專利名稱：抗微生物的光動(dòng)力治療化合物的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及光動(dòng)力治療領(lǐng)域，尤其是光動(dòng)力治療在選擇性消滅人類和動(dòng)物患者體內(nèi)細(xì)菌中的應(yīng)用。
2.現(xiàn)有技術(shù)的公開光動(dòng)力治療(PDT)是眾所周知的，并且已被用于對(duì)抗大量通常與過度增生組織相關(guān)的疾病，諸如癌癥和多種皮膚疾病。PDT也已經(jīng)被用作抗微生物治療。然而，目前存在兩個(gè)與抗微生物PDT有關(guān)的主要問題。第一個(gè)問題源于難以發(fā)現(xiàn)可有效對(duì)抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌二者的光活物質(zhì)。革蘭氏陰性細(xì)菌主要由于其雙層外膜結(jié)構(gòu)存在非常堅(jiān)韌的屏障。
革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌之間的主要差異在于細(xì)胞壁，如圖1和2所示。如圖1所示，革蘭氏陽性細(xì)胞具有較厚的肽聚糖細(xì)胞壁101，由許多單獨(dú)的包圍細(xì)胞膜105的肽聚糖層103(例如，20-40層)組成。相比之下，如圖2所示，革蘭氏陰性細(xì)胞只具有包圍細(xì)胞膜203的薄層肽聚糖201，其還被附加的外膜205包圍。這個(gè)附加層可以使革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌利用革蘭氏染色法進(jìn)行區(qū)分。由于革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜，結(jié)晶紫-碘染色劑不能到達(dá)細(xì)胞壁的肽聚糖層并且在革蘭氏染菌法后不能象革蘭氏陽性細(xì)菌一樣被保留在革蘭氏陰性細(xì)菌中。外膜主要負(fù)責(zé)抑制許多物質(zhì)滲透進(jìn)入革蘭氏陰性細(xì)菌，并且是難以發(fā)現(xiàn)有效抗這兩種類型細(xì)菌的光敏劑的原因所在。
第二問題源于難以發(fā)現(xiàn)在諸如血清，血液或者唾液的復(fù)合物介質(zhì)存在下至少保留一些活性的合適的光敏化合物。大多數(shù)顯示出抗諸如磷酸鹽緩沖鹽水的貧瘠介質(zhì)中的細(xì)胞懸浮液的良好活性的光敏化合物(光敏劑)在血清，血液或者唾液存在下實(shí)際上無效果。這是因?yàn)檫@些復(fù)合物介質(zhì)(例如，蛋白，血細(xì)胞)中的組分與細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)PDT化合物的親合性。
番紅O是在450-600nm的藍(lán)綠波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收的紅色染料。在諸如顯微攝影術(shù)的方法中用作生物染色劑。例如，番紅O使核，染色體，木質(zhì)化以及角化的細(xì)胞壁染成紅色。其也與革蘭氏染色用的碘連用以區(qū)分細(xì)菌，并用于電子顯微術(shù)。番紅產(chǎn)品也被用在用于顯示滅菌技術(shù)中包括時(shí)間，壓力，能量的條件，或者某些化學(xué)試劑存在與否的油墨組合物(ink compositions)(美國(guó)專利5,990,199)。
番紅O，番紅以及相關(guān)染料已被用于檢測(cè)以及處理牙齒和齒齦上以及周圍的微生物和孔洞的牙周治療。美國(guó)專利6,337,357公開了一種包含水，水混溶的溶劑或者組合，能夠?qū)ρ例X的齲齒感染部分染色的染料以及抗微生物劑的抗微生物的齲齒檢測(cè)組合物。這既是孔洞檢測(cè)也是孔洞殺菌系統(tǒng)?？梢允褂弥T如番紅O的染料，其是溶于溶劑并且能夠目測(cè)顯示孔洞的存在以及位置的合適染料。對(duì)于此發(fā)明，番紅僅僅被用作著色劑并且不被考慮作為抗微生物劑。
番紅也被用作抗微生物PDT敷劑中的光敏劑。美國(guó)專利6,558,653(以及美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0059379)描述了一種PDT的方法以及用于消滅牙齒上的壞死組織以及細(xì)菌的光敏化合物。本方法包括施加諸如吸收450以及600nm之間波長(zhǎng)的光能的番紅的染料成分。該染料接觸壞死組織，細(xì)菌以及周圍組織對(duì)組織進(jìn)行選擇性染色。因此染色的感染組織很容易吸收施加的輻射并且熱消滅染病的組織以及細(xì)菌。本發(fā)明限于利用光熱效應(yīng)處理牙周袋中的表面細(xì)菌。
番紅O的光活特性已經(jīng)被用于其它的敷劑中，諸如殺蟲以及非人類抗微生物處理劑以及組合物。美國(guó)專利5,798,112描述了諸如番紅O的光活染料在光毒性殺蟲組合物中的應(yīng)用。該組合物包含所選擇的光活染料，引誘物以及佐劑。該化合物由所需的昆蟲攝取，借此佐劑與光活染料以及昆蟲膜相互作用以改變組合物的毒性，從而在曝光一段時(shí)間以后殺死昆蟲。美國(guó)專利6,506,791公開了處理魚中原生動(dòng)物感染的方法。包括番紅O的光活染料被引入包含感染的魚的水相環(huán)境，使得光活染料的濃度足以殺死一些或者所有的細(xì)菌。
目前需要一種抗微生物PDT的方法以及在諸如血清，血液或者唾液的復(fù)合物介質(zhì)存在下有效的化合物。這種方法應(yīng)該被有效地用于抗革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性細(xì)菌。本發(fā)明滿足了這些需要。
發(fā)明目的以及概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供有效并且選擇性消滅人類或者動(dòng)物受試者體內(nèi)有害微生物，尤其是細(xì)菌的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供可由電磁輻射控制并且選擇性活化的抗細(xì)菌的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供有效消滅革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性細(xì)菌的方法。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明提供了利用番紅精O連同電磁輻射消滅體內(nèi)微生物尤其是細(xì)菌的方法以及組合物。在優(yōu)選的方法中，包括番紅O的組合物被引入處理區(qū)域。經(jīng)過足夠的時(shí)間后，將合適波長(zhǎng)的輻射施加到該區(qū)域活化番紅O并且通過光動(dòng)力反應(yīng)消滅細(xì)菌。優(yōu)選的輻射具有大約530nm的波長(zhǎng)。這種方法可有效消滅革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性細(xì)菌，并且可尤其有效用于也存在諸如血清，血液或者唾液的復(fù)合物介質(zhì)的區(qū)域。
本發(fā)明的上述及其他目的，特征以及優(yōu)點(diǎn)將通過下列描述連同附圖而顯而易見。


圖1-革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞外膜的剖視圖。
圖2-革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞外膜的剖視圖。
圖3-顯示由番紅O光動(dòng)力滅活金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)DSM1104的圖。
圖4-顯示由番紅O光動(dòng)力滅活銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DSM1117的圖。
圖5-顯示由番紅O光動(dòng)力滅活大腸桿菌DSM8698的圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)方法以及化合物中存在的難點(diǎn)，尤其是提供消滅革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性細(xì)菌以及避免諸如血清，血液或者唾液的復(fù)合物介質(zhì)的有害效應(yīng)的方法中的難點(diǎn)，需要發(fā)現(xiàn)克服這些缺點(diǎn)的化合物。令人驚訝地，人們發(fā)現(xiàn)番紅O可連同電磁輻射被用于有效消滅革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性微生物。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是復(fù)合組分的介質(zhì)(例如血清，血液或者唾液)的存在并不中和靶細(xì)菌中番紅O的效果，而通常中和其它光敏劑的效果。因此番紅O是本發(fā)明有效抗細(xì)菌處理的一部分。包括番紅精O的抗細(xì)菌PDT組合物也是本發(fā)明的一部分。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗菌處理包含3個(gè)常規(guī)步驟。第一步是向包含細(xì)菌的環(huán)境中引入番紅O組合物。第二步是經(jīng)過足夠的時(shí)間段以使番紅精O滲入處理區(qū)域中的細(xì)菌細(xì)胞或者至少結(jié)合在其細(xì)胞外膜的組分上。最后的步驟是施加合適波長(zhǎng)的輻射通過活化引起導(dǎo)致細(xì)菌消滅的活性氧以及自由基產(chǎn)生的番紅O啟動(dòng)光動(dòng)力機(jī)制。
施加番紅O組合物以及輻射之間的優(yōu)選時(shí)間段是可變的，并且將取決于諸如待處理細(xì)菌的類型，待處理的身體區(qū)域以及引入番紅O組合物的方法的因素而改變。通常，這個(gè)時(shí)間段為至少15分鐘。對(duì)于處理體內(nèi)細(xì)菌感染而言，該組合物可被注入血流中用于系統(tǒng)施用，或者如果感染限于特定區(qū)域進(jìn)行局部注射。對(duì)于皮膚上或者接近皮膚的感染，該組合物可以為用于體表施用的溶液，乳油，凝膠或者洗劑的劑型。
預(yù)定的時(shí)間段后，將輻射施用于處理位點(diǎn)以活化番紅O并消滅細(xì)菌。活化輻射的優(yōu)選波長(zhǎng)在500nm和580nm之間，并且更優(yōu)選大約530nm。輻射可以是諸如來自燈的非相干輻射或者相干的激光輻射。對(duì)于表面或者皮下處理而言，燈可以有效輻射特定的感染區(qū)域，而對(duì)于體內(nèi)較深的感染區(qū)域，包括一或者多條光纖，可能還包含漫射器或者其它輻射某一體內(nèi)區(qū)域所需的裝置的光纖設(shè)備優(yōu)選將激光輻射遞送到那些體內(nèi)區(qū)域。優(yōu)選的激光源是二極管泵激的532nm激光器。
本發(fā)明通過下列實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但并不限于此。
實(shí)施例1由番紅O光動(dòng)力滅活細(xì)菌細(xì)胞懸浮液幾個(gè)研究已經(jīng)顯示革蘭氏陽性細(xì)菌(例如，金黃色葡萄球菌)對(duì)光動(dòng)力滅活尤其敏感，而革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌，銅綠假單胞菌)對(duì)許多通常應(yīng)用的光敏劑更具顯著耐受性。而且，我們發(fā)現(xiàn)較復(fù)雜的介質(zhì)(例如，血液，血漿，血清，唾液)中的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞更能免于光動(dòng)力學(xué)作用。
用于本研究中的生物體是創(chuàng)口微生物群的3個(gè)成員金黃色葡萄球菌DSM1104(ATCC 25923)，革蘭氏陽性；大腸桿菌DSM 8698，革蘭氏陰性；銅綠假單胞菌DSM1117(ATCC 27853)，革蘭氏陰性。所有的菌株在37℃需氧過夜培養(yǎng)在胰酶大豆肉湯(Merck KGaA Darmstadt，Germany)中。經(jīng)離心收集細(xì)胞并分別再懸浮在無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)或者補(bǔ)充有10％無菌馬血清(Oxoid)，10％人血漿或者10％人血液(均新鮮獲自供體)的無菌PBS中。所有情況下，600nm，1cm的最終OD(光密度)均為0.03。
將等分試樣(190μl)的細(xì)菌懸液置入具有透明底部的無菌黑色96孔板(Costar3603，Coming Inc.，USA)中。添加10μl的3種不同的番紅O儲(chǔ)液以分別獲得10μM，100μM以及1mM的光敏劑終濃度。在黑暗室溫下對(duì)板溫育30分鐘。
培養(yǎng)后，將樣品暴露于來自532nm，設(shè)定到0.5W功率，經(jīng)來自板底部的光纖輻射85s的激光器Ceralas G2(biolitec AG，Germany)的射線。這些設(shè)置的流量率為約1.2W/cm2(由來自德國(guó)Puchheim的Optometer P-9710，Gigahertz-Optik GmbH測(cè)定)。隨著輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生的能量流量為約100J/cm2。
對(duì)照微孔不含番紅O并且不暴露于激光。為了獲得黑暗毒性的對(duì)照樣品只暴露于番紅O(終濃度1mM)，不伴隨任何照明。
照明后，從微板孔除去樣品，用胰酶大豆肉湯稀釋并且通過利用螺旋涂板器Eddy Jet(iul Instruments，巴塞羅那，西班牙)在胰酶大豆瓊脂板上涂板。通過利用菌落計(jì)數(shù)器Countermat Flash(iul Instruments，巴塞羅那，西班牙)在充分培養(yǎng)后對(duì)集落形成單位(CFU/ml)的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。
實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖3，4和5中我們發(fā)現(xiàn)在革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌細(xì)胞的PBS和更復(fù)雜介質(zhì)(PBS+10％馬血清，PBS+10％人血漿；參見圖4)的懸浮液的情況下通過利用番紅O的PDT處理獲得良好的殺傷效果。而且在存在血清或者血漿的處理懸液中也充分殺傷了革蘭氏陰性銅綠假單胞菌和大腸桿菌細(xì)胞的細(xì)胞懸液(分別參見圖4和5)。
已經(jīng)參考附圖描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)該理解本發(fā)明并不局限于確切的實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的附屬權(quán)利要求限定的范圍或者精神的情況下可以對(duì)其進(jìn)行多種改變和修改。
權(quán)利要求
1.一種消滅患者處理區(qū)域中細(xì)菌的方法，包括如下步驟a.向患者的處理區(qū)域引入包含番紅O作為光敏劑的組合物；b.經(jīng)過預(yù)置的時(shí)間段以使所述番紅O與所述處理區(qū)域中的細(xì)菌結(jié)合；以及c.向所述處理區(qū)域施加預(yù)選定波長(zhǎng)的輻射以活化所述番紅O并由此刺激光動(dòng)力反應(yīng)從而消滅所述細(xì)菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的消滅細(xì)菌的方法，其中所述預(yù)選定的波長(zhǎng)在約500nm和約580nm之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的消滅細(xì)菌的方法，其中所述預(yù)選定的波長(zhǎng)為約530nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的消滅細(xì)菌的方法，其中所述處理區(qū)域包含復(fù)合物介質(zhì)，并且其中所述復(fù)合物介質(zhì)選自血清，血液和唾液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的消滅細(xì)菌的方法，其中所述引入步驟選自系統(tǒng)施用，局部施用以及體表施用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的消滅細(xì)菌的方法，其中所述系統(tǒng)施用為靜脈注射。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的消滅細(xì)菌的方法，其中所述局部施用為局部注射入無血管組織。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的消滅細(xì)菌的方法，其中用于體表施用的所述組合物為選自溶液，乳油，凝膠和洗劑的劑型。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的消滅細(xì)菌的方法，其中所述預(yù)置時(shí)間為至少約15分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的消滅細(xì)菌的方法，其中所述輻射由選自非相干燈以及相干激光器的輻射源提供。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的消滅細(xì)菌的方法，其中所述施加輻射的步驟由至少一條與輻射源耦合的光纖實(shí)現(xiàn)。
12.一種抗微生物的光動(dòng)力治療組合物，包括作為用于光動(dòng)力治療的活化光敏劑組分的番紅O。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用番紅O連同電磁輻射用于消滅體內(nèi)微生物，特別是細(xì)菌的方法和組合物。在優(yōu)選的方法中，包括番紅O的組合物被引入處理區(qū)域。經(jīng)過充分的時(shí)間段后，將合適波長(zhǎng)的輻射施加于該區(qū)域活化番紅O并通過光動(dòng)力反應(yīng)消滅細(xì)菌。優(yōu)選的輻射具備大約530nm的波長(zhǎng)。這種方法可有效消滅革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌，并且尤其對(duì)也存在復(fù)合物介質(zhì)諸如血清，血液或者唾液的區(qū)域有效。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1863533SQ200480028934
公開日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2004年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
發(fā)明者福爾克爾·阿爾布雷希特, 布克哈德·吉特 申請(qǐng)人:塞拉莫普泰克工業(yè)公司