揮著重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的功能。
神經(jīng)酰胺通過(guò)神經(jīng)酰胺酶的作用而被分解為游離脂肪酸和長(zhǎng)鏈堿--鞘氨醇。鞘氨醇的1位羥基被磷酸化，代謝為鞘氨醇-1-磷酸。已知鞘氨醇-1-磷酸與神經(jīng)酰胺相反，顯示細(xì)胞增殖促進(jìn)作用，抑制由神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。這樣，可以認(rèn)為在細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞死亡等的調(diào)控中，細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺及其代謝產(chǎn)物鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸等的平衡是非常重要的。因此，作為調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞死亡的藥物，使細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的量增加且使鞘氨醇或鞘氨醇-1-磷酸水平減少的藥物是極有用的。
神經(jīng)酰胺由L-絲氨酸和棕櫚酰CoA進(jìn)行從頭合成，已知抑制該合成體系的起始酶棕櫚酰CoA絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的物質(zhì)有ISP-I(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)或神經(jīng)鞘真菌纖維素B(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。還已知由二氫鞘氨醇轉(zhuǎn)換為二氫神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)換酶--?；鵆oA二氫鞘氨醇N-酰基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑有伏馬菌素(フモニシソ)B1(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。這些物質(zhì)都抑制神經(jīng)酰胺的從頭合成，使細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺量減少。
另一方面，已知作為使神經(jīng)酰胺水平升高的物質(zhì)，抑制UDP-葡萄糖神經(jīng)酰胺葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性的物質(zhì)D-蘇型PDMP神經(jīng)酰胺葡糖基轉(zhuǎn)移酶是將葡萄糖轉(zhuǎn)移到神經(jīng)酰胺上，合成葡糖神經(jīng)酰胺(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)，已知該物質(zhì)引起細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的增加。但是，該酶是鞘糖脂生物合成的起始酶，因此鞘糖脂的合成也會(huì)受到抑制。
已知作為調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺和鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸的平衡的代謝酶，中性/堿性神經(jīng)酰胺酶(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)5、非專(zhuān)利文獻(xiàn)6和非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)、堿性神經(jīng)酰胺酶(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)的重要性受到人們的重視，但是，抑制這些酶的活性的物質(zhì)幾乎不為人所知。唯一已知的神經(jīng)酰胺的類(lèi)似物--D-赤型-2-(N-肉豆蔻酰氨基)-1-苯基-1-丙醇(D-赤型-MAPP)抑制堿性神經(jīng)酰胺酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺水平升高(例如參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1和非專(zhuān)利文獻(xiàn)9)。但是，該物質(zhì)對(duì)于中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的抑制活性不強(qiáng)，完全不能滿(mǎn)足需要。非專(zhuān)利文獻(xiàn)10中同樣記載了神經(jīng)酰胺的類(lèi)似物(1R，2R)-2-N-肉豆蔻酰氨基-1-(4-硝基苯基)-1，3-丙二醇(D-NMAPPD或B13)，與抑制堿性神經(jīng)酰胺酶相比，該化合物更有效地抑制酸性神經(jīng)酰胺酶，并未報(bào)道對(duì)中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的有效的抑制物質(zhì)。非專(zhuān)利文獻(xiàn)9中記載了N-油?；掖及肪哂袑?duì)酸性神經(jīng)酰胺酶的抑制效果，但該物質(zhì)對(duì)中性/堿性神經(jīng)酰胺酶幾乎不顯示抑制效果。專(zhuān)利文獻(xiàn)2中公開(kāi)了抑制皮膚角層中神經(jīng)酰胺分解、含有郁金、虎耳草、積雪草、海蔥(カィソゥ)的提取液的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，以及含有這些的皮膚外用藥，但沒(méi)有記載這些植物提取物對(duì)中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的抑制效果，并且皮膚神經(jīng)酰胺水平的升高效果也不充分。
另一方面，神經(jīng)酰胺是皮膚中的主要細(xì)胞間脂質(zhì)成分，對(duì)于皮膚的保濕性能、阻擋機(jī)制具有重要的作用。近年來(lái)，患者數(shù)量增加的特應(yīng)性皮炎患者的皮膚角層中，神經(jīng)酰胺含量減少，可以認(rèn)為這是特應(yīng)性皮炎的特征--皮膚干燥以及角層的阻擋功能異常的原因之一。最近有報(bào)道稱(chēng)與健康人相比，從特應(yīng)性皮炎患者中高頻率地檢出神經(jīng)酰胺酶生產(chǎn)菌(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)11)。另外，從特應(yīng)性皮炎患者中分離出了神經(jīng)酰胺酶生產(chǎn)菌綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)AN17菌株，并對(duì)該神經(jīng)酰胺酶進(jìn)行了純化、克隆(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)12和非專(zhuān)利文獻(xiàn)13)。由于所述細(xì)菌生產(chǎn)的神經(jīng)酰胺酶分解特應(yīng)性皮炎患者皮膚中的神經(jīng)酰胺，因此角層的神經(jīng)酰胺減少，皮膚的阻擋功能降低，可導(dǎo)致疾病惡化。但是，對(duì)于抑制來(lái)源于微生物的神經(jīng)酰胺酶的活性的特異性抑制物質(zhì)尚完全不知曉。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1國(guó)際公布第97/44019號(hào)小冊(cè)子專(zhuān)利文獻(xiàn)2日本專(zhuān)利公開(kāi)第2002-308791號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1Miyake Y、另外4人、Biochem.Biophys.Res.Commun.、第211卷、第396-403頁(yè)(1995)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2Zweerink MM、另外4人、The Journal ofBiological Chemistry、第267卷、第25032-25038頁(yè)(1992)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3Wang E、另外4人、The Journal of BiologicalChemistry、第266卷、第14486-14490頁(yè)(1991)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4Inokuchi J、另外1人、J.Lipid Res.、第28卷、第565-571頁(yè)(1987)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5Tani M、另外5人、The Journal of BiologicalChemistry、第275卷、第11229-11234頁(yè)(2000)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6Mitsutake S、另外8人、The Journal ofBiological Chemistry、第276卷、第26249-26259頁(yè)(2001)非專(zhuān)利文獻(xiàn)7E1 Bawab S、另外5人、The Journal of BiologicalChemistry、第275卷、第21508-21513頁(yè)(2000)非專(zhuān)利文獻(xiàn)8Mao C、另外5人、The Journal of BiologicalChemistry、第276卷、第26577-26588頁(yè)(2001)非專(zhuān)利文獻(xiàn)9Bielawska A、另外6人、The Journal ofBiological Chemistry、第271卷、第12646-12654頁(yè)(1996)非專(zhuān)利文獻(xiàn)10Raisova M、另外9人、FEBS Letters、第516卷、第47-52頁(yè)(2002)非專(zhuān)利文獻(xiàn)11Ohnishi Y、另外3人、Clin.Diagn.Lab.Immunol.、第6卷、第101-104頁(yè)(1999)非專(zhuān)利文獻(xiàn)12Okino N、另外3人、The Journal of BiologicalChemistry、第273卷、第14368-14373頁(yè)(1998)非專(zhuān)利文獻(xiàn)13Okino N、另外5人、The Journal of BiologicalChemistry、第274卷、第36616-36622頁(yè)(1999)發(fā)明內(nèi)容如上所述，抑制動(dòng)物或微生物所產(chǎn)生的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的活性的有效的抑制劑尚不為人知，還沒(méi)有進(jìn)行產(chǎn)業(yè)應(yīng)用，這是目前的現(xiàn)狀。本發(fā)明的目的在于提供來(lái)自植物的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑、其中特別是中性/堿性神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，含有該抑制劑的藥品、準(zhǔn)藥、化妝品、食品。
鑒于上述情況，本發(fā)明人進(jìn)行了深入地研究，考慮到中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的抑制物質(zhì)對(duì)于細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平的調(diào)控、進(jìn)而由細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺而引起的抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)分化、調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡有效，由此廣范圍地對(duì)各種物質(zhì)的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的抑制活性進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)源于各種植物的處理物、來(lái)源于該處理物的特定的化合物對(duì)中性/堿性神經(jīng)酰胺酶具有特異性抑制活性。還確認(rèn)了這些來(lái)源于植物的處理物、來(lái)源于植物的特定的化合物具有使動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞或皮膚角層的神經(jīng)酰胺含量增加的活性，并基于上述發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供神經(jīng)酰酶活性抑制劑、以及特征在于含有所述抑制劑的細(xì)胞內(nèi)外神經(jīng)酰胺水平調(diào)節(jié)劑、進(jìn)而提供抗炎癥藥、抗癌藥、皮膚外用藥等藥品、準(zhǔn)藥、化妝品、食品，其中所述神經(jīng)酰酶活性抑制劑以來(lái)源于植物的處理物、來(lái)源于植物的特定的化合物作為有效成分，其中所述來(lái)源于植物的處理物為來(lái)源于選自銀杏、葫蘆(ゥリ，gourd)、橙、粘液海帶(ガゴ メ)、黃瓜、葡萄柚、冬瓜、苦瓜、海帶、桉、艾蒿、來(lái)檬以及裙帶菜的至少一種植物的提取物、精油，例如水蒸氣蒸餾物、壓榨物等。
即，本發(fā)明的第1方面涉及神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，其特征在于含有來(lái)源于植物的處理物作為有效成分，其中所述植物選自銀杏科植物、葫蘆科植物、蕓香科植物、海帶科植物、桃金娘科植物和菊科植物的至少一種。本發(fā)明的第1方面中，例如優(yōu)選銀杏科植物為銀杏，葫蘆科植物為選自菜瓜、黃瓜、冬瓜和苦瓜的至少一種，蕓香科植物為選自橙、葡萄柚和來(lái)檬的至少一種，海帶科植物為選自粘液海帶、海帶和裙帶菜的至少一種，桃金娘科植物為桉，菊科植物為艾蒿，但并不受此限定。
本發(fā)明的第2方面涉及神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑，其特征在于含有第1方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
本發(fā)明的第3方面涉及藥品，其特征在于含有第1方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。本發(fā)明的第3方面中，藥品可以是皮膚外用藥、對(duì)于必須進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制的疾病的治療藥或預(yù)防藥、癌癥的治療藥或預(yù)防藥。
本發(fā)明的第4方面涉及準(zhǔn)藥，其特征在于含有第1方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
本發(fā)明的第5方面涉及化妝品，其特征在于含有第1方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
本發(fā)明的第6方面涉及食品，其特征在于含有第1方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
本發(fā)明的第7方面涉及具有下述理化學(xué)性質(zhì)的化合物、其衍生物、或它們的可藥用的鹽(1)質(zhì)譜m/z565(M+H)+；(2)MS/MS分析上述(1)為母離子時(shí)，子離子為m/z547、m/z338；(3)1H-NMR(氘代氯仿)σ0.848，0.860，0.871，1.236.1.265，1.277，1.289，1.354，1.368，1.507，1.531，1.584，1.923，1.934，1.945，1.964，1.974，2.018，2.029，2.041，2.053，2.208，2.350，2.462，2.575，2.957，2.969，3.728，3.747，3.770，3.777，3.783，3.789，3.971，3.976，3.989，3.994，5.321，5.330，5.346，5.356，5.368，5.378，5.394，5.491，5.501，5.515，5.527，5.539，5.605，5.616，5.629，5.642，5.653，6.455，6.468
(4)13C-NMR(氘代氯仿)σ14.10，22.68，25.42，29.20，29.22，29.34，29.36，29.49，29.54，29.62，29.63，29.65，29.69，31.91，31.92，32.42，32.57，32.60，34.36，40.56，53.96，62.45，74.06，122.17，129.72，130.88，136.81，171.83本發(fā)明的第8方面涉及神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，其特征在于含有選自本發(fā)明的第7方面的化合物、衍生物及其鹽的至少一種作為有效成分。
本發(fā)明的第9方面涉及神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑，其特征在于含有本發(fā)明的第8方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
本發(fā)明的第10方面涉及藥品，其特征在于含有本發(fā)明的第8方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。本發(fā)明的第10方面中，藥品是皮膚外用藥、對(duì)于必須進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制的疾病的治療藥或預(yù)防藥、癌癥的治療藥或預(yù)防藥。
本發(fā)明的第11方面涉及準(zhǔn)藥，其特征在于含有本發(fā)明的第8方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
本發(fā)明的第12方面涉及化妝品，其特征在于含有本發(fā)明的第8方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
本發(fā)明的第13方面涉及食品，其特征在于含有本發(fā)明的第8方面的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
本發(fā)明可提供神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，含有該抑制劑的神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑、藥品、準(zhǔn)藥、化妝品、食品。
本發(fā)明的抑制劑有望得到對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的抑制增殖、誘導(dǎo)分化、誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡等的效果，進(jìn)而，含有本發(fā)明的抑制劑的藥品、對(duì)增進(jìn)健康有用的食品有望獲得對(duì)炎癥性疾病、惡性腫瘤等起因于細(xì)胞的增殖或分化異常的疾病的治療效果。將含有本發(fā)明的抑制劑的乳劑、洗劑、或入浴劑涂布于皮膚，或使其接觸，則有望使健康人或特應(yīng)性皮炎患者的皮膚角質(zhì)層的神經(jīng)酰胺含量升高，獲得使皮膚的保濕性、阻擋功能提高的效果。并且，通過(guò)抑制特應(yīng)性皮炎相關(guān)微生物所產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺酶的活性，有望抑制特應(yīng)性皮炎中皮膚神經(jīng)酰胺的減少，獲得改善干燥皮膚進(jìn)而改善皮炎的效果。
附圖簡(jiǎn)述[

圖1]是表示本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的效果的圖。
是表示本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的效果的圖。
是表示本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的效果的圖。
是表示本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的效果的圖。
是表示本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的效果的圖。
是表示本發(fā)明的化合物的質(zhì)譜圖。
是表示本發(fā)明的化合物的MS/MS分析的質(zhì)譜圖。
是表示本發(fā)明的化合物的1H-NMR譜圖。
是表示本發(fā)明的化合物的13C-NMR譜圖。
具體實(shí)施例方式
(1)本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑是抑制神經(jīng)酰胺酶(セラミ一ダ)的酶活性的物質(zhì)，但它不一定必須直接作用于神經(jīng)酰胺酶來(lái)抑制該活性。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑例如有神經(jīng)酰胺酶抑制劑。以下，為了方便，也可將神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑稱(chēng)為神經(jīng)酰胺酶抑制劑。
本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑對(duì)神經(jīng)酰胺酶的酶活性的抑制作用是指與神經(jīng)酰胺酶本來(lái)的活性比較，使該活性降低的作用，例如可通過(guò)后述的參考例1的方法確認(rèn)。關(guān)于神經(jīng)酰胺酶的酶活性的抑制作用，只要是與神經(jīng)酰胺酶本來(lái)的活性比較使其活性降低了即可，沒(méi)有特別限定，例如可以是抑制5％，優(yōu)選10％，更優(yōu)選20％，進(jìn)一步優(yōu)選40％、60％、80％、90％。
本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑以來(lái)源于規(guī)定植物的處理物或來(lái)源于該處理物的特定的化合物等作為有效成分，對(duì)神經(jīng)酰胺酶、特別是中性/堿性神經(jīng)酰胺酶顯示優(yōu)異的抑制活性。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑可以含有有效成分本身。另外，對(duì)于來(lái)源于處理物的化合物等的描述只是表示化合物等的起源，與植物沒(méi)有關(guān)系、另外合成的與該化合物等相同的化合物等也包含在本發(fā)明的有效成分中。
本發(fā)明中作為有效成分使用的來(lái)源于植物的處理物(以下可稱(chēng)為本發(fā)明的處理物)只要是對(duì)植物實(shí)施人為處理而得到的即可，沒(méi)有特別限定，例如有提取物、精油(例如水蒸氣蒸餾物、榨汁液、壓榨物、溶劑提取物、超臨界流體提取物)。這些處理物可以分別單獨(dú)或?qū)?種或以上混合使用。本發(fā)明所使用的植物有選自銀杏科植物、葫蘆科植物、蕓香科植物、海帶科植物、桃金娘科植物和菊科植物的至少一種。
這些來(lái)源于植物的處理物只要至少對(duì)中性/堿性神經(jīng)酰胺酶顯示抑制活性即可，沒(méi)有特別限定。從植物的處理物的神經(jīng)酰胺酶活性抑制作用優(yōu)異的角度看，優(yōu)選使用以下例舉的植物。
例如，本發(fā)明所使用的銀杏科(Ginkgoaceae)植物可優(yōu)選使用銀杏(Ginkgo biloba、Ginkgoaceae)，主要使用葉。
本發(fā)明所使用的葫蘆科(Cucurbitaceae)植物可優(yōu)選使用菜瓜(Cucumis melo L.var.conomon Makino)或香瓜(Cucumis melo L.var.makuwa Makino)、甜瓜(Cucumis meloL.)，主要使用果實(shí)。還可優(yōu)選使用黃瓜(Cucumis sativus L.)、冬瓜(Benincasa ceriferaSavi)、苦瓜(Momordica charantiaL.)，主要使用果實(shí)。葫蘆科植物更優(yōu)選使用菜瓜、黃瓜、冬瓜和苦瓜的1種或2種或以上。
本發(fā)明所使用的蕓香科(Rutaceae)植物優(yōu)選使用橙(甜橙(Citrussinensis)、酸橙(Citrus aurantium)或桔(Citrus reticulate))、葡萄柚(Citrus Paraadisi)或來(lái)檬(Citrus aurantifolia)的1種或2種或以上，主要使用果實(shí)。也可以在本發(fā)明中使用從橙的皮中提取的油--苧烯。
本發(fā)明中使用的海帶科植物、特別是褐藻類(lèi)海帶科(Laminariaceae)植物優(yōu)選使用粘液海帶(Kjellmaniellacrassifolia Miyabe)、海帶(Laminaria japonica Areschoug)或裙帶菜(Undaria pinnatifida)的1種或2種或以上，主要使用葉、莖或孢子葉。
本發(fā)明中使用的桃金娘科(Myrtaceae)植物可優(yōu)選使用桉、即常綠高大樹(shù)木桉樹(shù)或其近緣植物(藍(lán)桉(Eucalyptus globulus)、檸檬桉(Eucalyptus citriodora)或薄荷桉(Eucalyptus dives))，主要使用葉。
本發(fā)明中使用的菊科(Compositae)植物可優(yōu)選使用艾蒿(Artemisi avulgaris L.var.indica Maxim.)，主要使用葉。
但是，使用上述植物時(shí)，對(duì)于本發(fā)明所使用的植物的組織并不限于上述，例如可以使用根莖、葉、果實(shí)、孢子葉或植物整體。本發(fā)明的處理物的原料可以使用切細(xì)物、破碎物、干燥物等加工品。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的制備可以將上述植物單獨(dú)或組合使用。
關(guān)于本發(fā)明所使用的這些植物或它們的處理物以及后述的本發(fā)明的特定的化合物具有中性/堿性神經(jīng)酰胺酶抑制效果，這是完全不為人知的。
本發(fā)明中使用的植物的提取物的提取方法例如可為如下方法將上述植物直接或?qū)⒏稍锓鬯槠吠ㄟ^(guò)通常的植物成分提取用溶劑提取，餾去溶劑。提取溶劑例如可以將甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇等低級(jí)醇或乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇等多元醇，丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、二氯乙烷、甲苯、正己烷、石油醚等各種有機(jī)溶劑或水等單獨(dú)或組合使用。從提取物的提取效率、收量的角度看，特別優(yōu)選水、乙醇、丙二醇、1，3-丁二醇或乙醇水溶液、丙二醇水溶液、1，3-丁二醇水溶液。
提取方法可以采用通常的植物成分提取所使用的條件，例如可在4-100℃下，將上述植物在提取溶劑中浸泡或加熱回流數(shù)小時(shí)至數(shù)周，可根據(jù)所使用的原料植物、植物體的部位、形態(tài)等適當(dāng)設(shè)定最佳方法。此時(shí)，可按照后述的參考例1的方法測(cè)定提取物對(duì)中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的抑制活性，設(shè)定提取方法，使抑制活性有最大值。
使用精油作為本發(fā)明的處理物時(shí)，也可以按照通常使用的方法制備。例如可采用水蒸氣蒸餾法、榨汁法、壓榨法、溶劑提取法、超臨界流體萃取法等，從上述植物中制備。
植物的提取物的提取方法、精油的制備方法可按照公知的方法進(jìn)行，例如可參照バィォセパレ一ショソ便覽(1996年、化學(xué)工學(xué)會(huì)“生物分離工學(xué)特別研究會(huì)”編)。
以上的植物提取物、精油可作為本發(fā)明的處理物直接使用，還可采用吸附分配色譜、凝膠過(guò)濾色譜、離子交換色譜、正相分配色譜、反相分配色譜等色譜進(jìn)行純化，通過(guò)測(cè)定所分離出的級(jí)分對(duì)中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的抑制活性，可以以高純度分選活性高的組分，或分離具有中性/堿性神經(jīng)酰胺酶抑制活性的物質(zhì)并使用。還可單獨(dú)使用中性/堿性神經(jīng)酰胺酶抑制活性高的組分，也可以以將多種組分混合得到的混合物的形式使用。
本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑可以使用選自以下的化合物、其衍生物以及它們的可藥用的鹽的至少一種作為有效成分。該化合物是從具有神經(jīng)酰胺酶活性抑制作用的裙帶菜孢子葉中得到的新型化合物，圖6表示其質(zhì)譜，圖7表示其MS/MS分析質(zhì)譜、圖8表示其1H-NMR譜、圖9表示其13C-NMR譜。該化合物的分離方法、各種譜的測(cè)定方法、測(cè)定結(jié)果、神經(jīng)酰胺酶活性抑制作用等的詳細(xì)情況可參照后述的實(shí)施例11。即，具有上述物理化學(xué)性質(zhì)的化合物及其衍生物、以及它們的可藥用的鹽(本說(shuō)明書(shū)中可稱(chēng)為化合物等)具有神經(jīng)酰胺酶活性的抑制作用，可與本發(fā)明的處理物發(fā)揮同等的功能。這些化合物是在本發(fā)明中首次分離出的，也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明的化合物可例舉以下的式(1)所示的化合物。
本發(fā)明中，優(yōu)選鹽為可藥用的鹽。本發(fā)明所使用的上述式(1)所表示的化合物的衍生物例如有酯等容易在體內(nèi)水解、并可發(fā)揮所希望的效果的衍生物(前藥)。將本發(fā)明的化合物給予哺乳動(dòng)物被代謝得到的衍生物也包含在本發(fā)明的衍生物中。所述前藥的制備可按照公知的方法進(jìn)行。所述衍生物可以是它們的鹽。因此，只要可得到本發(fā)明所需的效果，本發(fā)明的有效成分中也包含本發(fā)明的化合物的衍生物及其它們的鹽。只要是具有神經(jīng)酰胺酶活性抑制作用，本發(fā)明中使用的化合物的旋光異構(gòu)體、酮-烯醇互變異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體等各種異構(gòu)體、各異構(gòu)體的分離物都可在本發(fā)明中使用。
本發(fā)明中使用的鹽例如有堿金屬鹽、堿土金屬鹽、與有機(jī)堿的鹽等。所述鹽優(yōu)選可藥用的鹽。本發(fā)明中使用的可藥用的鹽是指對(duì)生物基本上無(wú)毒、且具有神經(jīng)酰胺酶活性抑制作用的化合物的鹽。該鹽例如有鈉、鉀、鈣、鎂、銨或質(zhì)子化的芐星青霉素(ベソザチソ)(N，N’-二-芐基乙二胺)、膽堿、乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、苯乙芐胺(N-芐基苯乙胺)、哌嗪或氨丁三醇(2-氨基-2-羥基甲基-1，3-丙二醇)等的鹽。
本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑只要是抑制神經(jīng)酰胺酶活性的物質(zhì)即可，其劑型沒(méi)有特別規(guī)定。上述神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑中所使用的添加物沒(méi)有特別限定，可以使用公知的基質(zhì)。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑可以將本發(fā)明的有效成分和公知的基質(zhì)適當(dāng)混合，例如可以以試劑的形式制備。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑例如可以與作為神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑、藥品(包括皮膚外用藥、細(xì)胞增殖抑制劑、癌癥治療藥或預(yù)防藥)、準(zhǔn)藥、化妝品、食品使用的物質(zhì)混合使用。
作為本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑中的有效成分的含量，當(dāng)有效成分為本發(fā)明的處理物時(shí)，干燥重量?jī)?yōu)選0.000001-100重量％，更優(yōu)選0.00001-20重量％；當(dāng)有效成分為本發(fā)明的化合物等時(shí)，優(yōu)選0.000001-100重量％，更優(yōu)選0.00001-20重量％。將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑與上述藥品等混合時(shí)，其混合量并沒(méi)有特別限定，干燥重量?jī)?yōu)選0.000001-100重量％，更優(yōu)選0.00001-20重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0.0001-10重量％左右的范圍。
含有本發(fā)明的有效成分的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑通過(guò)其生理作用，可用于細(xì)胞增殖、癌癥、炎癥、皺紋形成(皮膚彈性降低、皮膚的肥厚機(jī)理)、皮膚角質(zhì)層阻擋功能、干燥皮膚、微生物感染、皮膚免疫的研究，另外，除本發(fā)明的藥品外，還可用于鞘脂(神經(jīng)酰胺)相關(guān)的疾病用藥品、皮膚外用藥、細(xì)胞增殖抑制劑、癌癥治療藥或預(yù)防藥的篩選。
本說(shuō)明書(shū)中“含有”一詞有時(shí)包括稀釋和添加的意思使用。這里“添加”包括向原料中添加本發(fā)明中使用的有效成分的方式，“稀釋”包含本發(fā)明中使用的有效成分被添加到原料中，或原料被添加到本發(fā)明中使用的有效成分中，由此使有效成分被稀釋的方式。
(2)本發(fā)明的神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑本發(fā)明的神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑只要是具有通過(guò)本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑所具有的神經(jīng)酰胺酶抑制作用來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺量的效果即可，沒(méi)有特別限定。這里，“調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺量的效果”是指例如如下述實(shí)施例6-10所記載，由神經(jīng)酰胺酶抑制劑導(dǎo)致的培養(yǎng)細(xì)胞、人工皮膚中的神經(jīng)酰胺量的升高、以及對(duì)于升高的神經(jīng)酰胺量通過(guò)適當(dāng)選擇神經(jīng)酰胺酶抑制劑的添加量來(lái)達(dá)到所需的神經(jīng)酰胺量降低的效果。雖無(wú)特別限定，但本發(fā)明的神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)鞘脂的基本骨架--神經(jīng)酰胺量，因此可以調(diào)節(jié)作為控制細(xì)胞的增殖、分化、編程性細(xì)胞死亡等的信息分子的鞘脂量，調(diào)節(jié)與皮膚的保濕功能、阻擋功能相關(guān)的主要細(xì)胞間脂質(zhì)成分--神經(jīng)酰胺量。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑除調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺量之外，還可通過(guò)參與神經(jīng)酰胺的代謝來(lái)發(fā)揮鞘氨醇量、脂肪酸量、鞘氨醇-1-磷酸量調(diào)節(jié)劑的功能，因此可作為鞘氨醇量調(diào)節(jié)劑、脂肪酸量調(diào)節(jié)劑、鞘氨醇-1-磷酸量調(diào)節(jié)劑使用。
本發(fā)明的神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑的劑型沒(méi)有特別規(guī)定，可以將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑與公知的基質(zhì)適當(dāng)混合，例如可以以試劑的形式制備。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑中，本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑(有效成分)的含量可以是將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑與藥品等混合時(shí)與該抑制劑的混合量同樣的范圍。本發(fā)明的神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑的用途沒(méi)有特別限定，優(yōu)選作為與神經(jīng)酰胺相關(guān)的生物化學(xué)研究的試劑使用。
(3)本發(fā)明的藥品等本發(fā)明的藥品含有本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，可提供作為皮膚外用藥(保濕劑、阻擋功能保持劑、皮膚彈性提高劑或保持劑、皮膚肥厚改善劑或預(yù)防劑、上述用途的軟膏、乳膏、乳液、洗劑、面膜、浴用劑等)、細(xì)胞增殖抑制劑、抗炎癥藥、癌癥治療藥或預(yù)防藥、神經(jīng)酰胺或其代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)疾病的治療藥或預(yù)防藥。其中，本發(fā)明的藥品作為皮膚外用藥、必須抑制細(xì)胞增殖的疾病的治療藥或預(yù)防藥，或者癌癥治療藥或預(yù)防藥非常有用。
神經(jīng)酰胺是皮膚中主要的細(xì)胞間脂質(zhì)成分，對(duì)于皮膚的保濕功能、阻擋機(jī)制具有重要的作用。特應(yīng)性皮炎患者的皮膚角層中，神經(jīng)酰胺含量減少，這可認(rèn)為是作為特異性皮炎特征的干燥皮膚以及角層阻擋功能異常的原因之一，有使疾病惡化的可能性。另外，已知神經(jīng)酰胺量的減少會(huì)使皮膚彈性降低、增進(jìn)皮膚肥厚。如后述實(shí)施例所示，本發(fā)明的有效成分可通過(guò)抑制分解神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)外的神經(jīng)酰胺量增加，或者抑制神經(jīng)酰胺量的減少。因此，含有本發(fā)明的有效成分的本發(fā)明的藥品有望具有上述的疾病、癥狀的治療或預(yù)防效果。
關(guān)于與細(xì)胞的增殖、分化、編程性細(xì)胞死亡等的控制相關(guān)的鞘脂(鞘糖脂、鞘磷脂以及它們的代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸等)，它們?cè)诎┌Y、自身免疫疾病、感染病、皮炎、關(guān)節(jié)炎等炎癥等疾病中的代謝以及這些分子介導(dǎo)的信號(hào)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到人們的注意。其中可認(rèn)為神經(jīng)酰胺是作為鞘脂的基本骨架的脂質(zhì)，是調(diào)控細(xì)胞的生與死的重要的因子。因此，神經(jīng)酰胺的代謝異?？梢鸺?xì)胞的增殖或分化的異常，成為炎癥性疾病、惡性腫瘤(癌)等起因于上述異常的疾病的原因。例如，已知對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥處理、放射線(xiàn)照射，則細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺水平升高，癌細(xì)胞發(fā)生編程性細(xì)胞死亡，但有報(bào)道稱(chēng)獲得抗癌藥耐性的癌細(xì)胞中，神經(jīng)酰胺的代謝酶、例如用于將葡萄糖轉(zhuǎn)移到神經(jīng)酰胺上的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性升高，而細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺水平不升高(例如Lavie，Y.，Cao，H.，Bursten，S.L.，Giuliano，A.E.，和Cabot，M.C.(1996)J.Biol.Chem.271，19530-19536)。如后述實(shí)施例所示，本發(fā)明的有效成分通過(guò)對(duì)分解神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺酶活性的抑制，可以進(jìn)行細(xì)胞的增殖抑制、編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。因此，含有本發(fā)明的有效成分的本發(fā)明的藥品有望抑制神經(jīng)酰胺代謝異常的發(fā)生或改善該異常，有望獲得上述疾病、癥狀的治療或預(yù)防效果。本發(fā)明的藥品可發(fā)揮細(xì)胞增殖的抑制效果，因此可作為細(xì)胞增殖抑制劑使用。
如上所述，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可能與神經(jīng)酰胺的代謝異常有關(guān)，因此，本發(fā)明的藥品通過(guò)與神經(jīng)酰胺酶以外的神經(jīng)酰胺代謝酶例如葡糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑一起使用，例如有望獲得多藥耐藥性的癌癥治療或預(yù)防效果。
下面對(duì)本發(fā)明的藥品的制備方法進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的藥品以本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑作為有效成分，可將該有效成分與公知的藥用的載體組合，制成制劑。通常，將本發(fā)明的有效成分與可藥用的液態(tài)或固態(tài)載體混合，根據(jù)需要，添加溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦型劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑等，制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體制劑以及通常的溶液劑、混懸劑、乳劑等液體制劑。也可以制成在使用前添加適當(dāng)?shù)妮d體而成為液態(tài)的干燥品、外用藥。
藥用載體可根據(jù)本發(fā)明的藥品的給藥形式和劑型選擇，為口服制劑時(shí)，例如可利用淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無(wú)機(jī)鹽等。在制備口服制劑時(shí)，還可以混合粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、促流劑、矯味劑、著色劑、香料等。
另一方面，當(dāng)為非口服制劑時(shí)，可按照常規(guī)方法，將本發(fā)明的有效成分溶解或懸浮于作為稀釋劑使用的注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根據(jù)需添加殺菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、止痛劑等來(lái)制備。
皮膚外用藥包含經(jīng)皮給藥用的固體、半固體或液態(tài)的制劑。另外也包含栓劑。例如可以制成乳劑、洗劑等乳濁劑，外用酊劑等液體制劑，油性軟膏、親水性軟膏等軟膏劑，薄膜劑、貼劑、泥敷劑等經(jīng)皮給藥用的貼劑等。
本發(fā)明中包含的細(xì)胞增殖抑制劑、癌癥的治療藥或預(yù)防藥有望獲得本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的編程性細(xì)胞死亡誘發(fā)作用、細(xì)胞增殖抑制或預(yù)防效果、癌癥治療效果。本發(fā)明的藥品可通過(guò)制藥領(lǐng)域公知的方法制造。本發(fā)明的藥品中，本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑(有效成分)的含量可以是在將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑與藥品混合時(shí)，與該抑制劑的混合量同樣的范圍。
本發(fā)明的藥品可根據(jù)制劑形式以適當(dāng)?shù)慕o藥途徑給藥。給藥方法沒(méi)有特別限定，可以?xún)?nèi)服、外用和注射。注射劑例如可以通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)等給藥。
本發(fā)明的藥品的給藥量可根據(jù)其制劑形式、給藥方法、使用目的以及該藥品的給藥對(duì)象患者的年齡、體重、癥狀來(lái)適當(dāng)決定，并不是一成不變的。通常，對(duì)于制劑中含有的有效成分的給藥量，以干燥重量計(jì)算，優(yōu)選成人每天為0.1-2000mg/kg體重。當(dāng)然，給藥量根據(jù)各種條件而變動(dòng)，因此有時(shí)以比上述給藥量少的量也足夠，或者有必須超過(guò)上述范圍的情況。給藥可以是在所需的給藥量范圍內(nèi)，1天內(nèi)一次給藥或分?jǐn)?shù)次進(jìn)行。本發(fā)明的藥品除可直接口服之外，還可以添加到任意的飲料食品中進(jìn)行日常攝取。
作為皮膚外用藥使用時(shí)，除本發(fā)明的有效成分外，可根據(jù)需要適當(dāng)混合通?；瘖y品、藥品等皮膚外用藥所使用的成分，例如水性成分、油性成分、粉末成分、醇類(lèi)、保濕劑、增粘劑、紫外線(xiàn)吸收劑、美白劑、防腐劑、抗氧化劑、表面活性劑、香料、色素等。
本發(fā)明的準(zhǔn)藥的特征是含有本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。本發(fā)明的準(zhǔn)藥沒(méi)有特別限定，包括對(duì)人體作用緩慢的含漱劑、牙膏、口腔清涼劑、健胃清涼劑、含維生素保健劑、含片、防曬水、皂、毛發(fā)染色劑、生理衛(wèi)生巾、浴用劑、防止口臭、體臭、痱子、毛發(fā)脫落并以育毛或脫毛為目的的物質(zhì)以及它們的類(lèi)似物。本發(fā)明的準(zhǔn)藥有望獲得與本發(fā)明的藥品同樣的效果。
本發(fā)明的準(zhǔn)藥可將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑和公知的基質(zhì)適當(dāng)混合，以任意的形式制備。本發(fā)明的準(zhǔn)藥中，本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑(有效成分)的含量可以是在將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑與藥品混合時(shí)，與該抑制劑的混合量同樣的范圍。
(4)本發(fā)明的化妝品本發(fā)明的化妝品含有本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，本發(fā)明的化妝品所希望的效果的表達(dá)基于所述化妝品中所含的該抑制劑(有效成分)所具有的上述生理作用。在包括角層和/或角質(zhì)層的皮膚內(nèi)部，如果神經(jīng)酰胺量增加，則推斷可提高保濕性、阻擋效果、皮膚的張力、彈性、保濕性(濕潤(rùn))。因此，本發(fā)明的化妝品例如可以有效提高皮膚的張力、彈性。即，可以提供以本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑為有效成分的改善保濕性作用或預(yù)防其惡化作用、改善阻擋效果作用或預(yù)防其惡化作用、改善皺紋作用或預(yù)防作用、提高皮膚的彈性作用或保持作用、改善皮膚肥厚作用或預(yù)防作用、增強(qiáng)神經(jīng)酰胺生成作用或抑制減少作用或者細(xì)胞增殖抑制作用優(yōu)異的化妝品。該化妝品可制成標(biāo)示如下意圖的化妝品，即，所述化妝品用于表達(dá)例如由抗腫瘤活性、改善保濕性作用或預(yù)防其惡化作用、改善阻擋效果作用或預(yù)防其惡化作用、改善皺紋作用或預(yù)防作用、提高皮膚的彈性作用或保持作用、改善皮膚肥厚作用或預(yù)防作用、增強(qiáng)神經(jīng)酰胺生成作用或抑制減少作用或者細(xì)胞增殖抑制作用所帶來(lái)的所需效果。
本發(fā)明的化妝品中，作為本發(fā)明的有效成分的含量，干燥重量通常優(yōu)選0.0001-20重量％，更優(yōu)選0.001-5重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0.03-3重量％。
本發(fā)明的化妝品中，作為本發(fā)明的有效成分以外的其它成分，可以根據(jù)需要含有1，3-丁二醇、吡咯烷酮羧酸鹽等保濕劑，液體石蠟、凡士林、橄欖油、角鯊?fù)?、羊毛脂、合成酯油等皮膚柔潤(rùn)劑，椰油、棕櫚油等油脂類(lèi)，維生素E等維生素類(lèi)，蜜蠟、丙二醇單硬脂酸酯、硬脂酸等表面活性劑，硬脂基醇等乳化穩(wěn)定助劑、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯氫化蓖麻子油等增溶劑，對(duì)羥基苯甲酸甲酯等防腐劑，顏料，香料，抗氧化劑，紫外線(xiàn)吸收劑，藥理活性物質(zhì)，基質(zhì)，表面活性劑等。還可以結(jié)合使用以甘油、丙二醇、聚乙二醇、透明質(zhì)酸為代表的多糖類(lèi)等具有保水作用的物質(zhì)。
關(guān)于本發(fā)明的化妝品的形狀，只要可得到有效成分的上述生理作用即可，沒(méi)有特別限定，例如優(yōu)選化妝水類(lèi)、乳液類(lèi)、乳膏類(lèi)、面膜類(lèi)、浴用劑、洗面劑、浴皂、浴用洗劑或軟膏。
本發(fā)明的化妝品可使用本發(fā)明的有效成分以及根據(jù)需要的上述其它成分作為原料，按照化妝品領(lǐng)域公知的方法適當(dāng)?shù)刂苽?。例如，與后述的食品、飲料等同樣，也可以按照飲料食品領(lǐng)域的公知的方法，制造適合口服攝取的化妝品。
例如，在上述含有量范圍內(nèi)含有本發(fā)明的有效成分的化妝品、例如化妝水類(lèi)，按照各自的用途形式，將所需的量用于例如人的整個(gè)面部時(shí)，每次優(yōu)選使用0.01-5g、更優(yōu)選0.1-2g左右，這可得到以下的本發(fā)明所希望的效果可得到保濕效果、阻擋效果、改善皺紋效果或預(yù)防效果、提高皮膚彈性的效果或保持效果、改善皮膚肥厚效果或預(yù)防效果、增強(qiáng)神經(jīng)酰胺生成效果或抑制減少的效果以及細(xì)胞增殖抑制效果，使皮膚富有張力、光澤，得到美化肌膚的效果等。
本說(shuō)明書(shū)中的皮膚包括面部、頸部、胸部、背部、腕部、手部、腿部、腳部、臀部以及頭皮等包覆人、動(dòng)物的外側(cè)的所有部分。
(5)本發(fā)明的食品本發(fā)明的食品含有本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，本發(fā)明的食品的所希望的效果的表達(dá)基于所述食品中所含的該抑制劑(有效成分)所具有的上述生理作用。本發(fā)明提供含有本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑的食品，該食品的特征在于與以往的食品相比，高濃度和/或高純度含有本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶抑制劑。也就是說(shuō)，通過(guò)攝取本發(fā)明的食品，有望獲得抑制細(xì)胞增殖、誘發(fā)編程性細(xì)胞死亡等的效果，可有效地發(fā)揮神經(jīng)酰胺相關(guān)疾病的治療或預(yù)防的作用。該食品可以制成標(biāo)示如下意圖的健康食品(特定保健用食品)，即，所述健康食品用于表達(dá)例如由細(xì)胞增殖抑制活性、編程性細(xì)胞死亡誘發(fā)活性帶來(lái)的所希望的效果。本發(fā)明的食品也包含飲料，為了方便，可將飲用形式的食品稱(chēng)為飲料，將飲用形式以外的食品稱(chēng)為食品。
本發(fā)明的食品只要是含有本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑即可，沒(méi)有特別限定。例如有含有谷物加工制品(小麥粉加工制品、淀粉類(lèi)加工制品、預(yù)混加工制品、面類(lèi)、通心粉類(lèi)、面包類(lèi)、豆餡包類(lèi)、蕎麥面類(lèi)、麥麩、米粉、粉絲、包裝糯米糕點(diǎn)等)、油脂加工制品(塑性油脂、炸油、色拉油、蛋黃醬、調(diào)味醬等)、大豆加工制品(豆腐類(lèi)、豆醬、納豆等)、食用肉類(lèi)加工制品(火腿、臘肉、壓制火腿、紅腸等)、水產(chǎn)制品(冷凍碎魚(yú)肉、魚(yú)糕、圓筒狀魚(yú)糕、魚(yú)糕片、炸胡蘿卜魚(yú)肉片、氽魚(yú)丸、筋、魚(yú)肉火腿、腸、鰹魚(yú)刨花、魚(yú)卵加工制品、水產(chǎn)罐頭、甜烹海味等)、乳制品(原料乳、奶油、酸乳酪、黃油、干酪、練乳、奶粉、冰激凌等)、蔬菜·果實(shí)加工制品(糊類(lèi)、果醬類(lèi)、咸菜類(lèi)、果實(shí)飲料、蔬菜飲料、混合飲料等)、糕點(diǎn)類(lèi)(巧克力、餅干類(lèi)、糕點(diǎn)面包類(lèi)、蛋糕、糯米糕點(diǎn)(日本式)、糯米餅干類(lèi)等)、酒精類(lèi)(日本酒、中國(guó)酒、葡萄酒、威士忌、燒酒、伏特加、白蘭地、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清涼酒精飲料、果酒、利口酒等)、嗜好飲料(綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料等)、調(diào)料(醬油、醬汁、醋、甜料酒等)、罐裝·瓶裝·袋裝食品(牛肉飯、蓋澆飯、紅豆飯、咖哩、其它各種加工食品等)、半干燥或濃縮食品(肝醬、其它調(diào)味醬、蕎面·面條汁、濃縮湯類(lèi)等)、干燥食品(快餐面類(lèi)、快餐咖哩、速溶咖啡、果汁粉、湯粉末、快餐醬湯、加工食品、加工飲料、加工湯等)、冷凍食品(雞素?zé)⒄綦u蛋羹、烤鰻魚(yú)、漢堡牛排、燒麥、餃子、各種濃肉湯、果汁雞尾酒等)、固態(tài)食品、液體食品(湯等)、香辛料類(lèi)等農(nóng)產(chǎn)·林產(chǎn)加工制品、畜產(chǎn)加工制品、水產(chǎn)加工制品等。這些食品可使用本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，按照公知的食品制造方法制造。
本發(fā)明的食品中，本發(fā)明的有效成分的含量沒(méi)有特別限定，可從其感官和作用的表達(dá)的角度考慮適當(dāng)選擇。對(duì)于本發(fā)明的有效成分的含量，當(dāng)為食品時(shí)，干燥重量例如每100重量份食品本身的原料中優(yōu)選0.0001重量份或以上，更優(yōu)選0.001-10重量份；當(dāng)為飲料時(shí)，干燥重量例如每100重量份飲料本身的原料中優(yōu)選0.0001重量份或以上，更優(yōu)選0.001-10重量份。
本發(fā)明的食品中，上述有效成分可單獨(dú)或含有、添加和/或稀釋多種，根據(jù)其使用形式，有效成分的含量只要是相當(dāng)于抑制神經(jīng)酰胺酶活性所必需的量即可，對(duì)其形狀沒(méi)有特別限定，也包括片狀、顆粒狀、膠囊狀、軟膠囊狀、液狀、粉末狀等形狀的可口服攝取的形狀物質(zhì)。
(6)本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制方法本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制方法是對(duì)生物體(例如哺乳動(dòng)物、來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織、來(lái)自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞、真菌、酵母、擔(dān)子菌等細(xì)胞)或來(lái)自生物體的試樣(例如細(xì)胞提取物或其純化物)使用本發(fā)明的有效成分，抑制神經(jīng)酰胺酶活性的方法，通常，可根據(jù)它們的使用方式，將本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑、神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑、藥品、準(zhǔn)藥、化妝品或食品用于生物體或來(lái)自生物體的試樣來(lái)進(jìn)行實(shí)施。使用的方法只要是將本發(fā)明的有效成分與生物體或來(lái)自生物體的試樣接觸即可，沒(méi)有特別限定，例如有將本發(fā)明的有效成分給予哺乳動(dòng)物、將本發(fā)明的有效成分添加到來(lái)自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)液中等方法。
本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制方法例如可用于細(xì)胞增殖異常、癌癥、自身免疫疾病、皮膚免疫異常、感染癥、皮炎、關(guān)節(jié)炎等炎癥、皺紋的形成(皮膚彈性降低、皮膚肥厚的機(jī)理)、皮膚角質(zhì)層阻擋功能異常、干燥皮膚的治療、癥狀的緩和及其研究，神經(jīng)酰胺的制造、純化。
本發(fā)明的神經(jīng)酰胺酶活性抑制方法的實(shí)施方案只要是本發(fā)明的有效成分可發(fā)揮抑制活性即可，沒(méi)有特別限定，可以抑制生物體、細(xì)胞、組織以及來(lái)自它們的試樣的神經(jīng)酰胺酶活性。
實(shí)施例以下給出實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例。
制備例1神經(jīng)酰胺酶的制備使用來(lái)源于綠膿桿菌((Pseudomonas aeruginosa AN17菌株)的神經(jīng)酰胺酶和來(lái)源于大鼠腦的神經(jīng)酰胺酶兩種作為中性/堿性神經(jīng)酰胺酶。
綠膿桿菌AN17菌株是從特應(yīng)性皮炎患者的皮膚屑中分離的菌株，生產(chǎn)中性/堿性神經(jīng)酰胺酶[Journal of Biological Chemistry、第273卷、第14368-14373頁(yè)(1998)]。上述菌株被命名為AN17，于平成8年(1996年)6月26日(原保藏日)以保藏號(hào)FERM P-15699保藏于 305-8566日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6、獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心。神經(jīng)酰胺酶粗制酶液如下制備。
將綠膿桿菌AN17菌株在含有鞘磷脂的蛋白胨酵母提取液培養(yǎng)基(0.5％蛋白胨、0.1％酵母提取物、0.5％NaCl、0.01％鞘磷脂(シグマ公司制造)、0.05％牛黃脫氧膽酸鈉(TDC)、pH7.2)、在30℃培養(yǎng)3天，離心得到培養(yǎng)上清。將其過(guò)Q-瓊脂糖FF(Pharmacia公司制造、2.5×20cm)，其中所述Q-瓊脂糖FF預(yù)先用含有0.1％ルブロ一ル(Lubrol)PX(ナカラィテスク公司制造)的50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)平衡，然后用2mL/分鐘的流速流入該緩沖液，洗滌柱子，然后用最高1M的NaCl梯度將酶洗脫出來(lái)?；厥栈钚越M分，添加牛血清白蛋白(BSA)，使終濃度為1mg/mL，用含有0.1％ルブロ一ルPX的50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)進(jìn)行透析，得到粗制酶標(biāo)品。
另一方面，按照以下的方法制備來(lái)自大鼠腦的神經(jīng)酰胺酶粗制酶液。首先，使用ポッタ一ェルベヅェム型勻漿器，將2個(gè)大鼠腦組織(3.5g)在30mL 0.25M蔗糖溶液中勻漿。將其以700×g離心10分鐘，然后將上清以25,000×g離心10分鐘，再將得到的上清以100,000×g離心60分鐘，將得到的沉淀懸浮于3mL25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中。向其中加入9mL含有0.5％Triton X-100的25mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)，在冰上放置2小時(shí)，進(jìn)行萃取。將其以100,000×g離心60分鐘，回收上清，制成粗制酶標(biāo)品。
實(shí)施例1裙帶菜孢子葉提取物的制備向10g干燥的裙帶菜孢子葉片中加入100mL乙醇，輕輕地?cái)嚢钄?shù)次，靜置一天。將其過(guò)濾，得到裙帶菜孢子葉乙醇提取液。1mL提取物的干燥重量是4mg。
實(shí)施例2海帶提取物、粘液海帶提取物的制備向10g干燥的海帶片中加入100mL乙醇，輕輕地?cái)嚢钄?shù)次，靜置一天。將其過(guò)濾，得到海帶的乙醇提取液。1mL提取物的干燥重量是2.7mg。
對(duì)于粘液海帶也同樣地得到提取液。1mL提取物的干燥重量是1.8mg。
實(shí)施例3各種植物提取物的制備將銀杏葉、菜瓜果實(shí)、冬瓜果實(shí)、黃瓜果實(shí)、苦瓜果實(shí)、艾蒿葉用勻漿器制成汁液狀，然后冷凍干燥，每1g中加入10mL乙醇，靜置過(guò)夜，進(jìn)行萃取。過(guò)濾，得到乙醇提取液。1mL銀杏葉提取物的干燥重量是15mg，1mL菜瓜提取物的干燥重量是120mg，1mL冬瓜提取物的干燥重量是53mg，1mL黃瓜提取物的干燥重量是45mg，1mL苦瓜提取物的干燥重量是42mg，1mL艾蒿提取物的干燥重量是43mg。
橙油、葡萄柚油等植物精油使用山本香料(株)銷(xiāo)售的產(chǎn)品。
參考例1神經(jīng)酰胺酶抑制活性測(cè)定對(duì)于來(lái)源于綠膿桿菌的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶(綠膿桿菌神經(jīng)酰胺酶)的抑制活性的測(cè)定如下進(jìn)行。首先，將綠膿桿菌神經(jīng)酰胺酶用稀釋緩沖液(含有5mM氯化鈣、0.45％牛血清白蛋白的100mM Tris-鹽酸緩沖液pH8.5)稀釋至適當(dāng)?shù)拿笣舛龋瑢?0μL該稀釋酶液與5μL抑制劑混合，在37℃保溫10分鐘。向其中加入10μL含0.05mM或1.5mM NBD-C12-神經(jīng)酰胺(マトレァ公司制造)、5mM CaCl2、0.5％Triton X-100的Tris-鹽酸緩沖液pH8.5的底物溶液，再在37℃反應(yīng)30分鐘。加入75μL甲醇，終止反應(yīng)，將其中的25μL用于HPLC分析。
對(duì)于來(lái)源于大鼠腦的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶(大鼠腦神經(jīng)酰胺酶)的抑制活性的測(cè)定如下進(jìn)行。首先，將來(lái)源于大鼠腦的神經(jīng)酰胺酶用稀釋緩沖液(含有12.5mM氯化鎂的100mM甘氨酸-NaOH緩沖液pH9.5)稀釋至適當(dāng)?shù)拿笣舛龋瑢?0μL該稀釋酶液與5μL抑制劑混合，在37℃保溫10分鐘。向其中加入10μL含0.05mM或1.5mM NBD-C12-神經(jīng)酰胺、1.25％牛黃脫氧膽酸的100mM甘氨酸-NaOH緩沖液pH9.5的底物溶液，再在37℃反應(yīng)2小時(shí)。加入75μL甲醇，終止反應(yīng)，將其中的50μL用于HPLC分析。
HPLC分析如下進(jìn)行。柱使用Cosmosil 5C18-AR-II、4.6×50mm(ナカラィテスク公司制造)，洗脫液使用MeOH/1％TFA＝90∶10(v/v)，通過(guò)等度洗脫進(jìn)行洗脫。流速1mL/分鐘，檢測(cè)使用熒光檢測(cè)器，以激發(fā)光465nm、熒光535nm進(jìn)行。
對(duì)于每種酶，樣品以酶+抑制劑+底物、對(duì)照為酶+底物、空白為抑制劑+底物的組合進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)對(duì)照的活性為100％時(shí)的樣品活性的比例來(lái)計(jì)算抑制率。
本說(shuō)明書(shū)中，單指參照參考例1的方法時(shí)，意指使用來(lái)源于大鼠腦的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶的方法。
實(shí)施例4海藻提取物、植物提取物等對(duì)神經(jīng)酰胺酶的抑制效果采用參考例1的方法，使用終濃度為0.6mM的NBD-C12-神經(jīng)酰胺為底物，測(cè)定實(shí)施例1-3中得到的各種海藻、植物提取物等對(duì)神經(jīng)酰胺酶的抑制活性。結(jié)果如表1所示。海藻、植物提取物和橙油(苧烯)的稀釋用二甲基亞砜進(jìn)行。


實(shí)施例5裙帶菜孢子葉提取物對(duì)神經(jīng)酰胺酶的抑制效果分別用5mL100％乙醇、50％乙醇、25％乙醇溶液對(duì)各1g干燥的裙帶菜孢子葉片萃取過(guò)夜，過(guò)濾，得到裙帶菜孢子葉提取液。1mL提取物的干燥重量分別是8mg、72mg、74mg。采用參考例1的方法，使用終濃度為0.02mM的NBD-C12-神經(jīng)酰胺作為底物，測(cè)定裙帶菜孢子葉提取物的抑制活性。該提取物的10倍稀釋液對(duì)神經(jīng)酰胺酶的抑制率分別為71％、43％、11％。
實(shí)施例6海藻、植物提取物對(duì)人白血病培養(yǎng)細(xì)胞的效果(TLC)將人前髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL60在含有10％胎牛血清和1％青霉素·鏈霉素液(GIBCO BRL公司制造，批號(hào)20K1346)的RPMI-1640培養(yǎng)基中、在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。將培養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)1500rpm的離心回收，將細(xì)胞粒用Ultra DOMA-PF培養(yǎng)基(BioWhittaker公司制造)清洗，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，最終調(diào)節(jié)為2×10e7細(xì)胞/1.8mL的濃度，在6孔板中各分注1.8mL，再在相同環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。將2mL實(shí)施例1-3中得到的各種海藻、植物提取物預(yù)先濃縮離心，餾去溶劑，然后加入40μL的二甲基亞砜(DMSO)進(jìn)行溶解，再加入1.8mLUltraDOMA培養(yǎng)基。此時(shí)，向1.8mL上述培養(yǎng)細(xì)胞中各添加0.2mL該提取物稀釋液，在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)3小時(shí)。對(duì)于對(duì)照組，只將與制備提取物稀釋液時(shí)使用的相同的稀釋成分加入到培養(yǎng)液中。如下所述進(jìn)行測(cè)定取樣，制備測(cè)定活細(xì)胞數(shù)和鞘脂用的樣品。
用微量移液管將培養(yǎng)細(xì)胞液回收到10mL帶有螺旋蓋的玻璃管中，取40μL用于活細(xì)胞計(jì)數(shù)。向其中加入140μL Ultra DOMA培養(yǎng)基、20μL錐蟲(chóng)藍(lán)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)測(cè)活細(xì)胞數(shù)。使用余下的細(xì)胞制備鞘脂測(cè)定用樣品。將培養(yǎng)細(xì)胞以1500rpm離心5分鐘，將細(xì)胞粒用1mL的PBS清洗3次。向洗凈的細(xì)胞粒中加入1mL含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的Hanks緩沖液[HBSS、Life Technologies Inc.]，將其作為脂質(zhì)分析用樣品，分析前一直保存在-30℃下。
由分析用樣品中如下進(jìn)行脂質(zhì)的提取。
向1mL分析樣品中加入3mL氯仿/甲醇＝2∶1(v/v)，用搖動(dòng)器充分?jǐn)嚢?0分鐘。將其以3,000rpm離心2分鐘，將下層移入另外一個(gè)玻璃管中，用離心濃縮機(jī)完全餾去溶劑，使其干燥。將其作為薄層色譜(TLC)分析用樣品，分析前一直保存在-30℃下。TLC分析在以下的條件下進(jìn)行。
向TLC分析用樣品中加入20μL氯仿/甲醇＝1∶1(v/v)，溶解，將其全量鋪TLC板(メルク公司制造、HPTLC板硅膠60F254)。神經(jīng)酰胺標(biāo)準(zhǔn)品使用無(wú)羥基脂肪酸神經(jīng)酰胺(Non-hydroxy fatty acid ceramide)或無(wú)羥基神經(jīng)酰胺(Non-hydroxyceramide)(III型神經(jīng)酰胺、Sigma-Aldrich公司制造)和羥基脂肪酸神經(jīng)酰胺(hydroxy fatty acidceramide)或羥基神經(jīng)酰胺(hydroxyceramide)(IV型神經(jīng)酰胺、Sigma-Aldrich公司制造)。以氯仿/甲醇/乙酸＝190∶9∶1(v/v)作為展開(kāi)溶劑，進(jìn)行2次展開(kāi)，然后對(duì)TLC板進(jìn)行磷酸-銅試劑(含有10％CuSO3的8％磷酸溶液)噴霧，在160℃加熱10分鐘，用光密度計(jì)對(duì)顯現(xiàn)出來(lái)的印跡進(jìn)行定量。結(jié)果如圖1所示。添加有冬瓜、苦瓜、艾蒿、葫蘆、黃瓜、裙帶菜孢子葉的提取物的組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺量增加。
實(shí)施例7裙帶菜孢子葉提取物對(duì)人白血病培養(yǎng)細(xì)胞的效果(LCMS)將人前髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL60在含有10％胎牛血清和1％青霉素.鏈霉素液(GIBCO BRL公司制造，批號(hào)20K1346)的RPMI-1640培養(yǎng)基中、在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。將培養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)1500rpm的離心分離回收，將細(xì)胞粒用Ultra DOMA-PF培養(yǎng)基(BioWhittaker公司制造)清洗，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，最終調(diào)節(jié)為1×10e7細(xì)胞/1.8mL的濃度，在6孔板中各分注1.8mL，再在相同環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。將2mL裙帶菜孢子葉提取物預(yù)先濃縮離心，餾去溶劑，然后加入40μL的二甲基亞砜(DMSO)進(jìn)行溶解，再加入1.8mLUltra DOMA培養(yǎng)基，將DMSO的濃度調(diào)節(jié)為2％。向1.8mL上述培養(yǎng)細(xì)胞中各添加0.2mL該植物提取物稀釋液，在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)于對(duì)照組，只將與制備提取物稀釋液時(shí)使用的相同的稀釋成分加入到培養(yǎng)液中。如下所述在0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)進(jìn)行測(cè)定取樣，制備測(cè)定活細(xì)胞數(shù)和鞘脂用的樣品。
用微量移液管將培養(yǎng)細(xì)胞液回收到10mL帶有螺旋蓋的玻璃管中，取40μL用于活細(xì)胞計(jì)數(shù)。向其中加入140μL Ultra DOMA培養(yǎng)基、20μL錐蟲(chóng)藍(lán)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)測(cè)活細(xì)胞數(shù)。使用余下的細(xì)胞，按照真野等人的方法[Analytical Biochemistry、第244卷、第291-300頁(yè)、1997年]對(duì)鞘脂進(jìn)行定量。將培養(yǎng)細(xì)胞液以1500rpm離心5分鐘，將細(xì)胞粒用1mL的PBS清洗3次。向洗凈的細(xì)胞粒中加入1mL含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的Hanks緩沖液，將其作為脂質(zhì)分析用樣品，分析前一直保存在-30℃下。
LCMS中使用的定量用鞘脂標(biāo)準(zhǔn)品如下制備。
鞘脂完全溶解于甲醇。將300μL1mg/mL的C18-鞘磷脂(C18-SM、マトレャ公司制造)、100μL10μg/mL的C18-神經(jīng)酰胺(C18-Cer、マトレャ公司制造)、100μL10μg/mL的鞘氨醇(Sph、シグマ公司制造)、100μL3μg/mL的磷酸膽堿鞘氨苷(SPC、シグマ公司制造)、100μL1μg/mL的二甲基鞘氨醇(DMS、ァバソティリピッド公司制造)、100μL1μg/mL的鞘氨醇半乳糖苷(Psy、シグマ公司制造)和200μL甲醇混合，將總量制成1mL，以其作為標(biāo)準(zhǔn)液原液。在將其用甲醇稀釋?zhuān)苽?0倍稀釋液和100倍稀釋液。取100μL各稀釋液，加入到900μL含有0.1％BSA的HBSS中，充分?jǐn)嚢瑁瑢⑵渥鳛榍手瑯?biāo)準(zhǔn)混合液，使用之前一直保存在-30℃下。
如下從分析用樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中提取脂質(zhì)。
向1mL分析樣品中加入3mL氯仿/甲醇＝2∶1(v/v)，再加入作為內(nèi)標(biāo)的100μL1μg/mL的C2-神經(jīng)酰胺(C2-Cer、マトレャ公司制造)甲醇溶液，用漩渦攪拌器充分?jǐn)嚢?0分鐘。將其以3,000rpm離心2分鐘，將下層移入另外的玻璃管中，用離心濃縮機(jī)完全餾去溶劑，使其干燥。將其作為L(zhǎng)CMS分析用樣品，分析前一直保存在-30℃下。
LCMS在以下的條件下進(jìn)行。
HPLC柱使用YMC公司制造的半微量短柱、YMC-Pack Pro C18(2.0×35mm，3μm、YMC公司制造)。洗脫液A為5mM甲酸銨/甲醇/四氫呋喃＝5∶2∶3(v/v/v)(含有終濃度為0.01％的甲酸)，洗脫液B為5mM甲酸銨/甲醇/四氫呋喃＝1∶2∶7(v/v/v)(含有終濃度為0.01％的甲酸)。經(jīng)由分離機(jī)，將經(jīng)HPLC流出的洗脫液導(dǎo)入離子噴霧式四極桿式質(zhì)量分析裝置(API300、ァプラィドバィォシステムズ公司制造)。噴嘴(ォレフィス)電壓為70eV，離子噴霧電壓為5000V、正向模式、使用氬氣作為碰撞氣體，以多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定。監(jiān)測(cè)離子如表2所示。
結(jié)果如圖2所示。圖中，裙帶菜孢子葉提取物添加組用黑圓圈表示，對(duì)照組用白圓圈表示。A表示C18-鞘磷脂(C18-SM)、B表示C-16神經(jīng)酰胺(C16-Cer)、C表示C18神經(jīng)酰胺(C18-Cer)、D表示鞘氨醇(Sph)、E表示鞘氨醇-1-磷酸(SPP)、F表示HL60細(xì)胞數(shù)。裙帶菜孢子葉提取物添加組與對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)C16-Cer升高至約15倍，C18-Cer升高至約10倍。而神經(jīng)酰胺的分解產(chǎn)物Sph與對(duì)照組比較增加了約4倍。裙帶菜孢子葉提取物添加組與對(duì)照組比較，鞘氨醇的代謝產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸顯示稍微減少的傾向。C18-SM的水平?jīng)]有變化。裙帶菜孢子葉提取物添加組與對(duì)照組比較，HL60細(xì)胞的增殖得到顯著抑制。使用ApopLadder Ex(寶生物工程公司制造)，從該細(xì)胞中提取DNA，進(jìn)行使用1％瓊脂糖凝膠的電泳，用溴化乙啶染色，裙帶菜孢子葉添加組的細(xì)胞中檢出片段DNA序列梯，表明細(xì)胞發(fā)生編程性細(xì)胞死亡。由這些結(jié)果表明，由于裙帶菜孢子葉提取物的神經(jīng)酰胺酶抑制效果，細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺量增加，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞發(fā)生了編程性細(xì)胞死亡。
LCMS多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)

實(shí)施例8神經(jīng)酰胺酶抑制劑對(duì)人工培養(yǎng)皮膚的效果使用市售的正常人皮膚立體培養(yǎng)模型(クラボゥ公司制造、EPI-100)，測(cè)定神經(jīng)酰胺酶抑制劑對(duì)皮膚細(xì)胞的效果。首先，預(yù)先向六孔培養(yǎng)板各孔中加入2mL EPI-100用維持培養(yǎng)基(無(wú)慶大霉素培養(yǎng)基)，再向各孔內(nèi)加EPI-100的微型杯(ミニカップ)，在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)72小時(shí)。將培養(yǎng)基更換為4mL新的培養(yǎng)基，然后向微型杯中加入50μL實(shí)施例1中得到的裙帶菜孢子葉乙醇提取物的稀釋液。裙帶菜孢子葉乙醇提取物使用以下先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，然后再溶解于載體(含有0.5％聚氧乙烯氫化蓖麻籽油的80％丙二醇)，使提取物的濃度為0.05％-0.001％(w/v)。將只添加載體的組作為對(duì)照。在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)24小時(shí)，然后更換培養(yǎng)基，向微型杯中加入乙醇提取物，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。再更換一次培養(yǎng)基、添加乙醇提取物、培養(yǎng)24小時(shí)，然后取出微型杯，進(jìn)行皮膚細(xì)胞中神經(jīng)酰胺的測(cè)定。首先，將杯用生理鹽水清洗，然后用鑷子取出培養(yǎng)皮膚，轉(zhuǎn)移至帶有螺旋蓋的玻璃試管中，冷凍干燥。向其中加入2mL氯仿/甲醇(2∶1)，一邊時(shí)常攪拌，一邊在室溫下進(jìn)行2小時(shí)的神經(jīng)酰胺組分的萃取。以2,000rpm離心5分鐘，然后將上清轉(zhuǎn)移至另外的玻璃管中(上清1)。用濃縮離心裝置干燥沉淀后，再次用2mL氯仿/甲醇(2∶1)進(jìn)行萃取操作，離心得到上清(上清2)。將上清1和2合并，除去溶劑，將其作為薄層色譜(TLC)分析用樣品，分析前一直保存在-30℃下。TLC分析按照與實(shí)施例6同樣的方法進(jìn)行。結(jié)果如圖3所示。圖中，黑柱表示無(wú)羥基神經(jīng)酰胺，白柱表示羥基神經(jīng)酰胺。裙帶菜孢子葉乙醇提取物添加組與對(duì)照組相比，人工培養(yǎng)皮膚中的無(wú)羥基神經(jīng)酰胺、羥基神經(jīng)酰胺都隨所添加的提取物的濃度而顯著增加。圖3中，相對(duì)于對(duì)照的t檢驗(yàn)中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.005。
實(shí)施例9神經(jīng)酰胺酶抑制劑對(duì)感染綠膿桿菌的人工培養(yǎng)皮膚模型的效果有人指出特應(yīng)性皮炎患者的皮膚表面，埋于角層細(xì)胞的細(xì)胞間的神經(jīng)酰胺減少，該減少引起皮膚阻擋功能不全，即外界抗原容易侵入到體內(nèi)、以及過(guò)量的水分喪失到體外，進(jìn)而可能與上述病癥的發(fā)病和惡化有關(guān)。最近日本九州大學(xué)的伊東等人報(bào)告在特應(yīng)性皮炎患者的皮膚上統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高頻率地檢測(cè)出生產(chǎn)神經(jīng)酰胺酶的細(xì)菌，這些細(xì)菌多數(shù)是綠膿桿菌[J.Biol.Chem.，273，14368-14373(1998)以及Clinc.Diagnost.Lab.Immun.，6，101-104(1999)]。另一方面，已知特應(yīng)性皮炎患者的皮膚上高頻率可見(jiàn)金黃色葡萄球菌的感染。伊東等人還報(bào)告神經(jīng)酰胺酶生產(chǎn)菌可生產(chǎn)溶解金黃色葡萄球菌的蛋白酶，溶解的金黃色葡萄球菌會(huì)溶出激活神經(jīng)酰胺酶的心磷脂、磷脂酰甘油等陰離子性甘油磷脂[Biochem.J.，362，619-626(2002)]。由此可認(rèn)為如果神經(jīng)酰胺酶分泌菌綠膿桿菌感染特應(yīng)性皮炎患者的皮膚，則可溶解金黃色葡萄球菌，由此溶出的甘油磷脂激活神經(jīng)酰胺酶，皮膚角質(zhì)層的神經(jīng)酰胺水平降低。
這里，使綠膿桿菌感染正常人皮膚立體培養(yǎng)模型(EPI-100)，向該體系中添加神經(jīng)酰胺酶抑制劑，評(píng)價(jià)其效果。
首先，用L-broth(寶生物工程公司制造)，在30℃培養(yǎng)綠膿桿菌(綠膿桿菌AN17菌株)，在A(yíng)660nm的值為0.6時(shí)，終止培養(yǎng)，回收菌體。將其用PBS清洗，懸浮于PBS，達(dá)到4×107cfu/mL。另一方面，用L-broth在30℃液體培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，在A(yíng)660nm的值為0.6時(shí)，終止培養(yǎng)，回收菌體。將菌體用PBS清洗，懸浮于PBS，達(dá)到20×107cfu/mL，將懸浮液在100℃處理5分鐘，制備死菌。將該金黃色葡萄球菌死菌懸浮液用PBS稀釋5倍，將其與綠膿桿菌的PBS懸浮液在用前等量混合使用。預(yù)先向六孔培養(yǎng)板各孔中加入0.9mL EPI-100用維持培養(yǎng)基(無(wú)慶大霉素培養(yǎng)基)，再向各孔內(nèi)加EPI-100的微型杯，在37℃、5％CO2環(huán)境下預(yù)備培養(yǎng)2小時(shí)。更換為2mL新的維持培養(yǎng)基，然后向微型杯中加入50μL細(xì)菌懸浮液，在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)72小時(shí)。更換為4mL新的維持培養(yǎng)基，添加50μL實(shí)施例8中使用的裙帶菜孢子葉乙醇提取物稀釋液。將只添加載體的作為對(duì)照使用。在37℃、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)24小時(shí)，然后更換培養(yǎng)基，向微型杯中加入乙醇提取物，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。在更換一次培養(yǎng)基、添加乙醇提取物、培養(yǎng)24小時(shí)后，取出微型杯，進(jìn)行皮膚細(xì)胞中神經(jīng)酰胺的測(cè)定。首先，將杯用生理鹽水清洗，然后用鑷子取出培養(yǎng)皮膚，轉(zhuǎn)移至帶螺旋蓋的玻璃試管中，冷凍干燥。向其中加入2mL氯仿/甲醇(2∶1)，一邊時(shí)常攪拌，一邊在室溫下進(jìn)行2小時(shí)的神經(jīng)酰胺組分的萃取。以2,000rpm離心5分鐘，然后將上清轉(zhuǎn)移至另外的玻璃管中(上清1)。用濃縮離心裝置干燥沉淀后，再用2mL氯仿/甲醇(2∶1)進(jìn)行萃取操作，離心得到上清(上清2)。將上清1和2合并，除去溶劑，將其作為薄層色譜(TLC)分析用樣品，分析前一直保存在-30℃下。TLC分析按照與實(shí)施例6同樣的方法進(jìn)行。結(jié)果如圖4所示。圖中，黑柱表示無(wú)羥基神經(jīng)酰胺，白柱表示羥基神經(jīng)酰胺。0.05％裙帶菜孢子葉乙醇提取物添加組與對(duì)照組相比，人工培養(yǎng)皮膚中的無(wú)羥基神經(jīng)酰胺顯著增加，羥基神經(jīng)酰胺也可見(jiàn)增加傾向。0.05％裙帶菜孢子葉乙醇提取物添加組的神經(jīng)酰胺水平比未添加綠膿桿菌的實(shí)施例8的對(duì)照(參照?qǐng)D3)的神經(jīng)酰胺水平增加，因此顯示裙帶菜孢子葉提取物可恢復(fù)由于綠膿桿菌的神經(jīng)酰胺酶導(dǎo)致的皮膚角層神經(jīng)酰胺的減少，并且也抑制皮膚角層中的神經(jīng)酰胺酶，并有使角層中的神經(jīng)酰胺量增加的效果。圖4中，相對(duì)于對(duì)照的t檢驗(yàn)中，*表示p＜0.05。實(shí)施例10神經(jīng)酰胺酶抑制劑對(duì)感染綠膿桿菌的人工培養(yǎng)皮膚模型的效果通過(guò)與實(shí)施例9同樣的方法評(píng)價(jià)來(lái)源于各種植物的提取物的效果。裙帶菜孢子葉乙醇提取物如下使用從實(shí)施例1得到的物質(zhì)中除去溶劑，然后再溶解于載體(含有0.5％聚氧乙烯氫化蓖麻籽油的80％丙二醇)中，使提取物的濃度為0.05％(w/v)。海帶提取物如下使用從實(shí)施例2得到的物質(zhì)中除去溶劑，然后用載體稀釋?zhuān)固崛∥锏臐舛葹?.05％(w/v)。冬瓜提取物如下使用從實(shí)施例3得到的物質(zhì)中除去溶劑，然后用載體稀釋?zhuān)固崛∥锏臐舛葹?.5％(w/v)。橙油(山本香料公司制造)使用用載體稀釋1000倍的物質(zhì)。葡萄柚提取物(80％丙二醇提取、山本香料公司制造)直接使用原液。以只添加載體的作為對(duì)照。其它方法與實(shí)施例9相同。結(jié)果如圖5所示。圖中，黑柱表示無(wú)羥基神經(jīng)酰胺，白柱表示羥基神經(jīng)酰胺。裙帶菜孢子葉提取物添加組、海帶提取物添加組、冬瓜提取物添加組、橙油添加組與對(duì)照組相比，人工培養(yǎng)皮膚中的無(wú)羥基神經(jīng)酰胺顯著增加，羥基神經(jīng)酰胺也可見(jiàn)增加傾向。另外，葡萄柚提取物添加組也可見(jiàn)神經(jīng)酰胺量增加的傾向。圖5中，相對(duì)于對(duì)照的t檢驗(yàn)中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.005。
實(shí)施例11從裙帶菜孢子葉提取物中純化神經(jīng)酰胺酶抑制物質(zhì)(1)在不銹鋼容器中加入10kg干燥裙帶菜孢子葉片和20L乙醇，輕輕地?cái)嚢钄?shù)次，靜置一天。將其過(guò)濾，用乙醇清洗，得到34.4L裙帶菜孢子葉乙醇提取液。
(2)將三菱化學(xué)制造的DIAION HP20裝入玻璃柱(2.5L)，用乙醇洗滌，然后用50％乙醇平衡。在34.4L裙帶菜孢子葉乙醇提取液中加入等量的水，制成50％乙醇溶液(68.8L)，將其通入上述柱。全部過(guò)柱后，用12.5L50％乙醇洗滌，用25L乙醇洗脫。測(cè)定過(guò)柱(素通り)、洗滌、洗脫得到的各組分的抑制活性，可見(jiàn)乙醇洗脫組分具有活性，因此，濃縮該組分，除去乙醇。收量為136g。
(3)將硅膠60(Merk公司制造)填充到玻璃柱中(3.5×37cm、350mL)，用1L的正己烷平衡。向(2)的活性組分中加入正己烷，制成300mL，添加到柱中。用500mL的正己烷和1L的氯仿洗滌，然后分別用1LC/M＝9∶1、C/M＝8∶2洗脫。約80％的抑制活性洗脫到C/M＝9∶1組分中。
(4)將Ultrapack硅膠60(Yamazen公司制造、37×300mm、322mL)用1L正己烷以流速10mL/分鐘洗滌，然后用1L氯仿平衡，將(3)的活性組分(溶劑蒸發(fā)干燥固化，然后溶解于氯仿，制成50mL)過(guò)該柱。用1.5L的氯仿洗滌，然后進(jìn)行由氯仿至乙酸乙酯的梯度洗脫(0-100％乙酸乙酯/150分鐘)。最后用150mL的乙酸乙酯清洗。抑制活性分成兩種級(jí)分洗脫出來(lái)。
收集各級(jí)分，餾去溶劑。
級(jí)分I收量1925mg級(jí)分II收量440mg(5)將由上述硅膠柱層析得到的級(jí)分I進(jìn)一步通過(guò)反相HPLC純化。最初使用Cosmosil 5C18AR(10mm×250mm、ナカラィテスク公司制造)。將級(jí)分I溶解于10mL 50％異丙醇，分5次進(jìn)行層析。洗脫溶劑使用溶劑A(50％異丙醇)和溶劑B(100％異丙醇)，溶劑B的比例如下0分鐘至20分鐘為0％、20分鐘至60分鐘在0-100％之間變化、60分鐘至80分鐘保持100％。流量為2mL/分鐘，每隔1分鐘取一次洗脫液。通過(guò)參考例1的方法(使用終濃度為0.02 mM的NBD-C12-神經(jīng)酰胺，以下同樣)測(cè)定各級(jí)分的神經(jīng)酰胺酶抑制活性。在級(jí)分51-70中檢測(cè)出抑制活性。收集活性組分，除去溶劑。收量為450mg。
(6)使用YMC AM-322(10mm×150mm、YMC公司制造)，繼續(xù)對(duì)由上述(5)得到的組分的3/10進(jìn)行純化。樣品溶解于異丙醇中。洗脫溶劑使用溶劑A(50％異丙醇)和溶劑B(100％異丙醇)，溶劑B的比例如下0分鐘至10分鐘為0％、10分鐘至50分鐘在0-100％之間變化、50分鐘至55分鐘保持100％。流量為2mL/分鐘，注入樣品后，從第20分鐘開(kāi)始每隔1分鐘取一次洗脫液。通過(guò)參考例1的方法測(cè)定各級(jí)分的神經(jīng)酰胺酶抑制活性。在級(jí)分15-35中檢測(cè)出抑制活性。收集活性組分，除去溶劑。收量為32mg。
(7)使用XTerra RP18(4.6mm×150mm、ゥォ一タ一ズ公司制造)，繼續(xù)對(duì)由上述(6)得到的組分進(jìn)行純化。樣品溶解于異丙醇中，分兩次進(jìn)行層析。洗脫溶劑使用溶劑A(50％異丙醇)和溶劑B(100％異丙醇)，溶劑B的比例如下0分鐘至10分鐘為0％、10分鐘至50分鐘在0-100％之間變化、50分鐘至55分鐘保持100％。流量為1mL/分鐘，注入樣品后，從第20分鐘開(kāi)始每隔30秒鐘取一次洗脫液。通過(guò)參考例1的方法測(cè)定各級(jí)分的神經(jīng)酰胺酶抑制活性。在組分I(級(jí)分13-30)和組分II(級(jí)分21-25)兩種組分中檢測(cè)出抑制活性。收集活性組分，除去溶劑。收量為組分I10mg、組分II6mg。
(8)使用Symmetry Shield RP18(4.6mm×150mm、ゥォ一タ一ズ公司制造)，繼續(xù)對(duì)由上述(7)得到的組分I進(jìn)行純化。樣品溶解于氯仿/乙醇(1∶1)中。洗脫溶劑使用溶劑A(50％異丙醇)和溶劑B(100％異丙醇)，溶劑B的比例如下0分鐘至30分鐘為30％-70％、30分鐘至35分鐘保持100％。流量為1mL/分鐘，檢測(cè)采用220nm，注入樣品后，從第10分鐘開(kāi)始每隔15秒鐘取一次洗脫液。通過(guò)參考例1的方法測(cè)定各級(jí)分的神經(jīng)酰胺酶抑制活性。在組分I-I(級(jí)分26-29)、組分I-II(級(jí)分30-35)和組分I-III(級(jí)分36-42)三種組分中檢測(cè)出抑制活性。收集活性組分，除去溶劑。對(duì)組分I-III(收量為3.3mg)進(jìn)行NMR分析和質(zhì)量分析，由此進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
(9)使用離子噴霧式質(zhì)量分析儀(API-III、ァプラィドバィォシステムズ公司制造)對(duì)由上述(8)得到的組分I-III進(jìn)行質(zhì)量分析。測(cè)定溶劑使用含有0.1％甲酸的80％乙腈，用正向模式測(cè)定。結(jié)果，檢測(cè)出m/z565(M+H)+的信號(hào)。圖6表示質(zhì)譜。以該離子作為母離子進(jìn)行MS/MS分析，子離子檢測(cè)出m/z547和m/z338的信號(hào)，圖7表示MS/MS分析的質(zhì)譜。圖6和圖7中，橫軸表示m/z軸，縱軸表示信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度。
使用核磁共振(NMR)譜分析裝置(ブルッカ一公司制造)測(cè)定各種NMR譜，進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。以下給出各種NMR的信號(hào)。
1H-NMRσ0.848，0.860，0.871，1.236.1.265，1.277，1.289，1.354，1.368，1.507，1.531，1.584，1.923，1.934，1.945，1.964，1.974，2.018，2.029，2.041，2.053，2.208，2.350，2.462，2.575，2.957，2.969，3.728，3.747，3.770，3.777，3.783，3.789，3.971，3.976，3.989，3.994，5.321，5.330，5.346，5.356，5.368，5.378，5.394，5.491，5.501，5.515，5.527，5.539，5.605，5.616，5.629，5.642，5.653，6.455，6.468
1H-NMR中，樣品溶解于氘代氯仿，氘代氯仿中的殘留質(zhì)子的化學(xué)位移值為7.24ppm。圖8表示1H-NMR譜。圖8中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)強(qiáng)度。
13C-NMRσ14.10，22.68，25.42，29.20，29.22，29.34，29.36，29.49，29.54，29.62，29.63，29.65，29.69，31.91，31.92，32.42，32.57，32.60，34.36，40.56，53.96，62.45，74.06，122.17，129.72，130.88，136.81，171.8313C-NMR中，樣品溶解于氘代氯仿，氘代氯仿中的殘留質(zhì)子的化學(xué)位移值為77.0ppm。圖9表示13C-NMR譜。圖9中，橫軸表示化學(xué)位移值，縱軸表示信號(hào)強(qiáng)度。
由以上結(jié)果推定的作為神經(jīng)酰胺酶抑制物質(zhì)的化合物的一個(gè)例子是下式(1)所示的化合物。
通過(guò)參考例1的方法測(cè)定純化物的神經(jīng)酰胺酶抑制活性，本物質(zhì)以5μM的低濃度即可50％抑制來(lái)源于大鼠腦的中性/堿性神經(jīng)酰胺酶活性。而以往作為神經(jīng)酰胺酶抑制劑銷(xiāo)售的D-e-MAPP在5mM的濃度下的抑制率為28％。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑、含有該神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的藥品、準(zhǔn)藥、化妝品、食品。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，其特征在于含有來(lái)源于植物的處理物作為有效成分，其中所述植物選自銀杏科植物、葫蘆科植物、蕓香科植物、海帶科植物、桃金娘科植物和菊科植物的至少一種。
2.權(quán)利要求1的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，其中，銀杏科植物為銀杏，葫蘆科植物為選自菜瓜、黃瓜、冬瓜和苦瓜的至少一種，蕓香科植物為橙、葡萄柚和來(lái)檬的至少一種，海帶科植物為選自粘液海帶、海帶和裙帶菜的至少一種，桃金娘科植物為桉，菊科植物為艾蒿。
3.神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑，其特征在于含有權(quán)利要求1或2的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
4.藥品，其特征在于含有權(quán)利要求1或2的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
5.權(quán)利要求4的藥品，該藥品是皮膚外用藥。
6.權(quán)利要求4的藥品，該藥品是對(duì)于必須進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制的疾病的治療藥或預(yù)防藥。
7.權(quán)利要求4的藥品，該藥品是癌癥的治療藥或預(yù)防藥。
8.準(zhǔn)藥，其特征在于含有權(quán)利要求1或2的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
9.化妝品，其特征在于含有權(quán)利要求1或2的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
10.食品，其特征在于含有權(quán)利要求1或2的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
11.具有下述理化學(xué)性質(zhì)的化合物、其衍生物、或它們的可藥用的鹽(1)質(zhì)譜m/z 565(M+H)+；(2)MS/MS分析上述(1)為母離子時(shí)的子離子為m/z 547、m/z338；(3)1H-NMR(氘代氯仿)δ0.848，0.860，0.871，1.236.1.265，1.277，1.289，1.354，1.368，1.507，1.531，1.584，1.923，1.934，1.945，1.964，1.974，2.018，2.029，2.041，2.053，2.208，2.350，2.462，2.575，2.957，2.969，3.728，3.747，3.770，3.777，3.783，3.789，3.971，3.976，3.989，3.994，5.321，5.330，5.346，5.356，5.368，5.378，5.394，5.491，5.501，5.515，5.527，5.539，5.605，5.616，5.629，5.642，5.653，6.455，6.468(4)13C-NMR(氘代氯仿)δ14.10，22.68，25.42，29.20，29.22，29.34，29.36，29.49，29.54，29.62，29.63，29.65，29.69，31.91，31.92，32.42，32.57，32.60，34.36，40.56，53.96，62.45，74.06，122.17，129.72，130.88，136.81，171.83
12.神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑，其特征在于含有選自權(quán)利要求11的化合物、衍生物及其鹽的至少一種作為有效成分。
13.神經(jīng)酰胺量調(diào)節(jié)劑，其特征在于含有權(quán)利要求12的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
14.藥品，其特征在于含有權(quán)利要求12的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
15.權(quán)利要求14的藥品，該藥品是皮膚外用藥。
16.權(quán)利要求14的藥品，該藥品是對(duì)于必須進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制的疾病的治療藥或預(yù)防藥。
17.權(quán)利要求14的藥品，該藥品是癌癥的治療藥或預(yù)防藥。
18.準(zhǔn)藥，其特征在于含有權(quán)利要求12的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
19.化妝品，其特征在于含有權(quán)利要求12的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
20.食品，其特征在于含有權(quán)利要求12的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑、含有該神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的藥品、準(zhǔn)藥、化妝品、食品，其中所述的神經(jīng)酰胺酶活性抑制劑的特征在于抑制神經(jīng)酰胺酶的活性，特別是中性/堿性神經(jīng)酰胺酶活性，含有來(lái)源于植物的處理物作為有效成分，其中所述植物選自銀杏科植物、葫蘆科植物、蕓香科植物、海帶科植物、桃金娘科植物和菊科植物的至少一種。
文檔編號(hào)A61K36/28GK101027069SQ20048003532
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者佐藤睦, 伊豆博幸, 今村光雄, 岡本元子, 栗田豐久, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社