專(zhuān)利名稱(chēng)：：EphA4和EphA4調(diào)節(jié)劑用于診斷、治療和預(yù)防癌癥的用途的制作方法EphA4和EphA4調(diào)節(jié)劑用于診斷、治療和預(yù)防癌癥的用途本申請(qǐng)要求于2003年6月6日提交的U.S.臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/476,909和2003年9月16日提交的U.S.臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/503，356的優(yōu)先權(quán)，在此引入每一申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容引為參考。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療、控制或預(yù)防高增生性細(xì)胞疾病，尤其是癌癥的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括給予有效量的一種或多種對(duì)EphA4具有特異性的抗體，優(yōu)選是單克隆抗體，該抗體是EphA4激動(dòng)劑，可以抑制癌細(xì)胞表型(如軟瓊脂中的克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外膜制劑如MATRIGELTM中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成)，優(yōu)選地結(jié)合EphA4抗原決定部位，該抗原決定部位在癌細(xì)胞上而不是非癌細(xì)胞上選擇性地暴露或增加，和/或結(jié)合Koff小于3xl(T3S"的EphA4。本發(fā)明也提供藥物組合物，其包括一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體或還包括一種或多種用于癌癥治療的其他試劑。也提供診斷方法和篩選治療用EphA4特異性抗體的方法。2.發(fā)明背景遮瘤或腫瘤是因異常的不可控制的細(xì)胞生長(zhǎng)而形成的腫瘤塊，其可以是良性的或惡性的。良性腫瘤通常保持在一個(gè)地方。惡性腫瘤一般稱(chēng)為癌。術(shù)語(yǔ)"惡性"通常是指，胖瘤可以侵犯并破壞附近的身體結(jié)構(gòu)，并可擴(kuò)散到較遠(yuǎn)位置而致死(請(qǐng)參見(jiàn)Robbins和Angdl，1976,5咖'c尸a&o/ogy，2dEd.,W.B.SaundersCo.，Philadelphia,pp.68-122)。癌可以在身體多個(gè)位置發(fā)生，其表現(xiàn)因器官不同而不同。癌細(xì)胞破壞它們起源的身體部分，并擴(kuò)散到身體其他部分，在其他部分它們重新生長(zhǎng)，再次引起破壞。每年有超過(guò)120萬(wàn)的美囯人得癌癥。在美囯，癌癥是第二致死病癥，并且如果按這種趨勢(shì)發(fā)展，到2010年癌癥會(huì)成為第一致死病癥。對(duì)于美國(guó)男性而言，肺和前列腺癌癥是主要的癌癥殺手。對(duì)于美囯女性而言，肺和乳腺癌是主要的癌癥殺手。在美囯兩個(gè)男性之中就有一個(gè)在其一生中被診斷為患有癌癥。在美囯三個(gè)女性之中就有一個(gè)在其一生中被診斷為患有癌癥。癌癥治療法仍未被發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)有的治療選擇如外科治療，化學(xué)治療和放射治療通常沒(méi)有效果或存在嚴(yán)重副作用。轉(zhuǎn)移當(dāng)肺瘤細(xì)胞群落獲得在體內(nèi)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)距離和外部位點(diǎn)的能力時(shí)，就產(chǎn)生了大多數(shù)威脅生命的癌。這些轉(zhuǎn)移性細(xì)胞通過(guò)克服通常限制細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不同組織的限制條件而存活。例如，如果將一般的乳腺上皮細(xì)胞移植到肺部，那么它一般不能生長(zhǎng)或存活，然而肺轉(zhuǎn)移瘤是乳腺癌發(fā)病率和死亡率的主要原因。近來(lái)有證據(jù)表明，在原發(fā)性肺瘤在臨床上有表現(xiàn)之前的很長(zhǎng)時(shí)間，轉(zhuǎn)移性細(xì)胞就可擴(kuò)散到了全身。在檢測(cè)到并除去原發(fā)性肺瘤之后，這些微轉(zhuǎn)移性細(xì)胞可以保持休眠幾個(gè)月或幾年。因此，更好地了解轉(zhuǎn)移性細(xì)胞在外部微環(huán)境中的生長(zhǎng)和存活機(jī)理對(duì)于改進(jìn)治療非常重要，這樣可以對(duì)抗轉(zhuǎn)移性癌癥，并可較早地診斷和定位轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞信號(hào)癌癥是一種異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)疾病。異常細(xì)胞信號(hào)克服對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的錨定依賴性限制(Rhim等人，0/〖/ra/ievz'e>ra/wO"coge"es/;y8:305,1997;Patarca,CW〖/ca/iev/ews/"0"cogewes/s7:343，1996;Malik等人,W5/op力"/cfl爿cto1287:73,1996;Cance等人,5refl^OmcCT^es7>ea〖35:105,1995)。酪氨酸激酶活性是由ECM錨定誘導(dǎo)的，而且確實(shí)地，酪氨酸激酶的表達(dá)或功能通常在惡性細(xì)胞中增大(Rhim等人，0衍ca/iev/ews/"OwcogewCT/s8:305,1997;Cance等人，5reaWOmcw7VeW35:105,1995;Hunter，Ce//88:333,1997)。基于惡性細(xì)胞生長(zhǎng)需要酪氨酸激酶活性的事實(shí)，酪氨酸激酶成為新治療方法的標(biāo)耙(Levitzki等人，Sdewce267:1782,1995;Kondapaka等人，Mofea//wc&Ce//￡"cfocn>w/ogy117:53,1996;Fry等人，a^re擬Qp/剛'ow/"5/o7k;/mo/ogy6:662,1995)。不幸地是，與腫瘤細(xì)胞特異性有關(guān)的障礙經(jīng)常限制這些藥物的應(yīng)用。具體而言，酪氨酸激酶活性通常對(duì)于良性組織的功能和存活是至關(guān)重要的(Levitzki等人,Sdewce267:1782,1995)。為了使間接毒性最小化，識(shí)別在胂瘤細(xì)胞中選擇性過(guò)表達(dá)的酪氨酸激酶，然后以其為標(biāo)靶非常重要。EphA4EphA4是在大腦、心臟、肺、肌肉、腎、胎盤(pán)、胰腺(Fox等人，O"coge"e10:897,1995)和黑素細(xì)胞(Easty等人，MJC證r71:1061,1997)中表達(dá)的受體酪氨酸激酶。EphA4結(jié)合細(xì)胞膜錨定的配體(EphrinsAl、A2、A3、A4、A5、B2及B3;Pasquale，Cwr.Qp/".Ce/Z說(shuō)o/ogv,1997，9:608;及配體B61、AL1/RAGS、LERK4、Htk-L和Elk-L3;Martone等人，5ra/wiewarc/z771:238，1997)，結(jié)合配體使EphA4在酪氨酸殘基上自動(dòng)磷酸化(Ellis等人，(9"coge"e12:1727,1996)。EphA4酪氨酸磷酸化與SrcHomology2/3(Sffi/SH3)區(qū)生成蛋白結(jié)合區(qū)，如細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶p59fyn(Ellis等人，見(jiàn)上文；Cheng等人，CytoA:/恥朋c/Factoriew'evra13:75，2002)。在Xenopus胚胎中活化EphA4會(huì)導(dǎo)致釣粘連蛋白依賴性的細(xì)胞粘連的喪失(Winning等人，D^era^/加'ow70:46,2002;Cheng等人，見(jiàn)上文)，這表明EphA4在腫瘤血管生成中具有作用；然而，EphA4在癌癥發(fā)展中的作用還不清楚。EphA4在乳腺癌、食道癌癥及胰腺癌癥中表現(xiàn)出上調(diào)(Kuang等人,M/c/e/d/is26:1116,1998;Meric等人,C7/wW及饑8:361，2002;Nemoto等人,Pfl決o6/o/ogy65:195，1997;Logsdon等人，C朋ceri戰(zhàn)63:2649，2003)，而在黑素瘤組織中表現(xiàn)出下調(diào)(Easty等人，見(jiàn)上文)。癌癥治療發(fā)展抗轉(zhuǎn)移試劑的一個(gè)障礙是用于設(shè)計(jì)和評(píng)估這些藥物的分析系統(tǒng)。大多數(shù)常規(guī)癌癥治療是以快速生長(zhǎng)的細(xì)胞為乾。然而，癌細(xì)胞并不一定必需地快速生長(zhǎng)，而是可以在不允許正常細(xì)胞存活的條件下存活或生長(zhǎng)(Lawrence和Steeg，1996,阪/"眼14:124-130)。正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞行為上的這些基本差異為治療耙提供了機(jī)會(huì)。擴(kuò)散到全身的微轉(zhuǎn)移腫瘤的實(shí)例強(qiáng)調(diào)了在外部和三維微環(huán)境中需要評(píng)估可能的化學(xué)治療藥物。在常用細(xì)胞培養(yǎng)條件下可用多種標(biāo)準(zhǔn)癌藥物分析法來(lái)測(cè)量I中瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活(即單層生長(zhǎng))。然而，細(xì)胞行為在二維分析中通常不能可靠地預(yù)測(cè)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞行為。如今，癌癥治療可以包括外科治療、化學(xué)治療、激素治療和/或放射治療，以根除患者的肝瘤細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Stockdale，1998,"PrinciplesofCancerPatientManagement",5We"f訴c爿wer/c朋Mec/d"e，巻3，Rubenstein禾口Federman，第12章，第IV部分)。近來(lái)，癌癥治療也可以包括生物治療或免疫治療。所有這些方法對(duì)患者而言都有明顯的缺點(diǎn)。例如，外科治療可能由于患者的健康情況而不適宜，或者患者不能接受。此外，外科治療不可能完全除去胂瘤組織。放射治療只有在新生組織比正常組織表現(xiàn)出更高的放射敏感性時(shí)才有效，同時(shí)放射治療還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。激素治療雖然是有效的，但是其很少以單一試劑給予，其經(jīng)常在使用其他治療除去大部分癌細(xì)胞后，用于預(yù)防或延緩癌癥復(fù)發(fā)。生物治療/免疫治療受到次數(shù)限制，并且每種治療通常只對(duì)極特定類(lèi)型的癌癥有效。關(guān)于化學(xué)治療，有多種化學(xué)治療性試劑可用于治療癌癥。大部分癌癥化學(xué)治療是直接抑制DNA合成或間接抑制脫氧(核糖)核苷三磷酸前體的生物合成以預(yù)防DNA復(fù)制和伴隨的細(xì)胞分裂(參見(jiàn)，例如，Gilman等人，Goodman和Gilman's:ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第八版(PergamomPress,NewYork,1990))。這些試劑包括烷基化試劑，如亞硝基脲，抗代謝物，如甲氨蝶呤和幾基脲，及其他試劑，如依托泊苷(etoposide),campathecins,博來(lái)審素，多柔比星，柔紅霉素等，盡管它們具有必需的細(xì)胞周期特異性，但是由于它們對(duì)DNA復(fù)制起作用，因此可以在S期殺死細(xì)胞。其他試劑，具體而言是秋水仙堿和長(zhǎng)春花生物堿，如長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿，可以干擾微管組裝，從而使有絲分裂停滯?；瘜W(xué)治療方法通常包括給予化學(xué)治療性試劑的組合來(lái)提高治療效果。盡管可以使用多種化學(xué)治療性試劑，但是化學(xué)治療具有很多缺點(diǎn)(參見(jiàn)，例如,Stockdale，1998，"PrinciplesofCancerPatientManagement",ScientificAmericanMedicine,巻3,Rubenstein和Federman，第12章,第10部分)。幾乎所有的化學(xué)治療性試劑都有毒性，而且化學(xué)治療會(huì)引發(fā)明顯的并經(jīng)常是很危險(xiǎn)的副作用，包括嚴(yán)重惡心，骨髓抑制，免疫抑制等。此外，即使給予化學(xué)治療性試劑的組合，很多腫瘤細(xì)胞仍對(duì)化學(xué)治療性試劑具有抵抗性或會(huì)發(fā)展成具有抵抗性。事實(shí)上，對(duì)治療方法中使用的特定化學(xué)治療性試劑有抵抗性的那些細(xì)胞經(jīng)常被證實(shí)對(duì)其他藥物也有抵抗性，即使那些試劑的作用機(jī)理不同于特異性治療中所用藥物的作用機(jī)理；這種現(xiàn)象稱(chēng)為多向耐藥性或多藥耐藥性。因此，由于耐藥性，多種癌癥難于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療。這樣就明顯需要可選擇的癌癥治療方法，尤其是用于治療難于用標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療法(如外科治療，放射治療，化學(xué)治療，及激素治療)治療的癌癥的治療方法。此外，僅通過(guò)一種方法來(lái)治療癌癥非常少見(jiàn)。因此，需要研發(fā)治療癌癥的新治療性試劑和治療癌癥的新的更有效的治療組合。3.發(fā)明概述EphA4在許多癌癥中過(guò)表達(dá)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與EphA4結(jié)合的EphA4抗體可以鋒低細(xì)胞的增生和/或轉(zhuǎn)移行為，并使EphA4和75千道爾頓(kDa)的EphA4關(guān)聯(lián)蛋白磷酸化。本發(fā)明人認(rèn)為，EphA4與EphA2相似，可以在胂瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起作用。激發(fā)EphA2而產(chǎn)生EphA2信號(hào)的抗體實(shí)際上可降低EphA2表達(dá)并抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移，正如在未決的標(biāo)題為"EphA2MonoclonalAntibodiesandMethodsofUseThereof，、2003年5月12曰申請(qǐng)、代理機(jī)構(gòu)巻號(hào)10271-097-999的美囯專(zhuān)利申請(qǐng)10/436,782中描述的那樣。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，EphA4結(jié)合抗體足以降低細(xì)胞-ECM粘附和誘導(dǎo)細(xì)胞圓形化。細(xì)胞-ECM粘附通常被認(rèn)為提供了物理粘附和控制多方面細(xì)胞行為，包括決定細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵入和分化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。因此，EphA4抗體與EphA4的結(jié)合與EphA4磷酸化的升高和細(xì)胞-ECM粘附的降低有關(guān)。盡管不希望限于任何作用機(jī)理，但是通過(guò)誘導(dǎo)EphA4自磷酸化，激發(fā)EphA4的抗體或其他分子能夠抑制高增生或惡性細(xì)胞行為，從而使以后的EphA4降低到下調(diào)表達(dá)。因此,在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的EphA4抗體激發(fā)EphA4信號(hào)，并提高EphA4和EphA4相關(guān)75kDa蛋白的褲酸化("EphA4激發(fā)性抗體")o此外，癌細(xì)胞表現(xiàn)出不同于非癌細(xì)胞的表型特征，例如，癌細(xì)胞在三維基板如軟瓊脂中形成克隆或在三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑如MATRIGEL中形成管狀網(wǎng)絡(luò)或網(wǎng)狀基質(zhì)。非癌細(xì)胞在軟瓊脂中不形成克隆，而在三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中形成明顯的球狀結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，抗EphA4抗體能夠降低表達(dá)EphA4的癌細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明也提供如下抗體其可特異性結(jié)合EphA4，并抑制一種或多種癌細(xì)胞表型，如在軟瓊脂中的克隆形成或在三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成("癌細(xì)胞表型抑制性EphA4抗體")。使癌細(xì)胞暴露于這種癌細(xì)胞表型抑制性EphA4抗體可以防止或降低細(xì)胞形成克隆或在這些基板中形成管狀網(wǎng)絡(luò)的能力。此外，在某些實(shí)施方案中，將這種癌細(xì)胞表型抑制性EphA4抗體加到已經(jīng)形成的癌細(xì)胞克隆中，會(huì)例如通過(guò)壞死或細(xì)胞凋亡降低或除去存在的癌細(xì)胞克隆，即可以殺死高增生和/或轉(zhuǎn)移細(xì)胞。根據(jù)亞細(xì)胞位置，配體結(jié)合屬性或蛋白組織(例如，結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜中的方向)的差異可以進(jìn)一步區(qū)分癌細(xì)胞上的EphA4和非癌細(xì)胞上的EphA4。在非癌細(xì)胞中，EphA4以低水平表達(dá)。然而，癌細(xì)胞通常表現(xiàn)出較低的細(xì)胞間接觸，這可以降低EphA4-配體的結(jié)合。此外,EphA4的過(guò)表達(dá)可能使EphA4相對(duì)于配體過(guò)量，這會(huì)提高非配體結(jié)合的EphA4的量。因此，改變EphA4的亞細(xì)胞分布或膜定向可以使EphA4定位到癌細(xì)胞中配體不能接近的位置。此外，在癌細(xì)胞中EphA4可以具有變化的配體結(jié)合屬性(例如，由于變化構(gòu)形的原因)，這使得其不能與其配體穩(wěn)定地相互作用，而不論其是否被定位到細(xì)胞間的連接處。在每種情況下，這些變化都能在癌細(xì)胞的EphA4上露出在非癌細(xì)胞中不會(huì)露出的某些抗原決定部位。因此，本發(fā)明也提供如下抗體其可特異性結(jié)合EphA4，但優(yōu)選結(jié)合是在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位("暴露的EphA4抗原決定部位抗體")。使癌細(xì)胞暴露于這種EphA4抗體(其優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露或增加的EphA4抗原決定部位)可以使治療/預(yù)防抗體以癌細(xì)胞為靶，并具有防止或降低細(xì)胞增生的能力，同時(shí)不傷害非癌細(xì)胞。結(jié)合具有極低Koff速率的EphA4的抗體對(duì)于降低EphA4表達(dá)和/或誘導(dǎo)EphA4分解特別有效，從而可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移和/或高增生細(xì)胞的增生。因此，本發(fā)明還提供結(jié)合Koff小于3xlO'3S"的EphA4的抗體，并優(yōu)選是EphA4激動(dòng)劑。本發(fā)明提供篩選和識(shí)別抗體的方法，該抗體結(jié)合EphA4并激發(fā)EphA4，抑制癌細(xì)胞表型，優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上選擇性暴露或增加和/或其Koff小于3xl(T3S"的EphA4抗原決定部位，優(yōu)選是單克隆抗體。具體而言，本發(fā)明的抗體與EphA4的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合，并優(yōu)選產(chǎn)生EphA4信號(hào)和使EphA4自磷酸化，抑制癌細(xì)胞表型，優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上暴露和/或其Koff小于3xl(T3S"的EphA4抗原決定部位。本發(fā)明的抗體還可用于調(diào)節(jié)EphA4信號(hào)和EphA4關(guān)聯(lián)蛋白的褲酸化，如75kDa蛋白(該蛋白在酪氨酸殘基上磷酸化)的磷酸化，然后使EphA4與EphA4抗體交聯(lián)。調(diào)節(jié)這種75kDaEphA4關(guān)聯(lián)蛋白磷酸化的抗體可以用作治療性試劑。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了EphA4scFv抗體EphA4-44/EA44(在本說(shuō)明書(shū)中，EA44和EphA4-44指相同抗體，即結(jié)合EphA4的EphA4-44scFv克隆，予2004年6月10日在ATCC保藏為"EA44")。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種EphA4抗體，其中其可變重鏈和/或可變輕鏈的氨基酸序列分別與SEQIDNO:4和8中所含的EA44的可變重鏈或輕鏈氨基酸序列相同或至少90%序列相同。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種EphA4抗體，其中其至少3個(gè)，至少4個(gè)，至少5個(gè)，或全部6個(gè)CDR與EA44中的相應(yīng)CDR相同。在其他特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗EphA4scFv克隆8、18、20、36及41。具體而言，本發(fā)明提供了一種抗體，包括(或可選擇地，由其組成)EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)和VLCDRl(SEQIDNO.28);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDRl(SEQIDNO.28);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)和VHCDR3(SEQIDNO.26);EA44VHCDR3(SEQIDNO.26)和VHCDRl(SEQIDNO.22);EA44VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44麗CDRl,VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDRl(SEQIDNO.28);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDRl(SEQIDNO.28),EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)，VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR3(SEQIDNO.26)，VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VH32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24)，VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDRl(SEQIDNO.28);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR2(SEQIDNO,24),VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR3(SEQIDNO.26)，VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)，VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDR2(SEQIDNO.30)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR1(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24)，VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDR1(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR1(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24)，VLCDR1(SEQIDNO.28),VLCDR2(SEQIDNO.30)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR1(SEQIDNO.22)，VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDR1(SEQIDNO.28)，VLCDR2(SEQIDNO.30)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)，VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDR1(SEQIDNO.28),VLCDR2(SEQIDNO.30)和VLCDR3(SEQIDNO.32);或圖7所列的EA44VHCDR和VLCDR的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種EphA4激發(fā)性抗體包括用具有核苷酸序列SEQIDN0.21、23或25的核酸序列編碼的VHCDR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EphA4激發(fā)性抗體包括用具有核苷酸序列SEQIDNO.27、29或30的核酸序列編碼的VLCDR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EphA4激發(fā)性抗體包括分別用具有核苷酸序列SEQIDN0.21、23或25的核酸序列及SEQIDN0.27、29或30的核酸序列編碼的VHCDR和VLCDR。因此，本發(fā)明涉及藥物組合物及預(yù)防和治療方法，用于預(yù)防、治療或控制受試者中與EphA4過(guò)量表達(dá)相關(guān)的疾病，尤其是癌，尤其是轉(zhuǎn)移癌，該方法包括給予一種或多種抗體，該抗體特異性結(jié)合EphA4并激活EphA4，抑制癌細(xì)胞表型(如在軟瓊脂中的克隆形成或在三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑如MATRIGEL中管狀網(wǎng)絡(luò)形成)，優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上選擇性暴露或增加和/或其Koff小于3xl(T3S'1的EphA4抗原決定部位。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該EphA4抗體降低了軟瓊脂中已形成克隆的尺寸和/或降低了三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中管狀網(wǎng)絡(luò)形成的程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，該癌是上史細(xì)胞起源的癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該癌是皮膚、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺或膀胱癌，或是腎細(xì)胞癌或黑素瘤。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該癌是胰腺癌。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，待預(yù)防、治療或控制的癌中的癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)EphA4。在優(yōu)選實(shí)施方案中，由于細(xì)胞間接觸降低，或亞細(xì)胞位置變化的原因，或相對(duì)于配體而言EphA4量增大的原因，一些EphA4不與配體結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，EphA4激動(dòng)劑是EphA4抗體，其中其可變重鏈和/或可變輕鏈序列與SEQIDNO:22、24、26、28、30及32中所含的EA44的可變重鏈或輕鏈序列分別有至少90%的序列相同。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種EphA4抗體，其中它的至少3個(gè)，至少4個(gè)，至少5個(gè)，或全部6個(gè)CDR與EA44中的相應(yīng)CDR相同。在其他特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗EphA4scFv克隆8、18、20、36及41。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于預(yù)防、治療或控制肺瘤轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的抗體可以與一種或多種其他癌癥治療組合給予。具體而言，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或控制受試者癌癥的方法，該方法包括給予所述受試者治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體,除了給予本發(fā)明的EphA4抗體外，還組合給予治療或預(yù)防有效量的一種或多種化學(xué)治療，激素治療，生物治療/免疫治療和/或放射治療，或同時(shí)給予外科治療。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將一種或多種EphA4抗體與一種或多種EphA2抗體組合給予。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的EphA4抗體用于治療、預(yù)防和/或控制與細(xì)胞高增生相關(guān)的疾病或紊亂，例如但不限于癌癥，哮喘，慢性阻塞性肺病，大腸、小腸、胃部及其他重要器官炎性疾病，再狹窄(平滑肌和/或內(nèi)皮)，Crohn病(克隆氏病)，牛皮褲，及其他非轉(zhuǎn)移性疾病。在優(yōu)選實(shí)施方案中，高增生細(xì)胞是上皮細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，高增生細(xì)胞過(guò)表達(dá)EphA4。在優(yōu)選實(shí)施方案中，由于細(xì)胞間接觸降低、亞細(xì)胞位置變化、或者相對(duì)于EphA4-配體而言EphA4量增大的原因，一些EphA4不與配體結(jié)合。本發(fā)明的方法和組合物不僅可用于未治療的患者，還可以用于治療部分或完全難以用現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)癌癥療法治療的患者并提高治療功效，現(xiàn)有的治療方法包括但不限于化學(xué)治療、激素治療、生物治療、放射治療和/或外科治療。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防癌癥的治療和預(yù)防性激動(dòng)劑，該癌癥表現(xiàn)出是或可能是用除了包括給予本發(fā)明的EphA4抗體的治療方法外的其他治療方法難于治療或不反應(yīng)。在特定實(shí)施方案中，將一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體給予難于用基于非EphA4的治療方法治療，尤其是它莫西芬(tamoxifen)治療或耐藥性與IL-6水平增加有關(guān)的治療，或?qū)υ撝委煵环磻?yīng)的患者，以使患者可以治療或有反應(yīng)。因此，該治療對(duì)于以前難于治療或不反應(yīng)的患者可以產(chǎn)生治療效果。此外，本發(fā)明提供了篩選本發(fā)明的EphA4抗體的方法。具體而言，使用常規(guī)免疫技術(shù)可以篩選用于結(jié)合EphA4的抗體，尤其是結(jié)合EphA4的細(xì)胞外區(qū)域的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，為識(shí)別激發(fā)性EphA4抗體，可以篩選具有激發(fā)EphA4信號(hào)能力，例如提高EphA4磷酸化和/或75kDaEphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化和/或分解EphA4的EphA4抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為識(shí)別癌細(xì)胞表型抑制性抗體，可以篩選具有防止或降低軟瓊脂中癌細(xì)胞的克隆形成或降低或抑制三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中管狀網(wǎng)絡(luò)形成能力的抗EphA4抗體，或用于檢測(cè)癌表型降低的任何其他方法，例如檢測(cè)細(xì)胞增生接觸抑制增加的任何分析法(例如，單層細(xì)胞培養(yǎng)中的克隆形成降低)的抗EphA4抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，篩選具有降低軟瓊脂中存在的克隆的尺寸或降低三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀基質(zhì)形成程度能力的抗體，尤其是誘導(dǎo)細(xì)胞(尤其是癌細(xì)胞，更尤其是轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，也包括其他高增生細(xì)胞)壞死或細(xì)胞調(diào)亡的抗體。此外，可以篩選在其他抗癌試劑存在下(例如，激素，化學(xué)治療性試劑，生物或其他抗癌試劑)具有抑制或降低軟瓊脂中的克隆形成和/或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成能力的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為識(shí)別優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位的抗體，可以篩選具有優(yōu)選結(jié)合EphA4的能力的抗體，該EphA4不與配體(例如，EphrinA4)結(jié)合且不是定位在細(xì)胞間接觸中。本領(lǐng)域中用于測(cè)定細(xì)胞上抗體結(jié)合/定位的任何公知方法都可用于篩選具有所需結(jié)合屬性的候選抗體。在特定實(shí)施方案中，免疫熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀被用于測(cè)定抗體的結(jié)合屬性。在此實(shí)施方案中，當(dāng)EphA4與配體結(jié)合并定位至細(xì)胞間接觸時(shí)與EphA4的結(jié)合較差而與細(xì)胞上的自由EphA4很好結(jié)合的抗體也包括在本發(fā)明中。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，使用基于細(xì)胞的分析或ELISA分析，來(lái)選擇具有與配體(例如，細(xì)胞錨定的或純化的配體)竟?fàn)幗Y(jié)合EphA4能力的EphA4抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域公知的抗體結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析(例如基于表面電漿共振的分析，如BIACORETM分析)，來(lái)識(shí)別Koff速率小于3xl(T3S"的抗體，以篩選抗體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療、預(yù)防或控制癌癥的方法，包括給予除本發(fā)明的EphA4抗體之外的能夠在蛋白水平降低EphA4的治療性試劑，例如但不限于，對(duì)EphA4具有特異性的反義核酸，介導(dǎo)EphA4表達(dá)的RNA干擾的雙鏈EphA4RNA，抗EphA4核酶等，及其他EphA4抑制劑，例如，小分子EphA4抑制劑。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的EphA4抗體來(lái)評(píng)估癌癥治療功效的基于EphA4或基于非EphA4的診斷方法。通常，EphA4表達(dá)的增加與侵入性和轉(zhuǎn)移性癌的增加有關(guān)。因此，用特定治療使EphA4表達(dá)降低表明，該治療降低了癌侵入和/或轉(zhuǎn)移的可能性。本發(fā)明的診斷方法也可用于預(yù)測(cè)癌癥進(jìn)程或癌癥治療的結(jié)果。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法提供了使用遠(yuǎn)離原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)的組織和流體，例如全血、唾液、尿、血清、細(xì)針吸出物(即活組織檢查)的轉(zhuǎn)移成像和定位方法，以及診斷和預(yù)后的方法(及使用原發(fā)肺瘤的組織和流體的方法)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法提供了體內(nèi)轉(zhuǎn)移成像和定位方法及診斷和預(yù)后的方法。在這些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的抗體，優(yōu)選是暴露的EphA4抗原決定部位抗體檢測(cè)原發(fā)性轉(zhuǎn)移腫瘤。本發(fā)明的抗體也可用于冷凍或固定細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析或組織分析。此外，本發(fā)明的抗體和診斷方法可用于診斷、預(yù)測(cè)或監(jiān)測(cè)非癌癥高增生疾病(尤其是與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的疾病)的治療(不論是基于EphA4或基于非EphA4的治療)，該疾病例如但不限于哮喘、牛皮癬、腸炎性疾病，再狹窄、克隆氏病、前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)、慢性阻塞性肺病等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含本發(fā)明的藥物組合物或診斷試劑的試劑盒。3.1絲本文中，術(shù)語(yǔ)"激動(dòng)劑"是指包括蛋白、多肽、肽、抗體、抗體片段、大分子或小分子(小于10kD)在內(nèi)的任何化合物，該化合物可以提高另一分子的活性、活動(dòng)或功能。EphA4激動(dòng)劑可提高EphA4和/或75kDaEphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化，和EphA4蛋白的分解。激發(fā)EphA4的EphA4抗體可以抑制或可以不抑制癌細(xì)胞表型(例如，軟瓊脂中的克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成)，可以優(yōu)選結(jié)合或可以不結(jié)合在癌細(xì)胞而不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位，可以具有或可以不具有低Koff速率。本文中，術(shù)語(yǔ)"免疫特異性結(jié)合EphA4的抗體或其片段"指特異性結(jié)合EphA4多肽或EphA4多肽片段而不特異性結(jié)合其他多肽的抗體或其片段。優(yōu)選地，免疫特異性結(jié)合EphA4多肽或其片段的抗體或片段不與其他抗原發(fā)生非特異性的交叉反應(yīng)(例如，不與非EphA4蛋白(例如，BSA)竟?fàn)幗Y(jié)合)。例如，可以通過(guò)本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的免疫測(cè)定或其他技術(shù)來(lái)識(shí)別免疫特異性結(jié)合EphA4多肽的抗體或片段。本發(fā)明的抗體包括但不限于合成抗體、單克隆抗體、重組生成的抗體、內(nèi)抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、合成抗體、單鏈Fv(scFv)、Fab片段、F(ab')片段、二疏化物連接的Fv(sdFv)(包括雙特異性sdFvs)、及抗獨(dú)特型(抗Id)抗體，及上述任何一種的;fe^決定部位結(jié)合的片段。具體而言，本發(fā)明的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包括免疫特異性結(jié)合EphA4抗原的抗原結(jié)合位置(例如，抗EphA4抗體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))的分子。優(yōu)選地，免疫特異性結(jié)合EphA4多肽本文中，術(shù)語(yǔ)"癌"指涉及到具有轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端位置并表現(xiàn)出不同于非癌細(xì)胞的表型特性的細(xì)胞疾病，該表型特性例如，在三維基板如軟瓊脂中的克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑如MATOIGEL中的管狀網(wǎng)絡(luò)或網(wǎng)狀基質(zhì)形成。非癌細(xì)胞在軟瓊脂中不形成克隆，而在三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中形成明顯的球狀結(jié)構(gòu)。雖然有各種機(jī)理，但是癌細(xì)胞在發(fā)展中獲得獨(dú)特的功能能力。這種能力包括回避細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)信號(hào)自足、對(duì)抗生長(zhǎng)信號(hào)不敏感、組織侵A/轉(zhuǎn)移、無(wú)限的復(fù)制能力及持續(xù)的血管生成。術(shù)語(yǔ)"癌細(xì)胞"包括惡化前的癌細(xì)胞和惡性癌細(xì)胞。本文中，術(shù)語(yǔ)"癌細(xì)胞表型抑制"指化合物具有預(yù)防或降低軟瓊脂中癌細(xì)胞克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中管狀網(wǎng)絡(luò)形成的能力，或檢測(cè)癌細(xì)胞表型降低的任何其他方法，例如，例如檢測(cè)細(xì)胞增生接觸抑制增加的分析法(例如，單層細(xì)胞培養(yǎng)中的克隆形成降低)。當(dāng)將癌細(xì)胞表型抑制化合物加到軟瓊脂中的癌細(xì)胞克隆時(shí)，其還可以降低或除去克隆，或降低或除去三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成的程度。抑制癌細(xì)胞表型的EphA4抗體可以激發(fā)或可以不激發(fā)EphA4，可以具有或可以不具有低Koff速率。本文中，術(shù)語(yǔ)"衍生物"指包括EphA4多肽、EphA4多狀片段、免疫特異性結(jié)合EphA4多肽的抗體或免疫特異性結(jié)合EphA4多肽的抗體片段的氨基酸序列的多肽，它們通過(guò)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而改變。本文中，術(shù)語(yǔ)"衍生物"也指EphA4多肽、EphA4多肽片段、免疫特異性結(jié)合EphA4多肽的抗體或免疫特異性結(jié)合EphA4多肽的抗體片段，它們經(jīng)過(guò)修飾，如通過(guò)使其與任何類(lèi)型的分子共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾。例如，但不限于，可以通過(guò)糖基化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、用公知的保護(hù)/阻擋基團(tuán)衍生、蛋白斷裂、細(xì)胞配體或其他蛋白融合等來(lái)修飾EphA4多肽、EphA4多肽片段、抗體或抗體片段?？梢允褂帽绢I(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的技術(shù)通過(guò)化學(xué)修飾來(lái)修飾EphA4多肽、EphA4多肽片段、抗體或抗體片段的衍生物，包括但不限于，特異性化學(xué)裂解、乙?；⒓柞；?、衣審素的代謝合成等。此外，EphA4多肽、EphA4多肽片段、抗體或抗體片段的衍生物可以包括一種或多種非典型氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽衍生物具有與所述的EphA4多肽、EphA4多肽片段、抗體或抗體片段相似或相同的功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與未修飾的多肽相比，EphA4多肽、EphA4多狀片段、抗體或抗體片段的衍生物其活性發(fā)生改變。例如，衍生物抗體或其片段可以更緊地結(jié)合抗原決定部位或更耐蛋白水解。本文中，術(shù)語(yǔ)"抗原決定部位"指在動(dòng)物(優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是小鼠或人)中的EphA4多肽具有抗原或免疫原活性的一部分。具有免疫原活性的抗原決定部位是在動(dòng)物中產(chǎn)生抗體反應(yīng)的EphA4多肽的一部分。具有抗原活性的抗原決定部位是可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法(例如，通過(guò)免疫測(cè)定)測(cè)定的抗體免疫特異性結(jié)合的EphA4多肽的一部分?？乖乖瓫Q定部位不必須是免疫原的。本文中，術(shù)語(yǔ)"片段"包括含有EphA4多肽或免疫特異性結(jié)合EphA4多肽的抗體的氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少60個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少70個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少連續(xù)80個(gè)氨基酸殘基，至少連續(xù)90個(gè)氨基酸殘基，至少連續(xù)IOO個(gè)氨基酸殘基，至少連續(xù)125個(gè)氨基酸殘基，至少150個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，至少連續(xù)175個(gè)氨基酸殘基，至少連續(xù)200個(gè)氨基酸殘基，或至少連續(xù)250個(gè)氨基酸殘基的肽或多肽。優(yōu)選地，抗體片段是^4決定部位結(jié)合片段。本文中，術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"指非人(例如，鼠類(lèi))抗體形式，它們包括來(lái)源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對(duì)于大部分，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中該受體的高度可變區(qū)域殘基被非人物種(供者抗體)的高度可變區(qū)域殘基代替，該非人物種如小鼠、大鼠、野兔或具有所需特異性、親合性和能力的非人靈長(zhǎng)類(lèi)。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基代替。此外，人源化抗體可以包括在受者抗體或供者抗體未被發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行的這些修飾進(jìn)一步改變抗體的性能。通常，人源化抗體包括基本上所有的至少一個(gè)、通常至少兩個(gè)可變區(qū)域，其中所有或基本上所有的高度可變區(qū)域與非人免疫球蛋白的那些相應(yīng)，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體可選擇地還包括至少一部分免疫球蛋白不變區(qū)(Fc),通常是人免疫球蛋白的不變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體是衍生物。這種人源化抗體包括在一個(gè)或多個(gè)非人CDR中取代、缺失或添加的氨基酸殘基。與非衍生物人源化抗體相比，人源化抗體衍生物具有基本上相同的結(jié)合，更好的結(jié)合，或更差的結(jié)合。在特定實(shí)施方案中，CDR的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、或5個(gè)氨基酸殘奉被取代、缺失或添加(即，突變)。關(guān)于人源化抗體的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參考?xì)W洲專(zhuān)利EP239，400、EP592,106及EP519,596;囯際公布WO91/09967和WO93/17105;美國(guó)專(zhuān)利5，225,539、5,530,101、5，565，332、5，585，089、5,766,886及6,407,213;和Padlan,1991,Mo/ecw/ar/附w朋o/ogv28(4/5):489-498;Studnicka等人，1994,尸rato'"五"g/"em'"g7(6):805-814;Roguska等人，1994,PNAS91:969-973;Tan等人，2002，//附附w"o/.169:1119-25;Caldas等人，2000，尸rate/w五wg.13:353-60;Morea等人，2000，M幽&20:267-79;Baca等人，1997，C/e附.272:10678-84;Roguska等人，1996,/Voto'w五吸9:895-904;Couto等人，1995,Ca"ceri"55(23Supp):5973s-5977s;Couto等人，1995,Ca證.55:1717-22;Sandhu，1994，G微150:409-10;Pedersen等人，1994,/Mo/.5/o/.235:959-73;Jones等人，1986,321:522-525;Reichmann等人，1988,iVaft^332:323-329;和Presta,1992,C鮮.Qp.浙威編2:593-596。本文中，術(shù)語(yǔ)"高增生性細(xì)胞紊亂"指由細(xì)胞高增生引起的非肺瘤性紊亂或由于該疾病的病理狀態(tài)或癥狀所引起的紊亂。在一些實(shí)施方案中，高增生性細(xì)胞紊亂的特征是上皮細(xì)胞高增生。高增生性上皮細(xì)胞紊亂包括但不限于哮喘、COPD、肺纖維化、支氣管高反應(yīng)、牛皮癬、脂溢性皮炎及嚢腫性纖維化。在其他實(shí)施方案中，該高增生性細(xì)胞紊亂的特征是內(nèi)皮細(xì)胞高增生。高增生性內(nèi)皮細(xì)胞紊亂包括但不限于再狹窄、高增生性血管病、Behcet綜合癥、動(dòng)脈硬化癥及黃斑病變。本文中，術(shù)語(yǔ)"高度可變區(qū)域"指抗體中負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的氨基酸殘基。高度可變區(qū)域包括源于"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(即輕鏈可變區(qū)域中的殘基24-34(Ll)，50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)域中的31-35(Hl),50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等人，Se^ewcMo/7Vote/"so//附附Mwo/og/cfl//"tems/，第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991》和/或源于"高度可變環(huán)"的那些氨基酸殘基(即輕鏈可變區(qū)域中的殘基26-32(Ll),50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)域中的26-32(HI),53-55(ffi)和96-101(H3);Chothia和Lesk,1987，/Mo/.196:901-917)。"框架區(qū)"或"FR"殘基是除了所定義的高度可變區(qū)域殘基之外的那些可變區(qū)域殘基。本文中，術(shù)語(yǔ)"組合"指使用多于一種的預(yù)防和/或治療性試劑。使用術(shù)語(yǔ)"組合"并不限制將預(yù)防和/或治療性試劑給予患有高增生性細(xì)胞紊亂(尤其是癌癥)的受試者的順序。在將第二種預(yù)防或治療性試劑給予患有或易患高增生性細(xì)胞紊亂(尤其是癌癥)的受試者之前(例如，l分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、同時(shí)、或在此之后(例如、l分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、l周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)，可以給予第一種預(yù)防或治療性試劑。預(yù)防或治療性試劑以一定順序和時(shí)間間隔給予至受試者，使得本發(fā)明的試劑可以與其他試劑一起發(fā)揮作用，從而比以其他方式給予提供更大的益處。任何額外的預(yù)防或治療性試劑可以與其他額外的預(yù)防或治療性試劑以任何順序給予。本文中，術(shù)語(yǔ)"低耐受性"指一種狀態(tài)，在該狀態(tài)下患者出現(xiàn)治療副作用，從而使患者不適于治療和/或不能繼續(xù)治療，因?yàn)楦弊饔玫牟焕绊懞?或危害超過(guò)治療效果。本文中，術(shù)語(yǔ)"控制"指受試者從預(yù)防或治療性試劑的給藥中得到有益效果，但該有益效果不會(huì)使疾病治愈。在某些實(shí)施方案中，受試者被給予一種或多種預(yù)防或治療性試劑以"控制"疾病，從而預(yù)防疾病的進(jìn)展或惡化。本文中，術(shù)語(yǔ)"胂瘤"指具有轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端位置并表現(xiàn)出不同于非腫瘤細(xì)胞的表型特性潛能的細(xì)胞疾病，該表型特性例如，三維基板如軟瓊脂中的克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑如MATRIGEL中的管狀網(wǎng)絡(luò)或網(wǎng)狀基質(zhì)形成。非肺瘤細(xì)胞在軟瓊脂中不形成克隆，而在三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中形成明顯的球狀結(jié)構(gòu)。雖然有各種機(jī)理，但是腫瘤細(xì)胞在發(fā)展中具有獨(dú)特的功能性能力。這些能力包括回避細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)信號(hào)自足、對(duì)抗生長(zhǎng)信號(hào)不敏感、組織侵A/轉(zhuǎn)移、無(wú)限的復(fù)制能力、及持續(xù)的血管生成。因此，術(shù)語(yǔ)"非腫瘤病"意思是指病癥、疾病或紊亂不涉及癌細(xì)胞。本文中，術(shù)語(yǔ)"不反應(yīng)/難于治療"用于描述用一種或多種現(xiàn)有的治療方法(例如癌癥治療方法)，如化學(xué)治療、放射治療、外科治療、激素治療和/或生物治療/免疫治療，尤其是對(duì)特定癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療的患者，所述治療方法在臨床上不足以治愈患者，例如，保持對(duì)治療不敏感，因而這些患者需要額外的有效治療。此術(shù)語(yǔ)也可用于描述對(duì)治療有反應(yīng)，但產(chǎn)生副作用、復(fù)發(fā)、產(chǎn)生抵抗性等的患者。在各種實(shí)施方案中，"不反應(yīng)/難于治療"意思是指至少有一些明顯部分的癌細(xì)胞未被殺死，或它們的細(xì)胞分裂未得到抑制。通常本領(lǐng)域公知的用于分析癌細(xì)胞治療有效性的任何方法，可以用來(lái)在體內(nèi)或體處對(duì)癌細(xì)胞是否是"不反應(yīng)/難于治療"進(jìn)行測(cè)定，在本文中使用本領(lǐng)域已接受的"難于治療"的含義。在各種實(shí)施方案中，如果癌細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯降低，或都在治療中有所增加，那么癌癥為"不反應(yīng)/難于治療"的。本文中，術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)"指提高治療性試劑在通用或核準(zhǔn)劑量下的效力。本文中，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"指通過(guò)給予受試者預(yù)防或治療性試劑而防止疾病發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴(kuò)散。本文中，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防性試劑"指能夠用來(lái)防止與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂和/或細(xì)胞高增生病(尤其是癌癥)發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴(kuò)散的任何試劑。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防性試劑"指EphA4激發(fā)性抗體、EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體、暴露的EphA4抗原決定部位抗體、或結(jié)合具有低K^的EphA4的抗體。在某些其他實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防性試劑"指癌癥化學(xué)治療、放射治療、激素治療、生物治療(例如，免疫治療)和/或本發(fā)明的EphA4抗體。在其他實(shí)施方案中，可以組合給予多種的預(yù)防性試劑。本文中，"預(yù)防有效量"指預(yù)防性試劑的量足以防止細(xì)胞高增生病(優(yōu)選癌癥)的發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴(kuò)散。預(yù)防有效量可以指預(yù)防性試劑的量足以防止高增生病的發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴(kuò)散，尤其是癌癥，包括但不限于易患高增生病的那些癌癥，例如，遺傳上易患癌癥或以前接觸過(guò)致癌物質(zhì)的那些癌癥。預(yù)防有效量也可以指可以在預(yù)防高增生病中提供預(yù)防效果的預(yù)防性試劑的量。此外，本發(fā)明預(yù)防性試劑的預(yù)防有效量是指預(yù)防性試劑單獨(dú)的量，或與其他試劑組合的量，它們能夠在預(yù)防高增生病中提供預(yù)防效果。關(guān)于本發(fā)明的EphA4抗體的量，該術(shù)語(yǔ)包括可以提高整個(gè)預(yù)防作用或增強(qiáng)預(yù)防效果或與另一種預(yù)防性試劑的協(xié)同作用的量。本文中，"方案"包括給藥時(shí)間和給藥方法。本文中，術(shù)語(yǔ)"副作用"包括預(yù)防或治療性試劑的不需要和不利的作用。不利作用總是不想要的，但是不想要的作用不必然是不利的。預(yù)防或治療性試劑的不利作用可能是有害的或令人不舒適的或有危險(xiǎn)的?；瘜W(xué)治療的副作用包括但不限于胃腸毒性，如但不限于，早期或B免期瘌疾和腸胃氣脹、惡心、嘔吐、厭食、白血球減少癥、貧血癥、嗜中性白血球減少癥、虛弱、腹痙攣、發(fā)燒、疼痛、體重下降、脫水、禿頭癥、呼吸困難、失眠癥、頭昏眼花、粘膜病、口腔干燥、及腎衰竭、及便秘、神經(jīng)和肌肉影響、對(duì)腎和膀胱的臨時(shí)或永久性損害、流感類(lèi)癥狀、體液滯留、及臨時(shí)或永久性不孕。放射治療的副作用包括但不限于疲勞、口干、及食欲下降。生物治療/免疫治療的副作用包括但不限于在給予位置皮滲或胂脹，流感類(lèi)癥狀，如發(fā)燒，發(fā)冷和疲勞，消化道問(wèn)題和過(guò)敏反應(yīng)。激素治療的副作用包括但不限于惡心、受精力問(wèn)題、消沉、食欲下降、眼睛問(wèn)題、頭痛、及體重波動(dòng)?；颊叱霈F(xiàn)的其他不需要作用還有多種并且在本領(lǐng)域中是公知的。許多作用公開(kāi)于尸/)w'dfl附'DeAie/emzce(56也ed.,2002)中。本文中，術(shù)語(yǔ)"單鏈Fv"和"scFv"指包括抗體的VH和VL區(qū)域的抗體片段，其中這些區(qū)域存在于單個(gè)多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽還含有在VH和VL區(qū)域間的多肽連接，其可以使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。對(duì)于scFv,請(qǐng)參見(jiàn)Pluckthun,尸/^,co/ogy。/Mo騰/oto/顛/6o^s,vol.113,Rosenburg和Moore編.Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994)。在特定實(shí)施方案中，scFv包括雙特異性scFv和人源化scFv。本文中，術(shù)語(yǔ)"受試者"和"患者"可交換使用。本文中，受試者優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，如非靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)和靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，猴子和人)，最優(yōu)選是人。本文中，術(shù)語(yǔ)"治療"指根除、減少或緩解疾病或紊亂的癥狀，尤其是通過(guò)給予一種或多種治療性試劑根除、減少或緩解或控制原發(fā)性、區(qū)域性或轉(zhuǎn)移性癌組織。在某些實(shí)施方案中，這些術(shù)語(yǔ)指通過(guò)將一種或多種治療性試劑給予患有這種疾病的受試者來(lái)最小化或延緩癌癥擴(kuò)散。本文中，術(shù)語(yǔ)"治療性試劑"指能夠預(yù)防、治療或控制與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂和/或細(xì)胞高增生疾病或紊亂(尤其是癌癥)的任何試劑。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"治療性試劑"指EphA4激發(fā)性抗體，EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體，暴露的EphA4抗原決定部位抗體，或結(jié)合Koff小于3xlO'3S—1的EphA4的抗體，激發(fā)EphA4的非抗體試劑，如EphA4配體或EphA4-結(jié)合片段或其衍生物，或降低EphA4表達(dá)的試劑，如EphA4RNAi,反義藥物等。在某些其他實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"治療性試劑"指癌癥化學(xué)治療、放射治療、激素治療、生物治療/免疫治療、和/或本發(fā)明的EphA4抗體。在其他實(shí)施方案中，可以組合給予多種的預(yù)防性試劑。本文中，"治療有效量"指治療性試劑的量足以治療或控制與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂和/或細(xì)胞高增生疾病，并且優(yōu)選其量足以破壞、改變、控制或除去原發(fā)性、區(qū)域性或轉(zhuǎn)移性癌組織。治療有效量可以指足以延緩或最小化高增生病發(fā)作的治療性試劑量，例如，延緩或最小化癌癥擴(kuò)散。治療有效量可以指在治療或控制癌癥中提供治療效果的治療性試劑的量。此外，本發(fā)明治療性試劑的治療有效量指治療性試劑單獨(dú)的量，或與其他治療組合的量，它們能夠在治療或控制高增生病或癌癥中提供治療效果。關(guān)于本發(fā)明中EphA4抗體的量，該術(shù)語(yǔ)包括可以提高整個(gè)治療作用、或降低或避免不想要的效果、或增強(qiáng)治療效果或與另一種治療性試劑的協(xié)同作用的量。4.圖l:EphA4抗體誘導(dǎo)細(xì)胞圓形化。相對(duì)于在0。C下孵育的細(xì)胞而言，在37°C下孵育時(shí)，用結(jié)合EphA4的單鏈Fv抗體(scFv)孵育的Aspcl細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞圓形化。圖2:EphA4的交聯(lián)引起相關(guān)75kDa蛋白酪氨酸磷酸化。用LX13scFv孵育細(xì)胞，然后用抗Flag抗體交聯(lián)，用EphrinA4-Fc免疫沉淀，用抗磷化酪氨酸印跡。交聯(lián)的EphA4("X-交聯(lián)的EphA4")表明EphA4相關(guān)的75kDa蛋白相對(duì)于未交聯(lián)的對(duì)照細(xì)胞("對(duì)照")酪氨酸磷酸化提高。圖3:EphA4聚集抑制ASPC1細(xì)胞的軟瓊脂生長(zhǎng)。用EphA4抗體(scFv)處理細(xì)胞，然后用二級(jí)單克隆抗體(mab;"LX13Bival")交聯(lián)，相對(duì)于單獨(dú)用scFv("LX13")或單獨(dú)二級(jí)mab("對(duì)照")處理的細(xì)胞而言，軟瓊脂中的克隆形成明顯降低。圖4:EphA4上調(diào)使乳腺癌細(xì)胞系中的細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)雌激素的依賴性下降。MCF-7細(xì)胞通常表達(dá)極低水平的EphA4，用空載體("載體")或含有EphA4序列的載體的轉(zhuǎn)染。分離EphA4的穩(wěn)定表達(dá)體(克隆2和3,"EphA4-2"和"EphA4-3")。在其中用雌激素孵育細(xì)胞的軟瓊脂分析中，MCF-7-EphA4細(xì)胞相對(duì)于載體-轉(zhuǎn)染對(duì)照("+雌激素")，表現(xiàn)出錨定非依賴性生長(zhǎng)提高2.4倍。然而，在沒(méi)有雌激素時(shí)("-雌激素")，與載體-轉(zhuǎn)染對(duì)照相比，EphA4表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)提高了8.5倍。圖5:胰腺腫瘤組織中的EphA4RNA水平提高。豎條A:來(lái)自52歲男性的病理學(xué)正常胰腺組織中的EphA4RNA。豎條B:胰腺組織中的EphA4RNA,顯示了豎條A的52歲男性的階段4A胰管腺癌。豎條C:胰腺組織中的EphA4RNA,顯示了72歲男性的階段2A胰管腺癌。豎條D:71歲女性患者的淋巴結(jié)組織中的EphA4RNA，顯示了階段2B轉(zhuǎn)移性胰腺癌。豎條E:57歲女性網(wǎng)膜組織中的EphA4RNA，顯示了階段4轉(zhuǎn)移性胰腺癌。豎條F:45歲女性患者肝組織中的EphA4RNA，顯示可轉(zhuǎn)移性胰腺癌。圖6:抗EphA4scFv克隆44強(qiáng)烈誘導(dǎo)EphA4的酪氨酸磷酸化。相對(duì)于介質(zhì)中的對(duì)照細(xì)胞或僅用抗Flag抗體孵育的細(xì)胞而言，抗EphA4scFv克隆8、18及20也弱誘導(dǎo)EphA4的酪氨酸磷酸化，這表明了低水平的EphA4磷酸化。圖7:scFV克隆EphA4-44的序列。表明了CDR、VH及VL區(qū)域。5.發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明部分地是基于發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在某些癌細(xì)胞中EphA4會(huì)上調(diào)且抗EphA4抗體會(huì)減少某些癌細(xì)胞行為，如在軟瓊脂中的細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)?？笶phA4抗體會(huì)激發(fā)EphA4和EphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化。本發(fā)明人還相信EphA4在癌癥和細(xì)胞增生過(guò)程中發(fā)揮與EphA2相似的作用。通過(guò)降低在這些癌細(xì)胞中的EphA2表達(dá)水平，激發(fā)EphA2的EphA2單克隆抗體能抑制癌細(xì)胞增生和侵入(參考未決的美囯專(zhuān)利申請(qǐng)10/436,782，標(biāo)題為"EphA2MonoclonalAntibodiesandmethodsofUsethereof，，2003年5月12日提交)。EphA4活性的降低或EphA4信號(hào)的其他結(jié)果可以選擇性地抑制惡性癌細(xì)胞生長(zhǎng)。具體而言，EphA4水平的降低及EphA4和/或75kDaEphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化可通過(guò)EphA4激動(dòng)性單克隆抗體而得到。雖然不想被任何作用機(jī)理所限制，但是細(xì)胞生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移的這種抑制可通過(guò)刺激(即激發(fā))EphA4信號(hào)，從而引起EphA4的磷酸化，進(jìn)而引起EphA4的分解來(lái)實(shí)現(xiàn)。癌細(xì)胞生長(zhǎng)可因EphA4水平降低從而使配體非依賴性EphA4信號(hào)降低來(lái)降低。EphA4活性的降低還可通過(guò)EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體或優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位的抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，結(jié)合低Koff(例如，小于3xl(T3s")的EphA4的抗體也可降低EphA4水平。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)結(jié)合EphA4的抗體足以引發(fā)細(xì)胞行為發(fā)生改變。具體而言，結(jié)合細(xì)胞表達(dá)的EphA4的EphA4抗體會(huì)降低細(xì)胞-ECM粘附并誘導(dǎo)細(xì)胞圓形化。通常認(rèn)為細(xì)胞-ECM粘附提供物理粘附和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，該信號(hào)控制細(xì)胞行為的諸多方面，包括決定有關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵入和分化。與這種理解一致的是，細(xì)胞與其微環(huán)境的相互作用的改變與多種不同疾病狀態(tài)的引起或進(jìn)展有關(guān)。例如，提高ECM粘附能促進(jìn)遷移和增生，從而引發(fā)高增生疾病，其包括但不限于癌癥；大腸(IBD)、小腸(克隆氏病)、胃部及其他重要器官炎性疾??；哮喘；COPD和其他肺的高增生病變；以及再狹窄，這是由平滑肌或內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移增強(qiáng)引起的臨床表現(xiàn)。因此，EphA4抗體通?？捎糜谥委煼前┘膊?，尤其可用于治療與細(xì)胞-ECM粘附相關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明涉及到用于治療、抑制及控制與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的疾病和紊亂和/或細(xì)胞高增生疾病和紊亂的方法和組合物。本發(fā)明的特定方面涉及方法和包括抑制癌細(xì)胞增生和侵入的(特別是過(guò)表達(dá)EphA4的癌細(xì)胞)的化合物的組合物。本發(fā)明還涉及用于治療、抑制或控制上皮細(xì)胞起源的癌轉(zhuǎn)移(特別是人類(lèi)的乳腺、肺、皮膚、前列腺、膀胱、胰腺癌癥及腎臟細(xì)胞癌和黑素瘤)的方法和組合物。本發(fā)明的組合物和方法還包括與本發(fā)明的EphA4抗體組合使用的其他類(lèi)型的活性成分。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用于治療、預(yù)防或控制與細(xì)胞高增生相關(guān)的其他疾病或紊亂，例如但不限于哮喘、牛皮癬、再狹窄、COPD等。本發(fā)明還涉及治療、抑制及控制癌癥或其他高增生性細(xì)胞紊亂或疾病的方法，這種癌癥、紊亂或疾病用現(xiàn)有的或標(biāo)準(zhǔn)的癌癥治療方法部分或完全地?zé)o法治療，如化學(xué)治療、放射治療、激素治療及生物治療。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的EphA4抗體(特別是暴露的EphA4抗原決定部位抗體)來(lái)評(píng)估癌癥治療功效的基于EphA4的或非基于EphA4的診斷方法。本發(fā)明的診斷方法也可用于預(yù)測(cè)癌癥進(jìn)程。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法提供了使用遠(yuǎn)離原發(fā)性腫瘤位點(diǎn)的組織和流體的轉(zhuǎn)移成像和轉(zhuǎn)移定位的方法及診斷和預(yù)后的方法(及使用原發(fā)性腫瘤的組織和流體的方法)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法提供了轉(zhuǎn)移成像和轉(zhuǎn)移定位的方法及體內(nèi)診斷和預(yù)后的方法。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選抗癌癥試劑(尤其是抗轉(zhuǎn)移癌試劑)的方法，包括篩選具有降低軟瓊脂中的細(xì)胞克隆形成和/或三維基膜和細(xì)胞外基質(zhì)制劑如MATRIGEI^中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成的能力的試劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選用于治療和預(yù)防高增生性疾病和紊亂的試劑的方法，包括分析具有降低軟瓊脂中已有細(xì)胞克隆形成和/或三維基膜中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成的程度的能力。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抑制軟瓊脂中細(xì)胞克隆和/或MATRIGEL中管狀網(wǎng)絡(luò)形成可以更好地顯示抗轉(zhuǎn)移活性，且可以識(shí)別潛在的抗轉(zhuǎn)移試劑，該試劑通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)分析無(wú)法識(shí)別。5.1M如上所述，本發(fā)明包括給予抗體(優(yōu)選是單克隆抗體)或其片段，該抗體可免疫特異性結(jié)合并激發(fā)EphA4信號(hào)("EphA4激發(fā)性抗體")；抑制癌細(xì)胞表型，例如抑制軟瓊脂中的克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑如MATRIGEL中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成("癌細(xì)胞表型抑制性抗體")；優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露或增加的EphA4抗原決定部位("暴露的EphA4抗原決定部位抗體")；和/或結(jié)合Koff小于3x10—3S"的EphA4。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體結(jié)合EphA4的細(xì)胞外區(qū)域，并優(yōu)選地激發(fā)EphA4，例如，增強(qiáng)EphA4磷酸化和/或75kDaEphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化，并優(yōu)選地使EphA4分解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體結(jié)合EphA4的細(xì)胞外區(qū)域，并優(yōu)選地抑制或更優(yōu)選地降低軟瓊脂中的克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成的程度(如，通過(guò)細(xì)胞殺死機(jī)理，如壞死和細(xì)胞凋亡)。在其他實(shí)施方案中，在另一種抗癌癥試劑存在下，如激素、生物、化學(xué)治療或其他試劑存在下，該抗體抑制或降低癌細(xì)胞表型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在抗原決定部位結(jié)合EphA4的細(xì)胞外區(qū)域，該抗原決定部位在癌細(xì)胞中暴露而在非癌細(xì)胞中封閉。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合EphA4的細(xì)胞外區(qū)域，優(yōu)選Koff小于1x10-、"，更優(yōu)選小于3xl(^s"。在其他實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合EphA4，其Koff小于l(r、"，小于5xl(TV1,小于10一4s-1，小于5xl0—4s人小于10-53-1,小于5xlO-5s",小于10-6s-',+f5xlO-6s-1,小于IO-7s、小于5x10-7s",小于10-83-|,小于5x10-8s'1,小于10—9s'1,小于5xl(Tys-1，或小于1(T川s"。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，經(jīng)ELISA或任何其他合適的免疫測(cè)定分析，該抗體結(jié)合EphA4抗原決定部位和/或竟?fàn)幗Y(jié)合EphA4。表達(dá)抗EphA4scFvEA44的細(xì)胞根據(jù)囯際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約在2004年6月1日保藏在美囯類(lèi)型培養(yǎng)物中心(P.O.Box1549,Manassas,VA20108),并取得保藏號(hào)，在此引為參考。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供EphA4scFv抗體EphA4-44/EA44(在本說(shuō)明書(shū)中，EA44和EphA4-44指相同抗體，即結(jié)合EphA4的EphA4-44scFv克隆，在2004年6月10日在ATCC保藏為"EA44")。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種EphA4抗體，其中的可變重鏈和/或可變輕鏈的氨基酸序列與SEQIDNO:4和8中所含的EA44的可變重鏈或輕鏈氨基酸序列分別有至少90%的序列相同。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種EphA4抗體，其中它的至少3個(gè)，至少4個(gè)，至少5個(gè)，或全部6個(gè)CDR與EA44中的相應(yīng)CDR相同。在其他特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗EphA4scFv克隆8、18、20、36及41。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體是人抗體或被人源化。在其他實(shí)施方案中，該EphA4抗體包括EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)和VLCDRl(SEQIDNO.28);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDRl(SEQIDNO.28);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)和VHCDR3(SEQIDNO.26);EA44VHCDR3(SEQIDNO.26)和VHCDRl(SEQIDNO.22);EA44VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44雨CDRl,VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDRl(SEQIDNO.28);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDRl(SEQIDNO.28),EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR2(SEQIDNO.24)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR3(SEQIDNO.26)，VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDRl(SEQIDNO.28);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR2(SEQIDNO.24)，VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR2(SEQIDNO.24),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26)，VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)，VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDR2(SEQIDNO.30)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26)，VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR2(SEQIDNO.30);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR2(SEQIDNO.24),VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22)，VHCDR2(SEQIDNO.24)，VLCDRl(SEQIDNO.28),VLCDR2(SEQIDNO.30)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDRl(SEQIDNO.22),VHCDR3(SEQIDNO.26)，VLCDRl(SEQIDNO.28),VLCDR2(SEQIDNO.30)和VLCDR3(SEQIDNO.32);EA44VHCDR2(SEQIDNO.24)，VHCDR3(SEQIDNO.26),VLCDRl(SEQIDNO.28),VLCDR2(SEQIDNO.30)和VLCDR3(SEQIDNO.32);或圖7所列的EA44VHCDR和VLCDR的任意組合。本發(fā)明的抗體包括但不限于單克隆抗體，合成抗體，重組生成的抗體，內(nèi)抗體，多特異性抗體(包括雙特異性抗體)，人抗體，人源化抗體，嵌合抗體，單鏈Fv(scFv)(包括雙特異性scFv),如scFv克隆8、18、20、36、41及EA44，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab')片段，二疏化物連接的Fv(sdFv),及上迷任何一種的抗原決定部位結(jié)合片段。具體而言，本發(fā)明的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有免疫特異性結(jié)合EphA4的抗原結(jié)合位點(diǎn)并是EphA4激動(dòng)劑的分子，該分子抑制或降低癌細(xì)胞表型，優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位，和/或結(jié)合Koff小于3xl0'3s'1的EphA4。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可為任何類(lèi)型的免疫球蛋白分子(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，任何種類(lèi)(例如，IgG，IgG2,IgG3、IgG4、IgA,和IgA2)或小類(lèi)。本發(fā)明方法所用的抗體可源于任何動(dòng)物，包括鳥(niǎo)和哺乳類(lèi)動(dòng)物(例如，人類(lèi)、鼠科、驢、羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞)。優(yōu)選地，該抗體為人或人源化單克隆抗體。本文中，"人"抗體包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，還包括從人免疫球蛋白庫(kù)或表達(dá)人基因抗體的小鼠或其他動(dòng)物分離出的抗體。本發(fā)明方法所用的抗體可具有單特異性、雙特異性、三特異性或多特異性。多特異性抗體可免疫特異性結(jié)合EphA4多肽的不同抗原決定部位，或免疫特異性結(jié)合EphA4多肽及異種抗原決定部位，如異種多肽或固體載體材料。參見(jiàn)，例如，囯際公開(kāi)WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360及WO92/05793;Tutt等人，1991,乂/附附朋o//.147:60-69;美囯專(zhuān)利4,474,893,4,714,681,4,925,648，5,573,920及5,601,819;和Kostelny等人，1992,J/附/m/"o〃.148:1547-1553。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是BiTE(bispecificTcellengager)。BiTE是雙特異性抗體，其可重定向T細(xì)胞以抗原特異性地去除靶。BiTE分子具有在分子的一端結(jié)合T細(xì)胞抗原(例如CD3)的抗原結(jié)合區(qū)，及結(jié)合靶細(xì)胞上的抗原的抗原結(jié)合區(qū)。BiTE分子最近在WO99/54440中有所描述，這里將其引入作為參考。該文獻(xiàn)描述了一種新單鏈多功能多肽，其包括CD19和CD3抗原的結(jié)合位點(diǎn)(CD19xCD3)。該分子源自兩種抗體，一種抗體結(jié)合B細(xì)胞上的CD19,另一種抗體結(jié)合T細(xì)胞上的CD3。這些不同抗體的變化區(qū)域與多肽序列融合，從而形成單獨(dú)分子。其中還描述了特異性結(jié)合區(qū)的可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)通過(guò)柔性連接子連接而形成單鏈雙特異性抗體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合EphA4的抗體或配體包括BiTE分子的一部分。例如，結(jié)合EphA4的抗體的VH和/或VL(優(yōu)選是scFV)可以融合到抗CD3結(jié)合部分，如前述分子那樣，從而形成以EphA4為把的BiTE分子。除了EphA4抗體的可變重鏈和/或輕鏈外，結(jié)合EphA4的其他分子包括BiTE分子，例如EphrinsAl、A2、A3、A4、A5、B2及B3;B61、AL1/RAGS、LERK4、Htk-L及Elk-L3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BiTE分子包括結(jié)合其他T細(xì)胞抗原(除CD3外)的分子。例如，免疫特異性結(jié)合T細(xì)胞抗原(如CD2，CD4,CD8，CDlla,TCR及CD28)的配體和/或抗體，是本方發(fā)明所預(yù)期的一部分。上述內(nèi)容并不是排他的，而是闡明免疫特異性結(jié)合T細(xì)胞抗原的其他分子可用作BiTE分子的一部分。這些分子包括抗體或天然配體的VH和/或VL部分(例如LFA3,其天然配體為CD3)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，BiTE分子是EphA4激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BiTE分子是EphA4拮抗劑。本發(fā)明所用的"結(jié)合區(qū)"是指含有能夠特異性結(jié)合抗原決定部位的三維結(jié)構(gòu)的區(qū)域，如天然抗體、自由scFv片段或其相應(yīng)的一個(gè)免疫球蛋白鏈，優(yōu)選是VH鏈。因而，所述區(qū)域包括抗體或免疫球蛋白鏈的VH和/或VL區(qū)域，優(yōu)選至少是VH區(qū)域，或更優(yōu)選是用柔性多肽連接子連接的VH和VL區(qū)域(scFv)。另一方面，本發(fā)明的多肽中所含的所述結(jié)合區(qū)可包括抗體或免疫球蛋白鏈的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，用于識(shí)別T細(xì)胞上的抗原或細(xì)胞抗原。就這一點(diǎn)而言，需注意的是，本發(fā)明多肽中的結(jié)合區(qū)不僅可源自抗體，而且可源自其他T細(xì)胞或細(xì)胞抗原結(jié)合蛋白，如天然表面受體或配體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中還可預(yù)期到，在上述多肽的所述第一和或第二區(qū)域模擬或相應(yīng)于天然抗體的VH和VL區(qū)域。為本發(fā)明的多肽提供結(jié)合位點(diǎn)的抗體可以是例如單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體、合成抗體、抗體片段(如Fab、Fv或scFv片段等)或其任一化學(xué)修飾衍生物。本發(fā)明方法所用的抗體包括經(jīng)修飾的衍生物，即通過(guò)使任何類(lèi)型的分子與抗體共價(jià)連接來(lái)修飾的衍生物。例如，但不限于，所述的抗體衍生物包括修飾的抗體，例如通過(guò)糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、跣胺化、用公知的保護(hù)/阻擋基團(tuán)衍生、蛋白斷裂、細(xì)胞配體或其他蛋白融合等來(lái)修飾抗體。眾多化學(xué)修飾可用已知的技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于，特定化學(xué)裂解、乙?；?、甲?；?、衣審素的代謝合成等。此外，該衍生物可含有一種或多種非典型氨基酸。本發(fā)明包括單區(qū)域抗體，包括駱駝化的單區(qū)域抗體(參考例如，Muyldermans等人，2001年，7>ew&5/oc/e附.Sd.26:230;Nuttall等人，2000年,P/w/tm.說(shuō)otec/.1:253;Reichmann和Muyldermans,1999年，//w附朋o/.Me仇231:25;囯際公布WO94/04678和WO94/25591;美囯專(zhuān)利6,005,079;這里引入它們的全部?jī)?nèi)容作為參考)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供單區(qū)域抗體,其包括兩個(gè)VH區(qū)域，該區(qū)域具有EphA4激發(fā)性抗體、EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體、暴露的EphA4抗原決定部位抗體或結(jié)合K^小于3xl(T3S"的EphA4的EphA4抗體的任一VH區(qū)域的經(jīng)過(guò)修飾的氨基酸序列，因而形成單區(qū)域抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供單區(qū)域抗體，其包括兩個(gè)VH區(qū)域，該區(qū)域含有EphA4激發(fā)性抗體、EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體、暴露的EphA4抗原決定部位抗體或結(jié)合K^小于3xl0'3S"的EphA4的EphA4抗體的一個(gè)或多個(gè)VHCDR。本發(fā)明的方法還包括使用抗體或其片段，其在哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)中的半衰期(例如，血清半衰期)為15天以上，優(yōu)選是20天以上、25天以上、30天以上、35天以上、40天以上、45天以上、2個(gè)月以上、3個(gè)月以上、4個(gè)月以上或5個(gè)月以上。本發(fā)明的抗體或片段在哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)中半衰期增大,使得所述抗體或抗體片段在哺乳動(dòng)物中的血清滴度升高，從而降低了給予所通過(guò)本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所公知的技術(shù)提高抗體或其片段的體內(nèi)半衰期。例如，通過(guò)修飾(例如，取代，缺失或添加)參與Fc區(qū)域與FcRn受體間的相互反應(yīng)的氨基酸殘基，可以提高抗體或其片段的體內(nèi)半衰期(參見(jiàn)，例如，囯際公開(kāi)WO97/34631和WO02/060919,這里引用其全部?jī)?nèi)容作為參考)。通過(guò)使所述抗體或抗體片段與聚合物分子，如高分子量的聚乙二醇(PEG)連接,可以提高抗體或其片段的體內(nèi)半衰期。PEG可與所述抗體或抗體片段連接，使用或不使用多功能連接子，或者通過(guò)PEG與所述抗體或抗體片段的N-或C-端的位點(diǎn)特異性結(jié)合，或通過(guò)賴氨酸殘基上的s-氨基?？梢允褂檬股锘钚該p失最小的線性或帶分支的聚合體衍生物。通過(guò)SDS-PAGE和質(zhì)譜密切監(jiān)測(cè)結(jié)合的程度，來(lái)確保PEG分子與抗體的適當(dāng)結(jié)合。未反應(yīng)的PEG可通過(guò)例如尺寸排除法或離子交換色譜而與抗體-PEG共軛物分離。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于誘導(dǎo)編碼抗體或其片段的核苷酸序列發(fā)生突變，包括例如，定點(diǎn)突變和PCR介導(dǎo)的突變，從而使氨基酸取代。優(yōu)選地，相對(duì)于原抗體或其片段而言，該衍生物包括小于15個(gè)氨基酸的取代、小于10個(gè)氨基酸的取代、小于5個(gè)氨基酸的取代、小于4個(gè)氨基酸的取代、小于3個(gè)氨基酸的取代、或小于2個(gè)氨基酸的取代。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該衍生物含有保守氨基酸取代，該取代發(fā)生在一個(gè)或多個(gè)預(yù)計(jì)的非必須氨基酸殘基處。本發(fā)明還包括抗體或其片段，它們免疫特異性結(jié)合EphA4并激發(fā)EphA4和/或抑制癌細(xì)胞表型，優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞中暴露的EphA4抗原決定部位，和/或結(jié)合Koff小于3xlO'3s"的EphA4，所述抗體或抗體片段包括一個(gè)或多個(gè)q)R的氨基酸序列，該序列至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%與EphA4抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR的氨基酸序列相同?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員已知的任何辦法來(lái)決定兩個(gè)氨基酸序列的相同百分比，包括BLAST蛋白檢索。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明包括抗體或抗體片段，它們包括一個(gè)或多個(gè)CDR的氨基酸序列，該序列至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%或至少99%與scFv克隆EA44的的一個(gè)或多個(gè)CDR的氨基酸序列相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括重組的EphA4抗體或抗體片段，其為EphA4激發(fā)性抗體、EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體或暴露的EphA4抗原決定部位抗體，其中該抗體包括至少一個(gè)EA44抗體可變輕鏈或可變重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR),其中可變重鏈和輕鏈的氨基酸序列是EA44序列。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明包括EphA4抗體或抗體片段，其為EphA4激發(fā)性抗體，EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體或暴露的EphA4抗原決定部位抗體，其中所述抗體包括EA44抗體可變輕鏈和/或可變重鏈的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或全部6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。5丄1抗體共扼物本發(fā)明包括與異種試劑重組融合或化學(xué)結(jié)合(包括共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合)的抗體或其片段(或其他治療劑，如EphA4配體和其EphA4結(jié)合片段)的用途。異種試劑可以是多肽(或其一部分，優(yōu)選至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個(gè)氨基酸的多肽)，核酸，小分子(小于1000道爾頓)，或無(wú)機(jī)或有機(jī)化合物。融合不必是直接的，可通過(guò)連接子序列來(lái)融合。使用本領(lǐng)域所知的方法，與異種試劑融合或結(jié)合的抗體可用于體內(nèi)檢測(cè)、治療、控制或監(jiān)測(cè)紊亂的進(jìn)展。參考，例如，囯際公開(kāi)WO93/21232;EP439,095;Naramura等人，1994年，/附附朋o/.丄故39:91-99;美囯專(zhuān)利5,474,981;Gillies等人，1992年，濯S89:1428-1432;和Fell等人，1991年，《//附附w"o/.146:2446-2452,這里引用其全邵內(nèi)容作為參考。在一些實(shí)施方案中，待檢測(cè)、治療、控制或監(jiān)控的紊亂是過(guò)表達(dá)EphA4的惡性癌。在其他實(shí)施方案中，待檢測(cè)、治療、控制或監(jiān)控的紊亂是過(guò)表達(dá)EphA4的惡化前的癌。在特定實(shí)施方案中，惡化前的癌是進(jìn)行性前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN)、乳腺的導(dǎo)管癌、或復(fù)合痣。本發(fā)明還包括組合物，該組合物包括與抗體片段融合或結(jié)合的異種試劑。例如，所述異種多肽可以與Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段或它們的一部分融合或結(jié)合。使多肽與抗體部分融合或結(jié)合的方法在牟領(lǐng)域是已知的。參見(jiàn)，例如，美囯專(zhuān)利5,336,603,5,622,929,5,359,046,5,349,053，5,447,851及5,112,946;EP307,434;EP367,166;國(guó)際公開(kāi)WO96/04388和WO91/06570;Ashkenazi等人，1991年，尸腐88:10535-10539;Zheng等人，1995年，<//w/mmo/.154:5590-5600;和Vil等人，1992年，濯S89:11337-11341(這里引用上述全部?jī)?nèi)容作為參考)。通過(guò)基因改組、基序改組(motif-shuffling)、外顯子改組和/或密碼子改組技術(shù)(總體稱(chēng)作"DNA改組")可以產(chǎn)生其他融合蛋白。DNA改組可用于改變本發(fā)明抗體或其片段的活性(例如，抗體或其片段具有較高親和力及較低解離速率)。通常參考，美囯專(zhuān)利5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458;及Patten等人,1997，O/mQp/"/ow8:724-33;Harayama,1998,7>e"is歷otec/wo/.16:76;Hansson等人,1999，《/Mo/.歷o/.287:265;Lorenzo和Blasco,1998，5/o7Vc/ot/《mm24:308(在此引入這里每個(gè)專(zhuān)利和出版物的全部?jī)?nèi)容作為參考)。抗體或其片段，或其編碼的抗體或其片段可以在重組之前，通過(guò)易錯(cuò)PCR、隨機(jī)核苷酸插入或其他方法進(jìn)行隨機(jī)突變來(lái)進(jìn)行改變。編碼抗體或抗體片段的，免疫特異性結(jié)合EphA4的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)部分可以與一種或多種異種試劑的一種或多種成分、基序、段、部分、區(qū)域、片段等重組。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了便于純化，將本發(fā)明的抗體或其片段或其變體與標(biāo)記序列(如肽)結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記的氨基酸序列是六組氨酸狀，如pQE載體中的標(biāo)簽(QIAGEN,Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth,CA，91311),其中許多是商業(yè)上可提供的。例如，如Gentz等人，1989,86:821中所描迷的，六組氨酸可以為純化融合蛋白提供便利。用于純化的其他肽標(biāo)簽包括但不限于，紅血球凝聚素"HA"標(biāo)簽，其相應(yīng)于源自流感紅血球凝聚素蛋白的抗原決定部位(Wilson等人，1984,Ce//37:767)fp"Flag"標(biāo)簽。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段或其變體與診斷或檢測(cè)性試劑結(jié)合。作為臨床試驗(yàn)的一部分，這種抗體可用于監(jiān)控或預(yù)測(cè)癌癥的發(fā)展和進(jìn)程，如測(cè)定特定治療的功效。此外，這種抗體可用于監(jiān)控或預(yù)測(cè)惡化前的癌癥的發(fā)展和進(jìn)程(例如，高級(jí)前列腺上皮內(nèi)腫瘤(PIN),乳腺的導(dǎo)管癌，或復(fù)合痣)。在一個(gè)實(shí)施方案中，暴露的EphA4抗原決定部位抗體與診斷或檢測(cè)性試劑結(jié)合。這種診斷和檢測(cè)可通過(guò)使抗體與可檢測(cè)物質(zhì)配合來(lái)實(shí)現(xiàn)，該可檢測(cè)物質(zhì)包括，但不限于各種酶，如但不限于辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基，如但不限于鏈霉親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；熒光材料，如但不限于，傘形酮，熒光素，熒光素異疏代氰酸酯，若丹明，二氯三嗪基胺熒光素，丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料，如但不限于，發(fā)光氨；生物發(fā)光材料，如但不限于，熒光素酶，昆蟲(chóng)螢光素，及發(fā)光蛋白質(zhì)；放射性材料，如但不限于，鉍(^Bi),碳("C),鉻("Cr)，鈷fCo)，氟(is巧，釓，Gd，159(}(1)，鎵(68Ga，67Ga)，鍺(68Ge),鈥(版Ho),銦(^n，113In,112In,mIn),琪(1311,125I，123I，121I),鑭(14°1^),镥(1),錳(、),鉬("Mo)，把(旭Pd),磷(3￥),鐠("2pr),钷("9pm),錸(版Re，188Re)，銠，Rh),釕(97Ru)，釤("Sm),鈧(47Sc),硒("Se)，鍶(85Sr),疏(358),锝("Tc)，鉈(加Ti)，錫("3Sn，117Sn),氣(3h),氣，Xe),鐿(朋Yb,175Yb),釔(，),^65Zn);使用各種正子斷層造影的正電子發(fā)射金屬，以及非放射性的順磁金屬離子。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段或其變體與治療性試劑結(jié)合，如細(xì)胞毒素，例如，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死細(xì)胞的試劑，治療性試劑或放射性金屬離子，例如，a-發(fā)射體。細(xì)胞毒素或毒性試劑包括任何有害于細(xì)胞的任何試劑。例子包括紫杉醇(paclitaxel)，細(xì)胞松弛素B,短桿菌肽D,溴乙非啶，依米丁，絲裂霉素，依托泊苷，鬼臼噻吩甙，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，秋水仙堿，多乘比星，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素二酮,米托蒽醌，光神霉素，放射菌素D，l-去氫睪酮，糖皮質(zhì)激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，心得安，嘌呤霉素，表柔比星，及環(huán)磷酰胺和其類(lèi)似物或同系物。治療性試劑包括但不限于，抗代謝物(例如，甲氨蝶呤，6-巰噤呤，6-硫鳥(niǎo)嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶脫焦炭)，烷化試劑(例如，氮芥，thio印a,苯丁酸氮芥，苯丙酸氮芥，雙氯乙基亞硝脲(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)，環(huán)疏代璘酰胺，白消安，二溴甘露醇，鏈脲霉素，絲裂霉素C，及順式二氯二氨鉑(II)(DDP)順鉑)，蒽環(huán)霉素(例如，柔紅霉素(前柔紅霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，放線菌素D(前放射菌素)，博來(lái)審素，光神霉素及安曲霉素(AMC))，及抗有絲分裂試劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段或其變體與治療性試劑或改變預(yù)定生物反應(yīng)的藥物部分結(jié)合。該治療性試劑或試劑部分應(yīng)理解為不限于傳統(tǒng)的化學(xué)治療性試劑。例如，該試劑部分可以是具有所需的生物活性的蛋白或多肽。這種蛋白可包括例如毒素，如紅豆因，蓖麻毒素A，假單胞菌外毒素，霍亂霉素或白喉霉素；蛋白，如腫瘤壞死因子，a-干擾素，(3-干擾素，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，血小板生長(zhǎng)素，組織血漿酶原催化劑，細(xì)胞凋亡試劑，例如，TNF-a，TNF-p,AIMI(參考，囯際公開(kāi)WO97/33899)，AIMII(參考，囯際公開(kāi)WO97/34911)，F(xiàn)as配體(Takahashi等人，1994,J/w/咖"o/.，6:1567),及VEGI(參考，囯際公開(kāi)WO99/23105),血栓形成試劑或抗血管增生試劑，例如，血管抑素或血管內(nèi)皮抑制素；或生物反應(yīng)改性劑，例如，淋巴因子(例如，白細(xì)胞介素-l("IL-l"),白細(xì)胞介素-2("IL-2")，白細(xì)胞介素-6("IL-6"),粒-巨噬細(xì)胞克隆刺激因子("GM-CSF")，及粒細(xì)胞克隆刺激因子("G-CSF"))，或生長(zhǎng)因子(例如，生長(zhǎng)激素("GH"))。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段或其變體與治療性試劑結(jié)合，如與放射性材料或與射電金屬離子結(jié)合的大環(huán)螯合劑(參考前述放射性材料的例子)結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該大環(huán)螯合劑是l，4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-N,N'，N",N"-四乙酸(DOTA),可通過(guò)連接分子與抗體連接。這種連接分子在本領(lǐng)域中是公知的，公開(kāi)于Denardo等人，1998，a/"C朋cwi^.4:2483-90;Peterson等人，1999,5/ocow>g.C/e肌10:553;和Zimmerman等人，1999,Wmc/.Med5/o/.26:943-50,在此引入每個(gè)文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考。在特定實(shí)施方案中，結(jié)合的抗體是EphA4抗體，其優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是非癌細(xì)胞上的EphA4抗原決定部位(即暴露的EphA4抗原決定部位抗體)。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，該結(jié)合的抗體不是EA2。在另一實(shí)施方案中，該結(jié)合的抗體包括EA44抗體的可變輕鏈或可變重鏈。使治療部分與抗體結(jié)合的技術(shù)是公知的，參見(jiàn)，例如，Arnon等人，"MonoclonalForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",Mo膨/o"a/^m"6o^eswdCa"cer7T^ra;^,Reisfeld等人(編),pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985);Hellstrom等人，"AntibodiesForDrugDelivery",Cow/ro//edJ9n/gDe//ve77(2ndEd.),Robinson等人(eds.)，pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",Mo騰/owa"油7)o血51'84:BiologicalandClinicalApplications,Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985);"Analysis,Results,andFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",Mo騰/owa/顛/6o血sForQwcerZ)她criowfl"d77^響,Baldwin等人(eds.),pp.303-16(AcademicPress1985),及Thorpe等人，1982,/臓w"o/.iev.62:119-58。使抗體與多肽融合或結(jié)合的方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見(jiàn)，例如，美囯專(zhuān)利5,336,603,5,622,929,5，359,046，5,349,053，5,447,851,及5,112,946;EP307,434;EP367,166;國(guó)際公開(kāi)WO96/04388和WO91/06570;Ashkenazi等人，1991,iWJS88:10535-10539;Zheng等人，1995,<//顯腳/.154:5590-5600;和Vil等人，1992，P萌89:11337-11341。使抗體與基序融合不必須直接進(jìn)行，而是可以通過(guò)連接序列進(jìn)行。這種連接分子在本領(lǐng)域中是公知的，并公開(kāi)于Denardo等人，1998，C7/"Ca"ceri^.4:2483-90;Peterson等人，1999，5wcoM>g.Cfe附.10:553;Zimmerman等人，1999，7Vwc/.Med5/o/.26:943-50;Gamett,2002,A/v.DragZH/v.iev.53:171-216，在此引入每一文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考?？蛇x擇地，抗體可以與第二種抗體結(jié)合以形成抗體復(fù)共軛對(duì)配合物，如Segal在美囯專(zhuān)利4,676,980中所述的，在此引入其全部作為參考?？贵w也可與固體載體連接，這尤其適用于免疫測(cè)定或目標(biāo)抗原的純化。這種固體載體包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。5丄2制備抗體的方法抗體或其片段可通過(guò)本領(lǐng)域中合成抗體的任何已知方法來(lái)制備，具體而言，通過(guò)化學(xué)合成或優(yōu)選通過(guò)重組表達(dá)技術(shù)來(lái)制備。可通過(guò)使用本領(lǐng)域所知的各種技術(shù)(包括使用雜交瘤、重組、及噬菌體展示技術(shù)，或它們的組合)來(lái)制備單克隆抗體。例如，單克隆抗體可通過(guò)使用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備，這些技術(shù)包括本領(lǐng)域已知的那些或如下的教導(dǎo)，例如，Harlow等人，顛'W^:^！Z^固to^;Mz謹(jǐn)Z，(ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1988);Hammerling等人,Mo"oc/owa/顛/W/as"m/T-Ce///^&Wwmw563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(在此引入所述文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考)。在本文中，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"不限于通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備的抗體。術(shù)語(yǔ)"羊克隆抗體"是指源自單一克隆的抗體，包括任何真核，原核或噬菌體克隆，不是指其制備的方法。使用雜交瘤技術(shù)制備和篩選特定抗體的方法是本領(lǐng)域常規(guī)和公知的。簡(jiǎn)言之，可以用EphA4(全長(zhǎng)蛋白或其區(qū)域，例如，細(xì)胞外區(qū)域)免疫小鼠，并且一旦檢測(cè)到免疫反應(yīng)，例如，在小鼠血清中檢測(cè)到對(duì)EphA4有特異性的抗體，那么就割取小鼠的脾，并進(jìn)行脾細(xì)胞分離。然后將脾細(xì)胞通過(guò)已知技術(shù)與任何適合的骨髓瘤細(xì)胞融合，例如從ATCC的細(xì)胞系SP20得到的細(xì)胞。通過(guò)有限的稀釋?zhuān)x擇雜交瘤并克隆。然后用本領(lǐng)域熟知的方法分析雜交瘤克隆，分析分泌能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的細(xì)胞。通常，含有高水平抗體的腹液可通過(guò)用陽(yáng)性雜交瘤克隆免疫小鼠來(lái)得到。因此，單克隆抗體可通過(guò)培養(yǎng)可分泌本發(fā)明抗體的雜交瘤來(lái)制備，其中優(yōu)選地，通過(guò)使從用EphA4或其片段免疫的小鼠中分離出的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，然后從該融合體中篩選雜交瘤以篩選出分泌能夠結(jié)合EphA4的抗體的雜交瘤克隆，從而制備出雜交瘤。識(shí)別特定EphA4抗原決定部位的抗體片段可通過(guò)本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的任何技術(shù)得到。例如，本發(fā)明的Fab和F(ab')2片段可通過(guò)使用酶(如木瓜蛋白酶(以產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(以產(chǎn)生F(ab')2片段))來(lái)剪切免疫球蛋白分子制得。F(ab')2片段包括可變區(qū)域，輕鏈不變區(qū)和重鏈的CH1區(qū)域。此外，本發(fā)明的抗體還可通過(guò)使用本領(lǐng)域所知的各種噬菌體展示方法制得。在噬菌體展示方法中，功能抗體區(qū)域展示在運(yùn)載其多核苷酸編碼序列的噬菌體粒子的表面。具體而言，編碼VH和VL區(qū)域的DNA序列從動(dòng)物cDNA庫(kù)(例如，人或鼠類(lèi)淋巴組織的cDNA庫(kù))擴(kuò)增。將該編碼VH和VL區(qū)域的DNA通過(guò)PCR與scFv連接序列一起重組，并克隆到噬粒粒載體(例如，pCANTAB6或pComb3HSS)中。將該載體電穿孔到五.co//中，并和輔助噬菌體一起感染五,co//。這些方法中所用的噬菌體通常為包括fd和M13的細(xì)絲狀噬菌體，且VH和VL區(qū)域通常與噬菌體基因III或基因vin重組融合?？梢杂每乖瓉?lái)篩選或識(shí)別表達(dá)結(jié)合EphA4抗原決定部位的抗原結(jié)合區(qū)的噬菌體，例如，使用標(biāo)記抗原或被結(jié)合或捕獲到固體表面上的抗原來(lái)篩選或識(shí)別。可用于制備本發(fā)明抗體的噬菌體展示方法的例子包括如下所公開(kāi)的那些Brinkman等人，1995,//附w朋o/.Me&o^182:41-50;Ames等人，1995，//附附朋o/.MeAocfe184:177;Kettleborough等人，1994,五wn//附mw"o/.24:952-958;Persic等人，1997,187:9;Burton等人，1994，Wra薩/附附wno/ogy57:191-280;囯際申請(qǐng)PCT/GB91/01134;囯際公開(kāi)WO90/02809,WO91/10737,WO92/01047,WO92/18619，WO93/11236,WO95/15982,WO95/20401,及WO97/13844;和美國(guó)專(zhuān)利5,698，426,5,223,409,5,403,484,5,580,717,5,427,908，5,750,753,5,821,047,5,571,698,5,427,908,5,516,637，5,780,225,5,658,727,5,733,743和5，969，108;在此引入每一文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考?？梢院Y選結(jié)合EphA4，尤其結(jié)合EphA4的細(xì)胞外區(qū)域的噬菌體。也可以篩選激動(dòng)性EphA4活性(例如，EphA4磷酸化提高，EphA4水平降低)，或癌細(xì)胞表型抑制活性(例如，在軟瓊脂中的克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑如MATRIGELTM中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成降低)，或優(yōu)選與在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位的結(jié)合(例如，與在細(xì)胞間接觸中與配體結(jié)合的EphA4結(jié)合較差，與在細(xì)胞間接觸中不與配體結(jié)合的EphA4結(jié)合較好)。如上述參考文獻(xiàn)中描述的，在選擇了噬菌體后，噬菌體的抗體編碼區(qū)域可被分離并用于生產(chǎn)整個(gè)抗體，包括人抗體，或任何其他所需的抗原結(jié)合片段，并且在任何所需的宿主中表達(dá)，包括例如下文所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞，酵母及細(xì)菌。可以使用本領(lǐng)域所公知的方法來(lái)重組產(chǎn)生Fab，F(xiàn)ab'和F(ab')2片段，如在下述文獻(xiàn)中公開(kāi)的那些，囯際公開(kāi)WO92/22324;Mullinax等人，1992，歷o7k;/zw々wes12:864;Sawai等人，1995,A/W34:26;和Better等人，1988,Sd匿240:1041(在此引入所述文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考)。為了產(chǎn)生整個(gè)抗體，可用PCR引物(包括VH或VL核苷酸序列，限制位點(diǎn)，及保護(hù)限制位點(diǎn)的側(cè)翼序列)來(lái)擴(kuò)增scFv克隆中的VH或VL序列。利用本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的克隆技術(shù)，可以將PCR擴(kuò)增的VH區(qū)域克隆到表達(dá)VH不變區(qū)，例如人y4不變區(qū)的載體中，和可以將PCR擴(kuò)增的VL區(qū)域克隆到表達(dá)VL不變區(qū)，例如人K或X不變區(qū)的載體中。優(yōu)選地，表達(dá)VH或VL區(qū)域的載體包括EF-la啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、可變區(qū)域的克隆位點(diǎn)、不變區(qū)、及選擇標(biāo)記如新審素。VH和VL區(qū)域還可克隆到表達(dá)必需不變區(qū)的載體中。然后，使用本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的技術(shù)，將重鏈轉(zhuǎn)化載體和輕鏈轉(zhuǎn)化載體一起轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系中，以產(chǎn)生穩(wěn)定或短暫的細(xì)胞系，表達(dá)全長(zhǎng)抗體，例如，IgG。在一些用途中，包括抗體在人體內(nèi)的應(yīng)用和體外檢測(cè)分析，優(yōu)選地使用人或嵌合抗體。完全人抗體在治療人受試者方面是尤其理想的。人抗體可通過(guò)本領(lǐng)域公知的各種方法制備，包括如上所述的使用源自人免疫球蛋白序列的抗體庫(kù)的噬菌體展示方法制備。還可參考美國(guó)專(zhuān)利4,444,887和4,716,111,和國(guó)際公開(kāi)WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735、及WO91/10741,在此引入每一文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考。還可通過(guò)使用不能表達(dá)功能性內(nèi)生免疫球蛋白但可表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備人抗體。例如，可以將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合物隨機(jī)地或通過(guò)同源重組導(dǎo)入到小鼠胚胎干細(xì)胞中。可選擇地，除了人重鏈和輕鏈基因外，可以將人可變區(qū)域、不變區(qū)、及差異性區(qū)域?qū)氲叫∈笈咛ジ杉?xì)胞中。小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋基因可以非功能性地單獨(dú)導(dǎo)入或在通過(guò)同源重組導(dǎo)入人免疫球蛋白克隆的同時(shí)導(dǎo)入。具體而言，Jh區(qū)域的同合子缺失使內(nèi)生抗體不能產(chǎn)生。擴(kuò)增經(jīng)修飾的胚胎千細(xì)胞并將其微注射到胚泡中從而產(chǎn)生嵌合小鼠。然后培育該嵌合小鼠，以產(chǎn)生表達(dá)人抗體的同型后代。以常規(guī)方式用所選的抗原免疫該轉(zhuǎn)基因小鼠，例如，用本發(fā)明的全部多肽或其一部分免疫。用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)從該免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠中可以獲得所述抗原的單克隆抗體。在該轉(zhuǎn)基因小鼠中的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化過(guò)程中重新排列，然后發(fā)生類(lèi)型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因而，使用這種技術(shù)，可產(chǎn)生治療用IgG、IgA、IgM和IgE抗體。關(guān)于制備人抗體的技術(shù)的總體描述，參考Lonberg和Huszar(1995,/脫/ev./附ww"o/.13:65-93)。關(guān)于制備人抗體和人單克隆抗體的技術(shù)和制備這種抗體的方法的詳細(xì)說(shuō)明，參見(jiàn)，例如，囯際公開(kāi)WO98/24893、WO96/34096及WO96/33735;和美囯專(zhuān)利5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318及5,939,598,在此引入每一文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考。此外，一些公司，如Abgenix,Inc.(Freemont,CA)和Medarex(Princeton,NJ)使用與上述描述相似的技術(shù)可提供所選抗原的人抗體。嵌合抗體是其中抗體不同的部分源自于不同的免疫球蛋白分子的分子，如具有源自于非人抗體的可變區(qū)域和人免疫球蛋白不變區(qū)的抗體。制備嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域是公知的。參見(jiàn)，例如，Morrison,1985,Sde"ce229:1202;Oi等人，1986，歷o7k^w々wes4:214;Gillies等人，1989,了附wm"o/.M&W"25:191-202;和美國(guó)專(zhuān)利5,807,715、4,816,567及4,816,397，在此引入每一文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考。嵌合抗體包括源于非人物種的一個(gè)或多個(gè)CDR和源于人免疫球蛋白分子的框架區(qū)，并可使用本領(lǐng)域所公知的各種技術(shù)來(lái)制備，這些技術(shù)包括例如，CDR移植(EP239,400;囯際公開(kāi)WO91/09967;和美囯專(zhuān)利5,225,539、5,530,101及5,585,089),鑲嵌或重構(gòu)建(EP592,106;EP519,596;Padlan,1991,M/ecw/w/附附wwo/og);28(4/5):489-49S，Studnicka等人，1994，尸rate/"五"g/ween'wg7:805;和Roguska等人，1994，PNAS91:969),及鏈改組(美囯專(zhuān)利5,565,332)。通常，框架區(qū)里的框架殘基會(huì)被CDR供體抗體相應(yīng)的殘基取代，從而改變了，優(yōu)選是改進(jìn)了抗原結(jié)合。這些框架取代可用本領(lǐng)域公知的方法來(lái)識(shí)別，例如，通過(guò)模擬CDR與框架殘基間的相互作用來(lái)鑒別框架殘基對(duì)抗原結(jié)合的重要性來(lái)識(shí)別，和進(jìn)行序列比較來(lái)識(shí)別在特定位置上的不尋?？蚣軞埢鶃?lái)識(shí)別。(參見(jiàn)，例如，美囯專(zhuān)利5,585,089;和Riechmann等人，1988，Atowre332:323,在此引入其全部?jī)?nèi)容作為參考)。人源化抗體是抗體或其變體或其片段，其能結(jié)合預(yù)定抗原，且含有框架區(qū)和CDR,該框架區(qū)基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列，CDR基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列。人源化抗體基本上包括至少一個(gè)、通常是兩個(gè)可變區(qū)域，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)域與非人免疫球蛋白(即供體抗體)的CDR區(qū)域相應(yīng)，且所有或基本上所有框架區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的框架區(qū)。優(yōu)選地，人源化抗體還包括至少一部分免疫球蛋白不變區(qū)(Fc),通常是人免疫球蛋白的不變區(qū)。通常，該抗體包括輕鏈及至少重鏈的可變區(qū)域。該抗體還包括重鏈的CH1、鉸鏈區(qū)、CH2、CH3及CH4區(qū)域。人源化抗體可選自任何種類(lèi)的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE,及任何異型，包括IgG、IgG2、IgG3和IgG4。通常地，如果需要人源化抗體表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，那么該不變區(qū)是互補(bǔ)結(jié)合的不變區(qū)，且是典型的IgG種類(lèi)。如果不需要這種細(xì)胞毒性，那么該不變區(qū)可以是IgG2種類(lèi)。該人源化抗體可包括來(lái)源于多種種類(lèi)或異型的序列，選擇特定的不變區(qū)以優(yōu)化所需的效果是本領(lǐng)域技術(shù)公知的。人源化抗體的框架區(qū)域和CDR區(qū)域不需要與雙親序列精確一致，例如，可通過(guò)取代、添加或缺失至少一個(gè)殘基而使供體CDR或共有框架發(fā)生突變，從而使在該位點(diǎn)的CDR或構(gòu)架殘基不與共有或產(chǎn)生的抗體相應(yīng)。然而，這種突變不會(huì)很多。通常，至少75%的人源化抗體殘基與雙親的框架區(qū)(FR)和CDR序列一致，更通常為90%,且最優(yōu)選的是大于95%。人源化抗體可通過(guò)使用本領(lǐng)域所知的各種技術(shù)而制得，包括但不限于，CDR接枝(歐洲專(zhuān)利EP239,400、囯際公開(kāi)WO91/09967和美囯專(zhuān)利5,225,539、5,530,101及5,585,089),鑲嵌或重構(gòu)建(歐洲專(zhuān)利EP592,106和EP519,596;Padlan,1991,Mo/ecw/fl〃m附wo/ogy28(4/5):489-498;Studnicka等人，1994，iVote/"五"g/"em'wg7(6):805-814;和Roguska等人，1994,/WJS91:969-973)，鏈改組(美囯專(zhuān)利5,565,332),及下列文獻(xiàn)中公開(kāi)的技術(shù)，例如，美國(guó)專(zhuān)利6,407,213，5,766,886，5,585,089,囯際公開(kāi)WO9317105，Tan等人，2002,//附m朋o/.169:1119-25,Caldas等人，2000，13:353-60,Morea等人,2000,Afe^oA20:267-79，Baca等人,1997，/5/o/.C/ze肌272:10678-84,Roguska等人，1996,尸rote/"五"g.9:895-904，Couto等人，1995，C""cw及es.55(23Supp):5973s-5977s，Couto等人，1995,C朋ceri戰(zhàn)55:1717-22，Sandhu,1994,Gene150:409-10,Pedersen等人，1994,JMo/.艦235:959-73，Jones等人，1986,胸騰321:522-525,Riechmann等人，1988,JVofwe332:323,及Presta,1992,Cwr.^racf.說(shuō)W.2:593-596。通常，框架區(qū)里的框架殘基會(huì)被CDR供體抗體的相應(yīng)殘基取代，以改變并優(yōu)選是改進(jìn)抗原結(jié)合。這些框架取代可用本領(lǐng)域公知的方法來(lái)識(shí)別，例如，通過(guò)模擬CDR與框架殘基間的相互作用來(lái)筌別框架殘基對(duì)抗原結(jié)合的重要性來(lái)識(shí)別，和進(jìn)行序列比較來(lái)識(shí)別在特定位置上的不尋?？蚣軞埢鶃?lái)識(shí)別。(參見(jiàn)，例如，美囯專(zhuān)利5,585,089;和Riechmann等人，1988,7Vflft^332:323，在此引入其全部?jī)?nèi)容作為參考)。此外，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員使用公知的技術(shù)可用本發(fā)明的抗體來(lái)制備特異基因型抗體。(參見(jiàn)，例如，Greenspan&Bona,1989，尸^SSSJ.7:437-444;和Nissinoff，1991,//mwwwo/.147:2429-2438)。本發(fā)明提供了使用多核苷酸的方法，該多核苷酸含有編碼本發(fā)明的抗體或其片段的核苷酸序列。5丄3編碼抗體多核苷酸本發(fā)明的方法還包括能在如上文所定義的高度嚴(yán)格、中度嚴(yán)格或低嚴(yán)格雜交條件下與編碼本發(fā)明的抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。上迷多核苷酸可以用本領(lǐng)域所公知的任何方法來(lái)獲得，且該多核苷酸的核苷酸序列可使用本領(lǐng)域所公知的任何方法來(lái)測(cè)定。因?yàn)榭贵w的氨基酸序列是已知的，所以編碼這些抗體的核苷酸序列可使用本領(lǐng)域所公知的方法測(cè)定，即，將已知編碼特定氨基酸的核苷酸密碼子組裝起來(lái)從而得到編碼本發(fā)明抗體或其片段的核酸。這種編碼該抗體的多核苷酸可用化學(xué)合成的寡核苷酸來(lái)組裝(例如，Kutmeier等人，1994,歷oMw',17:242),該組裝簡(jiǎn)而言之，包括合成交疊的寡核苷酸，該寡核苷酸含有該抗體的一部分編碼序列；退火并連接這些寡核苷酸；然后用PCR擴(kuò)增該連接的寡核苷酸?？蛇x擇地，編碼抗體的多核苷酸可由適當(dāng)來(lái)源的核酸產(chǎn)生。如果含有編碼特定抗體的核酸的克隆不能從商業(yè)上得到，但抗體分子的序列是已知的，那么編碼該免疫球蛋白的核酸可以通過(guò)化學(xué)合成得到或從適合來(lái)源(例如，從任何表達(dá)抗體的組織或細(xì)胞產(chǎn)生的抗體cDNA庫(kù)或cDNA庫(kù)，或從任何表達(dá)抗體的組織或細(xì)胞分離的核酸，優(yōu)選是聚A+RNA，該組織或細(xì)胞如選擇來(lái)表達(dá)本發(fā)明抗體的雜交瘤)得到，其方法是通過(guò)使用可與序列的3'端和5'端雜交的合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或通過(guò)使用對(duì)特定基因序列具有特異性的寡核苷酸探針進(jìn)行克隆，以例如從編碼該抗體的cDNA庫(kù)中識(shí)別cDNA克隆。然后，使用本領(lǐng)域公知的任何方法將通過(guò)PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸克隆成到可復(fù)制的克隆載體中。一旦上述抗體的核苷酸序列得到測(cè)定，那么就使用核普酸序列操作領(lǐng)域公知的方法，來(lái)操作該抗體的核苷酸序列，該方法如，重組DNA技術(shù)，定點(diǎn)變異，PCR等。(參見(jiàn)，例如，下面文獻(xiàn)中所述的技術(shù)，Sambrook等人，1990，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，NY和Ausubel等人，編，1998，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY,在此引入其全部?jī)?nèi)容作為參考)，以產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體，例如產(chǎn)生氨基酸取代，缺失和/或添加。在特定實(shí)施方案中，使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)，將一個(gè)或多個(gè)CDR插入到框架區(qū)中。該框架區(qū)可以是天然的或共有的框架區(qū)，優(yōu)選是人框架區(qū)(關(guān)于人框架區(qū)列表，參見(jiàn)，例如，Chothia等人，1998,Mo/.歷o/.278:457-479)。優(yōu)選地，通過(guò)組合框架區(qū)和CDR產(chǎn)生的多核苷酸編碼特異性結(jié)合EphA4的抗體。優(yōu)選地，如上文所述，在框架區(qū)內(nèi)可以有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，并且優(yōu)選地，氨基酸取代提高了抗體與其抗原的結(jié)合。此外，這種方法可用于產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)參與鏈內(nèi)二疏鍵的可變區(qū)半胱氨酸殘基的氨基酸取代或缺失，從而產(chǎn)生缺少一個(gè)或多個(gè)鏈內(nèi)二疏鍵的抗體分子。本發(fā)明也包括多核苷酸的其他變體，這些變體是本領(lǐng)域公知的。5丄4抗體的重組表達(dá)本發(fā)明的抗體、衍生物、類(lèi)似物或其片段(例如，本發(fā)明抗體的重鏈或輕鏈，或其一部分，或本發(fā)明的單鏈抗體)的重組表達(dá)，需要構(gòu)建含有編碼該抗體的多核苷酸的表達(dá)載體。一旦得到編碼本發(fā)明的抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈或其一部分(優(yōu)選但不必須包括重鏈或輕鏈可變區(qū)域)的多核苷酸，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過(guò)重組DNA技術(shù)就可制得用于制備該抗體分子的載體。因此，本文中描述了通過(guò)表達(dá)含有編碼抗體的核苷酸序列的多核苷酸來(lái)制備蛋白的方法。可以使用本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的方法來(lái)構(gòu)建含有抗體編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)及體內(nèi)基因重組。因此，本發(fā)明提供了可復(fù)制的載體，其含有編碼本發(fā)明抗體分子、抗體的重鏈或輕鏈、抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)域或其一部分或重鏈或輕鏈CDR,且與啟動(dòng)子操作性連接的核苷酸序列。這種載體可以包括編碼抗體分子不變區(qū)的核苷酸序列(參見(jiàn)，例如，囯際公開(kāi)WO86/05807和WO89/01036和美國(guó)專(zhuān)利5,122,464),且該抗體的可變區(qū)域可以克隆進(jìn)這種栽體中，以表達(dá)全部重鏈、全部輕鏈或全部重鏈和輕鏈。可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以制備本發(fā)明的抗體。因此，本發(fā)明包括宿主細(xì)胞，其含有編碼本發(fā)明的抗體或其片段，或其重鏈或輕鏈，或其一部分，或本發(fā)明的單鏈抗體，并與異源啟動(dòng)子可操作性連接的多核苷酸。在表達(dá)雙鏈抗體的優(yōu)選實(shí)施方案中，如下所述，編碼重鏈和輕鏈的載體可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)以表達(dá)整個(gè)免疫球蛋白分子?？梢允褂酶鞣N宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)本發(fā)明的抗體分子(參見(jiàn)，例如，美囯專(zhuān)利5,807,715)。代表性的這種宿主表達(dá)系統(tǒng)是載體，通過(guò)該載體，可制備目的編碼序列并隨后純化；和細(xì)胞，當(dāng)用適合的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)染時(shí)，該細(xì)胞原位表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。這些包括但不限于用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物，如細(xì)菌(例如，co/Z和5.sw^7/s);用含有抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，&cc/wro/M_yc";/c/z/fl);用含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒病毒，TMV)感染的或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或含有重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS、CHO、BHK、293、NSO及3T3細(xì)胞)，它們含有源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如，金屬疏蛋白啟動(dòng)子)或源于哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如，腺病毒B免期啟動(dòng)子；牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子)。優(yōu)選地，用細(xì)菌細(xì)胞如Esc/^7'c/2/aco//,更優(yōu)選真核細(xì)胞，特別是表達(dá)整個(gè)重組抗體分子的細(xì)菌細(xì)胞或優(yōu)選的真核細(xì)胞來(lái)表達(dá)重組抗體分子。例如，結(jié)合有載體(如從人細(xì)胞巨化病毒中得到的主要中早其基因啟動(dòng)子元件)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中囯卵巢細(xì)胞(CHO))是抗體的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等人，1986，45:101;和Cockett等人，19卯,說(shuō)orec/"o/ogv8:2)。在特定實(shí)施方案中，通過(guò)組成型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)編碼抗體或其片段的核苷酸序列的表達(dá)，其中該抗體免疫特異性結(jié)合EphA4并激發(fā)EphA4，抑制癌細(xì)胞表型，優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞而不是非癌細(xì)胞上選擇性暴露和/或Koff小于3xl(T3S"的EphA4抗原決定部位。在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)待表達(dá)的抗體分子的用途來(lái)有利地選擇表達(dá)載體的數(shù)量。例如，當(dāng)制備大量這種蛋白時(shí)為，為了生產(chǎn)抗體分子的藥物組合物，指導(dǎo)高水平表達(dá)融合蛋白產(chǎn)物且使該蛋白產(chǎn)物容易純化的載體是理想的。這種載體包括但不限于￡.co//表達(dá)載體pUR278(Ruther等人，1983,五MB012:1791)，其中該抗體編碼序列可以分別連接到該載體的帶有l(wèi)acZ編碼區(qū)域的框架中，從而制得融合蛋白；pIN載體(Inouye&Inouye,1985，iVMcfe/c爿d^ie;y.13:3101-3109;VanHeeke&Schuster,1989，說(shuō)W.C/2e附.24:5503-5509)等。pGEX載體也可用于表達(dá)外源多肽，如含有谷胱甘肽5-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。通常，這種融合蛋白是可溶解的，并易于從溶解的細(xì)胞中通過(guò)吸附、結(jié)合基質(zhì)谷胱甘肽-瓊脂糖珠，然后在游離谷胱甘肽存在下進(jìn)行洗脫來(lái)純化。該pGEX載體設(shè)計(jì)成含有凝血酶或因子X(jué)a蛋白酶剪切位點(diǎn)，從而可以從GST部分釋放出克隆的目標(biāo)基因產(chǎn)物。在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，將爿wtograp/wcfl/z》/72/ca核型多角體病毒(AcNPV)用作載體來(lái)表達(dá)外源基因。病毒在5^wtopfera^7^)7m5to細(xì)胞中生長(zhǎng)。上述抗體的編碼序列可以分別克隆到病毒的非必需區(qū)域(例如多角體蛋白基因)并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制下。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以使用多個(gè)基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在使用腺病毒作為表達(dá)載體的情況下，目標(biāo)抗體編碼序列可以連接到腺病毒轉(zhuǎn)^/翻譯控制復(fù)合物中，例如，連接到B免期啟動(dòng)子和三聯(lián)體引導(dǎo)序列中。然后可以通過(guò)體外或體內(nèi)重組，將這種嵌合基因插入到腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)域(例如，區(qū)域El或E3)中插入會(huì)產(chǎn)生可繁殖的且能夠在感染的宿主中表達(dá)抗體分子的重組病毒(例如，參見(jiàn)Logan&Shenk,1984，尸iV^S81:355-359)。對(duì)于插入的抗體編碼序列的有效翻譯，可能還需要特定的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和相鄰序列。此外，該起始密碼子必須與所需編碼序列的閱讀框協(xié)調(diào)一致，以確保整個(gè)插入物得到翻譯。這些外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是各種來(lái)源的，包括天然和合成來(lái)源的。通過(guò)加入適合的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件，轉(zhuǎn)錄終結(jié)子等，可以增強(qiáng)表達(dá)效率(參見(jiàn)，例如，Bittner等人，1987，M&Ws/函z戸/.153:516-544)。此外，選擇宿主細(xì)胞抹，該細(xì)胞抹調(diào)節(jié)嵌入序列的表達(dá)，或以特定的理想方式修飾和處理基因產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物的這種修飾(例如，糖基化)和處理(例如，斷裂)對(duì)于蛋白的功能是重要的。對(duì)于蛋白或基因產(chǎn)物的翻譯后處理和修飾，不同的宿主細(xì)胞具有特征性和特定機(jī)制。選擇適合的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保正確修飾和處理表達(dá)的外源蛋白。因此，可以使用具有所述基因產(chǎn)物的初級(jí)轉(zhuǎn)錄、糖基化及磷酸化合適處理細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、NS1和T47D、NSO(鼠類(lèi)骨髓瘤細(xì)胞系，不會(huì)內(nèi)源產(chǎn)生任何免疫球蛋白鏈)，CRL7030和HsS78Bst細(xì)胞。為了長(zhǎng)期高產(chǎn)率地生產(chǎn)重組蛋白，穩(wěn)定表達(dá)是優(yōu)選的。例如，可以建立穩(wěn)定地表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。如果不使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以使用受合適表達(dá)控制元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終結(jié)子、多聚腺苷酸位點(diǎn)等)控制的DNA和可選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)錄宿主細(xì)胞。在引入外源DNA后，可以將構(gòu)建的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)l-2天，然后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的可選擇性標(biāo)記對(duì)選擇具有抗性，從而使細(xì)胞穩(wěn)定地與質(zhì)粒染色體結(jié)合，并生長(zhǎng)形成集落，該集落隨后克隆并擴(kuò)展成細(xì)胞系。這種方法可用于構(gòu)建表達(dá)抗體分子的細(xì)胞系。這種構(gòu)建的細(xì)胞系尤其適用于篩選和分析直接或間接與抗體分子相互作用的組合物。可以使用多種選擇系統(tǒng)，包括但不限于，可分別用于tk-,hgprt-或aprt-細(xì)胞的單純皰滲病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell11:223)，次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(827&^1^&Szybalski，1992,Ato/.爿o^.Scz'.202),腺噪呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，1980，Ce〃22:8-17)基因。此外，抗代謝物抗性可用作選擇下列基因的基礎(chǔ)^/r，對(duì)甲氨蝶呤具有抗性(Wigler等人，1980，iWJS77:357;O'Hare等人，1981,7W^S78:1527);砂f，對(duì)麥考酚酸具有抗性(Mulligan&Berg，1981，戶A^S78:2072);對(duì)氨基糖苷G-418具有抗性(Wu和Wu,1991，歷0Aerap73:87;Tolstoshev,1993,iev.尸/wwwco/.7bx/co/.32:573;Mulligan,1993,Sc/e"ce260:926j和Morgan和Anderson,1993,j朋.iev.62:191;May,1993,7757EOni:155-)和&gTO,對(duì)潮霉素具有抗性(Santerre等人，1984，Ge"e30:147)。重組DNA
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的方法通?？捎糜谶x擇所需的重組克隆，并且這種方法公開(kāi)于下迷文獻(xiàn)中，例如，Ausubel等人(eds.),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY(1993);Kriegler,GeneTransferandExpression，ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(1990);第12和13章，Dracopoli等人(eds)，CurrentProtocolsinHumanGenetics,JohnWiley&Sons,NY(1994);Colberre-Gampin等人，1981,/Mo/.150:1,在此引入這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考?？赏ㄟ^(guò)載體擴(kuò)增來(lái)提高抗體分子的表達(dá)水平(參見(jiàn)，Bebbington和Hentschel,TheuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancellsinDNAcloning,Vol.3.(AcademicPress,NewYork，1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記是可擴(kuò)增的時(shí)，提高宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的抑制劑水平會(huì)增大標(biāo)記基因復(fù)制的數(shù)量。由于擴(kuò)增區(qū)域與抗體基因相關(guān)，因此抗體的產(chǎn)量也增大(Crouse等人，1983,Mo/.Ce//.5/o/.3:257)。宿主細(xì)胞可以用本發(fā)明的兩個(gè)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，第一載體編碼重鏈衍生的多肽，第二載體編碼輕鏈衍生的多肽。這兩種載體可以包括相同的可選擇性標(biāo)記，該標(biāo)記能使重鏈和輕鏈多肽同等表達(dá)?？蛇x擇地，可以使用編碼并能夠同時(shí)表達(dá)重鏈和輕鏈多肽的單個(gè)載體。在這種情況下，輕鏈應(yīng)置于重鏈之前，以避免有毒的自由重鏈過(guò)量(Proudfoot，1986，Atowe322:52;和Kohler,1980,iWJS77:2197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包括cDNA或基因組DNA。一旦通過(guò)重組表達(dá)制得本發(fā)明的抗體分子，那么就可以通過(guò)純化免疫球蛋白分子領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法進(jìn)行純化，例如，通過(guò)色譜法(例如，離子交換、親和色諳，尤其是蛋白A之后的特異性抗原親和色譜、及大小篩份(sizing)柱色譜)，離心，不同的溶解度純化或通過(guò)純化蛋白的任何其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化。此外，本發(fā)明的抗體或其片段可以與本文所述或本領(lǐng)域中公知的其他異種多肽序列融合，以利于純化。5.2EphA4配體融合蛋白本發(fā)明包括含有EphA4配體的融合蛋白的用途，該配體例如，EphrinsAl、A2、A3、A4、A5、B2、及B3、B61、AL1/RAGS、LERK4、Htk-L、及Elk-L3，或其配體片段，該片斷優(yōu)選結(jié)合EphA4并引起EphA4信號(hào)的產(chǎn)生，與異種試劑，尤其是抗體的Fc區(qū)域重組融合或化學(xué)結(jié)合(包括共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合)而產(chǎn)生融合蛋白(參見(jiàn)，美囯專(zhuān)利5,116,964,Capan和Lasky)。異種試劑可以是多肽(或其一部分，優(yōu)選至少I(mǎi)O、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少I(mǎi)OO個(gè)氨基酸的多肽)，核酸，小分子(小于1000道爾頓)，或其他有機(jī)化合物。融合不必是直接的，可通過(guò)連接序列來(lái)融合。使用本領(lǐng)域所知的方法，這種融合蛋白可用于體內(nèi)檢測(cè)、治療、控制或監(jiān)測(cè)紊亂的進(jìn)展。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將EphA4配體融合蛋白用作EphA4激動(dòng)劑。5.3預(yù)防/治療方法本發(fā)明包括用于治療、預(yù)防或控制受試者中與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂和/或細(xì)胞高增生紊亂的方法，優(yōu)選是癌癥，包括給予一種或多種EphA4激發(fā)性抗體、或EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體、或暴露的EphA4抗原決定部位抗體、或結(jié)合K^小于3xl(T3S"的EphA4的EphA4抗體，優(yōu)選是一種或多種單克隆(從其他單一抗體物種來(lái)源得到的抗體)EphA4激發(fā)性抗體、或EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體或暴露的EphA4抗原決定部位抗體、或結(jié)合Koff小于3xl(^S"的EphA4的EphA4抗體。在特定實(shí)施方案中，待治療、預(yù)防或控制的紊亂是惡性癌癥。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，待治療、預(yù)防或控制的紊亂是惡化前的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以與一種或多種用于治療、預(yù)防或控制與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂，高增生紊亂和/或癌癥的其他治療性試劑組合給藥。在某些實(shí)施方案中，一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體與一種或多種用于治療癌癥的其他治療性試劑同時(shí)給予至哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人。術(shù)語(yǔ)"同時(shí)"不限于將預(yù)防或治療性試劑在準(zhǔn)確的相同時(shí)間給予，還指，將本發(fā)明的EphA4抗體和其他試劑按順序在一定時(shí)間間隔內(nèi)給予至受試者，使得本發(fā)明的抗體能夠與其他試劑一起起作用，從而比以其他方式給藥產(chǎn)生更大的優(yōu)點(diǎn)。例如，每種預(yù)防或治療性試劑可以同時(shí)給予，或以任何順序在不同時(shí)間點(diǎn)相繼給予；然而，如果沒(méi)有同時(shí)給予，它們應(yīng)該及時(shí)充分地給予，從而提供所需的治療或預(yù)防效果。每種治療性試劑可以以任何適合的形式并通過(guò)任何適合的方案分別給予。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的EphA4抗體在外科治療之前、過(guò)程中或之后給予。優(yōu)選地，外科治療完全除去局部腫瘤或降低了大胂瘤的尺寸。外科治療也可以作為預(yù)防性措施或用于減輕疼痛。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療和預(yù)防方法包括給予EphA4表達(dá)抑制劑，如但不限于，對(duì)EphA4具特異性的反義核酸，介導(dǎo)RNAi的雙鏈EphA4RNA,抗EphA4核酶等(參見(jiàn)部分5.5或除了EphA4抗體之外的EphA4活性激動(dòng)劑，如小分子EphA4活性抑制劑或激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種本發(fā)明的EphA4激動(dòng)性試劑與一種或多種EphA2激動(dòng)性試劑(參見(jiàn)，美囯申請(qǐng)10/436，783,Kinch等人，2004年5月12日申請(qǐng))組合給予。在各種實(shí)施方案中，預(yù)防或治療性試劑給藥的間隔時(shí)間小于l小時(shí)，為約l小時(shí)，為約1小時(shí)約2小時(shí)，為約2小時(shí)約3小時(shí)，為約3小時(shí)約4小時(shí)，為約4小時(shí)~約5小時(shí)，為約5小時(shí)~約6小時(shí)，為約6小時(shí)~約7小時(shí)，為約7小時(shí)~約8小時(shí)，為約8小時(shí)~約9小時(shí)，為約9小時(shí)約10小時(shí)，為約10小時(shí)~約11小時(shí)，為約11小時(shí)~約12小時(shí)，不超過(guò)24小時(shí)或不超過(guò)48小時(shí)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，兩種或多種成分給藥到同一受試患者。術(shù)語(yǔ)治療有效的和預(yù)防有效的表示了給藥的劑量和頻率。該劑量和頻率通常還根據(jù)每個(gè)患者的特定因素而變化，這取決于用于給藥的特異性治療性或預(yù)防性試劑，癌癥的嚴(yán)重程度和類(lèi)型，給藥方案，及患者的年齡、體重、反應(yīng)和過(guò)往病史。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以考慮上述因素并根據(jù)例如文獻(xiàn)報(bào)道和尸/^da"'sDeA7e/erace(56thed.,2002)中推薦的劑量選擇適合的方案。5.3.1患者群本發(fā)明提供了用于治療、預(yù)防和控制與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂和/或細(xì)胞高增生細(xì)胞疾病的方法，優(yōu)選是癌癥，包括給予需要的受試者治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的EphA4抗體可以與一種或多種其他治療性試劑組合給予。受試者優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，如非靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)和靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，猴子，如獼猴和人)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是人。本發(fā)明方法治療的特定癌癥包括但不限于過(guò)表達(dá)EphA4的癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該癌是上皮起源的。這種癌的例子是肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺及皮膚癌。其他癌包括膀胱和胰腺癌及腎臟細(xì)胞癌和黑素瘤。其他癌舉例列出，并不限于部分5.2丄1。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于治療和/或預(yù)防原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的方法和組合物包括將一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體給予患有或?qū)⒒加邪┌Y的受試者/患者，例如,對(duì)特定型癌癥具有基因易患病的體質(zhì)，接觸過(guò)致癌物質(zhì)或從特定癌癥康復(fù)的受試者/患者。本文中，"癌"指原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌。這種患者在之前可能進(jìn)行過(guò)或未進(jìn)行過(guò)癌治療。本發(fā)明的方法和組合物可以用作第一次或第二次癌癥治療性試劑。本發(fā)明也包括治療進(jìn)行過(guò)其他癌治療的患者，本發(fā)明的方法和組合物可在任何不利作用出現(xiàn)之前使用，或在忍受這些其他癌癥治療的過(guò)程中使用。本發(fā)明也包括給予一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體以治療或改善難于治療患者癥狀的方法。在某些實(shí)施方案中，難于治療的癌指，至少癌細(xì)胞的一些明顯部分未被殺死或它們的細(xì)胞分裂未受抑制。對(duì)癌細(xì)胞是否難于治療的測(cè)定可通過(guò)分析癌細(xì)胞治療效果領(lǐng)域的任何公知方法在體內(nèi)或體外進(jìn)行，在本文中對(duì)"難于治療"使用本領(lǐng)域可接受的含義。在各種實(shí)施方案中，如果癌細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有顯著降低或有所增加，那么癌癥是難于治療的。本發(fā)明也包括給予一種或多種EphA4激發(fā)性抗體以預(yù)防癌癥在易患癌癥的患者中開(kāi)始和復(fù)發(fā)的方法。在特定實(shí)施方案中，將本發(fā)明的EphA4抗體或降低EphA4表達(dá)的其他治療給予對(duì)某些激素、放射和化學(xué)治療性試劑具有不利耐藥性或敏感性降低的癌細(xì)胞中，從而使癌細(xì)胞對(duì)這些試劑中的一種或多種再敏感，然后給予(或繼續(xù)給予)以治療或控制癌癥，包括預(yù)防轉(zhuǎn)移。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的EphA4抗體被給予至細(xì)胞因子IL-6水平提高的患者，這種提高與對(duì)不同治療方案(如化學(xué)治療和激素治療)的癌細(xì)胞耐藥性發(fā)展有關(guān)。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的EphA4抗體被給予至患有乳腺癌的患者，而乳腺癌對(duì)它莫西芬治療反應(yīng)很低或用其難于治療。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的EphA4抗體被給予至細(xì)胞因子IL-6水平提高的患者，這種提高與對(duì)不同治療方案(如化學(xué)治療和激素治療)的癌細(xì)胞耐藥性發(fā)展有關(guān)。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患者癌癥的方法，包括給予一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體與任何其他治療試劑至該患者，而該患者已被證實(shí)難于用其他治療方法治療且不再使用這些治療方法。在某些實(shí)施方案中，用本發(fā)明方法治療的患者是已經(jīng)用化學(xué)治療、放射治療、激素治療或生物治療/免疫治療來(lái)處理過(guò)的患者。其中，這些患者是難以治療的患者和難以用現(xiàn)有癌癥治療方法治療的患者。在其他實(shí)施方案中，該患者已經(jīng)過(guò)治療且不再有疾病活性，給予一種或多種本發(fā)明的激發(fā)性抗體來(lái)預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，現(xiàn)有治療是化學(xué)治療。在特定實(shí)施方案中，現(xiàn)有治療包括給予化學(xué)治療試劑，包括但不限于，甲氨蝶呤，泰素，巰嘌呤，疏鳥(niǎo)嘌呤，羥基脲，阿糖胞苷，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，亞硝基脲，順鉑，卡鉑，絲裂審素，達(dá)卡巴漆(dacarbazine)，procarbizine,依托泊脊，campathecins,博來(lái)霉素，多柔比星，伊達(dá)比星(idambicin),柔紅霉素，放線菌素D，普卡霉素，米托蒽醌，天冬酰胺酶，長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine)，紫杉醇，多西他賽(docetaxel)等。這些患者是經(jīng)過(guò)放射治療、激素治療和/或生物治療/免疫治療過(guò)的患者。這些患者是經(jīng)過(guò)外科手術(shù)治療過(guò)的患者?？蛇x擇地，本發(fā)明也包括治療正在進(jìn)行或進(jìn)行過(guò)放射治療的患者的方法。這些患者正在用化學(xué)治療，激素治療和/或生物治療/免疫治療治療，或已前用過(guò)它們來(lái)治療。另外，這些患者是經(jīng)過(guò)外科手術(shù)治療過(guò)的患者。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療正在進(jìn)行或進(jìn)行過(guò)激素治療和/或生物治療/免疫治療的患者的方法。這些患者正在用化學(xué)治療和/或放射治療進(jìn)行治療，或已前用過(guò)它們來(lái)治療。這些患者是經(jīng)過(guò)外科手術(shù)治療過(guò)的患者。此外，本發(fā)明也提供了作為代替化學(xué)治療、放射治療、激素治療和/或生物治療/免疫治療來(lái)治療癌癥的方法，其中上述各種治療已被證實(shí)或可能被證實(shí)毒性過(guò)高，即對(duì)正在治療的受試者產(chǎn)生不可接受或無(wú)法忍受的副作用。用本發(fā)明方法治療的受試者可選擇地同時(shí)用其他癌癥治療一起治療，如外科手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、激素治療或生物治療，這取決于哪種治療被認(rèn)為是不可接受或無(wú)法忍受的。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了給予一種或多種本發(fā)明的激動(dòng)性單克隆抗體，而不需要其他任何癌癥治療方法來(lái)治療癌癥，該癌癥證實(shí)難以用該治療方法治療。在特定實(shí)施方案中，難于用其他癌癥治療方法治療的患者在沒(méi)有進(jìn)行癌癥治療的情況下給予一種或多種激動(dòng)性單克隆抗體，。在其他實(shí)施方案中，患有與過(guò)表達(dá)EphA4的細(xì)胞相關(guān)的惡化前癌癥的患者可給予本發(fā)明的抗體，以治療紊亂和降低發(fā)展成惡性癌癥的可能性。在特定實(shí)施方案中，惡化前的癌癥是進(jìn)行性前列腺上皮內(nèi)肺瘤(PIN),乳腺的導(dǎo)管癌，或復(fù)合痣。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防和控制非癌高增生性細(xì)胞紊亂的方法，尤其是與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的紊亂，包括但不限于，哮喘，慢性阻塞性肺紊亂(COPD)，再狹窄(平滑肌和/或內(nèi)皮)，牛皮褲等。這些方法包括與對(duì)上述治療、預(yù)防和控制癌癥的方法相似的方法，例如，給予本發(fā)明的EphA4抗體及抑制EphA4表達(dá)的試劑，組合治療，給予難于用特定治療方法治療的患者等。5.3丄1.遮可以用本發(fā)明的方法和組合物治療、預(yù)防或控制的癌癥和相關(guān)紊亂包括但不限于上皮細(xì)胞起源的癌癥。在優(yōu)選實(shí)施方案中，癌是胰腺癌。這種癌的例子包括白血病，如但不限于急性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓性白血病，如骨髓細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞性及紅細(xì)胞白血病和骨髓增生異常綜合癥；慢性白血病，如但不限于，慢性骨髓性(粒細(xì)胞)白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病，發(fā)狀細(xì)胞性白血病；真性紅血球增多癥；淋巴瘤如但不限于何杰金氏病，非何杰金氏??；多發(fā)性骨髓瘤，如但不限于郁積多發(fā)性骨髓瘤，非分泌型骨髓瘤，骨硬化性骨髓瘤，漿細(xì)胞白血病，單一質(zhì)漿細(xì)胞瘤和髓外質(zhì)漿細(xì)胞瘤；Waldenstrom巨球蛋白血癥；意義未明的單克隆丙種球蛋白血癥；良性單克隆丙種球蛋白血癥；重鏈疾病；骨和結(jié)締組織肉瘤，如但不限于骨質(zhì)肉瘤，骨肉瘤，軟骨肉瘤，尤文氏肉瘤，惡性巨細(xì)胞腫瘤，骨纖維肉瘤，脊索瘤，骨膜肉瘤，軟組織肉瘤，血管肉瘤，纖維肉瘤，卡波氏肉瘤，平滑肌纖維肉瘤，脂肪肉瘤，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞肉瘤，經(jīng)鞘瘤，橫紋肌肉瘤，滑液肉瘤；大腦腫瘤，如但不限于，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星細(xì)胞瘤，大腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤，室鼓膜瘤，寡樹(shù)突膠質(zhì)瘤，腦瘤，聽(tīng)神經(jīng)瘤，顱咽管瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，腦膜瘤，松果瘤，松果母細(xì)胞瘤，原發(fā)性大腦淋巴瘤；乳腺癌包括但不限于腺癌，小葉性(小細(xì)胞)肺癌，導(dǎo)管內(nèi)癌，髓質(zhì)乳腺癌，粘液性乳腺癌，管狀乳腺癌，乳頭狀乳腺癌，帕杰病，及炎癥乳腺癌；腎上腺癌，如但不限于嗜鉻細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)癌；甲狀腺癌，如但不限于乳頭狀或?yàn)V泡性甲狀腺癌，髓質(zhì)甲狀腺癌和未分化甲狀腺癌；胰腺癌，如但不限于，胰島瘤，促胃液素瘤，胰升糖素瘤，舒血管腸肽瘤，生長(zhǎng)激素抑制素分泌腫瘤，及良性肺瘤或胰島細(xì)胞瘤；垂體癌，如但不限于庫(kù)欣氏病(Cushing，sdisease),泌乳刺激素分泌腫瘤，肢端肥大癥，及尿崩癥；眼癌，如但不限于眼黑素瘤，如虹膜黑素瘤，脈絡(luò)膜骨黑素瘤，及睫狀體黑素瘤，及成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤；陰道癌，如鱗狀上皮細(xì)胞癌，腺癌，及黑素瘤；陰門(mén)癌，如鱗狀上皮細(xì)胞癌，黑素瘤，腺癌，基細(xì)胞癌癌，肉瘤，及帕杰病；子宮頸癌，如但不限于，鱗狀上皮細(xì)胞癌，及腺癌；子宮癌，如但不限于子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤；卵巢癌，如但不限于，卵巢上皮癌，邊界瘤，生殖細(xì)胞腫瘤，及胃腸道間質(zhì)腫瘤；食道癌，如但不限于，鱗狀上皮細(xì)胞癌，腺癌，淋巴組織癌，粘液表皮樣癌，腺鱗狀癌，肉瘤，黑素瘤，質(zhì)漿細(xì)胞瘤，疣狀癌，及燕麥細(xì)胞(小細(xì)胞)癌；胃癌，如但不限于，腺癌，蕈傘型(息肉型)的、潰瘍性的、表面擴(kuò)散的、分布擴(kuò)散的，惡性淋巴瘤，脂肪肉瘤，纖維肉瘤，及癌肉瘤；結(jié)腸癌；直腸癌；肝癌，如但不限于肝細(xì)胞癌和肝母細(xì)胞瘤；膽嚢癌，如腺癌；膽管癌，如但不限于乳頭狀，結(jié)節(jié)狀，及擴(kuò)散狀；肺癌，如非小細(xì)胞肺癌癥，鱗狀上皮細(xì)胞癌(表皮癌)，空腸腺癌，大細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌；睪丸癌，如但不限于生殖細(xì)胞瘤，精原細(xì)胞瘤，間變型，一般型(普通型)，精母細(xì)胞型，非精原細(xì)胞瘤，胚胎癌，畸胎癌，絨毛膜癌(卵黃嚢腫瘤)，前列腺癌，如但不限于，腺癌，平滑肌肉瘤，及橫紋肌肉瘤；penal癌；口腔癌，如但不限于鱗狀上皮細(xì)胞癌；基底癌；唾腺癌，如但不限于腺癌，粘膜表皮癌，及增殖腺癌；咽癌，如但不限于鱗狀上皮細(xì)胞癌癥，及疣狀癌；皮膚癌癥，如但不限于，基底細(xì)胞癌，鱗狀上皮細(xì)胞癌和黑素瘤，表面擴(kuò)散黑素瘤，結(jié)節(jié)狀黑素瘤，斑點(diǎn)惡性黑素瘤，肢端雀斑樣黑素瘤；腎癌，如但不限于腎臟細(xì)胞癌，腺癌，腎上腺樣瘤，纖維肉瘤，移行細(xì)胞癌(腎臟骨盆和/或子宮)；魏氏腫瘤；膀胱癌，如但不限于移行細(xì)胞癌，鱗狀上皮細(xì)胞癌癥，腺癌，癌肉瘤。此外，癌包括軲液肉瘤，骨源性肉瘤，內(nèi)皮瘤，淋巴管內(nèi)皮瘤，間皮瘤，滑膜瘤，成血管細(xì)胞瘤，上皮癌，乳頭狀嚢腺癌，支氣管肺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌和乳頭狀腺癌(對(duì)于這種紊亂，請(qǐng)參見(jiàn)，F(xiàn)ishman等人，1985,Mefifc/"e，2dEd.，J.B.LippincottCo"Philadelphia和Murphy等人,1997,/"/or附MDec/s/orazCow;/efeJ5ooA:o/Cfl"cerD/agwos/&rra^附e賊flm/iecove^y，VikingPenguin,PenguinBooksU.S.A.，Inc.,美囯)。因此，本發(fā)明的方法和組合物也適用于治療或預(yù)防各種癌癥或其他異常性增生疾病，包括(但不限于)下述疾病癌，包括膀胱、乳腺、結(jié)腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、子宮頸、甲狀腺和皮膚；包括鱗狀上皮細(xì)胞癌；淋巴系統(tǒng)的造血細(xì)胞肺瘤，包括白血病，急性淋巴細(xì)胞白血病，急性成淋巴細(xì)胞白血病，B細(xì)胞淋巴瘤，T細(xì)胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤；骨髓系統(tǒng)的造血細(xì)胞肺瘤，包括急性和慢性髓性白血病和前髓細(xì)胞白血??；間葉細(xì)胞樣起源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其他肺瘤，包括黑素瘤，精原細(xì)胞瘤，tetratocarcinoma,神經(jīng)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤；中柩和外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星細(xì)胞瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，及神經(jīng)鞘膜瘤；間葉細(xì)胞樣起源的肺瘤，包括纖維肉瘤，橫紋肌肉瘤，及骨肉瘤；和其他腫瘤，包括黑素瘤，著色性干皮病，keratoactanthoma，精原細(xì)胞瘤，甲狀腺卵泡癌癥和teratocarcinoma?？梢灶A(yù)期到，因細(xì)胞凋亡異常引起的癌癥也可用本發(fā)明的方法和組合物治療。這種癌癥包括但不限于卵泡淋巴瘤，具有p53突變的癌，乳腺、前列腺和卵巢的激素相關(guān)的胂瘤，及癌癥前期損害，如家族性大腸息肉癥，及骨髓增生異常綜合癥。在特定實(shí)施方案中，治療或預(yù)防皮膚、肺、結(jié)腸、乳腺、前列腺、膀胱、腎、胰腺、卵巢或子宮中的惡性或病態(tài)增生變化(如組織轉(zhuǎn)化和發(fā)育異常)，或高增生紊亂。在其他特定實(shí)施方案中，治療或預(yù)防肉瘤、黑素瘤、或白血病。在一些實(shí)施方案中，癌癥是惡性的并過(guò)表達(dá)EphA4。在其他實(shí)施方案中，癌癥是惡化前的癌細(xì)胞并過(guò)表達(dá)EphA4。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療和/或預(yù)防乳腺、結(jié)腸、卵巢、肺、及前列腺癌和黑素瘤，并在下文中以舉例的方式進(jìn)行說(shuō)明，但不起限制作用。5.3丄2.乳腺癌的治療在特定實(shí)施方案中，患乳腺癌的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與有效量的一種或多種用于乳腺癌治療的其他試劑組合給予，這些試劑包括但不限于多柔比星，表柔比星，多柔比星和環(huán)磷酰胺(AC)的組合，環(huán)磷酰胺、多柔比星和5-氟尿嘧啶(CAF)的組合，環(huán)磷酰胺、表柔比星和5-氟尿嘧啶(CEF)、赫賽汀(herceptin)、它莫西芬的組合，它莫西芬和細(xì)胞毒素性化學(xué)治療、紫杉烷類(lèi)(如多西他賽和紫杉醇)的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可與紫杉烷類(lèi)及標(biāo)準(zhǔn)多柔比星和環(huán)磷酰胺組合給予，來(lái)輔助治療淋巴結(jié)陽(yáng)性局部乳腺癌。在特定實(shí)施方案中，患有惡化前導(dǎo)管癌的患者被給予本發(fā)明的EphA4抗體，來(lái)治療紊亂并減少其發(fā)展成為惡性乳腺癌的可能性。5.3丄3.結(jié)腸癌的治療在特定實(shí)施方案中，患有結(jié)腸癌的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一種或多種用于結(jié)腸癌治療的其他試劑組合給予，這些試劑包括但不限于5-FU和亞葉酸的組合，5-FU和左咪唑的組合，依立替康(CPT-11)或依立替康(irinotecan)、5-FU和亞葉酸(IFL)的組合。5.3丄4.前列腺癌的治療在特定實(shí)施方案中，患有前列腺癌的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一秤或多種用于前列腺癌治療的其他試劑組合給予，這些試劑包括但不限于體外放射治療，放射性同位元素(即，I125、鈀、銥)間質(zhì)移植，亮丙瑞林或其他LHRH激動(dòng)劑，非類(lèi)固醇抗雄激素(氟他胺，里奴內(nèi)酰胺，必卡他胺)，類(lèi)固醇抗雄激素(醋酸環(huán)丙氯地酮醋)，亮丙瑞林和氟他胺的組合，雌激素如DES,三對(duì)甲氧苯氯乙烯，乙炔基雌二醇，共輒雌激素U.S.P.，DES二磷酸,放射性同位元素如鍶-89,體外放射治療和鍶-89的組合，二線激素治療劑如氨魯米特，氫化可的松，氟他胺戒斷藥，孕酮及酮康唑，低劑量強(qiáng)的松，或可使受試者在癥狀上有所改善且降低PSA水平的其他化學(xué)治療方案，包括多西他賽，紫杉醇，雌莫司汀/多西他賽，雌莫司汀/依托泊苷(etoposide),雌莫司汀/長(zhǎng)春堿，及雌莫司汀/紫杉醇。在特定實(shí)施方案中，對(duì)患有惡化前進(jìn)行性前列腺上皮內(nèi)胂瘤(PIN)的患者給藥本發(fā)明的EphA4抗體來(lái)治療紊亂并降低發(fā)展成惡性前列腺癌癥的可能性。5.3丄5.黑素瘤的治療在特定實(shí)施方案中，患有黑素瘤的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一種或多種用于黑素瘤癌癥治療的其他試劑組合給予，這些試劑包括但不限于達(dá)卡巴漆(DTIC)，亞硝基脲如雙氯乙基亞硝脲(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)，中度單試劑活性的試劑，包括長(zhǎng)春花生物堿，鉑化合物，及紫杉烷類(lèi)，Dartmouth方案(順鉑，BCNU及DTIC),干擾素a(IFN-A)及白細(xì)胞介素-2(IL-2)。在特定實(shí)施方案中，有效量的一種或多種本發(fā)明的激動(dòng)性單克隆抗體在有或沒(méi)有腫瘤壞死因素-a(TNF-a)存在下，可與高溫隔離肢體灌注化療(ILP)及苯丙酸氮芥(L-PAM)組合給予至患有多重大腦轉(zhuǎn)移瘤、骨轉(zhuǎn)移瘤及脊髓壓迫癥的患者，以減輕癥狀和使放射治療引起的腫瘤縮小。在特定實(shí)施方案中，對(duì)患有惡化前復(fù)合痣的患者給予本發(fā)明的EphA4抗體來(lái)治療紊亂并降低發(fā)展成惡性黑素瘤的可能性。5.3丄6.卵巢癌的治療在特定實(shí)施方案中，患有卵巢癌的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一種或多種用于卵巢癌癥治療的其他試劑組合給予，這些試劑包括但不限于腹膜內(nèi)的放射治療，如p"治療，整個(gè)腹部和骨盆的放射治療，順鉑，紫杉醇或多西他賽(Taxotere)和順柏或卡柏的組合，環(huán)磷酰胺和順賴的組合，環(huán)磷酰胺和卡鉑組合，5-FU和亞葉酸的組合，依托泊苷，脂質(zhì)體多柔比星，吉西他濱(gemcitabine)或拓樸替康(topotecan)?？深A(yù)期的是，有效量的一種或多種本發(fā)明的激動(dòng)性單克隆抗體與紫杉醇組合給予至患有難于用鉑治療疾病的患者。治療患有難治卵巢癌的患者包括向患有難于用鉑治療的疾病的患者給予異環(huán)磷酰胺，在基于順鉑組合的治療方案失敗后用六甲基三聚氰胺(HMM)作為搶救性化學(xué)治療，及向其腫瘤上含有可檢測(cè)水平的細(xì)胞質(zhì)雌激素受體的患者給它莫西芬予。5.3丄7.肺癌的治療在特定實(shí)施方案中，患有小肺細(xì)胞癌癥的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可與有效量的一種或多種用于肺癌癥治療的其他試劑組合給予，該試劑包括但不限于胸部放射治療，順賴，長(zhǎng)春新堿，多柔比星，及依托泊苷，單獨(dú)或組合的；環(huán)磷酰胺，多柔比星，長(zhǎng)春新堿/依托泊苷及順賴(CAV/EP)的組合，用支氣管內(nèi)激光治療、支氣管內(nèi)支架和/或近接治療的局部緩解。在其他特定實(shí)施方案中，患有非小肺細(xì)胞癌癥的患者被給予有效量的一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體及有效量的一種或多種用于肺癌癥治療的其他試劑，其包括但不限于減輕放射治療，順鉑、長(zhǎng)春堿和絲裂審素的組合,順鉑和長(zhǎng)春瑞賓、紫杉醇、多西他賽或吉西他濱的組合，卡鉑和紫杉醇的組合，支氣管內(nèi)病變的間質(zhì)放射治療或立體定向外科治療。5.3.2其他預(yù)防/治療性試劑在一些實(shí)施方案中，通過(guò)給予一種或多種單克隆抗體的治療與一種或多種治療，如但不限于，化學(xué)治療、放射治療、激素治療、和/或生物治療/免疫治療組合使用。預(yù)防/治療性試劑包括但不限于蛋白性分子，包括但不限于肽、多肽、蛋白，包括翻譯后經(jīng)修飾的蛋白，抗體等；或小分子(小于1000道爾頓)，無(wú)機(jī)或有機(jī)化合物；或核酸分子，包括但不限于，雙鏈或單鏈DNA,或雙鏈或單鏈RNA,及三螺旋核酸分子。預(yù)防/治療性試劑可源自于合成分子庫(kù)的任何已知有機(jī)體(包括但不限于，動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌及原生生物，或病毒)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括組合給予本發(fā)明的治療性抗體與一種或多種預(yù)防/治療性試劑，這些試劑是血管生成抑制劑，如但不限于血管抑素(血漿酶原片段)；抗血管增生抗凝血酶III;Angiozyme;ABT-627;Bay12-9566;倍尼芬；Bevacizumab;BMS-275291;源自軟骨的抑制劑(CDI);CAI;CD59補(bǔ)充片段;CEP國(guó)7055;Col3;康布瑞塔卡汀A-4;血管內(nèi)皮抑制素(膠原質(zhì)XVffl片段)；纖維連結(jié)蛋白片段；Gro-(3;自夫酮；肝膿肺；肝磷脂六糖片段；HMV833;人絨毛促性腺激素(hCG);IM-862;干擾素a/卩/Y;干擾素誘導(dǎo)蛋白(IP-10);白細(xì)胞介素-12;Kringle5(血漿酶原片段)；馬立馬司他；金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs);2-甲氧基雌二醇；MM270(CGS27023A);MoAbIMC-lCll;Neovastat;NM-3;Panzem;PI-88;胎盤(pán)核糖核酸酶抑制劑；血漿酶原催化劑抑制劑；血小板因子-4(PF4);Prinomastat;泌乳刺激素16kD片段；多育曲菌素-關(guān)聯(lián)蛋白(PRP);PTK787/ZK222594;類(lèi)維生素A;Solimastat;角鯊胺；SS3304;SU5416;SU6668;SU11248;四氯可的索-S;四巰基鉬酸鹽；薩利多胺；Thrombospondin-l(TSP-l);TOP-470;轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-(3(TGF-P);血管抑制素；血管抑制因子(鈣網(wǎng)蛋白片段)；ZD6126;ZD6474;法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI);和二磷酸鹽?？捎糜诒景l(fā)明各種實(shí)施方案，包括本發(fā)明的藥物組合物、劑型和試劑盒的其他抗癌癥試劑例子，包括但不限于阿西維辛，阿克拉審素，鹽酸阿考達(dá)唑，阿克羅寧，阿多來(lái)新，阿地白介素，六甲蜜胺，二霉素，阿美蒽醌醋酸鹽，氨基導(dǎo)眠能，安吖啶，阿那曲唑，安曲實(shí)素，天冬酰胺酶，曲林菌素，阿扎胞苷，阿扎替派，含氮霉素，巴馬司他，苯佐替派，必卡他胺，鹽酸比生群，二甲磺酸雙奈法德，比折來(lái)新，硫酸博來(lái)霉素，布喹那鈉，溴匹立明，白消安，放線菌素C,卡普睪酮，卡醋胺，卡貝替姆，卡鉑，卡氯芥，鹽酸卡柔比星，卡折來(lái)新，西地芬戈，苯丁酸氮芥，西羅審素，順鉑，克拉屈濱，crisnatolmesylate,環(huán)磷酰胺，阿糖胞苷，達(dá)卡巴。秦，放線菌素D,鹽酸柔紅霉素，decarbazine,地西他濱，右?jiàn)W馬鉑，地扎胍寧，曱磺酸地扎胍寧，地吖醌，多西他賽，多柔比星，鹽酸多柔比星，屈洛昔芬，檸檬酸屈洛昔芬，丙酸屈他雄酮，偶氮審素，依達(dá)曲沙，鹽酸依氟鳥(niǎo)氨酸，依沙蘆星，恩洛鉑，恩普氨酯，依匹哌啶，鹽酸表柔比星，厄布洛唑，鹽酸依索比星，雌莫司汀，磷酸鹽雌莫司汀，依他硝唑，依托泊苷，磷酸依托泊苷，etoprine,鹽酸法倔唑，法扎拉濱，芬維A胺，氟尿苷，蜂酸氟達(dá)拉濱，氟尿嘧啶，氟西他濱，褲喹酮，福司曲星鈉，吉西他濱，鹽酸吉西他濱，羥基脲，鹽酸伊達(dá)比星，異環(huán)磷酰胺，伊莫福新，白細(xì)胞介素2(包括重組白細(xì)胞介素2，或rlL2),干擾素a-2a,干擾素a-2b,干擾素a-nl，干擾素a-n3,干擾素a-Ia,干擾素y-Ib,異丙鉑，鹽酸依立替康，醋酸蘭瑞肽，來(lái)曲唑，醋酸亮丙瑞林，鹽酸利阿唑，洛美曲索鈉，洛莫司汀，鹽酸洛索蒽醌，馬索羅酚，美登素，鹽酸氮芥，醋酸甲地孕酮，醋酸甲蜂雌醇，苯丙酸氮芥，美諾立爾，巰嘌呤，甲氨蝶呤，甲氨蝶呤鈉，metoprine,美妥替派，米丁度胺,mitocarcin，mitocromin,米托潔林，絲裂馬菌素，絲裂審素，米托司培，米托坦，鹽酸米托蒽醌，麥考酚酸，亞硝基脲，諾考達(dá)唑，諾加霉素，奧沙利鉑，奧昔舒侖，紫杉醇，培門(mén)冬酶，佩里霉素，奈莫司汀，疏酸派來(lái)審素，培磷酰胺，哌泊溴烷，哌泊舒凡，鹽酸吡羅蒽醌，普卡審素，普洛美坦，外非姆鈉，紫菜霉素，潑尼莫司汀，鹽酸丙卡巴肼，嘌呤零素，鹽酸嘌呤霉素，吡唑呋喃菌素，利波腺苷，羅谷亞胺，沙芬戈，鹽酸沙芬戈，司莫司汀，辛曲秦，sparfosatesodium,稀疏霧素，鹽酸鍺螺胺，螺莫司汀，螺鉑，鏈黑菌素，鏈佐星，磺氯苯脲，他利霉素，tecogalansodium,替加氟，鹽酸替洛蒽醌，替莫泊芬，替尼泊苷，替羅昔隆，睪內(nèi)酪，thiamiprine,疏鳥(niǎo)嘌呤，塞替派，噻唑呋啉，替拉扎明，檸檬酸托瑞米芬，醋酸曲托龍，磷酸曲西立濱，三甲曲沙，葡糖醛酸三甲曲沙，曲普瑞林，鹽酸妥布氯唑，烏拉莫司汀，烏瑞替派，伐普欣，維替泊芬,疏酸長(zhǎng)春堿，疏酸長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春地辛，疏酸長(zhǎng)春地辛，疏酸長(zhǎng)春匹定，疏酸長(zhǎng)春甘酯，疏酸長(zhǎng)春羅新，酒石酸長(zhǎng)春瑞賓，疏酸長(zhǎng)春羅定，疏酸長(zhǎng)春利定，伏氯唑，折尼鉑，凈司他丁，鹽酸佐柔比星氫氯化物。其他抗癌癥藥物包括但不限于20-epi-l,25二幾基維生素D3,5-乙炔基尿嗜啶，阿比特龍，阿克拉霉素，?；幌?，adecypenol,阿多來(lái)新，阿地白介素，ALL-TK拮抗劑，六甲蜜胺，阿雌莫司汀，amidox,阿米福汀，氨基乙酰丙酸酸，氨柔比星，安吖啶，阿那格雷，阿那曲唑，穿心蓮內(nèi)酯，血管生成抑制劑，拮抗劑D,拮抗劑G,antarelix，抗背部化形態(tài)發(fā)生蛋白-1,抗雄激素，抗雌激素，肺瘤，aphidicolinglycinate，細(xì)胞凋亡基因調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞凋亡調(diào)整器，無(wú)瞟呤核酸，ara-CDP-DL-PTBA,精氨酸脫氨基酶，asulacrine,阿他美坦，阿莫司汀,axinastatin1,axinastatin2,axinastatin3，阿扎司瓊，azatoxin,氮胸腺嘧啶，漿果赤$素III衍生物，balanol,巴馬司他，BCR/ABL拮抗劑，benzochlorins，苯甲?；鵶taurosporine，卩內(nèi)酰胺衍生物,卩-alethine，p-clamycinB,樺木酸，bFGF抑制劑,必卡他胺，比生群，bisazkidinylspermine,雙奈法德，bistmteneA,比折來(lái)新，breflate,溴匹立明，布度鈦，丁基疏堇亞胺，鈣泊三醇，鈣磷酸蛋白C，喜樹(shù)堿衍生物，金絲雀滲IL-2，卡培他濱，甲酰胺-氨基-三氮雜茂，羧酰胺三唑，CaRestM3，CARN700,源自軟骨的抑制劑，卡折來(lái)新，干酪素激酶抑制劑(ICOS),栗樹(shù)精胺，cecropinB,西曲瑞克，氯喹喔啉磺胺藥物，西卡前列素，順式卟淋，克拉屈濱，克羅米芬類(lèi)似物，克審唑，collismycinA，collismycinB，康布瑞塔卡汀A4，康布瑞塔卡汀類(lèi)似物,conagenin，crambescidin816,crisnatol，cryptophycin8,cryptophycinA衍生物,curacinA，環(huán)戊蒽醌,cycloplatam，cypemycin,阿糖胞苷ocfosfate,細(xì)胞因子，cytostatin,達(dá)昔單抗，地西他濱，脫氫膜海鞘素B，地洛瑞林，地塞米松，右異環(huán)磷酰胺，右雷佐生，右維拉帕米，地吖醌，didemninB,didox,二乙基norspermine,二氬-5-氮雜胞，定，二氫紫杉醇,dioxamycin,苯基苯螺莫司汀，多西他賽，二十二烷醇，多拉司瓊，去氧氟尿苷，屈洛昔芬,屈大麻酚，duocarmycinSA，依布硒啉，依考莫司汀,依地福新，依決洛單抗，依氟鳥(niǎo)氨酸，欖香烯，乙嘧替氟，表柔比星，愛(ài)普列特，雌莫司汀類(lèi)似物，雌激素激動(dòng)劑，雌激素拮抗劑，依他硝唑，依托泊苷褲酸鹽，依西美坦，法倔唑，法扎拉濱，芬維A胺，非格司亭，非那雄胺，flavopiridol,氟卓斯汀,fluasterone，氟達(dá)拉濱,鹽酸fluorodaunorunicin,福酚美克,福美斯坦，福司曲星，福莫司汀，德外啉釓，硝酸鎵，加洛他濱，加尼瑞克，白明膠酶抑制劑，吉西他濱，谷胱甘肽抑制劑，hepsulfam，heregulin,環(huán)己雙乙酰胺，金絲桃素，伊班膦酸，伊達(dá)比星，艾多昔芬，伊決孟酮，伊莫福新，伊洛馬司他，咪唑并吖啶酮，咪喹莫特，免疫刺激肽，類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-l受體抑制劑，干擾素激動(dòng)劑，干擾素，白細(xì)胞介素，碘千胍，碘代多柔比星，蕃薯寧,伊羅普拉,伊索拉定,isobengazole，isohomohalicondrinB，伊他司瓊，jasplakinolide，kahalalideF，層狀素-N三醋酸基的，蘭瑞肽，lei醒ycin,來(lái)格司亭，疏酸蘑菇多糖，leptolstatin,來(lái)曲唑，白血病抑制因素，白細(xì)胞a干擾素，亮丙瑞林+雌激素+黃體酮，亮丙瑞林，左咪唑，利阿唑，線性聚胺類(lèi)似物，親脂性二糖肽，親脂性鉑化合物，lissocli誦ide7,洛鉑，板衫l磷脂，洛美曲索，氯尼達(dá)明，洛索蒽醌，洛伐他汀，洛索立賓，勒托替康，德卟啉镥，lysofylline,溶解肽，美坦辛，mannostatinA，馬立馬司他，馬索羅酚，maspin，matrilysin抑制劑，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，美諾立爾，麥爾巴隆，meterelin,methioninase,滅吐靈，MF抑制劑，米非司酮，米替福新，米立司亭，不匹配雙鏈RNA，米托胍腙，二溴衛(wèi)矛醇，絲裂審素類(lèi)似物，米托萘胺，mitotoxin纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子-saporin,米托蒽醌，莫法羅汀，莫拉司亭，單克隆抗體，人絨毛促性腺激素，單磷?；椭珹+乳酸分支桿菌細(xì)胞壁sk,莫哌達(dá)醇，多耐藥性基因抑制劑，多腫瘤抑制劑l基治療，芥子氣抗癌試劑，印度洋海綿B,分枝軒菌細(xì)胞壁提取物，myriaporone,N-乙?；啬橇?，N-替代苯甲脒，那法瑞林，nagrestip，納洛酮+戊唑辛，napavin,naphterpin，那托司亭，奈達(dá)鉑，奈莫柔比星，奈立膦酸，中性肽鏈內(nèi)切酶，里奴內(nèi)酰胺，nisamycin，氮氧化物調(diào)節(jié)劑，硝基氧抗氧化物，nitrullyn，06-千基鳥(niǎo)噪呤,奧曲肽，okicenone,寡核苷酸，奧納司酮，恩丹西酮，恩丹西酮，oracin,口服細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑，奧沙利鉑，奧沙特隆，奧沙利鉑，oxaunomycin,紫杉醇，紫杉醇類(lèi)似物，紫杉醇衍生物，palauamine，palmitoyl利索新，帕米膦酸，人參三醇，帕諾米芬，parabactin，帕折普汀，培門(mén)冬酶，peldesine,戊聚糖聚疏酸鈉，噴司他丁，pentrozole，全氟溴烷，培磷酰胺，芥子醇，phenazinomycin，乙酸苯酯，磷酸酶抑制劑，picibanil,鹽酸匹魯卡品,吡柔比星,吡曲克辛,placetinA，placetinB,血漿酶原活化抑制劑，合成鉑，鉑化合物，合成鉑-三胺，葉非姆鈉，甲基絲裂霉素，強(qiáng)的松，丙烷基二度-吖啶酮，前列腺素J2，蛋白解體抑制劑，蛋白A基免疫調(diào)節(jié)劑，蛋白激酶C抑制劑，蛋白激酶C抑制劑，微藻，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑，噤呤核苷褲酸化酶抑制劑，紅紫素，吡唑并吖啶，pyridoxylated血色素聚氧化乙烯結(jié)合物，mf拮抗劑，雷替曲塞，雷莫司瓊，ras法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑，ras抑制劑，ras-GAP抑制劑，脫甲基的retelliptine,依替膦酸鈉錸Re186,利索新，核酶，RII視黃酰胺，羅谷亞胺，rohitukine，羅莫肽,羅唾美克,rubiginoneBl，ruboxyl，沙芬戈,saintopin,SarCNU,sarcophytolA,sargramostim,Sdil模擬藥，司莫司汀，衰老源自抑制劑1,正義寡核苷酸，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑，單鏈抗原結(jié)合蛋白，西佐喃，索布佐生，硼卡鈉，苯基乙酸鈉，solverol，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素結(jié)合蛋白,索納明，斯帕福斯酸，spi固ycinD,螺莫司汀，splenopentin,天然物質(zhì)海綿素l，角鯊胺，干細(xì)胞抑制劑，干細(xì)胞分離抑制劑，stipiamide，基質(zhì)溶解酶抑制劑，sulf次黃苷，超活性血管活性的腸肽拮抗劑，suradista,蘇拉明，苦馬豆素，合成祐多糖，他莫司汀，它莫西芬甲碘化物，牛磺莫司汀，紫杉醇,tazarotene，tecogalan鈉,替力u氟，tellurapyrylium,端粒酶抑制劑，替莫泊芬，替莫唑胺，替尼泊苷，四氯癸烷氧化物，tetmzomine，thaliblastine，撒利多胺，thiocoraline,疏鳥(niǎo)噪呤，血小板生成素，血小板生成素模擬物，胸腺法新，促胸腺生成素受體激動(dòng)劑，胸腺曲南，甲狀腺刺激性激素，初乙基外啉錫，替拉扎明，二茂鈦二氧化物，topsentin,托瑞米芬,全能干細(xì)胞因素，轉(zhuǎn)換抑制劑，維A酸，三乙?；蜍眨髁I，三曱曲沙，曲普瑞林，托烷司瓊，妥羅雄脲，酪氨酸激酶抑制劑，tyrphostins，UBC抑制劑，烏苯美司，尿生殖竇性的生長(zhǎng)抑制性因子，尿激酶受體拮抗劑，伐普肽,variolinB,載體系統(tǒng),紅血球基因治療，維拉雷瑣，veramine，verdins，維替泊芬，長(zhǎng)春瑞賓，vinxaltine，vitaxin,伏氯唑，扎諾特隆，折尼鉑，亞千維C，及凈司他丁斯酯。優(yōu)選的抗癌癥藥物為5-氟尿嘧啶和亞葉酸。在更特定實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括給予一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體及給予一種或多種治療劑，如但不限于如表l中所述的抗癌試劑，優(yōu)選是治療如前所述的乳腺、卵巢、黑素瘤、前列腺、結(jié)腸和肺癌。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>(Taxotere)紫杉醇(Taxol)靜脈內(nèi)3小時(shí)內(nèi)175mg/m2每3周4次(相繼給予含有阿審素的化學(xué)治"組合)它莫西芬檸檬酸鹽(Nolvadex)口服(片劑)20-40mg大于20mg的劑量應(yīng)分次給予(早上或晚上)每曰亞葉酸鈣，注射靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射怎樣供應(yīng)350mg小瓶劑量不清楚PDR3610luprolide醋酸鹽(Lupron)單次皮下注射lmg(0.2ml或20單位)一天一次氟他胺(Eulexln)口服(膠囊)250mg(每個(gè)膠囊包括125mg氟他胺)一天3次，間隔8小時(shí)(總?cè)談┝?50mg)里奴內(nèi)醜膚(Nilandron)口服(片劑)300mg或150mg(每一片包括50或150mg里奴內(nèi)酰胺)一天一次300mg達(dá)30天，然后一天一次150mg必卡他胺(Casodex)口服(片劑)50mg(每一片包括50mg必卡他胺)一天一次黃體酮注射USP在麻油中，50mg/ml酮康唑(Nizoral)霜?jiǎng)└鶕?jù)不同癥狀日教2%霜?jiǎng)┮淮位蚨螐?qiáng)的松口服(片劑)根據(jù)被治療的特定疾病實(shí)體，每天開(kāi)始劑量為5mg~60mg難莫司汀褲酸鈉(Emcyt)口服(膠囊)14mg/kg體重(對(duì)10kg或22lb體重給予一個(gè)140mg膠囊)每天給予3或4次分劑量依托泊普或VP-I6靜脈內(nèi)5ml&液(20mg/ml)(100mg)達(dá)卡巴嗪(DTIC-Dome)靜脈內(nèi)24.5mg/kg一天一次達(dá)10天。以4周的間隔進(jìn)行重復(fù)帶有卡氯芥移植物(BCNU)(亞硝基脲)的聚苯丙生20(Gliadel)晶片置于切除腔中如果切除腔的大小和形狀允許，那么可以有8個(gè)晶片，每個(gè)含有7.7mg卡氯芥，總共61.6mg順鈾注射怎樣供應(yīng)1mg/ml溶液，在50mL和100mL的多劑量小瓶中絲裂審素注射在5mg和20mg小瓶中供應(yīng)(含有5mg和20mg絲裂審素)吉西他濱HCl(Gemzar)靜脈內(nèi)對(duì)于NSCLC-研究了2個(gè)方案，沒(méi)有找到最佳方案4周方案-靜脈內(nèi)給予1000mg/m2，30分鐘內(nèi)3周方案-靜脈內(nèi)給予Gemzar，1250mg/m2，30分鐘內(nèi)4周方案-每28天周期的第1、8和15天。在灌輸Gemzar后的第l天，靜脈內(nèi)給予順翁100mg/m2。3周方案-每21天周期的第1和8天。在給予Gemzar后的第1天，靜脈內(nèi)給于順粕100mg/m2?？ㄣK(Paraplatin)靜脈內(nèi)卓試劑治療在第l天,360mg/m2l.V.(灌輸持續(xù)15分鐘或更久)其他劑量計(jì)算與環(huán)磷醜胺的組合治療，劑量調(diào)整建議，制劑劑量，等每4周異環(huán)磷酰胺(Ilex)靜脈內(nèi)每天12g/ra2連續(xù)5天，每3周重復(fù)，或從血液毒性恢復(fù)后鹽酸拓樸替康(Hycamtin)靜脈內(nèi)每天靜脈內(nèi)灌輸30分鐘,1.5mg/m2連續(xù)5天，在21天周期的第1天開(kāi)始本發(fā)明還包括給予本發(fā)明的EphA4抗體及放射治療，包括使用x-射線，Y射線和其他破壞癌細(xì)胞的放射源。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該放射治療作為外部放射或遠(yuǎn)距放射治療，其中該放射直接從遠(yuǎn)程源導(dǎo)入。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，該放射治療作為內(nèi)部治療或近接治療，其中放射源被置于體內(nèi)部，接近癌細(xì)胞或胂瘤部分。癌癥治療和其劑量，給予方法和推薦的使用方法在本領(lǐng)域是公知的，且在Physician'sDeskReference中有所描述(第56版，2002)。5.4本發(fā)明抗體的識(shí)別5.4.1激發(fā)性抗體本發(fā)明的抗體優(yōu)選激動(dòng)(即，引發(fā)EphA4磷酸化)并免疫特異性結(jié)合EphA4受體。當(dāng)被激動(dòng)時(shí)，EphA4磷酸化75kDaEphA4關(guān)聯(lián)蛋白，且其本身可被磷酸化，然后分解。本領(lǐng)域公知的分析EphA4或75kDaEphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化、活性、或表達(dá)的任何方法都可用于分析候選的EphA4抗體，來(lái)測(cè)定其激動(dòng)活性(參見(jiàn)，例如，下文的6.2部分)。5.4.2優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位的抗體本發(fā)明的抗體優(yōu)選結(jié)合EphA4抗原決定部位，該抗原結(jié)合部位暴露在癌細(xì)胞(例如，過(guò)表達(dá)EphA4的細(xì)胞和/或帶有不與配體結(jié)合的EphA4的細(xì)胞)而不是非癌細(xì)胞或其中的EphA4與配體結(jié)合的細(xì)胞上。在該實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是不在非癌細(xì)胞上而在癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位的抗體。本領(lǐng)域公知的用于檢測(cè)候選EphA4抗體在細(xì)胞上的結(jié)合/定位的任何方法都可用來(lái)篩選候選的具有理想結(jié)合屬性的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，用免疫熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)抗體的結(jié)合屬性。可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)比較抗體與體外生長(zhǎng)的細(xì)胞的結(jié)合。在特定實(shí)施方案中，將與癌細(xì)胞結(jié)合的抗體與結(jié)合于非癌細(xì)胞的抗體進(jìn)行比較。暴露的EphA4抗原決定部位抗體與非癌細(xì)胞結(jié)合較差，但與癌細(xì)胞結(jié)合較好。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，將與解離的非癌細(xì)胞(例如，用鈣螯合劑(如EGTA)處理)結(jié)合的抗體與結(jié)合于未解離的非癌細(xì)胞的抗體進(jìn)行比較。暴露的EphA4抗原決定部位抗體與未解離的非癌細(xì)胞結(jié)合較差，但與解離的非癌細(xì)胞結(jié)合較好。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體的結(jié)合特性。在該實(shí)施方案，EphA4可與其配體交聯(lián)或不交聯(lián)。暴露的EphA4;^f、決定部位抗體與交聯(lián)的EphA4結(jié)合較差，但與未交聯(lián)的EphA4結(jié)合較好。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用cell-based或免疫測(cè)定法來(lái)檢測(cè)抗體的結(jié)合特征。在該實(shí)施方案中，可用與EphA4配體(例如，EphrinsAl、A2、A3、A4、A5、B2及B3、B61、AL1/RAGS、LERK4、Htk-L及Elk-L3)竟?fàn)幗Y(jié)合EphA4的抗體來(lái)代替EphA4配體。在這種分析中用到的EphA4配體可以是可溶解的蛋白(例如，重組表達(dá)的)或在細(xì)胞上表達(dá)，從而錨定到該細(xì)胞上。5.4.3癌細(xì)胞表型抑制性抗體本發(fā)明的抗體可優(yōu)選抑制(且優(yōu)選是降低)例如軟瓊脂中的癌細(xì)胞克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成并免疫特異性結(jié)合EphA4受體。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以分析候選EphA4抗體抑制這種行為的能力(參見(jiàn)，例如，見(jiàn)下文6.3部分)。懸浮于軟瓊脂的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞形成克隆，而良性腫瘤細(xì)胞則不形成克隆?？梢苑治鲕洯傊械目寺⌒纬桑鏩elinski等人描述的(2001，Owc^及戰(zhàn)61:2301-6,在此引其全部?jī)?nèi)容作為參考)。需要分析其激動(dòng)活性的抗體可以包含在底部和頂部瓊脂溶液中。轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞可以在軟瓊脂中懸浮，并可以生長(zhǎng)。EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體將抑制克隆形成。轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的另一種特異性行為可用來(lái)識(shí)別癌細(xì)胞表型抑制性抗體，這種形為是在三維微環(huán)境中如MATRIGELTM中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成。通常，癌細(xì)胞迅速組裝到管狀網(wǎng)絡(luò)中，然后快速占據(jù)全部MATRIGEL。在存在EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體的情況下，癌細(xì)胞組裝成球狀結(jié)構(gòu)，這與分化的非癌細(xì)胞的行為相似。因此，EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體可通過(guò)其抑制癌細(xì)胞管狀網(wǎng)絡(luò)形成的能力而得到識(shí)別。用于檢測(cè)細(xì)胞增生接觸抑制增大的任何其他方法(例如，在單層細(xì)胞培養(yǎng)中克隆形成的降低)也可用來(lái)識(shí)別癌細(xì)胞表型抑制性抗體。除了抑制癌細(xì)胞克隆形成外，當(dāng)將癌細(xì)胞表型抑制性抗體加到已經(jīng)形成的癌細(xì)胞克隆中時(shí)，通過(guò)殺死細(xì)胞，例如，通過(guò)壞死或細(xì)胞凋亡，還可降低克隆或除去克隆。分析壞死和細(xì)胞凋亡的方法在本領(lǐng)域是公知的。5.4.4低Kpff速率的抗體本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)EphA4或其片段的結(jié)合親合力及單克隆抗體-EphA4相互作用的解離速率可通過(guò)竟?fàn)幮越Y(jié)合分析來(lái)確定。竟?fàn)幮越Y(jié)合分析的一個(gè)例子是放射免疫測(cè)定法，包括用目標(biāo)單克隆抗體孵育標(biāo)記的EphA4(例如，311或1251),同時(shí)提高未標(biāo)記的EphA4的量，并檢測(cè)與標(biāo)記的EphA4結(jié)合的單克隆抗體。單克隆抗體對(duì)EphA4的親和力及結(jié)合解離速率可通過(guò)斯卡查德點(diǎn)分析得到的數(shù)據(jù)來(lái)確定。與第二種單克隆抗體的竟?fàn)幰部梢杂梅派涿庖邷y(cè)定法來(lái)測(cè)定。在這種情況下中，用與標(biāo)記的EphA4(例如，3H或1251)結(jié)合的單克隆抗體賻育EphA4，同時(shí)提高第二種未標(biāo)記的單克隆抗體的量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域公知的任何基于表面電漿共振的分析方法來(lái)分析候選的EphA4抗體，表征EphA4-EphA4抗體相互作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在本發(fā)明中可以使用任何可從商業(yè)上得到的SPR儀器,包括但不限于，BIACORE儀器，從BiacoreAB(Uppsala,Sweden)得到；IAsys儀器，從AffinitySensors(Franklin,MA.)得到；IBIS系統(tǒng)，從WindsorScientificLimited(Berks,UK)得到，SPR-CELLIA系統(tǒng)，從NipponLaserandElectronicsLab(Hokkaido,Japan)得到，及SPRDetectorSpreeta，從TexasInstruments(Dallas,TX)得到。對(duì)于基于SPR的技術(shù)，請(qǐng)參考Mullet等人，2000，MeAo&22:77-91;Dong等人,2002，/"M/.腺ec/.，82:303-23;Fivash等人，1998，Q^m^Cip/m'o"/"歷ofec/"o/og);9:97-101;Rich等人，2000,CM/reWCfp/m'ow/"11:54-61;在此引入這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考。此外，美囯專(zhuān)利6，373，577、6,289,286、5,322,798、5,341,215、6,268,125中所述的用于測(cè)量蛋白-蛋白相互作用的任何SPR儀器和基于SPR的方法都可用在本發(fā)明方法中，在此引用這些專(zhuān)利的全部?jī)?nèi)容作為參考。簡(jiǎn)而言之，基于SPR的分析包括將結(jié)合隊(duì)的一個(gè)組分固定在表面上，并監(jiān)控其在溶液中與該結(jié)合對(duì)的另一組分的相互作用。SPR基于測(cè)量在配合物形成或解離時(shí)表面附近發(fā)生的溶劑的折射率改變。進(jìn)行固定的表面是傳感器芯片，其是SPR技術(shù)的核心所在；其由包被一薄層金的玻璃表面組成，并形成多種特異性表面的基底，該特異性表面設(shè)計(jì)用來(lái)優(yōu)化分子與表面的結(jié)合。各種傳感器芯片可從商業(yè)上得到，具體地是從上文所列出的公司處得到，它們都可用于本發(fā)明的方法。傳感器芯片的例子包括BIAcoreAB,Inc.所提供的傳感器芯片，例如，傳感器芯片CM5、SA、NTA及HPA。本發(fā)明的分子可使用本領(lǐng)域公知的任何固定方法和化學(xué)方法固定到傳感器芯片表面，包括但不限于通過(guò)胺基團(tuán)直接共價(jià)結(jié)合，通過(guò)巰基直接共價(jià)連接，與抗生物素蛋白涂覆表面的生物素粘附，與碳水化合物的乙醛連接及用NTA芯片通過(guò)組氨酸標(biāo)簽粘附。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，BIACORE動(dòng)力學(xué)分析被用于測(cè)定單克隆抗體對(duì)EphA4的結(jié)合或解離速率(參見(jiàn)，例如，下文的6.5部分)。BIACORETM動(dòng)力學(xué)分析包括用固定在芯片表面上的EphA4或其片段分析單克隆抗體與芯片的結(jié)合和解離。一旦收集了一組完整的數(shù)據(jù)，就可以使用供應(yīng)商BIAcore,Inc.(Piscataway，NJ)提供的計(jì)算機(jī)算法生成結(jié)合曲線。這些算法用于計(jì)算和Koff，表觀平衡結(jié)合常數(shù)KD推導(dǎo)為兩個(gè)速率常數(shù)的比(即Ko^K^)。對(duì)各速率常數(shù)的更多詳細(xì)處理公開(kāi)于BIAevaluaionSoftwareHandbook(BIAcore，Inc.,Piscataway,NJ)中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的任何方法對(duì)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)生成的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的各種解釋方法可以參考Myszka,1997,CWrew/一油w/w5/otec/mo/，8:50-7;Fisher等人,1994,CewfO—/ow在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以與一種或多種用于治療、預(yù)防或控制與EphA4過(guò)表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂，高增生紊亂和/或癌癥的其他治療性試劑組合給藥。在某些實(shí)施方案中，一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體與一種或多種用于治療癌癥的其他治療性試劑同時(shí)給予至哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人。術(shù)語(yǔ)"同時(shí)"不限于將預(yù)防或治療性試劑在準(zhǔn)確的相同時(shí)間給予，還指，將本發(fā)明的EphA4抗體和其他試劑按順序在一定時(shí)間間隔內(nèi)給予至受試者，使得本發(fā)明的抗體能夠與其他試劑一起起作用，從而比以其他方式給藥產(chǎn)生更大的優(yōu)點(diǎn)。例如，每種預(yù)防或治療性試劑可以同時(shí)給予，或以任何順序在不同時(shí)間點(diǎn)相繼給予；然而，如果沒(méi)有同時(shí)給予，它們應(yīng)該及時(shí)充分地給予，從而提供所需的治療或預(yù)防效果。每種治療性試劑可以以任何適合的形式并通過(guò)任何適合的方案分別給予。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的EphA4抗體在外科治療之前、過(guò)程中或之后給予。優(yōu)選地，外科治療完全除去局部腫瘤或降低了大胂瘤的尺寸。外科治療也可以作為預(yù)防性措施或用于減輕疼痛。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療和預(yù)防方法包括給予EphA4表達(dá)抑制劑，如但不限于，對(duì)EphA4具特異性的反義核酸，介導(dǎo)RNAi的雙鏈EphA4RNA,抗EphA4核酶等(參見(jiàn)部分5.5或除了EphA4抗體之外的EphA4活性激動(dòng)劑，如小分子EphA4活性抑制劑或激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種本發(fā)明的EphA4激動(dòng)性試劑與一種或多種EphA2激動(dòng)性試劑(參見(jiàn)，美囯申請(qǐng)10/436，783,Kinch等人，2004年5月12日申請(qǐng))組合給予。在各種實(shí)施方案中，預(yù)防或治療性試劑給藥的間隔時(shí)間小于l小時(shí)，為約l小時(shí)，為約1小時(shí)約2小時(shí)，為約2小時(shí)約3小時(shí)，為約3小時(shí)約4小時(shí)，為約4小時(shí)~約5小時(shí)，為約5小時(shí)~約6小時(shí)，為約6小時(shí)~約75.5.1反義本發(fā)明包括反義核酸分子，即與編碼EphA4的有義核酸的全部或部分互補(bǔ)的分子，例如，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)或與mRNA序列互補(bǔ)。因此，反義核酸可與有義核脧?fù)ㄟ^(guò)氫鍵結(jié)合。反義核酸可互補(bǔ)于整個(gè)編碼鏈，或僅與其一部分互補(bǔ)，例如，與蛋白編碼區(qū)域(或開(kāi)放閱讀框)的全部或部分互補(bǔ)。反義核酸分子可以反義于編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的編碼鏈的全部或部分非編碼區(qū)。非編碼區(qū)("5'和3'非翻譯區(qū)")是5'和3'序列，其與編碼區(qū)側(cè)翼連接但不翻譯成氨基酸。反義寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸可以通過(guò)使用本領(lǐng)域公知的工藝通過(guò)化學(xué)合成和酶連反應(yīng)制備。例如，反義核酸(例如，反義寡核苷酸)可使用天然核苷酸或經(jīng)各種修飾的核苷酸來(lái)化學(xué)合成，該修飾的核苷酸設(shè)計(jì)來(lái)增強(qiáng)分子的生物穩(wěn)定性或提高反義和有義核酸之間形成的雙鏈的物理穩(wěn)定性，例如，可使用疏代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸?？捎糜诋a(chǎn)生反義核酸的修飾的核苷酸的例子包括5-氟尿嘧咬，5-溴尿嗜啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙?；肃奏ぃ?-(羧羥基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷，5-羧甲基氨基曱基尿嘧啶，二氟尿嘧啶，卩-D-半乳糖基Q核苷，次黃苷，N6-異戊蜂基腺嘌呤，1-甲基鳥(niǎo)嘌呤，l-甲基次黃苷，2,2-二甲基鳥(niǎo)噪呤，2-甲基腺噪呤，2-曱基鳥(niǎo)噪呤，3-甲基胞核嘧啶，5-甲基胞核嘧咬，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥(niǎo)嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嗜啶，5-甲氧基氨基甲基-2-疏脲嘧p定，卩-D-甘露糖基Q核苷，5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基疏代-N6-異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧化乙酸(v),wybutoxosine,假尿嘧啶，Q核苷，2-疏代胞核嗜啶，5-甲基-2-疏脲嘧啶，2-疏脲嗜啶，4-疏脲嗜啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧化乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧化乙酸(v),5-甲基-2-疏脲嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧咬，(acp3)w，及2,6-二氨基嘌呤。可選擇地，可以使用在反義方向上(即，從插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA相對(duì)于目標(biāo)核酸即EphA4是反義方向的)亞克隆有核酸的表達(dá)載體來(lái)生物制備反義核酸。本發(fā)明的反義核酸分子通常被給予至受試者或在原位產(chǎn)生，從而使它們與編碼本發(fā)明所選多肽的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，從而抑制表達(dá)，例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而抑制表達(dá)。通過(guò)常規(guī)核苷酸互補(bǔ)雜交可以形成穩(wěn)定的雙鏈，或例如反義核酸分子通過(guò)在雙螺旋主溝中的特異性相互作用與DNA雙鏈結(jié)合。給予本發(fā)明反義核酸分子的方案的例子包括在組織位點(diǎn)直接注射?？蛇x擇地，反義核酸分子可修飾成以所選細(xì)胞為靶，然后系統(tǒng)性給藥。例如，為了系統(tǒng)性給藥，可以對(duì)反義分子進(jìn)行修飾，從而使它們特異性結(jié)合所選細(xì)胞表面上的受體或表達(dá)的抗原，例如，將反義核酸分子與與細(xì)胞表面受體或抗原結(jié)合的肽或抗體連接。也可以使用本文所述的載體將反義核酸分子運(yùn)輸至細(xì)胞。為了使反義分子具有足夠的細(xì)胞內(nèi)濃度，其中的反義核酸分子受控于強(qiáng)polII或polIII啟動(dòng)子的載體構(gòu)建體是優(yōu)選的。本發(fā)明的反義核酸分子可以是a-端異構(gòu)性核酸分子。a-端異構(gòu)性核酸分子與互補(bǔ)的RNA形成特異性雙鏈雜交，其中，與常規(guī)P-單元相反，各鏈彼此平行(Gaultier等人，1987,M/c/e/c爿c油i^.15:6625)。反義核酸分子還包括2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，1987,池c/e/cfisM15:6131)或嵌合的RNA-DNA類(lèi)似物(Inoue等人，1987,F五5S丄故.215:327)。5.5.2核酶本發(fā)明還包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能夠裂解其有互補(bǔ)區(qū)域的單鏈核酸，如mRNA。因此，核酶(例如，錘頭狀的核酶；在Haselhoff和Gerlach，1988,iVfl加e334:585-591中有描述)可用于催化性裂解mRNA轉(zhuǎn)錄物，從而抑制該mRNA編碼蛋白的翻譯。基于EphA4的核苷酸序列，可以設(shè)計(jì)對(duì)編碼EphA4的核酸分子具有特異性的核酶。例如，可以構(gòu)造re/ra/^weraL-19IVSRNA的衍生物，其中的活性位點(diǎn)的核苷酸序列與裂解的核苷酸序列互補(bǔ)，這公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利4，987,071和5,116,742中。可選擇地，編碼本發(fā)明多狀的mRNA可用于從RNA分子庫(kù)中選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見(jiàn)，例如，Bartel和Szostak,1993,Sc/ewce261:1411。5.5.3RNA干擾在某些實(shí)施方案中，RNA干擾(RNAi)分子用于降低EphA4表達(dá)。RNA干擾(RNAi)定義為雙鏈RNA(dsRNA)抑制與其自身序列相應(yīng)的基因表達(dá)的能力。RNAi也稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制或PTGS。因?yàn)橹挥型ǔＴ诩?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的RNA分子是單鏈mRNA的分子，所以細(xì)胞含有識(shí)別并將dsRNA切成含有21-25個(gè)堿基對(duì)的片段的酶(約兩圈雙螺旋，并稱(chēng)作小干擾RNA或siRNA)。片段的反義鏈與有義鏈分離的足夠開(kāi)，從而使反義鏈可以與內(nèi)生細(xì)胞mRNA分子上的互補(bǔ)有義序列雜交。該雜交引發(fā)雙鏈區(qū)域中的mRNA切割，從而破壞其翻譯成多肽的能力。通過(guò)引入與特定基因相應(yīng)的dsRNA,從而可以破壞特定組織和/或選定時(shí)間的細(xì)胞本身的基因表達(dá)。雙鏈(ds)RNA可用于干擾哺乳動(dòng)物中的基因表達(dá)(Wianny&Zemicka-Goetz，2000，Ce//祝o/ogy2:70-75;在這里引入其全部?jī)?nèi)容作為參考)。dsRNA用作抑制劑性RNA或EphA4功能性RNAi,以得到與零突變的EphA4相同的表型(Wianny&Zemicka-Goetz,2000，iVa加reCe//5/o/ogy2:70-75)。5.6治療或預(yù)防作用的表征和證實(shí)本發(fā)明的預(yù)防和/或治療方案的毒性和效果可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)室動(dòng)物中測(cè)定，例如，測(cè)定LD5o(50。/o的致死劑量)和ED50(50%的有效治療劑量)。毒性和治療效果的劑量比是治療指數(shù)，可以表達(dá)成LD5()/ED5()。表現(xiàn)出較大治療指數(shù)的預(yù)防和/或治療性試劑是優(yōu)選的。盡管可以使用具有毒性副作用的預(yù)防和/或治療性試劑，但是應(yīng)該小心設(shè)計(jì)輸送系統(tǒng)，以將這種試劑輸送至受影響的組織位點(diǎn)，從而使未受感染的細(xì)胞的可能損害達(dá)到最小化，因而降低副作用。細(xì)胞培養(yǎng)分析和動(dòng)物研究中得到的數(shù)據(jù)可用于配制各種劑量的人用預(yù)防和/或治療性試劑。這種試劑的劑量?jī)?yōu)選是在循環(huán)濃度范圍內(nèi)，具有ED50和較小的或沒(méi)有毒性。根據(jù)所用的劑型和使用的給藥方案，劑量可在此范圍內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明方法中使用的任何試劑，其治療有效量可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)分析進(jìn)行初步估計(jì)。配制劑量以在動(dòng)物模型中達(dá)到循環(huán)血漿濃度，包括細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)的ICso(即，達(dá)到最大癥狀抑制的一半時(shí)的測(cè)試化合物濃度)。這些信息可用于更精確地測(cè)定人的有用劑量。例如使用高效液相色譜可以測(cè)量血漿中的水平。種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)測(cè)定，如其中的小鼠EphA4用人EphA4替換的SCID小鼠模型或轉(zhuǎn)基因小鼠，帶有人異種移植物的棵鼠，動(dòng)物模型，如倉(cāng)鼠，野兔等，這些公開(kāi)在iefevawceo/!Tw附orAfocfe/s/orJ"ft'owcerDragZ)eve/op附e甜(1999，eds.Fiebig和Burger)jCo輸/6wri譜to6>腳/卿(1999,Karger)5T7eM/cfeMo,/w0"co/ogyiese鮮/z(1991，eds.Boven和Winograd);和j"riowcerZ>wgDeve/o;附ew/GWcfe(1997ed.Teicher),在此引入全部?jī)?nèi)容作為參考。5.6.1治療或預(yù)防實(shí)用性的證明本發(fā)明的方案和組合物在使用前優(yōu)選在人體外、然后在人體內(nèi)對(duì)所需的治療或預(yù)防活性進(jìn)行測(cè)試。例如，體外分析可用于檢測(cè)是否給予了特定的治療方案。該分析包括體外細(xì)胞培養(yǎng)分析，其中的患者組織樣品在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，暴露或給予其他方案，并觀察這種方案對(duì)組織樣品的作用，例如，EphA4的磷酸化或分解升高，在軟瓊脂中的生長(zhǎng)和/或克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中管狀網(wǎng)絡(luò)形成受到抑制或降低。接觸細(xì)胞的低水平增生或存活表明，治療性試劑對(duì)于治療患者是有效的?？蛇x擇地，不培養(yǎng)患者細(xì)胞，可以使用腫瘤或惡性細(xì)胞系的細(xì)胞來(lái)篩選治療性試劑和方法。本領(lǐng)域中有多種分析標(biāo)準(zhǔn)可用于分析這種存活和/或生長(zhǎng)；例如，可以通過(guò)測(cè)量311-胸苷的插入、直接細(xì)胞計(jì)數(shù)、檢測(cè)已知基因(如原癌基因(例如，fos,myc))的轉(zhuǎn)錄活性或細(xì)胞循環(huán)標(biāo)記的變化來(lái)分析細(xì)胞增生；可以通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色分析細(xì)胞生存能力，基于形態(tài)變化、EphA4磷酸化或分解的提高、軟瓊脂中的生長(zhǎng)和/或克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成降低等來(lái)可見(jiàn)地分析分化。在人中進(jìn)行測(cè)試之前，治療用的化合物可在適合的動(dòng)物模型系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試，包括但不限于在大鼠、小鼠、小雞、牛、猴子、野兔、倉(cāng)鼠等，例如，上文所述的動(dòng)物模型。然后在適合的臨床試驗(yàn)中使用化合物。此外，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的任何分析都可用來(lái)評(píng)估本文所述的用于治療或預(yù)防癌癥的組合治療的預(yù)防和/或治療實(shí)用性。5.7藥物組合物本發(fā)明的組合物包括藥物組合物制造中用的原料藥組合物(例如，不純的或未消毒的組合物)和可用于制備單位劑型的藥物組合物(即，適于給予受試者或患者的組合物)。這些組合物含有預(yù)防或治療有效量的本文所述的預(yù)防和/或治療性試劑或這些試劑與藥物可接受的載體的混合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物含有預(yù)防或治療有效量的一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體和藥物學(xué)上可接受的載體，或可降低EphA4表達(dá)(例如，反義寡核苷酸)的試劑及藥物學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還還有其他的治療性抗癌試劑。在特定實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"藥物可接受的"是指聯(lián)邦或政府管理機(jī)構(gòu)核準(zhǔn)的或美囯藥典或其他通常認(rèn)可的藥典中所列的適于動(dòng)物，更具體地是人的載體。術(shù)語(yǔ)"載體"是指稀釋劑、佐劑(例如，F(xiàn)reund佐劑(完全和不完全)，更優(yōu)選地，從Chiron，Emeryville,CA得到的MF59C.1佐劑)，賦形劑，或通過(guò)其給予治療劑的載體。這種藥物學(xué)載體可以是消毒的液體，如水和油，包括石油，動(dòng)物，植物或合成的，如花生油，大豆油，礦物油，麻油等。當(dāng)該藥物組合物通過(guò)靜脈內(nèi)給予時(shí)，水是優(yōu)選的載體。生理鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液體載體，尤其是用于注射用溶液。適合的藥物學(xué)賦形劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，凝膠，麥芽，水稻，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鈉，甘油單硬脂酸酯，滑石，氯化鈉，干脫脂奶，甘油，丙蜂，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，該組合物還可以含有少量潤(rùn)濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以是溶液，懸浮液，乳狀液，片劑，丸藥，膠嚢，粉末，緩釋制劑等形式。通常，本發(fā)明組合物的成分可以分別供應(yīng)或混合成單位劑型，例如作為在密封容器中(如表明活性試劑量的安瓿或小袋)的凍干粉末或無(wú)水濃縮物。如果通過(guò)灌輸給予該組合物，那么可以用裝有消毒藥物級(jí)水或生理鹽水的灌輸瓶分散。如果通過(guò)注射給予該組合物，那么可以提供注射用消毒水或生理鹽水安瓿，以在給予之前混合成分。本發(fā)明組合物可配制成中性或鹽形式。藥物學(xué)上可接受的鹽包括用陰離子形成的鹽，如衍生于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些鹽，還包括用陽(yáng)離子形成的鹽，如衍生于鈉、鉀、銨、鲺、氫氧化鐵、異丙基胺、三乙基胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。各種運(yùn)輸系統(tǒng)是公知的，并可用于給予本發(fā)明的激動(dòng)性單克隆抗體或本發(fā)明的激動(dòng)性單克隆抗體與用于預(yù)防或治療癌癥的預(yù)防性或治療性試劑的組合，例如脂質(zhì)體膠嚢，微粒，微膠嚢，能夠表達(dá)抗體或抗體片段的重組細(xì)胞，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(參見(jiàn)，例如，Wu和Wu,1987,J祝o/.0柳.262:4429-4432),作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體等一部分的核酸結(jié)構(gòu)。給予本發(fā)明預(yù)防或治療性試劑的方法包括但不限于，腸胃外給予(例如，皮層內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)和皮下)，腦膜外，及粘膜(例如，鼻內(nèi)，吸入，及口服路線)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的預(yù)防或治療性試劑通過(guò)肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，或皮下給予。預(yù)防或治療性試劑可以通過(guò)任何常規(guī)路線給予，例如通過(guò)灌輸或丸藥注射，通過(guò)上皮或粘膜皮膚襯層吸附(例如，口服粘膜，直腸和腸內(nèi)粘膜等)，也可以與其他生物活性試劑組合給予。給予可以是系統(tǒng)性的或局部的。在特定實(shí)施方案中，可能需要將本發(fā)明的預(yù)防或治療性試劑局部給予至需要治療的區(qū)域；這可以通過(guò)例如但不限于局部灌輸、注射、或通過(guò)移植物來(lái)進(jìn)行，所述移植物可以是帶孔的、非孔的或凝膠狀材料，包括膜，如硅橡膠膜，或過(guò)濾料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)防或治療性試劑可通過(guò)控制釋放或緩釋系統(tǒng)輸送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用泵進(jìn)行控制釋放或緩釋(參見(jiàn)，Langer,見(jiàn)上文；Sefton，1987,OCC欣ie/5/o附^/.￡喂14:20;Buchwald等人，1980,Swr取^88:507;Saudek等人，1989，W五"g/.321:574)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物材料可用于對(duì)本發(fā)明的抗體或其片段進(jìn)行控制釋放或緩釋(參見(jiàn)例如,Afe^/a//J/p//a^/orao/Co"fra/fed7efeose,Langer和Wise(eds.)，CRCPres.,BocaRaton，F(xiàn)lorida(1974);Cow/ro〃edDn/g5/oava//a6///0;,Dn/gDas^wawd尸er/or附awce,Smolen和Ball(eds.),Wiley,NewYork(1984);Ranger和Peppas，1983,/Matcra附o/.Sd.iev.她cra附o/.C7e附.23:61;也參見(jiàn)Levy等人，1985,Sd匿228:190;During等人,1989，爿肌iVewro/.25:351;Howard等人，1989，iVemwwrg.71:105);美囯專(zhuān)利5,679,377;5,916,597;5,912,015;5,989,463;5,128,326;囯際公開(kāi)WO99/15154和WO99/20253。緩釋制劑中所用的聚合物例子包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)，聚(甲基丙烯酸甲基酯)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)，聚乙醇酸(PLG),聚酸酐，聚(N-乙烯吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙烯乙二醇)，聚交酯(PLA),聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA),及聚原酸酯。在優(yōu)選實(shí)施方案中，緩釋制劑中所用的聚合物是惰性的，不含可濾去雜質(zhì)，貯存穩(wěn)定，消毒，及可生物分解的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，控制釋放或緩釋系統(tǒng)置于接近預(yù)防或治療目標(biāo)處，因此僅需要系統(tǒng)性劑量的一部分(參見(jiàn)，例如，Goodson，MedicalApplicationsofControlledRelease,見(jiàn)上文，vol.2，pp.115-138(1984))。控制釋放系統(tǒng)公開(kāi)在Langer(1990,Sde"ce249:1527-1533)的綜述中。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的任何技術(shù)可用于制備包含一種或多種本發(fā)明治療性試劑的緩釋制劑。參見(jiàn)，例如，美囯專(zhuān)利4,526,938;囯際公開(kāi)WO91/05548和WO96/20698;Ning等人，1996，iW/o^ra/_yc&0"co/ogy39:179-189;Song等人,1995，戶A4Jbw簡(jiǎn)/o/泡r,m/ftW5We臟&7k;/wo/ogy50:372-397;Cleek等人，1997，尸m7,Cow&o/.ie/.5/ofld24:853-854;和Lam等人，1997，尸mCow/ro/.ie/.5/oac/.24:759-760,在此引入每一文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考。5.7.1基因治療在特定實(shí)施方案中，給予降低EphA4表達(dá)(例如，EphA4反義核酸或EphA4dsRNA)的核酸通過(guò)基因治療的方式來(lái)治療、預(yù)防或控制癌癥?；蛑委熤竿ㄟ^(guò)給予受試者表達(dá)的或可表達(dá)的核酸來(lái)進(jìn)行的治療。在本發(fā)明的這種實(shí)施方案中，制備反義核酸并用來(lái)介導(dǎo)預(yù)防或治療效果。本領(lǐng)域中基因治療用的任何方法都可用于本發(fā)明中。下面給出示例性方法。對(duì)于基因治療的常用方法，參見(jiàn)Goldspiel等人，1993,C//"/cfl/尸/wwwcy12:488;Wu和Wu,1991,5/oAera/^3:87;Tolstoshev，1993,爿朋.戶/w/waco/.rox/co/.32:573;Mulligan,1993，Sc/e"ce260:926-932;和Morgan和Anderson,1993，X朋.iev.別ocAe附.62:191;May,1993,11:155?？梢允褂玫闹亟MDNA
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法公開(kāi)在Ausubel等人(eds.),CWre"fProtoco/sMo/ecw/ar5油gy,JohnWiley&Sons,NY(1993);禾口Kriegler，7>,，朋d五x戸抓'ow，ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(簡(jiǎn))。在優(yōu)選方面中，本發(fā)明的組合物包括降低EphA4表達(dá)的EphA4核酸，所述核酸是在合適宿主中表達(dá)該核酸的表達(dá)載體的一部分。具體而言，這種核酸具有啟動(dòng)子，優(yōu)選是異源啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的或組成型的，且可選擇地具有組織特異性。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，使用核酸分子，其中降低EphA4表達(dá)的核酸和任何其他所需序列與一區(qū)域側(cè)翼連接，該區(qū)域啟動(dòng)基因組目標(biāo)位點(diǎn)的同源重組，從而使降低EphA4表達(dá)的核酸內(nèi)表達(dá)(Koller和Sm他ies，1989,iWJS86:8932;Zijlstra等人，1989,A^w^342:435)。運(yùn)輸核酸至受試者可以是直接的(其中受試者直接與核酸或承載核酸的載體接觸)或是間接的(其中首先在體外用核酸轉(zhuǎn)錄細(xì)胞，然后移植到受試者中)。這兩種技術(shù)分別稱(chēng)作體內(nèi)或體外基因治療。在特定實(shí)施方案中，在體內(nèi)直接給予核酸序列。這可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)使它們成為合適核酸表達(dá)載體的一部分，并用其給藥，從而將它們置于細(xì)胞內(nèi)，例如，通過(guò)使用缺失性或衰減逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體感染(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,980,286)，或直接注射棵DNA,或通過(guò)使用微粒轟擊(例如，基因槍?zhuān)籅iolistic,Dupont)，或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染試劑包被，通過(guò)脂質(zhì)體嚢，微粒，或微膠嚢，或通過(guò)將它們與已知可進(jìn)入核的肽連接來(lái)給藥，將它們與產(chǎn)生受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體連接來(lái)給藥(參見(jiàn)，例如，Wu和Wu,1987，J歷o/.C/zew.262:4429)(這可用于使特異性表達(dá)受體的細(xì)胞型成為耙)等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以形成核酸-配體配合物，其中配體包括融合病毒肽，以破壞核內(nèi)體，這樣使核酸避免溶酶體分解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)以特異性受體為耙，核酸成為體內(nèi)細(xì)胞特異性吸收和表達(dá)的目標(biāo)(參見(jiàn)，例如，囯際公開(kāi)WO92/06180;WO92/22635;WO92/20316;WO93/14188,WO93/20221)?？蛇x擇地，通過(guò)同源重組，核酸可以導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，并整合到宿主細(xì)胞DNA內(nèi)而表達(dá)(Koller和Sm池ies,1989，iWJS86:8932;和Zijlstra等人，1989,A^we342:435)。在特定實(shí)施方案中，使用含有降低EphA4表達(dá)的核酸序列的病毒載體。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Miller等人，1993，Me/2.五^ywo/.217:581)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有正確包裝病毒基因組并整合到宿主細(xì)胞DNA中所必需的成分。將基因治療中所用的核酸序列克隆到一種或多種載體中，這有利于將該核酸運(yùn)輸?shù)绞茉囌咧?。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的更詳細(xì)說(shuō)明公開(kāi)于Boesen等人，1994,5/oAera砂6:291-302,其中公開(kāi)了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體運(yùn)輸mdrl基因至造血干細(xì)胞，從而該干細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療更有抗性。其他闡明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中的用途的文獻(xiàn)是Clowes等人，1994,Ja/w,/"組93:644-651;Klein等人，1994，祝ood83:1467-1473;Salmons和Gunzberg,1993,i7w附朋Ge"e77^卿4:129-141;和Grossman和Wilson，1993，0#r.C^/w./"Gew"/aDeve/.3:110-114。腺病毒是可在基因治療中使用的其他病毒載體。對(duì)于將基因運(yùn)輸?shù)胶粑掀ぜ?xì)胞而言，腺病毒是特別有吸引力的載體。腺病毒會(huì)自然地感染上皮細(xì)胞，從而引起輕度疾病。腺病毒的優(yōu)點(diǎn)是能夠感染非分裂細(xì)胞。Kozarsky和Wilson,1993，Cwre"fOp/"/o"/"Deve/opweW3:499，給出了腺病毒基基因治療論述。Bout等人，1994,//Mm朋Ge恥rAeraw5:3-10,證實(shí)了使用腺病毒載體可以將基因轉(zhuǎn)化到獼猴的呼吸上皮細(xì)胞。在基因治療中使用腺病毒的其他例子公開(kāi)于Rosenfeld等人，1991252:431;Rosenfeld等人，1992，Ce〃68:143;Mastrangeli等人，1993,/C//"./"ve咸91:225;國(guó)際公開(kāi)WO94/12649;和Wang等人，1995，Ge"e77^ra/^2:775。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用腺病毒載體。腺相關(guān)病毒(AAV)已被建議用于基因治療中(Walsh等人，1993Soc.五早5/o/.Md204:289-300;和美國(guó)專(zhuān)利5,436,146)。另一種基因治療技術(shù)包括將基因轉(zhuǎn)化到組織培養(yǎng)中的細(xì)胞中，例如通過(guò)電穿孔，脂質(zhì)感染，磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或病毒傳染轉(zhuǎn)化。通常，轉(zhuǎn)化方法包括將可選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中。然后將這些細(xì)胞置于篩選條件下，以分離吸收并正在表達(dá)轉(zhuǎn)化基因的那些細(xì)胞。然后，將那些細(xì)胞運(yùn)輸?shù)绞茉囌咧?。在此?shí)施方案中，在用得到的重組細(xì)胞體內(nèi)給藥之前，將核酸導(dǎo)入到細(xì)胞中。這種導(dǎo)入可通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法進(jìn)行，包括但不限于轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，用含有核酸序列的病毒或抗菌素載體傳染，細(xì)胞融合，染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，原生質(zhì)球融合等。在本領(lǐng)域中將外源基因?qū)氲郊?xì)胞中的許多技術(shù)是公知的(參見(jiàn)，例如，Loeffler和Behr,1993，Me仇五^ywo/.217:599;Cohen等人，1993,Me仇五"矽附o/.217:618),并可用于本發(fā)明中，只要受體細(xì)胞必需的發(fā)展和生理功能未被破壞。這種技術(shù)應(yīng)該將核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到所述細(xì)胞中，從而使該核酸在細(xì)胞中表達(dá)，并優(yōu)選在其細(xì)胞后代中可遺傳和可表達(dá)。得到的重組細(xì)胞通過(guò)本領(lǐng)域公知的各種方法運(yùn)輸?shù)绞茉囌?。預(yù)期的細(xì)胞用量取決于所需的效果，患者狀態(tài)等，并可由本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員測(cè)定。5.7.2制劑本發(fā)明所用的藥物組合物可以使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體或賦形劑以常規(guī)方式配制。因此，本發(fā)明的EphA4激發(fā)性抗體或其他抗EphA4試劑(例如，反義和其他核酸)及其生理學(xué)上可接受的鹽和溶劑化物可配制成通過(guò)吸入或吹入(通過(guò)口腔或鼻子)、或口服、腸胃外或粘膜(如口腔，陰道，直腸，舌下)給藥。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用局部或系統(tǒng)性腸胃外給藥。對(duì)于口服給藥而言，上述藥物組合物例如可以通過(guò)用常規(guī)方式與藥物學(xué)上可接受的賦形劑一起制成片劑或膠嚢，該賦形劑如結(jié)合劑(例如，預(yù)凝固的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖，微晶纖維素或磷酸氬鉤)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石或氧化硅)；崩解劑(例如，土豆淀粉或淀粉乙醇酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如，月桂基琉酸鈉)。可以用本領(lǐng)域公知的方法包被片劑。口服給藥用的液體制劑可以是例如溶液，糖漿或懸浮液，或它們以干產(chǎn)物的形式存在以在使用之前與水或其他適合載體組合。這種液體制劑可以通過(guò)用常規(guī)方法用藥物學(xué)上可接受的添加劑制備，該添加劑如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿，纖維素衍生物或氬化食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹(shù)膠)；非水性載體(例如，杏仁油，油狀酯，乙醇或分鎦的植物油)；和防腐劑(例如，甲基或丙基-p-幾基苯甲酸酯或山梨酸)。在需時(shí)，該制劑也可以含有緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑?？诜o藥用的上述制劑可以配制成使活性化合物可控制地釋放。對(duì)于口腔給藥，上述組合物可以以常規(guī)方式配制成片劑或止咳糖的形式。對(duì)于吸入給藥，本發(fā)明所用的預(yù)防或治療性試劑方便地從壓縮包或噴霧器中以氣霧噴劑形式輸送，該輸送需要使用適合的推進(jìn)劑，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他適合氣體。對(duì)于壓縮的氣霧劑，可以使用閥來(lái)測(cè)定劑量單位以實(shí)現(xiàn)定量輸送。吸入器或吹入器中所用的凝膠膠嚢和藥管可配制成含有化合物和合適粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物?？梢詫㈩A(yù)防或治療性試劑配制成通過(guò)注射進(jìn)行腸胃外給藥，例如，通過(guò)丸藥注射或連續(xù)灌輸給藥。注射用制劑可以是單位劑型，例如，在安瓿中或在多次劑量容器中的單位劑型，其中加入了防腐劑。該組合物在油性或水性載體中可以呈現(xiàn)出懸浮液、溶液或乳狀液形式，并可以含有配方試劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x擇地，所述的活性成分可以在使用前與適合載體例如消毒的無(wú)熱原水配制成粉末形式。預(yù)防或治療性試劑也可以配制成直腸組合物，如栓劑或灌腸劑，例如，含有常規(guī)檢劑基質(zhì)，如可可油或其他甘油酯的栓劑或灌腸劑。除了上述制劑外，上述預(yù)防或治療性試劑也可以配制成貯存制劑。這種長(zhǎng)時(shí)間作用制劑可通過(guò)植入(例如皮下或肌肉內(nèi))來(lái)給予或通過(guò)肌肉內(nèi)注射給予。因此，例如，該預(yù)防或治療性試劑可用合適的聚合或疏水材料配制(例如在可接受油中作為乳狀液)或用離子交換樹(shù)脂配制，或配制成少量溶解的衍生物，例如，微溶的鹽。本發(fā)明也提供包裝在密封容器中(如表明活性試劑量的安瓿或小袋)的預(yù)防或治療性試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該預(yù)防或治療性試劑可作為密封容器中的干消毒凍干粉末或無(wú)水濃縮物提供，并可例如用水或生理鹽水重建成適合濃度，以給予受試者。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，各種化學(xué)治療、生物治療/免疫治療和激素治療性試劑的配制和給予是本領(lǐng)域公知的，通常公開(kāi)在尸/!"/d朋'sZ)eAie/e^"ce,第56版(2002)中。例如，在本發(fā)明的某些特定實(shí)施方案中，配制本發(fā)明的治療性試劑，并以表l形式供應(yīng)。在本發(fā)明其他實(shí)施方案中，可以以膠嚢中的液體或飲品形式口服給予放射治療性試劑，如放射性同位素。放射性同位素也可配置成靜脈內(nèi)注射。腫瘤學(xué)家可以測(cè)定優(yōu)選的制劑和給藥路徑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的激動(dòng)性單克隆抗體以lmg/ml、5mg/ml、10mg/ml及25mg/ml配制，以進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，和以5mg/ml、10mg/ml及80mg/ml配制，以進(jìn)行重復(fù)皮下給予和肌肉內(nèi)注射。如果需要，可以將上述組合物置于包裝或分配裝置中，其可包括一種或多種含有活性成分的單無(wú)劑型。這種包裝例如包括金屬或塑料箔，如泡罩包裝。該包裝或分配裝置可以附有給藥說(shuō)明書(shū)。5.7.3歷可有效治療、預(yù)防或控制癌癥的本發(fā)明的組合物的量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)來(lái)確定。例如，可有效治療、預(yù)防或控制癌癥的組合物的劑量可通過(guò)將該組合物給予動(dòng)物模型來(lái)確定，例如，用本文所述或本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的動(dòng)物模型。此外，任選地可以使用體外分析方法來(lái)幫助確定最佳的劑量范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于幾種因素的考慮，來(lái)確定優(yōu)選有效劑量(例如通過(guò)臨床試驗(yàn))。這些因素包括待治療或預(yù)防的疾病、癥狀、患者體重、患者免疫狀態(tài)和本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的影響給予的藥物組合物的精確度的其他因彔。使用的精確劑量也取決于給藥途徑及癌癥的嚴(yán)重度，并根據(jù)每個(gè)醫(yī)生的判斷和患者情況來(lái)決定?？梢愿鶕?jù)體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線外推出有效劑量。對(duì)于抗體，給予患者的劑量通常為O.lmg/kg~100mg/kg患者體重。優(yōu)選地,給予患者的劑量為0.1mg/kg20mg/kg患者體重，更優(yōu)選為1mg/kg~10mg/kg患者體重。通常，人和人源化抗體在人體中比從其他物種得到的抗體有更長(zhǎng)的半衰期，這是由于對(duì)外源多肽有免疫反應(yīng)。因此，通常可以給予較少劑量的人抗體和給予次數(shù)減少。對(duì)于給予患者的其他癌癥治療性試劑而言，本領(lǐng)域公知的各種癌癥治療的通常劑量列于表l中。在本發(fā)明中，某些優(yōu)選實(shí)施方案包括在組合治療中給予的劑量比單一試劑給予的劑量低。本發(fā)明提供了用已知預(yù)防或治療性試劑給藥的任何方法，其給予計(jì)量比以前認(rèn)為的預(yù)防、治療、控制或改善癌癥有效劑量務(wù)f氐。優(yōu)選地，將較低劑量的公知抗癌癥治療劑與較低劑量的本發(fā)明的激動(dòng)性單克隆抗體組合給藥。5.8試劑盒本發(fā)明提供藥物包或試劑盒，其包括填充有本發(fā)明的單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)容器。此外，一種或多種用于治療癌癥的其他預(yù)防或治療性試劑也可以包含在這種藥物包或試劑盒中。本發(fā)明還提供一種藥物包或試劑盒，其包括填充有一種或多種本發(fā)明藥物組合物的一個(gè)或多個(gè)容器。任選地，這種容器含有一個(gè)通知，其以政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式規(guī)定藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用或銷(xiāo)售，這種通知反應(yīng)了允許制造、使用或銷(xiāo)售以用于人給藥。本發(fā)明提供可在上述方法中使用的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒含有一種或多種本發(fā)明的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒還含有在一個(gè)或多個(gè)容器中的一種或多種用于治療癌癥的其他預(yù)防或治療性試劑。在某些實(shí)施方案中，其他預(yù)防或治療性試劑是化學(xué)治療的。在其他實(shí)施方案中，預(yù)防或治療性試劑是生物治療或激素治療的。6.實(shí)施例6.1EphA4抗體引起細(xì)胞行為的變化細(xì)胞粘附和細(xì)胞圓形化分析為了檢測(cè)細(xì)胞圓形化，將胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)spcl細(xì)胞置于已用細(xì)胞外膜(ECM)蛋白包被的6-孔板上，或置于ECM蛋白包被的24-孔板蓋片上。進(jìn)行細(xì)胞粘附48小時(shí)，用含有EphA4scFv抗體的培養(yǎng)基在37。C下孵育。作為對(duì)照，將上述置于板上并軲附的細(xì)胞用EphA4scFv抗體在0°C而不是在37°C下孵育。孵育后，洗滌EphA4-scFv孵育的細(xì)胞，并用抗Flag抗體處理，以交聯(lián)EphA4結(jié)合的scFv。洗滌板子或蓋片，固定，染色，用顯微鏡觀察。相對(duì)于用EphA4抗體在0°C下(即細(xì)胞形狀不改變的溫度)終育的細(xì)胞而言，用EphA4抗體在37°C下稃育的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞圓形化(圖1A,B)。這進(jìn)一步表明，抗EphA4抗體使對(duì)ECM基質(zhì)的粘附下降。ECM-細(xì)胞粘附出現(xiàn)明顯的下降，因?yàn)檫@些類(lèi)型的粘附使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的位點(diǎn)，該信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、遷牙多禾口侵入(Burridge牙口Chrzanowska-"Wodnicka，X/wm.iev.Ce//Z)ev.5/o/.，12:463,1996;Parsons,Cwr.Qp/".Ce//5/o/.,8:146,1996)。細(xì)胞粘附和細(xì)胞圓形化分析也可以按Miao等人(AtowreCe/Z別o/.2:62,2000)的方法進(jìn)行，在此引入其全部?jī)?nèi)容作為參考。為研究細(xì)胞粘附，簡(jiǎn)單來(lái)講，將三等份細(xì)胞置于已用各種ECM蛋白或聚-L-賴氨酸包被的96-孔板上。在存在或不存在EphA4抗體(或其他EphA4激動(dòng)劑)的情況下，以每孔lxl()S個(gè)細(xì)胞的密度放置細(xì)胞，并在37。C下粘附30分鐘。從孔中洗掉非轱附細(xì)胞，固定粘附細(xì)胞，染色，并通過(guò)酶聯(lián)免疫免疫吸附分析(ELISA)讀數(shù)器來(lái)定量測(cè)量吸附。相對(duì)于在沒(méi)有EphA4抗體的情況下發(fā)生祐附的對(duì)照細(xì)胞而言，用EphA4抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理表現(xiàn)出對(duì)ECM蛋白-處理孔的粘附下降。為了進(jìn)行細(xì)胞圓形化分析，簡(jiǎn)單來(lái)講，將細(xì)胞置于ECM蛋白包被的6-孔板上，或ECM蛋白包被的24-孔板蓋片中。粘附細(xì)胞48小時(shí)，用含有或不含有EphA4抗體(或其他EphA4激動(dòng)劑)的培養(yǎng)基孵育10分鐘。洗滌板子或蓋片，固定，染色，用顯微鏡觀察。相對(duì)于用不含EphA4抗體的培養(yǎng)基處理的細(xì)胞而言，用EphA4抗體處理的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞圓形化，這表明對(duì)ECM基質(zhì)的祐附下降。6.2制備單克隆抗體免疫和融合使用融合蛋白EphA4-Fc制備EphA4細(xì)胞外區(qū)域的單克隆抗。這種融合蛋白由與人免疫球蛋白連接的人EphA4的細(xì)胞外區(qū)域組成，從而促進(jìn)融合蛋白的分泌。在左跖骨區(qū)域，在第0天和第7天，用溶于TiterMax輔劑的5嗎EphA4融合蛋白(總體積100pl)注射小鼠(Balb/c小鼠或SJL小鼠)。在左跖骨區(qū)域，在第12天和第14天，用溶于PBS的10嗎EphA4融合蛋白(總體積100叫注射小鼠。在第15天，從腿和腹股溝取下腿彎部和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞，并與P3XBcl-2-13細(xì)胞進(jìn)行融合(使用PEG)。從免疫的SJL小鼠的融合淋巴結(jié)分離雜交瘤產(chǎn)生的EphA4抗體。篩選抗體使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，ELISA免疫測(cè)定)，篩選母培養(yǎng)雜交瘤上清液的EphA4免疫反應(yīng)性。進(jìn)一步篩選上清液抑制EphA4單克隆抗體與EphA4結(jié)合的能力。簡(jiǎn)言之，在未標(biāo)記的EphA4抗體或其他未標(biāo)記的EphA4結(jié)合蛋白存在的條件下，通過(guò)竟?fàn)幮訣LISA分析標(biāo)記的EphA4抗體結(jié)合EphA4融合蛋白的能力。隨著加入的未標(biāo)記抗體或結(jié)合蛋白的濃度提高，結(jié)合EphA4-Fc的標(biāo)記EA4的量降低。6.3EphA4抗體的用途6.3.1EphA4磷酸化EphA4抗體促進(jìn)ASPCl細(xì)胞中的酪氨酸磷酸化。對(duì)照和在抗EphA4單克隆抗體(NED154-567)存在條件下的細(xì)胞在37。C下孵育細(xì)胞15分鐘。然后用EphrinA4-Fc(R&DSystems;Minneapolis,畫(huà))免疫沉淀細(xì)胞裂解物，用SDS-PAGE溶解，用抗磷化酪氨酸抗體4G10(UpstateBiotechnology;LakePlacidNY)和PY20(BDTransductionLaboratories;FranklinLakes,NJ)的混合液進(jìn)行Western印跡分析。用EphA4抗體處理后，發(fā)現(xiàn)EphA4磷酸化增大，這表明EphA4抗體激發(fā)EphA4，并可能促進(jìn)EphA4自磷酸化。EphA4scFv抗體克隆EA44強(qiáng)烈促進(jìn)EphA4的酪氨酸磷酸化(圖6)。表達(dá)抗EphA4scFvEA44的細(xì)胞根據(jù)囯際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約在2004年6月1日保藏在美囯類(lèi)型培養(yǎng)物中心(P.O.Box1549,Manassas,VA20108),并取得保藏號(hào)。EA44的VH和VLCDR氨基酸序列分別包含在SEQIDNO:22、24、26、28、30及32中(圖7)。用所迷的抗EphA4scFv(5pg/ml)在水上稃育Aspcl胰腺癌細(xì)胞。30分鐘后，除去培養(yǎng)基,用水冷的PBS洗滌細(xì)胞，將含有IOpg/ml對(duì)flag抗原決定部位M2有特異性的抗體的培養(yǎng)基置于細(xì)胞上。此時(shí)，用10|ig/mlmAb9(—種誘導(dǎo)EphA4酪氨酸磷酸化的已知抗體)處理對(duì)照樣品。用scFv克隆8、18、20、36、41或44,或mAb9在37。C下孵育細(xì)胞15分鐘，用冰冷的PBS洗滌，然后在含有1%TritonX-100的Tris-緩沖生理鹽水中裂解。用EphrinA4-Fc(4嗎；R&D系統(tǒng))從細(xì)胞裂解物中免疫沉淀出EphA4，用SDS-PAGE溶解，再轉(zhuǎn)移至硝基纖維素中。用抗pTyr抗體、4G10和PY20進(jìn)行Western印跡分析，來(lái)分析EphA4酪氨酸磷酸化的狀態(tài)。如圖6所示，scFv克隆44強(qiáng)烈促進(jìn)EphA4磷酸化。EphA4抗體也促進(jìn)EphA4關(guān)聯(lián)蛋白的酪氨酸磷酸化。用LX13scFv抗體孵育細(xì)胞，洗滌，然后用抗Flag抗體孵育以在細(xì)胞表面上交聯(lián)scFv。用EphrinA4-Fc免疫沉淀出EphA4，用抗磷酸酪氨酸抗體進(jìn)行Western印跡分析。如圖2所示，相對(duì)于細(xì)胞中約75kDa的EphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化而言(其中EphA4未交聯(lián)("對(duì)照"泳道))，交聯(lián)EphA4("X-連接的EphA4"泳道)使約75kDa的EphA4關(guān)聯(lián)蛋白的酪氨酸磷酸化提高。6.3.2.EphA4分解還可以分析抗體介導(dǎo)的EphA4分解。在EphA4抗體(IOpg/ml)存在下，在37。C下孵育單層EphA4陽(yáng)性細(xì)胞(如胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC1或MiaPaca2)。在加入抗體后，在下面的時(shí)間點(diǎn)在含有1%TritonX-100(Sigma,St.Louis，MO)的Tris-緩沖生理鹽水中裂解細(xì)胞0、0.5、1、2、4、8及24小時(shí)。在測(cè)量蛋白濃度(BioRad，Hercules,CA)后，用SDS-PAGE溶解等量總蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝基纖維素(Protran,Schleicher和Schuell，Keene,NH)。使用商業(yè)上可得到的EphA4/Sek單克隆抗體(BDBiosciences,SanJose，CA)通過(guò)Western印跡分析觀察EphA4水平。然后剝離膜，舟paxillin特異性抗體檢測(cè)(cloneSHI1;UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY)，以確保兩個(gè)樣品含有等量的總蛋白。6.3.3.在軟瓊脂中生長(zhǎng)分析本發(fā)明的抗體抑制軟瓊脂中癌細(xì)胞形成的能力(這種分析可按下述進(jìn)行，例如，Zelinski等人,2001，CancerRes.61:2301,I在此引入其全部?jī)?nèi)容作為參考)。簡(jiǎn)言之,在抗EphA4LX13scFv抗體(LX13)或?qū)φ杖芤?PBS)存在下，使細(xì)胞在37。C下在軟瓊脂中懸浮7天。用LX13或PBS孵育后，洗滌細(xì)胞，用抗LX13二級(jí)單克隆抗體(二級(jí)mab)或PBS孵育。用顯微鏡將克隆形成分等級(jí)。含有至少三個(gè)細(xì)胞的簇定為陽(yáng)性。如圖3所示，用LX13和二級(jí)mab("LX13bival")孵育的細(xì)胞含有聚集的EphA4，這表明，相對(duì)于用PBS然后用二級(jí)mab孵育的細(xì)胞("對(duì)照")或用LX13然后PBS("LX13")處理的細(xì)胞而言，軟瓊脂中的生長(zhǎng)明顯得到抑制。分析本發(fā)明抗體除去軟瓊脂中形成的癌細(xì)胞克隆的能力。分析方法與上述相似，除了在軟瓊脂生長(zhǎng)的第3天之后，才將抗體加到癌細(xì)胞中。6.3.4.在乳腺癌細(xì)胞中的雌激素依賴性轉(zhuǎn)化雌激素敏感性乳腺癌細(xì)胞，即MCF-7細(xì)胞，并穩(wěn)定地過(guò)表達(dá)人EphA4(MCF-7EPhA4)。Western印跡分析證實(shí)，相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照(數(shù)據(jù)未列出)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的EphA4異常過(guò)表達(dá)。挑選兩種EphA4過(guò)表達(dá)克隆，即EphA4-2和EphA4-3,用于進(jìn)一步研究。EphA4過(guò)表達(dá)會(huì)提高惡性生長(zhǎng)，并降低雌激素的作用。在有或沒(méi)有雌激素存在下，分析EphA4-2和EphA4-3克隆和單獨(dú)的載體對(duì)照在軟瓊脂中的克隆形成。在雌激素存在下，EphA4-2和EphA4-3細(xì)胞證實(shí)了相對(duì)于對(duì)應(yīng)的對(duì)照而言,在軟瓊脂中的克隆形成提高了兩倍(圖4,"+雌激素")。EphA4-2和EphA4-3細(xì)胞形成平均4.6個(gè)克隆/區(qū)域(圖4,"+雌激素"，"EphA4-2"和"EphA4-3"豎條)，而用空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞形成小于2個(gè)克隆/區(qū)域(圖4，"+雌激素"，"載體"豎條)。在沒(méi)有外源雌激素下進(jìn)行平行研究(圖4，"-雌激素"豎條)。雌激素的實(shí)驗(yàn)偏差放大了對(duì)照和EphA4-2、EphA4-3細(xì)胞之間的細(xì)胞行為差異。盡管MCF-7對(duì)照細(xì)胞很大程度上不能在軟瓊脂上形成克隆(圖4,"-雌激素"區(qū)域中的"載體"豎條，<1克隆/區(qū)域)，但是EphA4-2和EphA4-3細(xì)胞形成了更多個(gè)克隆(3.4個(gè)克隆/區(qū)域；固4，"-雌激素"豎條)。盡管EphA4-2和EphA4-3細(xì)胞在軟瓊脂上比對(duì)應(yīng)的對(duì)照能更有效地形成克隆，但是這些細(xì)胞在沒(méi)有外源雌激素下生長(zhǎng)的更好(圖4,"-雌激素"豎條)。因此，EphA4過(guò)表達(dá)降低了對(duì)外源雌激素的需求。6.3.5.MATRIGEL中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成三維微環(huán)境如MATRIGEI/M中的胂瘤細(xì)胞行為，可用于可靠地預(yù)測(cè)乳腺上皮細(xì)胞的分化狀態(tài)和侵略性。在EphA4抗體(IOpg/ml)或?qū)φ杖芤?PBS)的存在下，在MATRIGEL上孵育良性(MCF-10A)或惡性(MDA-MB-231)乳腺上皮細(xì)胞的單層培養(yǎng)物。按Zelinski等人(2001,61:2301-6)所迷分析MATRIGEL上的細(xì)胞行為。簡(jiǎn)言之，在加入已在水上用EphA4抗體或?qū)φ杖芤?PBS)稃育1小時(shí)的lx105MDA-MB-231或MCF-10A細(xì)胞之前，在37。C下用MATRIGEL(CollaborativeBiomedicalProducts,Bedford,MA)包被組織培養(yǎng)皿。在37°C下在MATRIGEL上解育細(xì)胞24小時(shí),使用OlympusIX-70倒立顯微鏡分析細(xì)胞行為。所有圖像記錄在35mm膠巻上(T-Max-400.Kodak,Rochester,NY)。6.3.6.體內(nèi)生長(zhǎng)分析本發(fā)明的抗體抑制體內(nèi)胂瘤癌生長(zhǎng)的能力。簡(jiǎn)言之，將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞皮下移植進(jìn)無(wú)胸腺小鼠中。在腫瘤已生長(zhǎng)到平均體積為100mm3后，向小鼠腹膜內(nèi)給予6mg/mlEphA4抗體或PBS對(duì)照，一周兩次持續(xù)3周。檢測(cè)胂瘤生長(zhǎng)，并表達(dá)為肺瘤體積除以原始腫瘤體積(IOOmm"的比值。使腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，直到腫瘤體積到達(dá)1000mm3。通過(guò)計(jì)算每天處理后存活小鼠的百分比測(cè)定小鼠的存活率。由于受體酪氨酸激酶通常調(diào)節(jié)肺瘤中的異常細(xì)胞行為，因此EphA4可以為胰腺癌基于抗體的治療提供可能的治療乾。另一個(gè)Eph受體家族成員(EphA2)的抗體介導(dǎo)的聚集降低了癌細(xì)胞的惡性潛能(Kinch和Carles-Kinch,C7/"/cfl/flro/jEJc;en'mewto/Meto5fa^，20:59，2003)。為測(cè)試是否EphA4耙也會(huì)有相似的結(jié)果，測(cè)試幾個(gè)結(jié)合人EphA4的scFv片段。使用二級(jí)抗體交聯(lián)EphA4特異性scFv來(lái)介導(dǎo)EphA4的聚集。胰腺癌細(xì)胞系(ASPC1)的EphA4抗體處理產(chǎn)生多種生物和生物化學(xué)結(jié)果。首先，細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附降低(圖1),這有意義的，因?yàn)檫@些粘附是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的位點(diǎn)，該信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、遷移和侵入(Burridge和Chrzanowska-Wodnicka,X朋w.Ce〃Dev.歷o/.,12:463，1996;Parsons,Cwr.C(p/".Ce//5/o/.，8:146,1996)。其次，如同使用軟瓊脂克隆分析的測(cè)定結(jié)果，EphA4抗體介導(dǎo)的聚集抑制錨定依賴性ASPC1細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖3)。第三，EphA4活化使EphA4和EphA4相關(guān)75kDa蛋白酪氨酸磷酸化。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，EphA4抗體介導(dǎo)的活化誘導(dǎo)信號(hào)通道，使胰腺癌細(xì)胞的惡性發(fā)展降低。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，EphA4上調(diào)促進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞系的錨定非依賴性生長(zhǎng)，從而降低省長(zhǎng)對(duì)雌激素的依賴性。MCF-7細(xì)胞通常表達(dá)極低水平的EphA4，將其轉(zhuǎn)化，并分離出EphA4的穩(wěn)定表達(dá)體(EphA4-2和EphA4-3)。在使用雌激素的軟瓊脂分析中，MCF-7-EphA4細(xì)胞證實(shí)與載體轉(zhuǎn)化的對(duì)照相比，起錨定非依賴性生長(zhǎng)提高2.4倍(圖4)。然而，在沒(méi)有雌激素時(shí)，與相同對(duì)照相比，EphA4表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)提高了8.5倍。這些數(shù)據(jù)表明，與沒(méi)有EphA4的細(xì)胞相比，EphA4過(guò)表達(dá)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)刺激(如基質(zhì)粘附和生長(zhǎng)因子)的依賴性更低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，抗體介導(dǎo)的MCF-7-EphA4細(xì)胞聚集可以逆轉(zhuǎn)惡性發(fā)展的增加。6.4.在胰腺腫瘤組織中EphA4RNA水平提高檢測(cè)患者樣品的EphA4RNA水平，以測(cè)定癌組織中的EphA4表達(dá)。如圖5所示，EphA4RNA水平在胰腺腫瘤組織中比正常組織高。豎條標(biāo)記的"正常"(A)表示52歲男性患者的病理學(xué)正常胰腺組織的EphA4RNA水平。"階段4原發(fā)的"(B)表示胰腺組織中的EphA4RNA水平，顯示了取得豎條A的組織樣品的同一52歲男性患者的階段4A胰管腺癌。"階段2原發(fā)的"(C)表示胰腺組織中的EphA4RNA水平，顯示了72歲男性患者的階段2A胰管腺癌。"Met"(D)表示71歲女性患者的淋巴結(jié)組織中的EphA4RNA水平，顯示了階段2B轉(zhuǎn)移性胰腺癌。"Met"(E)表示57歲女性患者網(wǎng)膜組織中的EphA4RNA水平，顯示了階段4轉(zhuǎn)移性胰腺癌。"Met"(F)表示45歲女性患者肝組織中的EphA4RNA水平，顯示了轉(zhuǎn)移性胰腺癌。從這些樣品可以證實(shí)，癌和轉(zhuǎn)移組織中的EphA4表達(dá)比對(duì)照組織更高。6.5.對(duì)轉(zhuǎn)移癌患者的治療設(shè)計(jì)研究來(lái)分析本發(fā)明的單克隆抗體在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的藥物動(dòng)力學(xué)和安全性。正接受治療的患者可以繼續(xù)接受這些藥物治療。對(duì)患者用單一IV劑量的本發(fā)明單克隆抗體給藥，開(kāi)始4周后，進(jìn)行分析，然后每周重復(fù)給予相同劑量的IV劑量，持續(xù)12周。分析用本發(fā)明的單克隆抗體治療的安全性及IV劑量26周內(nèi)疾病活性的可能發(fā)展。治療并相似地分析不同組患者，但接受劑量為1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg或8mg/kg。將本發(fā)明的單克隆抗體配制成5mg/ml和10mg/mlIV注射。重復(fù)皮下給藥需要80mg/ml的制劑。本發(fā)明的單克隆抗體還配制成100mg/ml給藥，以進(jìn)行研究。根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)的進(jìn)展來(lái)檢測(cè)或測(cè)定變化。6.6.EphA4抗體的動(dòng)力學(xué)分析用基于表面電漿共振的BIACOREm分析法測(cè)量本發(fā)明的單克隆抗體的Koff速率。測(cè)量雜交瘤上清液中的IgG。EphA4的固定使用標(biāo)準(zhǔn)胺(NHS/EDC的70(il1:1混合物)連合化學(xué)，將EphA4融合蛋白固定到CM5傳感芯片表面上。簡(jiǎn)言之，將溶解在10mMNaOAc中，pH4的400nMEphA4融合蛋白溶液注射到活化的表面上，達(dá)到密度1000-1100RU。然后用lMEt-NH2的70pl注射液"封住"未使用的活性酯。相似地，在不含蛋白的同一種傳感芯片上制備活化的和"封住"的對(duì)照表面，作為參考表面。結(jié)合實(shí)驗(yàn)將250pl每種EphA4雜交瘤上清液的注射液注射到EphA4融合蛋白和對(duì)照表面上，記錄結(jié)合反應(yīng)。這些上清液未經(jīng)稀釋。每次注射后，收集至少10min的分離相數(shù)據(jù)。制備純化的EphA4單克隆抗體，以作為陽(yáng)性對(duì)照(每250(il生長(zhǎng)培養(yǎng)基ljig、5pg和25iig)。還制備出不結(jié)合EphA4的陰性對(duì)照單克隆抗體，制備成5(ig/250^il生長(zhǎng)培養(yǎng)基。還制備出覆蓋這些表面的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的對(duì)照注射液。每次結(jié)合循環(huán)后，EphA4融合蛋白表面用單次lmin的1MNaCl-50mMNaOH脈沖(注射)再生。數(shù)據(jù)分析通過(guò)稱(chēng)為"雙參照"的技術(shù)，減去人為噪聲(空培養(yǎng)基注射液)和非特異性結(jié)合(對(duì)照表面)來(lái)校正結(jié)合數(shù)據(jù)。因此，傳感器覆蓋圖代表了"凈"結(jié)合曲線。EphA4抗體具有低速率。7.等價(jià)物本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到或能夠確定不超過(guò)正常實(shí)驗(yàn)的方案，這些都是本發(fā)明特定實(shí)施方案的等價(jià)物。這種等價(jià)物也包括在下面的權(quán)利要求內(nèi)。本說(shuō)明書(shū)中所述的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)都在本說(shuō)明書(shū)中引入作為參考，其結(jié)合程度就象是每種出版物、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)都是具體的并且每一個(gè)都結(jié)合參考。權(quán)利要求1.一種治療需要此種治療的患者癌癥的方法，所述方法包括向所述患者以治療有效量的EphA4抗體給藥，該EphA4抗體是EphA4激發(fā)性抗體、EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體、或暴露的EphA4抗原決定部位抗體。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中相對(duì)于未經(jīng)治療的癌細(xì)胞中的EphA4的磷酸化水平，所述給藥提高了癌細(xì)胞中EphA4的磷酸化。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中相對(duì)于未經(jīng)治療的癌細(xì)胞中的75kDaEphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化水平，所述給藥提高了癌細(xì)胞中75kDaEphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中相對(duì)于未經(jīng)治療的癌細(xì)胞中的EphA4的表達(dá)水平，所述給藥降低了癌細(xì)胞中EphA4的表達(dá)。5.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述EphA4抗體抑制軟瓊脂中的克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述EphA4抗體降低軟瓊脂中存在的克隆形成或基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述降低通過(guò)細(xì)胞凋亡或壞死發(fā)生。8.如權(quán)利要求l所述的方法，其中當(dāng)在細(xì)胞上表達(dá)而不在細(xì)胞間的接觸中表達(dá)時(shí)，所述EphA4抗體結(jié)合EphA4。9.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所迷EphA4抗體結(jié)合不能與其配體發(fā)生穩(wěn)定相互作用的EphA4。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述EphA4抗體結(jié)合不與其配體結(jié)合的EphA4。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述癌癥是上皮細(xì)胞起源的。12.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述癌癥是內(nèi)皮細(xì)胞起源的。13.如權(quán)利要求l所述的方法，其中相對(duì)于具有所述癌細(xì)胞組織類(lèi)型的非癌細(xì)胞，所述癌含有過(guò)量表達(dá)EphA4的細(xì)胞。14.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述癌是皮膚、肺、結(jié)腸、乳腺、前列腺、膀胱或胰腺癌，或是腎臟細(xì)胞癌或黑素瘤。15.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述癌是轉(zhuǎn)移癌。16.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述EphA4抗體是單克隆抗體。17.如權(quán)利要求l所述的方法，所述EphA4抗體是人源化的。18.如權(quán)利要求l所迷的方法，其中所述EphA4抗體是人抗體。19.如權(quán)利要求l所述的方法，其中可變重鏈和/或可變輕鏈的氨基酸序列與SEQIDNO:4和8中所含的EA44的可變重鏈或輕鏈氨基酸序列分別有至少90%的氨基酸序列相同。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述重鏈和/或輕鏈序列的至少3個(gè)CDR與EA44中的相應(yīng)CDR相同。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述EphA4CDR的至少4個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述EphA4CDR的至少5個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述EphA4CDR的全部6個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。24.如權(quán)利要求l所述的方法，該方法包括給予不是EphA4抗體的抗癌治療。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述額外的癌治療包括用EphA2抗體給藥。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述額外的癌治療選自化學(xué)治療、生物治療、免疫治療、放射治療、激素治療、及外科治療。27.—種藥物組合物，該組合物包括治療有效量的EphA4抗體及藥物學(xué)上可接受的載體，該EphA4抗體是激發(fā)性抗體，EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體，或暴露的EphA4抗原決定部位抗體。28.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所迷EphA4抗體是單克隆抗體。29.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述EphA4抗體是人源化的。30.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述EphA4抗體是人的。31.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述可變重鏈和/或可變輕鏈的氨基酸序列與SEQIDNO:4和8中所含的EA44的可變重鏈或輕鏈氨基酸序列分別有至少90%的氨基酸序列相同。32.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述可變重鏈和/或可變輕鏈序列的CDR至少3個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。33.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述EphA4抗體CDR的至少4個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。34.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述EphA4抗體CDR的至少5個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。35.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述EphA4抗體CDR的全部6個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。36.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，該組合物包括不是EphA4抗體的抗癌試劑。37.如權(quán)利要求36所迷的藥物組合物，其中所迷抗癌試劑是EphA2抗體。38.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中所述EphA2抗體是單克隆的。39.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其中所述抗癌試劑是化學(xué)治療性試劑、放射治療性試劑、激素治療性試劑、生物治療、或免疫治療性試劑。40.—種特異性結(jié)合EphA4的抗體，該結(jié)合激發(fā)至少一種EphA4活性。41.如權(quán)利要求40所述的抗體，其中所述EphA4活性是EphA4的磷酸化。42.如權(quán)利要求40所述的抗體,其中所述EphA4活性是75kDa的EphA4關(guān)聯(lián)蛋白的磷酸化。43.—種特異性結(jié)合EphA4的抗體，該結(jié)合抑制癌細(xì)胞表型。44.如權(quán)利要求43所述的抗體，其中所述結(jié)合抑制軟瓊脂中的癌細(xì)胞克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成。45.如權(quán)利要求43所述的抗體，其中所述結(jié)合降低軟瓊脂中的癌細(xì)胞克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中的管狀網(wǎng)絡(luò)形成。46.如權(quán)利要求45所述的抗體，其中所速降低通過(guò)癌細(xì)胞的壞死或細(xì)胞凋亡發(fā)生。47.—種特異性結(jié)合EphA4的抗體，該結(jié)合僅當(dāng)EphA4不是在細(xì)胞間接觸中或不與EphrinA4配體結(jié)合時(shí)才發(fā)生。48.如權(quán)利要求40-42或47中任一項(xiàng)所述的抗體,該抗體是單克隆抗體。49.如權(quán)利要求40-42或47中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是人源化的。50.如權(quán)利要求40-42或47中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所迷抗體是人的。51.如權(quán)利要求40-42或47中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是衍生物。52.如權(quán)利要求51所述的抗體，與不是衍生物的抗體相比，該抗體的體內(nèi)半衰期增大。53.—種細(xì)胞系，該細(xì)胞系產(chǎn)生如權(quán)利要求40-42或47中任一項(xiàng)所述的抗體。54.—種識(shí)別抑制癌細(xì)胞表型的EphA4抗體的方法，所述方法包括a.在適于抗體-抗原決定部位結(jié)合的條件下，用特異性結(jié)合EphA4的抗體與表達(dá)EphA4的細(xì)胞接觸，這種細(xì)胞培養(yǎng)在軟瓊脂或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中；和b.檢測(cè)所述細(xì)胞在軟瓊脂中形成克隆或在所述三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中形成管狀網(wǎng)絡(luò)的能力，其中如果相對(duì)于未接觸所述抗體的表達(dá)EphA4的細(xì)胞，檢測(cè)到所述細(xì)胞形成克隆或管狀網(wǎng)絡(luò)的能力降低時(shí)，就表明所述抗體是抑制癌細(xì)胞表型的EphA4抗體。55.—種識(shí)別殺死具有癌細(xì)胞表型的癌細(xì)胞的EphA4抗體的方法，所述方法包括a.在適于抗體-抗原決定部位結(jié)合的條件下，用特異性結(jié)合EphA4的抗體與表達(dá)EphA4的癌細(xì)胞接觸，這種癌細(xì)胞培養(yǎng)在軟瓊脂或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中；和b.檢測(cè)所述克隆或管狀網(wǎng)絡(luò)的降低，其中如果相對(duì)于未接觸所述抗體的表達(dá)EphA4的細(xì)胞的克隆或管狀網(wǎng)絡(luò)，檢測(cè)到所述克隆或管狀網(wǎng)絡(luò)降低時(shí)，就表明所述抗體是殺死具有癌細(xì)胞表型的癌細(xì)胞的EphA4抗體。56.—種識(shí)別優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位的EphA4抗體的方法，所述方法包括a.接觸兩組表達(dá)EphA4的細(xì)胞，其中第一組細(xì)胞是非癌細(xì)胞，第二組細(xì)胞是癌細(xì)胞；和b.檢測(cè)所述抗體結(jié)合EphA4的能力，其中如果在所述第二組細(xì)胞中而不是在所述第一組細(xì)胞中檢測(cè)到抗體結(jié)合，就表明所迷抗體是優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位的EphA4抗體。57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的檢測(cè)使用免疫熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀。58.—種治療需要此種治療的患者癌癥的方法，該方法包括以治療有效量的EphA4反義核酸分子向所述患者給藥。59.—種治療需要此種治療的患者癌癥的方法，該癌全部或部分地用第一種治療難于治療，所述方法包括給予所述患者第二種治療，所述第二種治療包括給予治療有效量的EphA4抗體，該抗體是EphA4激發(fā)性抗體、EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體、或暴露的EphA4抗原決定部位抗體。60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述第一種治療是化學(xué)治療、激素治療、生物治療、或放射治療。61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述激素治療包括它莫西芬給藥。62.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述第二種治療包括給予化學(xué)治療、激素治療、生物治療、或放射治療。63.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述第一種治療與所述第二種治療同時(shí)進(jìn)行。64.—種治療需要此種治療的患者非癌性高增生細(xì)胞疾病或紊亂的方法，所述方法包括向所述患者用治療有效量的EphA4抗體給藥，該EphA4抗體是EphA4激發(fā)性抗體、EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體、或暴露的EphA4抗原決定部位抗體。65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述EphA4抗體優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位。66.如權(quán)利要求64所述的方法，其中相對(duì)于未經(jīng)治療的非癌性高增生細(xì)胞中的EphA4磷酸化水平，所述給藥提高非癌性高增生細(xì)胞中的EphA4磷酸化。67.如權(quán)利要求64所述的方法，其中相對(duì)于未經(jīng)治療的非癌性高增生細(xì)胞中的EphA4表達(dá)水平，所述給藥降低非癌性高增生細(xì)胞中的EphA4表達(dá)。68.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述非癌性高增生細(xì)胞是上皮細(xì)胞。69.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述患者具有非癌性高增生細(xì)胞，該非癌性高增生細(xì)胞相對(duì)于具有相同組織類(lèi)型的非癌性非高增生細(xì)胞過(guò)表達(dá)EphA4。70.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述非癌性高增生細(xì)胞疾病或紊亂是哮喘、牛皮湊、炎性腸疾病、平滑肌再狹窄、內(nèi)皮再狹窄、克隆氏病(crohn'sdisease)、或慢性阻塞性肺疾病。71.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述EphA4抗體是單克隆抗體。72.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述EphA4抗體是人源化的。73.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述EphA4抗體是人抗體。74.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的可變重鏈和/或可變輕鏈的氨基酸序列與SEQIDNO:4和8中所含的EA44的可變重鏈或輕鏈氨基酸序列分別有至少90%的氨基酸序列相同。75.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述可變重鏈和可變輕鏈的至少3個(gè)CDR與EA44中的相應(yīng)CDR相同。76.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述EphA4抗體CDR的至少4個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。77.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述EphA4抗體CDR的至少5個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。78.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述EphA4抗體CDR的全部6個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。79.—種診斷、預(yù)測(cè)或監(jiān)測(cè)已知患有或懷疑患有癌癥的患者中癌癥治療功效的方法，所述方法包括a.在適于抗體-EphA4結(jié)合的條件下，用EphA4抗體與所述患者的細(xì)胞接觸，該EphA4抗體是EphA4激發(fā)性抗體，EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體，暴露的EphA4抗原決定部位抗體；和b.檢測(cè)與所述細(xì)胞結(jié)合的EphA4抗體，其中如果檢測(cè)到EphA4抗體結(jié)合水平比對(duì)照中的高，就表明該患者患有癌癥。80.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述細(xì)胞是全血、唾液、尿、血清或胂瘤細(xì)胞組織的細(xì)針吸出物。81.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述細(xì)胞來(lái)自從所述患者中得到的冷凍或固化組織或細(xì)胞。82.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述檢測(cè)包括對(duì)所述患者中的所述EphA4抗體結(jié)合進(jìn)行成像。83.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述患者患有轉(zhuǎn)移癌。84.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述EphA4抗體是暴露的EphA4抗原決定部位抗體。85.—種EphA4抗體或抗體片段，其是EphA4激發(fā)性抗體，EphA4癌細(xì)胞表型抑制性抗體，或暴露的EphA4抗原決定部位抗體，其中可變重鏈和/或可變輕鏈的氨基酸序列其與SEQIDNO:4和8中所含的EA44的可變重鏈或輕鏈氨基酸序列分別有至少90%的氨基酸序列相同。86.如權(quán)利要求85所述的EphA4抗體，其中所述可變重鏈和可變輕鏈的至少3個(gè)CDR與EA44中的相應(yīng)CDR相同。87.如權(quán)利要求85所述的EphA4抗體，其中其CDR的至少4個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。88.如權(quán)利要求85所述的EphA4抗體，其中其CDR的至少5個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。89.如權(quán)利要求85所述的EphA4抗體，其中其CDR的全部6個(gè)與EA44中的相應(yīng)CDR相同。90.—種細(xì)胞系，其可產(chǎn)生如權(quán)利要求85-89中任一項(xiàng)所述的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及用于治療、控制或預(yù)防癌癥，尤其是轉(zhuǎn)移性癌癥的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括給予有效量的一種或多種結(jié)合EphA4和激發(fā)EphA4的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括給予有效量的一種或多種結(jié)合EphA4和抑制軟瓊脂中的癌細(xì)胞克隆形成或三維基膜或細(xì)胞外基質(zhì)制劑中管狀網(wǎng)絡(luò)形成的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括給予有效量的一種或多種優(yōu)選結(jié)合在癌細(xì)胞上而不是在非癌細(xì)胞上暴露的EphA4抗原決定部位的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括給予有效量的一種或多種結(jié)合極低k_off的EphA4的抗體，以降低EphA4表達(dá)，由此抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移。本發(fā)明也提供藥物組合物，其包括一種或多種本發(fā)明的EphA4抗體或還包括一種或多種用于癌癥治療的其他試劑。文檔編號(hào)A61K39/395GK101227921SQ200480021986公開(kāi)日2008年7月23日申請(qǐng)日期2004年6月7日優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日發(fā)明者凱利·卡爾斯-金奇,邁克爾·S·金奇申請(qǐng)人:醫(yī)學(xué)免疫公司