專利名稱：用于全身傳遞使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及納米技術領域。更具體地，本發(fā)明提供用于向需要此治療的個體全身傳遞治療性生物活性脂質化合物和/或疏水性化療劑和/或核苷酸/基因物質的納米級裝配系統(tǒng)。
背景技術：
Richard Keynman在他的1959年的演講“There′s Plenty of Room at theBottom”中提出了活細胞的復雜性和微小性，并挑戰(zhàn)科學界來“制作非常小的、能實現我們的意圖的東西”，由此開始，納米技術已經錯綜復雜地與生命科學相關聯(通常稱作納米生物技術)(Feynman，R.P.，1959，可從http//www.zyvex.com/nanotech/feynman.Html得到)。盡管商業(yè)納米生物技術仍然處于萌芽狀態(tài)，但由于其具有獨特的優(yōu)點，即這些系統(tǒng)能用于藥物傳遞和治療，因此納米級裝配系統(tǒng)發(fā)展的速度在近十年來已經指數地增加。一些納米級裝配系統(tǒng)的實例包括脂質體、聚合結構例如樹枝狀聚合物(dendrimer)和水凝膠，和稱作量子點(quantum dot)的金屬或半導體納米顆粒。
許多有效的試劑可用于將轉錄活性的DNA、甚至功能肽和蛋白導入活細胞中。但是，通常無法將生物活性的脂質傳遞進入活細胞中。生物活性的鞘脂質和磷脂代謝物、類似物、模擬物(mimetic)或衍生物的傳遞以及它們向細胞中的插入受到其理化性質的阻礙，該性質使這些脂質疏水且不可透過細胞。
神經酰胺是起衍生于脂質的第二信使的作用的鞘脂，其調控細胞分化、細胞周期停滯和/或細胞凋亡的誘導，它是外源性施用遇到問題的生物活性脂質的一個實例。許多刺激會引起胞內的神經酰胺累積，例如生長因子缺乏、細胞因子、化療和其它細胞毒性劑、電離輻射、熱激、和各種環(huán)境因子。已經發(fā)現這些刺激會啟動神經酰胺介導的信號級聯放大，包括抑制Akt促進存活的(pro-survival)途徑和刺激半胱天冬酶活性，最終導致DNA斷裂和細胞死亡。因而，基于神經酰胺對細胞生長、分化和死亡的有效調節(jié)，以及其為靶向于與增殖和/或存活有關的離散的激酶和信號途徑的天然分子的事實，已經將神經酰胺視作癌癥和心血管疾病的治療劑。
Charles等以前已經證實，可透過細胞的神經酰胺類似物C6自藥物-洗脫平臺(drug-eluting platform)的局部傳遞可應用于臨床(Circ.Res.2000Aug.1887(4)282-8)。更具體而言，曾證實被神經酰胺包裹的氣囊導管會在拉傷的血管平滑肌細胞中誘導細胞周期停滯。盡管C6-神經酰胺自包裹的和膨脹的氣囊中的傳遞允許直接傳遞于脈管系統(tǒng)，但對于全身施用例如癌癥化療或靶向于擴散的動脈粥樣硬化病變和易損斑塊而言，神經酰胺的傳遞仍然有幾個障礙。更具體而言，盡管使用短鏈的、更能透過細胞的衍生物，但神經酰胺的全身傳遞仍然存在3個重大的障礙。
首先，短鏈的、可透過細胞的神經酰胺類似物例如C2、C6和C8-神經酰胺仍然是脂質，因而其性質極為疏水，當在DMSO或乙醇載體中加入細胞介質中時，會沉淀成細小的脂質膠束懸浮液。其次，盡管短鏈的神經酰胺類似物比長鏈的生理神經酰胺(C18-C24-神經酰胺)更能透過細胞，但它們的鞘氨基醇(sphingoid)主鏈限制它們插入質膜中。最后，循環(huán)的和胞內的神經酰胺酶的存在促進生物活性神經酰胺轉化為促進凋亡(pro-apoptotic)效力更低的代謝物。
為了增強神經酰胺向細胞內的傳遞，已經研究了有機溶劑系統(tǒng)。已經提出，在培養(yǎng)基中不溶的十二烷/乙醇溶劑系統(tǒng)與神經酰胺一起沉淀出來，并形成非常小的能與質膜融合的液滴或膠束。這種沉淀溶劑的使用可能受到粒徑的變異性和接近細胞膜的限制。蛋白佐劑，例如牛血清清蛋白，也可以通過非特異性的脂質/蛋白相互作用而在體外有助于神經酰胺傳遞，但是不能有效地將足夠量的C6-神經酰胺傳遞至全身靶標。
因而，為了實現生物活性脂質或基因治療劑的治療益處，需要將這種疏水的或帶電荷的化療化合物傳遞進入需要這種治療的動物或人的活細胞中的改進的全身傳遞系統(tǒng)。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供使用納米級裝配系統(tǒng)優(yōu)化能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性藥物和/或化療疏水劑和/或基因治療劑向有此需要的動物或人中全身傳遞的系統(tǒng)和方法，從而滿足了該迫切的需要。
本發(fā)明提供最大化能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性治療化合物和/或基因治療劑向需要這種治療的動物或人的活細胞中全身傳遞的方法和系統(tǒng)，其使用納米級裝配系統(tǒng)，例如脂質體、可再吸收的和非聚集的分散的納米顆粒、金屬或半導體納米顆粒或聚合材料例如樹枝狀聚合物或水凝膠，其分別具有更高的脂溶性、細胞透性、更長的循環(huán)半衰期，以及具有更高的腫瘤或脈管靶向性的藥物動力學特征。
在本發(fā)明的一個實施方案中，配制在本文中稱作“PEG化的”脂質體的適用于傳遞生物活性脂質、蛋白和治療劑的聚乙二醇450脂質體，其具有一個或多個膜，這些膜包含能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或基因治療劑和/或膽固醇。這些PEG化的脂質體被配制成含有大小為750-5000MW的PEG C8(PEG化的可透過細胞的神經酰胺)和/或大小為2000-5000MW的PEG DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)。本實施方案使用PEG C8來穩(wěn)定脂質雙層，使脂質體含有高摩爾比(即，30％)的游離的生物活性C6神經酰胺。另外，本實施方案使用PEG C8作為含有生物活性神經酰胺和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑的脂質體的必備(integral)成分。而且，由PEG-C8配制的脂質體確保游離神經酰胺向富含小窩蛋白的脂筏中的最佳插入和定位，這是膜內在化并向包括線粒體的亞細胞器轉移以隨后誘導靶組織或腫瘤的細胞凋亡或程序性細胞死亡的先決條件。PEG化的脂質體也稱作“潛行”(stealth)脂質體，其能逃避不被網狀內皮組織系統(tǒng)(RES)從循環(huán)中清除，從而具有更高的循環(huán)半衰期和組織靶向性。通過與能促進向身體的特定細胞或組織中的靶向累積的特定靶向體(targeting moiety)如抗體和/或受體配體的結合，可以進一步實現靶向性。其它的實施方案指出，脂質治療劑也可以在有或沒有PEG-C8存在的情況下配制成包含陽離子脂質的“陽離子”脂質體，以有效地傳遞帶負電荷的寡核苷酸；或在有或沒有PEG-C8存在的情況下配制成“融合”(fusogenic)脂質體，其中脂質體的整個膜與靶位點的細胞膜融合，以將脂質體的成分和內容物傳遞到那里。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了具有磷硅酸鈣(calciumphosphor-silicate，CPS)外殼的可再吸收的納米顆粒，其中將能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性化合物、和/或化療疏水劑，和/或基因治療劑載至可再吸收的納米顆粒中。本發(fā)明的可再吸收的納米顆粒可以將一般不能通過循環(huán)轉運的化療疏水性脂質或藥物或基因治療劑全身地向活細胞傳遞。合成可再吸收的納米顆粒的關鍵特征是，納米顆粒在水性液體介質中的適當分散(無聚集)。實現分散的一種方法是使用為用于具有含硅酸鹽外殼的納米顆粒特別改進的尺寸排阻高效液相色譜(SEC)。實現納米顆粒的分散的另一種方法是使有機、無機或金屬-有機分散劑結合到外部的CPS殼上。另外，可以使碳二亞胺-介導的(carbodiimide-mediated)聚乙二醇(PEG)偶聯劑結合到烷基胺硅烷或烷基羧酸偶聯劑上，以進一步確保納米顆粒在體內的“分散的”非聚集狀態(tài)，并提供靶向體在PEG偶聯劑上的結合點，從而使納米顆粒能靶向特定的位點，以實現胞內的藥物傳遞。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以組合各聚合物以形成“生物智能的”即對物理的或化學的刺激有反應、以及體內可生物降解的物質，并且其可以載有能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或基因治療劑。


圖1.制備用于藥物傳遞的具有可再吸收的包衣的心-殼顆粒(core-shell particle)的示意圖。
圖2A-B.脂質體制劑的表征。生產的脂質體制劑具有球形形態(tài)和均勻的大小分布。(A)PEG化的脂質體囊[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4∶3∶1∶1∶1)]的代表性的TEM。使用常規(guī)的脂質體制劑[EPC/DOPE/CH/C6(6∶0.5∶1.5∶2)]觀察到同樣的顯微照片(未顯示數據)。囊的大小是直徑為85-140nm；橫條代表100nm。脂質溶液的擠出不會顯著減少C6混入脂質體囊中。(B)脂質體制劑平均大小的圖示。
圖2C-D脂質體制劑的表征。(C)將由EPC/DOPE/CH/C6(6∶0.5∶1.5∶2)和痕量的[3H]C6組成、終濃度為10mg/ml的膠束制劑擠出，以生成所述的常規(guī)脂質體。平均值±標準誤差，n＝3獨立實驗。在擠出脂質膠束溶液生成脂質體囊后，脂質組成保持一致。(D)使用CHCL3/MeOH/ddH2O(60∶25∶5)溶劑系統(tǒng)所分離的常規(guī)脂質體制劑[EPC/DOPE/CH/C6(3.5∶3∶2∶1.5)和EPC/DOPE/CH/DHC6(3.5∶3∶2∶1.5)]的代表性的TLC。如所預期的，C6、而不是DHC6被染上碘，因為C6缺少DHC6的C4-5雙鍵。
圖3A.C6傳遞的體外藥物動力學。C6的脂質體傳遞導致與非脂質體傳遞相比C6隨時間的細胞累積更高。(A)用痕量的[3H]C6制備脂質體，以測定神經酰胺向MDA細胞傳遞的動力學。將添加給細胞的脂質體和非脂質體C6的總量設定為100％。在20μM，C6累積在約16小時時達峰。平均值±標準誤差，n＝3獨立實驗。*，脂質體C6累積與非脂質體C6累積相比，p＜0.05。
圖3B-C.C6傳遞的體外藥物動力學。說明是脂質體C6、而不是膽甾(cholesteryl)-1，2-3H(N)十六烷基醚(3H-CHE)隨著時間(B)和劑量(C)向MDA細胞膜中分配。用痕量的[3H C6]和[3H CHE]配制PEG化的脂質體[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4∶3∶1∶1∶1)]，以評價神經酰胺(10uM)在指定的時期向MDA細胞傳遞的機制。在10小時的處理期間，研究了神經酰胺傳遞的劑量-依賴性機制。將傳遞給細胞的脂質的量計算為pmol/106細胞。平均值±標準誤差，n＝3獨立實驗。*，各制劑中的C6累積和CHE累積相比，p＜0.05。
圖4A-B.胸苷摻入生長實驗(thymidine incorporation growth assay)證明，在雌激素受體-陰性的MDA乳腺癌細胞中，脂質體C6傳遞比非脂質體C6更有效。(A)常規(guī)脂質體；(B)陽離子脂質體。
圖4C.胸苷摻入生長實驗證實，在雌激素受體-陰性的MDA乳腺癌細胞中，PEG化的脂質體C6傳遞比非脂質體C6更有效。
圖5.PEG化的脂質體C6[DSPC/DOPE/DSPC-PEG(5000)/C8-PEG(750)/C6-Cer(3.75∶1.75∶0.75∶0.75∶3.0)]傳遞增強C6的抗增殖活性。脂質體傳遞降低C6在410.4腺癌細胞中的IC50?；烊隤EG-C8至0.75允許混入30mol％的C6。結果代表著3次獨立實驗的平均值±標準誤差。*p＜0.05。
圖6.作為細胞凋亡的測量，脂質體C6傳遞增強MDA細胞中的半胱天冬酶-3/7活性。
圖7A.脂質體C6傳遞增強胞內的C6的促凋亡活性。斷裂的3′-OHDNA的TUNEL染色證實，C6處理(20μM)誘導MDA細胞的凋亡。在溫育約16小時時，觀察到發(fā)生細胞凋亡。非脂質體(20uM)C6和常規(guī)的脂質體C6[EPC/DOPE/CH/C6(6∶0.5∶1.5∶2)](20μM)以與DNA酶(DNase)陽性對照類似的方式誘導DNA斷裂。通過膜聯蛋白V染色測定，脂質體C6傳遞導致細胞凋亡的大量誘導。
圖7B.用非脂質體C6(25μM)、PEG化的脂質體C6[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4∶3∶1∶1∶1)](25μM)、或Ghost脂質體處理MDA細胞24小時，用FITC-膜聯蛋白V染色，并通過流式細胞儀分析。平均值±標準誤差，n＝3獨立實驗。*，p＜0.05；#p＜0.005，與未處理的對照組相比。
圖8A-B.脂質體C6傳遞調控與生長抑制和/或細胞凋亡有關的信號級聯放大。脂質體C6傳遞抑制MDA細胞中的Akt磷酸化。(A和B)用非脂質體C6(50μM)、PEG化的脂質體C6[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4∶3∶1∶1∶1)](50μM)、或Ghost脂質體預處理細胞8小時，然后用20ng/mlIGF-1另外刺激15分鐘。用探針檢測蛋白裂解產物中的Akt的天然的和活性的(磷酸化的)形式。(A)n＝3獨立實驗的代表性的印跡。(B)，平均值±標準誤差，n＝3獨立實驗。*，p＜0.05，與未處理的IGF-刺激的對照相比。
圖9A-B.脂質體C6傳遞導致C6向小窩(caveola)和線粒體結構內的累積。(A)從脂質體囊向細胞傳遞的NBD-C6的共焦顯微圖像證實，C6也累積在細胞線粒體中。NBD-C6共同定位(colocalize)在線粒體中。(B)使用[3H]-C6作為總C6的標記物，PEG化的脂質體傳遞導致神經酰胺在小窩脂質信號筏(signaling raft)中的時間依賴性累積。神經酰胺累積于蔗糖梯度的級分#4-5中，它代表富含小窩蛋白-1的脂筏(小窩)。
圖10A-B.PEG化的脂質體C6[DSPC/DOPE/DSPC-PEG(5000)/C8-PEG(750)/C6-Cer(3.75∶1.75∶0.75∶0.75∶3.0)]對腫瘤體積的影響。(A)在用12、24和36mg/kg脂質體C6和空脂質體載體處理過程期間和之后，檢測接種了410.4腺癌細胞的動物的腫瘤體積。結果代表每組5只動物的平均值±標準誤差。(B)于以40mg/kg處理1周的腫瘤的腫瘤冷凍切片染色證實細胞凋亡的TUNEL染色呈陽性。對于Ghost和未處理的腫瘤切片，明顯的染色很少。代表性的載玻片來自每組3只動物和每個腫瘤切片的10個隨機視域。
圖11A-B.PEG化的脂質體C6在攜帶410.4腫瘤的Balb/C小鼠中的藥物動力學。(A)10和40mg/kg劑量的脂質體-C6似乎遵守一級動力學，在24小時處維持與體外IC50相關聯的足夠的血漿濃度。(B)在這些劑量下，在約30分鐘時，C6在腫瘤組織中達到穩(wěn)態(tài)濃度。40mg/kg的劑量將濃度維持在理想的IC50以上達24小時。
圖12.由具有熱反應性和可生物降解性質的PLL、PLLA和NIPAAM聚合物組成的專有的樹枝狀結構。
圖13A-B.樹枝狀聚合物的熱反應性的和藥物釋放性質。A)使用Uv可見光譜研究合成的樹枝狀聚合物在0.5和0.1mg/ml時的透光率。在約34℃時觀察到溶液濁度的急劇轉變，代表著樹枝狀聚合物的LCST。B)載有C6的樹枝狀聚合物表現出確定的釋放動力學和體外生物功效。在37℃和25℃下于含有0.5％(w/v)SDS的蒸餾水中C6從載有C6的樹枝狀聚合物中隨時間的釋放比率。在高于樹枝狀聚合物的LCST的溫度37℃，樹枝狀聚合物更為疏水，從而導致C6從載有C6的樹枝狀聚合物中的釋放曲線更加緩慢。樹枝狀聚合物的濃度是122μg/ml。
圖14A-C.在樹枝狀聚合物的LCST以下(25℃)和LCST以上(37℃)的溫度下，MDA細胞吸收濃度為100μg/ml的樹枝狀聚合物1小時。A&B)用綠FITC標記樹枝狀聚合物，用藍DAPI對MDA細胞核染色。共焦顯微術證實，在LCST以上的溫度(37℃)樹枝狀聚合物優(yōu)先累積在MDA細胞中。左上，藍DAPI-染色的核；右下，綠FITC-樹枝狀聚合物；左下，相襯(phase/contrast)；右下，重疊。C)流式細胞儀分析證實，在樹枝狀聚合物LCST以上的溫度(37℃)下，比在LCST以下(25℃)的溫度顯著地更多的樹枝狀聚合物內在化到MDA細胞中，*p≤0.005。
圖15A-B.載有C6-神經酰胺的樹枝狀聚合物在體外表現出抗癌作用。A)在有5％FBS存在時，載有C6的樹枝狀聚合物允許向MDA細胞傳遞神經酰胺，導致即使不是更好也是與施用在DMSO中的游離C6類似的C6-誘導的細胞毒性。B)載有C6的樹枝狀聚合物導致比施用在DMSO中的游離C6顯著更高的C6-誘導的細胞凋亡。*p≤0.05。
圖16.NIPAAM-共-PLLA-共-葡聚糖水凝膠的結構，其中R是-CONHCH2CH＝CH2或H，且m和n是從約1至數千的整數。NIPAAM鏈段也可以具有從約10至數千的單元。
具體實施例方式
本發(fā)明提供最大化地以及靶向地將能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性治療化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑全身傳遞給需要這種治療的動物或人的活細胞的方法和系統(tǒng)，其使用納米級裝配系統(tǒng)，例如脂質體、可再吸收的和非聚集的納米顆粒、金屬或半導體納米顆?；蚓酆喜牧侠鐦渲罹酆衔锘蛩z，其分別都表現出更高的脂溶性、細胞透性、更長的循環(huán)半衰期和具有提高的腫瘤或血管靶向性的藥物動力學特征。
如本文所使用的，“使生長停滯的”指活細胞不再對從臨近組織釋放出的生長因子或細胞因子發(fā)生反應。而且，“生長停滯的”指不再復制其DNA并增殖的細胞。
如本文所使用的，促進凋亡指經歷程序化細胞死亡過程的活細胞或組織。
如本文所使用的，短語“衍生于脂質的”指為在生物膜中存在的天然脂質的代謝物的物質。
如本文所使用的，術語“生物活性的”指能轉導信息和啟動從細胞的質膜向核中的信號級聯放大的活性劑，其中特定的基因被活化或失活，導致細胞表型發(fā)生變化(即，生長停滯和/或細胞凋亡)。
如本文所使用的，術語“納米級”和“納米大小”指細分的特定狀態(tài)，暗示著顆粒具有小于約300nm的平均尺寸，且表現出體相通常不具備的性質，例如，量子光學效應。
如本文所使用的，短語“疏水性化療劑”指用作藥物來減少細胞增殖和/或誘導細胞凋亡、且相對難溶于水性環(huán)境中的小分子、肽、蛋白、肽模擬物和脂質模擬物。
如本文所使用的，術語“納米復合顆?！焙汀凹{米顆粒”是可互換的。
如本文所使用的，術語“聚集(agglomeration)”指通過物理(范德華或疏水的)力或靜電力在懸浮液中形成聚集體(aggregate)(由微粒亞單位組成的附著體)。得到的結構稱作“聚集物(agglomerate)”。
如本文所使用的，非聚集的是“分散的”生物顆粒的狀態(tài)。
更具體地，本發(fā)明提供將化療的疏水性化合物全身地、長期地(chronic)或靶向地傳遞給需要這種治療的動物或人的系統(tǒng)和方法，其包括納米級裝配系統(tǒng)和能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑。納米級裝配系統(tǒng)可以包含但不限于脂質體、可以被磷硅酸鈣(CPS)外殼包封的可再吸收的納米顆粒、或能夠制成生物反應性的(生物智能的)和可生物降解的聚合材料例如樹枝狀聚合物或水凝膠。
通過靜脈內的、導管傳遞、輸液泵、微球或藥膏全身地傳遞能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑，以用于治療涉及功能障礙性生長(dysfunctional growth)例如癌癥、腫瘤、動脈炎癥、動脈粥樣硬化、再狹窄、易損斑塊或糖尿病的病理。
能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性化合物的實例包括但不限于生理性神經酰胺和/或衍生物、在SN-2位具有由2-10個碳單元組成的短鏈脂肪酸并可透過細胞的神經酰胺和/或衍生物、二甲基鞘氨醇(sphingosine)、三甲基鞘氨醇、醚連接的甘油二酯、醚連接的磷脂酸、鞘氨醇或二氫鞘氨醇(sphinganine)?；蛑委焺┑膶嵗ǖ幌抻诠押塑账?、核酶、DNA-酶、質粒、反義或常規(guī)的Si-RNA或病毒(AAV，AV或lenti)表達的SiRNA。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在這里將稱作“PEG化的”脂質體的適用于傳遞疏水性生物活性脂質、蛋白和治療劑的PEG-750-C8和/或PEG-DSPE(2000-5000MW)脂質體配制成具有一個或多個包含能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑和/或膽固醇的膜。用PEG-750-C8和PEG-DSPE(2000-5000)“PEG化的”脂質體也稱作“潛行”脂質體，其可以制成能逃避不被網狀內皮組織系統(tǒng)(RES)從循環(huán)中清除，且其可以具有與其結合的結合物如抗體或受體配體以靶向身體的特定細胞或組織。與其它的膠粒一樣，脂質體通常被RES、主要被肝的Kupfer細胞和脾的固定巨嗜細胞迅速從循環(huán)中清除。據信，RES攝入脂質體的速度與脂質體的調理作用或去調理作用(dysopsonization)的過程有關。因此，脂質體治療功效依賴于逃避被RES識別并從而在循環(huán)中保留更長時間的能力。因此，術語“潛行”脂質體指該逃避性質，且用于指其膜含有雙層相容物(biolayer-compatible species)例如聚乙二醇(PEG)-連接的脂質的脂質體。因而，“潛行”或PEG化的脂質體具有通過逃避RES來提高能釋放藥物的脂質體的親水性和生物利用度的潛力，并且許多年來已經知道脂質體PEG化的制備方法，如Blume，G等(Biochim.Biophys.Acta，102991-97，1990)所報道。而且，通過將特定的靶向體例如抗體和/或受體配體結合到PEG上，可促進向身體的特定細胞或組織中的靶向累積，從而能夠進一步實現靶向性?；蛘?，該實施方案可以含有用于有效地傳遞帶負電荷的寡核苷酸的陽離子脂質，例如二油?；?1，2-二?；?3-三甲基銨-丙烷。另外，可以配制“融合”脂質體，其中脂質體的整個膜與靶位點的細胞膜融合，以將脂質體的成分和內容物傳遞于其中。融合脂質是不穩(wěn)定的脂質，其在水溶液中形成六角形的構象，從而產生能通過內吞過程或“融合”過程結合到細胞膜上的反膠束(inversemicelle)。
因此，本發(fā)明的脂質體載體通過阻止生物活性脂質從溶液中沉淀出來，而使其能更有效地被傳遞到細胞中，從而改進了與全身傳遞衍生于脂質的生物活性化合物例如C6-神經酰胺有關的主要問題。而且，本實施方案使用PEG-C8來穩(wěn)定脂質雙層，使脂質體含有濃度高達至少40mol％的游離的生物活性的C6神經酰胺。另外，本實施方案使用PEG-C8作為含有生物活性神經酰胺和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑的脂質體的必備成分。而且，PEG-C8配制的脂質體能確保游離的神經酰胺向富含小窩蛋白的脂筏中的最佳插入和定位，這是膜內在化以及向亞細胞器(例如線粒體)轉移以隨后誘導靶組織或腫瘤的細胞凋亡或程序化細胞死亡的先決條件。
而且，本發(fā)明的脂質體可以用于局部地和和全身地傳遞治療性神經酰胺類似物。例如，已證實在牽張損傷后的兔中，從栓子清除術導管的涂覆有神經酰胺的氣囊局部地和直接地傳遞C6-神經酰胺會限制新內膜增生(再狹窄)(Charles等，Circ.Res.2000Aug.1887(4)282-8)。其它人員已經證實，池內和靜脈內傳遞的在DMSO載體中的可透過細胞的神經酰胺類似物在局灶性腦缺血后的大鼠中誘導神經保護作用。在脂質體囊中包裹傳遞C6-神經酰胺和其它治療劑的臨床潛力巨大。研究已經證實，神經酰胺可以與化療劑例如紫杉醇和芬維A胺協同作用。因而，在C6-配制的脂質體中組合傳遞化療劑可以進一步增強凋亡作用，并通過有效地降低在脂質體制劑中使用的每種試劑的濃度，從而同時減少副作用。而且，與腫瘤特異性抗體或受體配體結合的靶向免疫脂質體也可有利地混入C6-神經酰胺。
很大程度上尚不清楚神經酰胺參與細胞凋亡程序的機制，盡管神經酰胺累積似乎與許多凋亡標志有關，例如聚(A)DP核糖聚合酶(PARP)切割、DNA斷裂、磷脂酰絲氨酸暴露和錐蟲藍攝入(Kolesnick，R.N.等，Annu.Rev.Physiol.，60643-665，1998)。而且，內源性的神經酰胺在線粒體膜內累積，且部分地誘導細胞色素C釋放從而導致線粒體功能障礙和最終的細胞凋亡。神經酰胺可以通過細胞內的不同的代謝途徑生成。例如，已經證實，存在由對細胞的不同處理例如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、抗Fas、血清抽取、和其它物質引起的、應激誘導的鞘磷脂酶催化的鞘磷脂向神經酰胺的代謝轉換。另外，神經酰胺能夠通過從頭合成途徑生成，其中絲氨酸棕櫚酰轉移酶和/或神經酰胺合酶的活化起關鍵作用(Garzotto，M.等，Cancer Res.，582260-2264，1998)。外源地添加的神經酰胺通常能以立體特異性的方式模擬應激誘導的細胞凋亡，且已經證實，在有些情況下，抑制神經酰胺的形成會抑制細胞凋亡的發(fā)展(Wiesner，D.A.等，J.Biol.Chem.，2729868-9876，1997)。外源的神經酰胺在富含小窩蛋白的質膜脂筏內的插入和累積可以促進這些域向包含線粒體的亞細胞器中的內在化。
細胞凋亡涉及細胞的協調的死亡(orchestrated death)，且已經證實，這是生物體在增殖的組織和系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)或在發(fā)炎的調節(jié)障礙的細胞或組織中維持體內平衡的重要方式，如經常在癌癥、再狹窄或動脈粥樣硬化中觀察到的(Frasca，L.，等，Crit.Rev.Immunol.，18569-594，1998)。實際上，細胞凋亡控制的喪失是癌形成的標志。已經證實，神經酰胺類似物在體外誘導腫瘤細胞中發(fā)生細胞的凋亡。但是，迄今為止，由于全身傳遞時有限的溶解度，還沒有研究證實神經酰胺的體內凋亡和化療作用。術語細胞凋亡經常與程序性細胞死亡可互換地使用。其由于缺少有關的炎性反應，從而與壞死導致的死亡相區(qū)別。細胞凋亡的特征在于發(fā)生了一個或多個細胞事件，包括線粒體完整性的喪失、核濃縮、膜起泡、染色質斷裂或膜完整性的喪失，導致磷脂酰絲氨酸暴露和錐蟲藍攝入(Wyllie，A.H.，J.Cell Biol.，73189-197，1997)。很大程度上尚不清楚分別調節(jié)這些細胞特征的生化機制。但是據信，稱作半胱天冬酶的半胱氨酸蛋白酶家族的活化在細胞凋亡過程的發(fā)展中起重要作用(Thornberry，N.A.等，Science，2811312-1316，1998)。在該半胱天冬酶家族中，通過凋亡刺激活化啟動型半胱天冬酶(initiator caspase)，并隨后活化下游的執(zhí)行型半胱天冬酶(effector caspase)。這些執(zhí)行型半胱天冬酶又具有大量的胞內底物，其中包括對于細胞動態(tài)平衡必需的成分。剪切這些底物中的一種或多種會使細胞功能失調，并促進細胞凋亡程序的特定的形態(tài)特征(Thomberry，N.A.等，Science，2811312-1316，1998)。本發(fā)明的一個重要實施方案是PEG-C8穩(wěn)定化脂質體、使高達約40摩爾％的游離的生物活性神經酰胺可以用于膜插入和內在化并隨后誘導細胞凋亡的機制。因而，化合物例如C6-神經酰胺對凋亡過程的調控可以提供有價值的治療方法。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或基因治療劑載于用于藥物和基因治療的、具有磷硅酸鈣(CPS)外殼和藥心(drug core)可再吸收的納米顆粒中。本發(fā)明的可再吸收的納米顆?？梢詫⑼ǔ２荒芡ㄟ^循環(huán)轉運的疏水性脂質或蛋白藥物或基因治療劑全身地傳遞給活細胞?？稍傥盏募{米顆粒可以具有1-300nm的直徑，優(yōu)選地小于50nm，最優(yōu)選地為20nm或更小。具有約20nm或更小的直徑的納米顆粒能透過血腦屏障(BBB)，從而能將藥物直接傳遞進入中樞神經系統(tǒng)；這是治療致癌的腦或神經病變的重大的優(yōu)點。這些納米系統(tǒng)也適用于實體瘤，不限于腺癌、黑素瘤、前列腺癌、結腸癌、肺癌(氣霧劑傳遞)和乳腺癌，以及非實體瘤例如白血病。藥心可以作為固體或在水溶液中傳遞。制備心-殼顆粒的示意圖如圖1所示。
更具體而言，合成可再吸收的納米顆粒的方法包含能與水和疏水性非水溶劑例如環(huán)己烷或異辛醇結合以形成反膠束結構的將非離子型表面活性劑如聚(氧乙烯)壬基苯基醚(IGEPALTM520CO)，或任何其它的含有極性頭部基團和非極性尾部的兩性化合物與水和疏水的非水性溶劑例如環(huán)己烷或異辛醇混合，以形成反膠束結構。能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的化合物或基因治療劑可以懸浮到水相中，形成水和藥物或水和基因治療劑的溶液、懸浮液或膠束混合物。所得到的在其核心含有活性物質的反膠束包有無機的可再吸收的、在生理的、即等滲的環(huán)境中生物降解的包衣。CPS是可再吸收的包衣的實例，其具有下述組成Cax(PO4)yzSiO2，其中0.1≤x≤10 0.1，0.1≤y≤10，并且0≤z≤10?？梢哉{節(jié)該組成以提供外殼在生理環(huán)境中的不同再吸收速度，更高的硅和更低的鈣和磷酸根濃度導致更慢的再吸收速度。
合成可再吸收的納米顆粒的一個關鍵特征是納米顆粒在液體介質中的適當分散。合適的液體可包含但不限于去離子水、鹽水溶液、水-乙醇混合物或適用于生理環(huán)境和/或任何其它處理步驟如制粒工藝，例如在制成經口傳遞的片劑之前的噴霧干燥的其它液體-懸浮介質。這是如下完成的首先洗滌納米顆粒以去除過量的兩性化合物和任何其它的離子或添加劑，從而確保能實現納米顆粒的最佳分散。另外，在洗滌過程中必須濃縮懸浮液以生成足夠高濃度的懸浮液，從而以足夠的劑量傳遞藥物或基因治療劑。這是使用為用于含硅酸鹽外殼的納米顆粒而特別改進的尺寸排阻高效液相色譜(SEC)實現的。這種改進是防止接觸的納米顆粒之間形成固體橋從而導致永久性聚集所必需的。根據本發(fā)明的方法生產的初級納米顆粒(primary nanoparticle)的大小范圍是約1.0-300nm。該方法能防止納米顆粒的聚集，如通過粒徑分布測量技術如準彈性光散射或測定離心或沉降的光密度所測量的，顆粒的聚集可以大大超過1微米。因而，由于在洗滌和回收步驟過程中的聚集，沒有經過如本文所述的處理的納米微粒懸浮液會導致比初級尺寸的納米顆粒的情況明顯改變的流動單元(flow unit)。
SEC收集和納米顆粒的洗滌步驟中的關鍵改進包括，使用裝有直徑約20微米的微孔硅顆粒的更短的洗脫柱，以及進行化學修飾?；瘜W修飾包括但不限于在合成納米顆粒后向反膠束懸浮液中添加乙醇或任何其它合適的醇，以生成均質的納米顆粒懸浮液。用醇代替典型地使用的水或丙酮防止形成具有比初級納米顆粒粒徑更大的流動單元的納米顆粒聚集塊(agglomerated mass)。另一種至關重要的化學修飾是與能作用于納米顆粒的表面以提供能防止納米顆粒永久聚集的電位層(electrosteric layer)的有機或無機分散劑結合。合適的有機分散劑包括但不限于檸檬酸、酒石酸或醋酸。合適的金屬有機分散劑包括但不限于烷基胺硅烷偶聯劑如氨基丙基三氯硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APS)、3-氨基丙基硅倍半氧烷)、3-環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPS)、三甲氧基甲硅烷基-丙基二亞乙基三胺(DETA)、3-三甲氧基甲硅烷基丙基琥珀酐、以及烷基羧酸硅烷偶聯劑如酰胺連接的羧基。合適的離子分散劑包括但不限于過量的鈣、磷酸鹽或焦磷酸鹽。
而且，必需用相同的分散劑處理用于填充SEC柱的微孔硅顆粒的表面，以生成阻止納米顆粒在通過柱子的過程中粘附到微孔硅表面上的電位屏障。在SEC納米顆粒濃縮和洗滌步驟中，還必須控制pH水平。因而，為了將pH水平維持在約6和8之間而根據需要加入酸，例如但不限于硝酸、醋酸或鹽酸；或堿，例如但不限于氫氧化鈉或氫氧化鉀。當pH大于8時，納米顆粒的表面上的電荷太低而形成聚集。當pH小于6時，酸或堿的濃度太高，得到的離子強度在洗滌步驟中造成聚集。神經酰胺和其它衍生于脂質的生物活性介體能抵抗所有這些酸性或堿性過程。
另外，可以將碳二亞胺介導的聚乙二醇(PEG)偶聯劑結合到烷基胺硅烷或烷基羧酸偶聯劑上，以進一步確保納米顆粒在體內的分散狀態(tài)，并為結合劑例如抗體或表達的受體的配體提供結合到PEG偶聯劑上的結合點，從而實現富集神經酰胺或包封有神經酰胺的納米顆粒的靶向腫瘤特定位點的胞內藥物傳遞。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，納米級裝配系統(tǒng)包含聚合材料，例如載有能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或基因治療劑的樹枝狀聚合物或水凝膠。該樹枝狀聚合物或水凝膠是獨立的聚合物，它們組合形成生物智能的即能對刺激反應的、和可體內生物降解的材料。在研究和實驗后發(fā)現，結合智能鏈段和可降解的疏水性和/或親水性鏈段的材料可以用于藥物傳遞。鏈段被認為是材料的共價結合部分，且可具有許多聚合的單元。例如，鏈段可以包括若干聚合單體單元至約數千個聚合單體單元。這些鏈段可以具有任意的長度和任意的分子量，但是，每個鏈段優(yōu)選地具有大致足夠大的分子量以使該聚合物鏈段具有與預期的近似的理想性質。
當單獨使用時，所述聚合物受到不能達到最佳的或非生物降解性的限制。因而，將智能聚合物鏈段和可生物降解的聚合物鏈段相結合產生比各材料更通用得多的材料。通過結合生物反應性和可生物降解的聚合物形成既可生物降解又對生理刺激有反應的藥物傳遞系統(tǒng)。更具體而言，本發(fā)明提供包含智能鏈段和可生物降解鏈段的多功能聚合物，其中可生物降解鏈段包含疏水性鏈段(適用于結合化療劑或與化療劑相互作用)和親水性鏈段。
已知許多天然的和合成的可生物降解的聚合物。某些已經得以研究，包括聚酯例如聚丙交酯(PLA)、聚(L-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、生物素化的聚(乙二醇-乳酸嵌段共聚物)、聚(烷基氰基丙烯酸酯)和聚(ε-己內酯)，聚酸酐例如聚(雙(p-羧基苯氧基)丙烷-癸二酸)(PCPP-SA)、聚原酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、聚氨基甲酸酯、和聚(氨基酸)，多糖例如葡聚糖，其可為微囊、微粒、納米顆粒、水凝膠和膠束的形式。所有這種可生物降解的聚合物都包含在本發(fā)明中，作為多功能材料的鏈段。
在藥物耗盡后，前述聚合物通過主鏈的水解或酶切降解，是無毒的和非炎性的。聚合物的降解性質依賴于它們的化學成分、立構規(guī)整度、結晶度、摩爾質量、形態(tài)學、大小和形狀，以及pH和溫度。已知可生物降解的聚合物的化學和物理性質會影響藥物釋放特征，且所載的藥物的釋放動力學由藥物擴散和聚合物降解控制。
由于聚-L-賴氨酸(PLL)的電荷、親水性和靶向能力，因此影響樹枝狀聚合物或水凝膠的降解速率的另一個方法包括用PLL對疏水性材料如PLA和PLGA微粒/納米顆粒包衣或接枝。例如已經證實，與沒有PLL側鏈的那些相比，由PLL進行接枝的聚(L-乳酸-共-L-賴氨酸)組成的微粒具有顯著提高的羅丹明B釋放速度。而且，用PLL膠束接枝的PLGA表現出比PLL高10倍的轉染效率和低5倍的細胞毒性。本發(fā)明包括這種包衣和接枝技術在提供親水性-疏水性可降解鏈段中的應用。
樹枝狀聚合物定義為規(guī)則的、多枝的鏈段，其導致相對單分散的、樹狀的或多代的結構(generational structure)。樹枝狀聚合物具有3個顯著的結構特征核心、含有重復單元或代并與核心徑向連接的多枝狀內部區(qū)域；與最外層代相連的末端部分的外部或表面區(qū)域。通過調整這3個結構成分，可以將樹枝狀聚合物限定成許多結構。由于其高度的分子一致性、狹窄的分子量分布、特定的大小和令人感興趣的結構性質例如內部空隙和空腔、以及高度功能性的末端表面，高度枝化和反應性的三維大分子樹枝狀聚合物已經在生物醫(yī)藥應用方面變得越來越重要。空間上排列的官能團可以與許多分子例如親水性分子如PEO反應，以增加它們的血液循環(huán)時間，與造影劑反應以用于磁共振成像(MRI)，以及與靶向分子反應以定位到理想的組織位點。
目前可得到的樹枝狀聚合物包含二甲苯醚、丙烯亞胺、酰氨基胺(amidoamine)、L-賴氨酸、酯和碳硅烷樹枝狀鏈段。其中，已經廣泛地研究了陽離子聚酰氨基胺(PAMAM)樹枝狀聚合物，且據報道，視樹枝狀聚合物-DNA比率、樹枝狀聚合物的大小以及尤其是柔性而定，其在多種細胞中介導高水平的基因轉染。PAMAM樹枝狀聚合物被認為是靶向傳遞系統(tǒng)，且能夠增強在某些腫瘤微脈管系統(tǒng)內的累積，增加向腫瘤組織內的外滲。聚(L-賴氨酸)(PLL)樹枝狀聚合物是另一種聚陽離子樹枝狀聚合物，其含有大量的表面胺，且被認為能與聚陰離子如核酸、胞外基質中存在的蛋白聚糖以及細胞膜的磷脂發(fā)生靜電相互作用。這些聚合物可以將包括衍生于脂質的生物活性的能使生長停滯的、促進凋亡的代謝物或物質的藥物定位到目標膜上。
但是，聚陽離子樹枝狀聚合物仍然具有體內毒性問題，且能抵抗體內降解，因而不太適用于藥物傳遞。為了改善PAMAM樹枝狀聚合物的細胞毒性，可以將樹枝狀聚合物的陽離子胺末端基團替換為陰離子羧基末端基團。通過結合智能的和可降解的鏈段作為樹枝狀聚合結構的臂、枝或樹突(dendron)，本發(fā)明的材料解決了由單獨的組分制備的樹枝狀聚合結構的一些缺點。通過在化學鍵形成反應中將熱反應性聚合物鏈段與可生物降解的聚合物鏈段偶聯即可制備出這種樹枝狀聚合材料。
還可以將樹枝狀聚合物制成納米大小的顆粒。據信，大小為約1nm-1000nm的顆粒在將藥物轉運和靶向到發(fā)炎的、增殖的或轉化的組織方面具有顯著的優(yōu)點。通過吸附、包埋和共價結合將藥物載至納米大小的樹枝狀聚合物中，并通過脫附、擴散、聚合物侵蝕或任意或全部上述機制的組合將藥物從納米大小的樹枝狀聚合物釋放出來。體外和體內實驗證實，當以葡聚糖穩(wěn)定化并用聚山梨醇酯80包衣時，納米大小的樹枝狀聚合物可以具有較長的血液循環(huán)時間和較低的RES攝取。納米大小的樹枝狀聚合物能與血管或實體瘤相互作用，然后被這些細胞通過內吞作用攝入。因此據信，由于提高的循環(huán)半衰期，樹枝狀聚合物具有非常大的將藥物傳遞給發(fā)生腫瘤的或發(fā)炎的/增殖的組織中的能力。
納米技術近期的發(fā)展提供了受控地傳遞和靶向地釋放疏水性治療劑的巨大潛力。本發(fā)明的納米級樹枝狀聚合物裝配系統(tǒng)既對溫度刺激反應又可通過水解而可被生物降解，允許將C6靶向地和持續(xù)地傳遞給實體瘤。已經證實，可以將C6載至溫度敏感的、“智能的”樹枝狀聚合物中，且該藥物-聚合物復合物可以有效地抑制MDA雌激素-陰性的乳腺癌細胞的增殖以及誘導細胞凋亡。通過熱敷袋或超聲波向實體瘤區(qū)域施以急性局部高溫會觸發(fā)C6向患病組織內釋放。因而，熱反應性納米級樹枝狀聚合物可以用作向實體瘤組織靶向地和控制地傳遞包括神經酰胺的治療劑的最佳方案，該概念被稱作“生理高溫的藥物傳遞”(physiologicalhyperthermic drug delivery)。
樹枝狀聚合物在藥物傳遞中的應用脂質體藥物傳遞技術的光芒逐漸被通過采用聚合物化學技術以設計制造具有一系列藥物傳遞動力學優(yōu)勢的穩(wěn)定納米顆粒的更先進的藥物傳遞系統(tǒng)所蓋過。例如，聚合納米顆粒能夠延長生物利用度、靶向于疾病細胞、以及具有生物反應性和控制的藥物釋放(17)。通過吸附、包埋和共價結合將藥物載至聚合的納米顆粒中，并通過脫附、擴散、聚合物侵蝕或任意或全部上述機制的組合，將藥物從納米顆粒釋放出來。由于其高度的分子一致性、狹窄的分子量分布、特定的大小和令人感興趣的結構性質如內部空隙和空腔，以及高度功能性的末端表面，因此樹枝狀聚合物——高度枝化的和反應性的三維納米顆粒——適用于生物醫(yī)藥應用。本發(fā)明的樹枝狀聚合物包含聚陽離子聚合物(聚(L-賴氨酸)，PLL)、可生物降解的聚合物(聚(L-乳酸)、PLLA)、以及熱反應性的聚合物(聚(N-異丙基丙烯酰胺)，PNIPAAM)。通過與PLLA的疏水-疏水相互作用將疏水物質例如C6以高達1000mg/ml的濃度載至樹枝狀聚合物中。反應性聚合物與可生物降解的聚合物的結合在響應生理刺激例如溫度實現藥物的持續(xù)釋放方面具有優(yōu)勢。
智能的或反應性的聚合物對物理的、化學的或生物的刺激如溫度、溶劑組成、pH、離子強度、壓力、電場、光和代謝物有反應。在熱反應性聚合物中，聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAAM)已經廣泛地用于受控的藥物傳遞，因為它在約32℃的水溶液中，在低臨界溶液溫度(LCST)下表現出獨特的溶解度轉變(solubility transition)。當冷卻至低于LCST時，其擴大和膨脹，當加熱至高于LCST時，其收縮和崩潰?？梢酝ㄟ^向PNIPAAM中混入疏水性和親水性單元以及交聯劑而操控PNIPAAM的LCST，從而控制載藥和藥物的釋放。
重要的是，基于PNIPAAM的聚合物可用作用于位點特異性的藥物傳遞的可逆的靶向體。在本發(fā)明中，將聚合物設計成具有37℃至42℃之間的LCST。在低于LCST的37℃體溫時，聚合物可溶于生理性液體中，逃避身體的網狀內皮組織系統(tǒng)(RES)，并增加所載藥物的血液循環(huán)時間。當通過但不限于局部的超聲波和/或熱貼片使溫度升至高于聚合物在靶位點的LCST的42℃時，聚合物在靶位點累積，并以較高的局部濃度釋放出治療藥物。已經證實，在小鼠中全身注射LCST為40℃的聚(NIPAAM-共-丙烯酰胺)，局部高溫使共聚物在實體瘤處累積的程度比加熱的和未加熱的對照組高2倍。另外，已經制備LCST為40℃的由聚(N-異丙基丙烯酰胺-共-N，N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚(D，L-丙交酯)組成的可生物降解的和熱反應性膠束。已經證實，在高于LCST的42.5℃，由于細胞對膠束的攝入加快，載于膠束中的抗癌藥物阿霉素對牛主動脈內皮細胞的細胞毒性比游離的阿霉素高。由于PNIPAAM共價地與聚陽離子PLL(親水性和穩(wěn)定性)和可生物降解的PLLA(疏水性、受控的釋放)連接，本發(fā)明的樹枝狀納米顆粒擴展了PNIPAAM的熱反應性質。而且，該多功能的樹枝狀聚合物可載有促凋亡的脂質C6以誘導乳腺癌細胞凋亡。
水凝膠是三維交聯的聚合物網絡，其在水性環(huán)境吸收大量的水而膨脹，同時維持它們的結構。由于它們的高水含量、生物相容性和獨特的機械性質，水凝膠已經在生物醫(yī)藥應用如藥物傳遞和組織工程學方面引起了廣泛的興趣。通過響應環(huán)境刺激如溫度、pH、電信號、離子強度等而改變其結構，本發(fā)明的對環(huán)境敏感的水凝膠可以控制藥物釋放。共價地和非共價地(物理地)交聯的對溫度敏感的、可生物降解的凝膠是作為水凝膠的優(yōu)選材料。
更具體而言，將水凝膠制備成由下述成分組成共聚網絡N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAM)或其衍生物作為智能的或反應性成分、聚(L-乳酸)(PLLA)或其衍生物作為可水解地降解的和疏水性的成分、以及葡聚糖或其衍生物作為可酶促地降解的和親水性的成分。各成分或鏈段可以是任意的長度，包括約3個單體單元至約10,000個單體單元，例如約3至5,000個單元。該材料或鏈段還可以進一步包含其它的單體單元以該調節(jié)材料的性質。例如，該水凝膠還可以包含陰離子(丙烯酸)和陽離子(丙烯酰胺(acrylic amine))單元以增加凝膠的pH和離子強度敏感性。
PNIPAAM-PLLA-葡聚糖水凝膠是熱反應性的，低臨近溶液溫度(LCST)在約32℃，且它們的溶脹性質強烈地依賴于溫度變化、親水性/疏水性成分的平衡以及PLLA成分的降解。通過ATR-FTIR和重量減少實驗測得，PLLA成分中酯鍵水解斷裂造成的水凝膠的降解在低于LCST的25℃時比在高于LCST的37℃時更快。
不受理論的約束，據稱，當將治療化合物如能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或基因治療劑混入納米級裝配系統(tǒng)如脂質體、可再吸收的非聚集的納米顆粒、或聚合材料如樹枝狀聚合物或水凝膠中時，它們向癌細胞的全身傳遞增強，從而極大地增強了能使生長停滯的、促凋亡的化合物的效力。另外，可以應用富集或包封有神經酰胺的納米技術在復合療法中傳遞更小劑量的其它疏水性化療劑或基因治療劑，以實現更高的功效且具有更低的副作用。
下面的實施例用于進一步解釋本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案，而不具備限制的性質。僅僅使用常規(guī)實驗，本領域技術人員就能夠認識到或能夠確定許多與本文所述的具體物質和方法等同的方案。
實施例實施例1-通過脂質體傳遞的C6-神經酰胺-誘導的乳腺癌細胞凋亡材料和細胞培養(yǎng)卵磷脂酰膽堿(EPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)、膽固醇(CH)、聚乙二醇(2000-5000)-二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG-DSPE)、D-赤-己?；?鞘氨醇(C6-神經酰胺)、聚乙二醇-750-C8-神經酰胺(PEG-C8)、二油?；?1，2-二酰基-3-三甲基-銨-丙烷(DOTAP)購自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)。二氫-赤-己?；?鞘氨醇(DHC6)購自Biomol(Plymouth Meeting，PA)。[3H]-C6購自ARC(St.Louis，MO)，[3H]-胸苷購自ICN(Costa Mesa，CA)，膽甾-1，2-3H(N)十六烷基醚([3H]-CHE)購自Perkin Elmer(Boston，MA)。Silica gel 60薄層色譜板購自EMD Chemicals(Gibbstown，NJ)。Formvar/碳包裹的400目銅網購自Electron Microscopy Sciences(Fort Washington，Pa)，聚-L-賴氨酸購自Sigma(St Louis，MO)。
對磷酸化的-Akt(pAkt)和Akt-1，2，3特異性的抗體購自Cell Signaling(Beverly，MA)。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)購自CalBiochem(San Diego，CA)。為了進行Western印跡分析，4％-12％預制的SDS-PAGE梯度凝膠購自Invitrogen(Carlsbad，CA)，ECL試劑購自Amersham(Piscataway，NJ)。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自UpState Biotechnology(Waltham，MA)。Vybrant細胞凋亡實驗試劑盒#3購自Molecular Probes(Eugene，OR)，Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7Assay購自Promega(Madison，WI)。RNA酶購自Roche(Indianapolis，IN)，碘化丙啶(PI)購自Sigma(St.Louis，MO)。人MDA-MB-231(MDA)乳腺癌細胞購自ATCC(Manassas，VA)，并在37℃、于添加了10％FBS的RPMI 1640中生長。該細胞系是人乳腺癌的高侵蝕轉移的、雌激素受體-陰性的模型。
脂質體制劑和擠出配制了脂質并測試了它們將C6混入脂質體藥物傳遞囊中的能力。簡而言之，將溶解到氯仿(CHCl3)中的脂質以特定的摩爾比混合，在高于脂質轉變溫度的氮氣流下干燥，并用無菌的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)水合。超聲處理得到的溶液2分鐘，隨后通過100nm聚碳酸酯膜擠出。通過將痕量的[3H]C6混入制劑中，在CHCl3/MeOH(2∶1)中萃取脂質組分(constituent lipid)，使用閃爍計數器對比擠出前后的放射活性，從而確定混入的效率。用于體內施用的制劑包含DSPC∶DOPE∶DSPE-PEG(5000)∶C8-神經酰胺-PEG(750)∶C6-神經酰胺(3.75∶1.75∶0.75∶0.75∶3.0，摩爾比)。加入PEG(750)-C8，允許含高達30mol％的C6-神經酰胺。在410.4乳腺癌細胞中確定這些PEG化的制劑的生物活性。通過在氯仿/甲醇(2∶1)中萃取脂質組分，隨后使用CHCl3/MeOH/ddH2O(60∶25∶4)溶劑系統(tǒng)，在預熱的硅膠60薄層色譜(TLC)板上拆分，從而驗證了所配制的脂質體的組成。在碘室中使脂質可視化。使用透射電子顯微術(TEM)來表征所配制的脂質體的大小和形態(tài)學。
透射電子顯微術(TEM)為了表征所配制的脂質體的大小和形態(tài)學，使用了TEM。最初，用聚-L-賴氨酸包裹formvar碳-包裹的400目銅網10分鐘，以促進囊向疏水網的結合。接著，將脂質體樣品應用到干網上，并使其附著5分鐘。將1％磷鎢酸(pH 7.0)施用到干網上再5分鐘以進行負染色。使用60kV的加速電壓，在21,500×放大率下觀察樣品。
TEM分析證實了，對于所有的制劑，所生產的混有C6的脂質體載體具有均勻的大小分布，直徑介于85至140nm之間(圖2A)。圖2B說明脂質體制劑的平均大小。隨著痕量的[3H]C6向常規(guī)制劑中的混入，我們發(fā)現在擠出過程中沒有顯著的神經酰胺損失(圖2C)。另外，在TLC板上分析從常規(guī)脂質體萃取的脂質，證實了在擠出過程中沒有可視的脂質組分減少(圖2D)。
體外藥物動力學將痕量的[3H]C6混入脂質體制劑中以確定脂質體傳遞與非脂質體施用相比的量。以3.5×104細胞/孔將人MDA-MB-231(MDA)乳腺癌細胞接種到24-孔板中，在含有10％FBS的培養(yǎng)基中生長過夜。然后在添加了1％FBS的培養(yǎng)基中，用含有痕量的[3H]C6或[3H]CHE的脂質體或非脂質體C6以不同的時間間隔處理細胞。將脂質體C6直接添加到細胞培養(yǎng)基中，將非脂質體C6加入二甲基亞砜(DMSO)載體中，至終濃度≤0.1％(v/v)。在指定的時間點去除培養(yǎng)基，用冷PBS洗滌細胞1次以分離脂質體/膜-非特異性的相互作用。然后用1％SDS溶解細胞，使用閃爍計數器確定MDA細胞中的[3H]C6或[3H]CHE累積。
結果表明，在有1％FBS存在的情況下，脂質體制劑傳遞的C6比C6的非脂質體施用效力更強、效率更高(圖3A)。陽離子脂質體傳遞使MDA細胞的神經酰胺累積增加了2倍，在約16小時時觀察到了最大累積。發(fā)現常規(guī)的和PEG化的脂質體具有類似的體外藥物動力學特征。
然后，研究了C6從脂質體載體釋放或轉移到細胞膜內的機制。使用不可轉移的膽固醇脂質標記[3H]CHE作為脂質體/細胞膜聯合的探針，用[3H]C6或[3H]CHE標記脂質體，并與MDA細胞一起溫育指定的時間。如圖3B所示，脂質體會介導C6、而不是膽固醇從藥物載體向細胞膜轉移。而且，隨著C6隨時間累積，CHE累積不能顯著增加到背景水平以上。還以劑量-依賴性的方式觀察到了神經酰胺和膽固醇累積之間的不一致(圖3C)。這表明，C6是通過脂質轉移過程傳遞，該過程使得無需相關的脂質體/細胞膜融合C6即可從脂質體分配出來進入質膜雙層。
-胸苷細胞增殖為了確定常規(guī)的脂制劑向MDA細胞傳遞短鏈神經酰胺的應用，進行了[3H]胸苷增殖實驗。簡而言之，將MDA細胞以3.5×104細胞/孔接種到24-孔板中，并生長過夜，隨后血清饑餓24小時。在血清饑餓的第12小時，在剩余的血清饑餓期間用脂質體或非脂質體C6處理細胞。血清饑餓后，給培養(yǎng)基添加FBS(10％終濃度)再經過12小時，通過在最后的4小時處理中加入0.5mCi/ml[3H]胸苷檢測細胞的增殖。用冷PBS洗滌細胞1次，然后用10％三氯醋酸洗滌2次、10分鐘。用0.3N NaOH溶解細胞，使用閃爍計數器檢測混入酸不溶性DNA中的[3H]胸苷。
如圖4A所示，補充了C6的含有卵磷脂酰膽堿(EPC)和膽固醇(CH)的常規(guī)脂質體(實線)表現出對MDA細胞增殖的明顯的劑量依賴性抑制。將泡囊-去穩(wěn)定的脂質、二油?；字Ｒ掖及?DOPE)加入常規(guī)制劑中也增強C6的生物活性。在有10％FBS存在、處理12小時的情況下，當用25uM或更多的脂質體C6處理時，完全抑制了MDA細胞的生長。在脂質體制劑中傳遞C6，使IC50減少了約3倍，從非脂質體至脂質體分別從15降至5uM。與在DMSO載體中的非脂質體地施用的C6(虛線，空心圓)相比，這些常規(guī)制劑表現出提高的對MDA細胞的生長的劑量-反應性抑制，表明具有提高的效力和功效。不含有C6的脂質體(Ghost；虛線，空心正方形)以及PBS對照組未表現出顯著的生長抑制，表明C6是唯一的生物活性劑。該研究證實了C6-配制的常規(guī)脂質體作為抗增殖劑比游離地施用的C6更有效。
接著，研究了C6-向陽離子脂質制劑中的混入(圖4B)。盡管用帶正電荷的脂質、二油?；?1，2-二?；?3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)配制的Ghost陽離子脂質體(虛線，空心三角形)自身即增強MDA細胞增殖，但混有C6的陽離子脂質體(實線，空心三角形)劑量-依賴性地減少了MDA細胞增殖。該陽離子制劑比非脂質體C6施用(虛線，空心圓)更有效，但是不如常規(guī)制劑有效(實線，空心正方形)。這表明，陽離子脂質體制劑也可以用于傳遞生物活性的神經酰胺，以劑量-依賴性地抑制細胞增殖。
接著，研究了PEG化的脂質進一步增強C6的生物活性的作用。選擇了C8-神經酰胺(PEG-C8)，因為它還有促進脂質體/膜融合的潛在優(yōu)點。另外，已知包含PEG-C8會促進脂質體雙層的時間-釋放性質，具有生物利用度擴展的附加優(yōu)點。而且，本實施方案使用PEG C8來穩(wěn)定脂質雙層，使脂質體含有濃度高達至少30mol％的游離的生物活性C6神經酰胺。另外，本實施方案使用PEG C8作為脂質體的必備成分，所述脂質體含有生物活性的神經酰胺和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑。而且，PEG-C8配制的脂質體能確保游離的神經酰胺向富含小窩蛋白的脂筏中的最佳插入和定位，這是膜內在化和向包括線粒體的亞細胞器轉移，以隨后誘導靶組織或腫瘤的細胞凋亡或程序性細胞死亡的先決條件。
PEG化的脂質體沒有顯著地影響MDA細胞增殖，表明PEG-C8是生化惰性的。但是，在10和25uM時，混有C6的PEG化的脂質體在抑制增殖方面好像不比常規(guī)脂質體更有效(圖4C)。這表明設計用于全身藥物傳遞的PEG化的脂質體制劑也是C6-介導的對MDA細胞增殖的抑制的有效的載體?？傊?，在多種脂質體制劑中傳遞的C6表現出比非脂質體C6對生長具有更高的劑量-反應性抑制，表明具有更高的效力和功效。
MTS細胞毒性實驗為了評價用于體內研究的PEG化的制劑的體外功效，我們在鼠410.4乳腺癌細胞上測試了該制劑。將410.4細胞接種到96-孔板中，在添加了1％FBS的培養(yǎng)基中，用PEG化的脂質體或游離的C6處理24小時。根據生產商的說明，使用Promega Cell Titer Proliferation Kit(Promega)評價細胞毒性。PEG化的脂質體-C6傳遞導致增強的細胞毒性。與在DMSO載體中游離地施用C6相比，施用脂質體-C6制劑會降低C6的IC50。這些數據表明，當在PEG-C8脂質體制劑中傳遞時，C6-神經酰胺的IC50降低35-40％。在有1％FBS存在的情況下進行處理24小時。
半胱天冬酶實驗細胞凋亡與半胱天冬酶活性的上調有關，因而對用PEG化的脂質體處理MDA細胞后的半胱天冬酶-3/7的活性進行評價。簡而言之，將MDA細胞以6.0×103細胞/孔的密度接種到96-孔板中，并在含有10％FBS的培養(yǎng)基中生長48小時。然后在含有1％FBS的培養(yǎng)基中用脂質體或非脂質體C6處理細胞24小時。根據本領域已知的標準方法，使用Apo-ONEHomogeneous caspase-3/7 Assay(Promega，Madison，WI)檢測半胱天冬酶-3/7的酶活性水平。
結果表明，用PEG化的脂質體神經酰胺處理的MDA細胞表現出比用非脂質體神經酰胺處理的細胞顯著更大的半胱天冬酶-3/7活性(圖6)。用Ghost處理沒有觀察到半胱天冬酶-3/7活性的顯著變化?？傊?，這些結果表明，C6-配制的脂質體比C6的非脂質體施用更有效，導致MDA細胞增殖的顯著抑制和最終的凋亡性死亡。
細胞凋亡檢測進行了研究以確定C6-依賴性的生長抑制是否與增強的細胞凋亡相關。為了證實C6傳遞會導致MDA細胞凋亡，進行了TUNEL分析(UpstateBiotechnology，Lake Placid，NY)，它會對細胞凋亡的標志——斷裂的DNA進行染色(圖7A)。
用脂質體和非脂質體C6處理的連續(xù)分裂的、血清喂養(yǎng)的MDA細胞的TUNEL染色證實了在8小時時沒有DNA斷裂。脂質體和非脂質體C6處理以與DNA酶陽性對照類似的方式誘導DNA斷裂。在與C6傳遞的體外藥物動力學特征一致的時間點處理16小時時，觀察到了斷裂的3′-OH DNA的染色。對Ghost制劑沒有觀察到細胞凋亡。
為了定量C6-誘導的細胞凋亡，使用Vybrant細胞凋亡實驗試劑盒(Molecular Probes，Eugene，OR)進行了處理的連續(xù)分裂的MDA細胞的膜聯蛋白V染色和膜聯蛋白V-染色的細胞的流式細胞儀分析。
處理24小時后，PEG化的脂質體C6誘導了比非脂質體C6顯著地更多的膜聯蛋白V染色，而Ghost制劑無影響(圖7B)。
對促存活激酶活化的AKT的評價使用Western印跡分析研究了用脂質體和C6非脂質體制劑處理的MDA細胞中的神經酰胺-調節(jié)的Akt信號途徑。簡而言之，將MDA細胞以4.0×105細胞/孔接種到60mm板中，生長過夜，然后進行24小時血清饑餓。在血清饑餓的第16小時，在剩余的血清饑餓期間用脂質體或非脂質體C6處理細胞。在血清饑餓的第24小時，將IGF-1(20ng/ml)加入細胞培養(yǎng)基中15分鐘。用冷PBS洗滌細胞1次，然后在冰上加入150μl冷的裂解液(1％Triton X-100、20mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、2.5mM Na4P2O7、1mMβ-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4、1μg/ml在ddH2O中的亮肽素，pH 7.5)。在冰上裂解細胞15分鐘，收集細胞裂解物，并以15,000×G離心15分鐘。將35μg蛋白載樣于4％-12％預制的SDS-PAGE梯度凝膠中檢測pAkt。剝離印跡并重新探測Akt-1，2，3以證實載樣量相同。使用ECL化學發(fā)光使蛋白條帶可視化，并通過密度測定法定量。結果表明，在降低IGF-1-刺激的pAkt水平方面，PEG化的脂質體C6比非脂質體神經酰胺更有效，而Ghost制劑對pAkt水平無作用(圖8A和8B)。與非脂質體DHC6相比，脂質體二氫-赤-己?；?鞘氨醇(DHC6)也表現出對IGF-1-刺激的Akt磷酸化的抑制。選擇了C6處理的8小時，因為該時間點對應著C6向MDA細胞中幾乎最大的累積。該研究結果證實了脂質體C6通過長期抑制Akt信號級聯放大而誘導細胞生長抑制和細胞凋亡。
共焦研究為了證實C6在410.4鼠乳腺癌細胞中的細胞累積，我們施用了含有10摩爾％NBD-C6作為C6標記的脂質體-C6制劑。使用DAPI(核)對細胞復染色(counter-stain)，MitroTraker Red(線粒體)作為參考。通過60×放大率的共焦顯微術評價了C6傳遞。獲得NBD-C6自脂質體囊向細胞傳遞的共焦顯微圖像(圖9A)。NBD-C6(綠色)共定位于線粒體(MitoTraker-Red)；所染上的藍色代表染有DAPI的核。
蔗糖梯度將痕量的[3H]-C6混入脂質體制劑中用以評價C6在全部細胞和富集小窩的脂筏中的時間-依賴性的細胞累積。由于認為這些脂筏會促進多種途徑包括神經酰胺的信號轉導，因此施用脂質體-C6應當會促進C6在脂筏中的累積。為了評價該現象，以細胞裂解物的蔗糖梯度(5％、35％、和45％蔗糖)分離富集小窩的脂筏。取出梯度的每1ml級分(共12個級分)的等分試樣，使用閃爍計數器計數。使用[3H]-C6作為全部C6的標記，脂質體傳遞導致神經酰胺在小窩蛋白脂信號筏中的時間-依賴性的累積(圖9B)。神經酰胺累積在蔗糖梯度的級分4和5中，它們代表著小窩蛋白-1富集的脂筏(小窩)(圖9B)。
體內總結使用乳腺癌的體內小鼠模型系統(tǒng)，建立了用于全身傳遞C6治療實體瘤的方法。體內數據表明了PEG化的脂質體制劑在410.4攜帶腫瘤的BALB/c小鼠中具有有希望的抗癌活性(圖10A-B)。這些體內結果證實，與空Ghost脂質體相比，使用脂質體C6時腫瘤體積的劑量-反應性減少。這是在腫瘤發(fā)生的體內模型中證實全身的C6制劑的功效的第一個實驗。而且，體內藥物動力學分析證實，全身的脂質體C6傳遞導致C6在腫瘤組織中達到并維持穩(wěn)態(tài)生物活性濃度達24小時(圖11A-B)。盡管C6被迅速地從血液和主要的首過器官中清除，但該穩(wěn)態(tài)生物活性濃度得以維持?？傊C實了C6的全身制劑在體外和體內均表現出了具有優(yōu)越的藥物動力學的功效。而且，使用Swiss Webster小鼠證實了PEG化的脂質體-C6制劑在靜脈內注射高達100mg/kg后，沒有毒副作用，而以10mg/kg注射在DMSO中的游離C6殺死50％的小鼠。
體內抗癌功效為了評價全身的脂質體-C6傳遞的體內功效，將5×106個410.4細胞皮下注射進Balb/C小鼠的右后肋側。注射410.4細胞4天后，給小鼠靜脈內(i.v.)注射脂質體-C6、空脂質體(Ghost)、或0.9％NaCl。每2天治療小鼠。在即將治療前，對小鼠稱重，并測量腫瘤。用卡尺測量腫瘤大小，并使用下面的半橢球體公式計算腫瘤體積V＝π/6×L×W2，其中V＝腫瘤體積，L＝長度，且W＝寬度。
脂質體-C6[DSPC/DOPE/DSPC-PEG(5000)/C8-PEG(750)/C6-神經酰胺(3.75∶1.75∶0.75∶0.75∶3.0)]傳遞通過神經酰胺-誘導的細胞凋亡表現出劑量-依賴性的抗腫瘤活性。與空ghost脂質體相比，全身傳遞脂質體-C6以劑量-依賴性的方式抑制腫瘤生長(圖10A)。在用40mg/kg脂質體-C6處理1周后取出腫瘤，制作冷凍切片用于組織學分析(圖10B)。用TUNEL試劑盒對腫瘤切片染色，以評價誘導的細胞凋亡的程度、DAPI-染色的核。
體內藥物動力學使用[3H]-C6作為C6傳遞的標記，給攜帶腫瘤的小鼠注射10和40mg/kg脂質體-C6，在選定的時間點取出血液、腫瘤、脾、腎、肝和心臟組織。對組織稱重、溶解、使用閃爍計數器計數。對取出的每種組織計算每mg組織(或ml血液)的總C6量，并評價藥物動力學特征。為了相對于C6的分布示蹤脂質體載體的傳遞，將[3H]-CHE摻入脂質體制劑中作為傳遞載體的標記。
10和40mg/kg劑量的脂質體-C6似乎遵循一級動力學，在24小時時維持與體外IC50相關聯的足夠的血漿濃度(圖11A)。在這些劑量下，在約30分鐘時腫瘤組織中達到C6的穩(wěn)態(tài)濃度(圖11B)。40mg/kg的劑量使?jié)舛染S持在理想的IC50以上達24小時。使用[3H]-CHE作為PEG化的脂質體載體的標記，脂質體似乎以時間依賴性的方式累積在腫瘤組織中。這可能意味著由于PEG化的脂質體的連續(xù)累積，因而補充在腫瘤中代謝的C6，因此C6在腫瘤組織中的穩(wěn)態(tài)濃度可得以維持。
實施例2-樹枝狀聚合物作為C6-神經酰胺藥物傳遞載體樹枝狀聚合物合成通過使聚(L-賴氨酸)(PLL)樹突與接枝有PLLA的PNIPAAM結合而合成了樹枝狀聚合物。通過自由基聚合反應合成了接枝有PLLA的PNIPAAM(圖12)。
樹枝狀聚合物熱反應性性質在不同的濃度下，以1℃/30分鐘的速度升高溫度，在500nm處使用UV-可見光譜儀(Perkin Elmer Lamda 25，Shelton，CT)來研究樹枝狀聚合物在PBS(pH＝7.4)中的透光率(圖13A)。樹枝狀聚合物是熱反應性的，分別在1、0.5、0.1、和0.05mg/ml的濃度表現出31、32、34、和39℃的低臨界溶液溫度(LCST)(定義為在95％最大透光率時的溫度)。隨著樹枝狀聚合物濃度的降低，LCST變得模糊。在LCST以上，由于聚合物的相互作用增加，透光率大小隨著濃度的增加而降低。PNIPAAM和接枝有PLLA的PNIPAAM的LCST隨著對數濃度線性下降，由于PLLA的疏水性，后者在各濃度比前者低2℃。但是，當PLL結合到接枝有PLLA的PNIPAAM的兩端時，由于PLL的正電荷和親水性，樹枝狀聚合物的LCST表現出與對數濃度的非線性關系，并且與其它2種聚合物相比其值最高。
使用動態(tài)光散射(DLS)(ALV，Germany)通過測量樹枝狀聚合物對溫度的流體動力學大小，進一步確認了樹枝狀聚合物的熱反應性性質。樹枝狀聚合物在PBS(pH＝7.4)中的表觀流體動力學直徑(Dh)在3種濃度1、0.5和0.1mg/ml下、分別在3個區(qū)域表現出溫度依賴性(未顯示數據)。在低溫范圍，Dh隨著溶液溫度的升高而略有降低，反映了各鏈的收縮。在中溫范圍，Dh在達到它們的最大值之前增加，表明樹枝狀聚合物納米顆粒由于鏈間結合而彼此聚集。在高溫范圍，由于鏈內收縮，Dh隨著聚集溫度的升高而降低。樹枝狀聚合物的LCST是29(可能在25和29℃之間)、30和31℃，分別定義為在3種濃度1、0.5和0.1mg/ml時的Dh-溫度曲線的最初的拐點。在低溫范圍和中溫范圍，Dh隨著濃度的增加而增加，因為鏈間相互作用也隨著濃度的增加而增加。對于相同的溶液濃度，通過DLS測得的LCST略低于通過UV-可見光譜測得的值，這歸因于測量裝置的不同。DLS和UV-可見結果都證實，LCST隨著濃度的增加而降低。
C6神經酰胺和生物智能納米樹枝狀聚合物使用MALDI-TOF，通過測量樹枝狀聚合物的摩爾質量隨時間的變化，從而檢測了1mg/ml的樹枝狀聚合物分別在低于和高于LCST的溫度的25和37℃、于PBS(pH＝7.4)中的動態(tài)降解。在達1個月的時間內，樹枝狀聚合物的摩爾質量數(Mn)隨時間而降低，且在37℃比在25℃降低得更快，且在兩個溫度都在19天后達到相對穩(wěn)定的值。有趣的是，19天后穩(wěn)定的Mn是約2700g/mol，將其從起始Mn(約4200g/mol)中減去后約是1500g/mol，等于PLLA的摩爾質量數。該結果表明，樹枝狀聚合物降解、且它們的降解可能歸因于樹枝狀聚合物的PLLA成分的水解性降解。為了支持上面的觀點，分別隨時間測量了樹枝狀聚合物的FTIR光譜和粘度(未顯示數據)。發(fā)現在約1760cm-1的歸因于PLLA的酯C＝O伸縮振動的峰強度清楚地隨著時間而降低，并在19天后消失。因為在約1660cm-1的歸因于PNIPAAM和PLL的酰胺C＝O伸縮振動的峰相對穩(wěn)定，因此它們用作參比峰以標準化在約1760cm-1的峰強度。得到的峰高度百分比隨著時間而降低，并在19天后變?yōu)?(未顯示數據)。另外，發(fā)現樹枝狀聚合物的粘度(通過Cannon-Ubbelohde型粘度計測量，按照ASTM D 445和ISO 3104的方法)隨著時間而降低，且在37℃比在25℃降低得快，并在19天后達到穩(wěn)定值(未顯示數據)。因此，FTIR結果以及粘度測量和MALDI-TOF結果強烈地表明，由于PLLA成分的水解性降解，所設計的樹枝狀聚合物可生物降解。
C6包封率的方法學。在包含蒸餾水、乙醇和N-二甲基甲酰胺(DMF)(蒸餾水/乙醇/DMF{5∶5∶3，v/v/v})的溶劑系統(tǒng)中，在1mg/ml的濃度下將C6以3∶1(C6∶樹枝狀聚合物，w/w)的比率與樹枝狀聚合物混合，密封、并在室溫儲存7小時。將C6/樹枝狀聚合物溶液置于纖維素膜(MWCO-3500)中，并在乙醇(50ml)中透析，從膜的內側去除游離的C6。通過MALDI-TOF質譜分析測量纖維素膜內側和外側的C6的量。以1∶9(樣品∶基質)的比例將膜內側和外側的溶液與2，5-二羥基苯甲酸的基質溶液混合。使用C16-神經酰胺(C16)作為內標物，并加入每種溶液中。通過分別在424和562m/z的C6和C16質譜峰的相對強度隨時間(2、4、6、和10小時)計算出C6的量。以3∶1的比率將C6載至樹枝狀聚合物中(C6∶樹枝狀聚合物)，產生約35.94±1.2％的包封率。
從樹枝狀聚合物釋放C6的方法學。為了評價C6和樹枝狀聚合物之間的相互作用，必須評價C6從樹枝狀聚合物釋放的動力學。由于樹枝狀聚合物的水解性降解，C6的釋放率(Mt/Wω，其中Mt和Wω分別是在時間t釋放出的C6的量和釋放出的C6的最大量)隨著時間而增加。將樹枝狀聚合物-C6復合物溶于無菌的PBS(pH＝7.4)中，并置于纖維素膜(MWCO＝3500)中，在含有0.5％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)的無菌PBS(pH＝7.4)(50ml)中透析。由于C6是非常疏水的，必須在有去污劑(例如SDS)存在的情況下進行透析。在連續(xù)磁力攪拌下，在低于(25℃)和高于(37℃)LCST的溫度時，樹枝狀聚合物的終濃度是0.02、0.05、0.1和0.5mg/ml。在選定的時間(0至30天)間隔處取出1ml緩沖溶液，并用新鮮的緩沖液替換，以測定所釋放的C6的濃度。為了定量C6從樹枝狀聚合物中的釋放，使用C16作為內標，通過MALDI-TOF質譜分析測量了纖維素膜內側和外側的C6的量。在溫度高于樹枝狀聚合物的LCST的37℃，樹枝狀聚合物更為疏水，因而導致C6從載有C6的樹枝狀聚合物中的釋放更加緩慢(圖13B)。
樹枝狀聚合物的降解性質由于聚合的納米顆粒與脂質體技術相比具有如上所述的優(yōu)點，我們將C6載至溫度敏感的樹枝狀聚合物納米顆粒中，以使用溫度-誘導的傳遞策略靶向于實體瘤。我們專有的樹枝狀聚合物納米顆粒包含PLLA、PLL、和PNIMPAM。如上所述，使用UV-可見光譜監(jiān)控樹枝狀聚合物溶液的透光率隨著逐漸升高的溫度的變化，我們觀察到急劇的轉變，證實了這些樹枝狀聚合物確實是熱反應性的。發(fā)現這些原型的樹枝狀聚合物在100μg/ml時的近似LCST是約34℃。使用MALDI-TOF質譜分析，我們證實了樹枝狀聚合物的摩爾質量隨著時間而降低，這驗證了它們也是可生物降解的(未顯示數據)。如共焦顯微術所分析的，在溫度高于LCST(37℃)時比低于LCST(25℃)時樹枝狀聚合物在MDA細胞中優(yōu)先累積(圖14A)，這可能是由于增加的疏水性。而且，使用流式細胞儀來定量FITC-標記的樹枝狀聚合物的胞內累積和攝入，我們證實了在溫度高于LCST(37℃)時比低于LCST(25℃)時，MDA細胞中有明顯更多的樹枝狀聚合物攝入(圖14B)。更重要的是，用這些載有C6的樹枝狀聚合物處理MDA細胞產生顯著的生長抑制/細胞毒性，而樹枝狀聚合物自身不表現出細胞毒性(圖15A)。除了誘導生長停滯外，C6-富集的樹枝狀聚合物還誘導MDA細胞的凋亡(圖15B)?？傊覀兊呐R床前數據證實樹枝狀聚合物能有效地控制抗癌藥物C6的釋放。該實施方案的優(yōu)化已經包括設計具有略高于生理溫度的LCST的聚合的樹枝狀聚合物以允許生理的高溫的藥物傳遞。
樹枝狀聚合物作為C6-神經酰胺的藥物傳遞載體裝載和釋放主要目的是生成可生物降解的和溫度-敏感的樹枝狀的納米顆粒，其可以與C6復合、靜脈內注射、溶于血流中較長的時間，并實現治療劑向實體瘤的靶向的和持續(xù)的傳遞。為了產生LCST為約40℃的樹枝狀聚合物以將樹枝狀聚合物經熱方法(thermally)靶向于實體瘤，NIPAAM、疏水性PLLA和親水性PLL之間的相對摩爾比起關鍵作用。眾所周知，均聚物PNIPAAM具有32℃的LCST{Eeckman，2001#52}。通過分別增加摻入的疏水性或親水性成分的量，可以降低或增加該LCST{Eeckman，2001#52}。
為了設計制造生物反應性的、智能的、能在高于生理溫度的局部高溫誘導下釋放C6的樹枝狀聚合物，對樹枝狀聚合物結構進行優(yōu)化。為了設計具有略高于37℃的最佳LCST的樹枝狀聚合物，我們將PLLA替換為更柔性的和無定形的聚合物，例如摩爾質量為800、2000和4000g/mol的聚(D，L-乳酸)(PDLLA)。其次，我們使用PLL的不同代(樹枝狀的結構的連續(xù)的同心環(huán))，例如3、4或5。最后，我們使用PDLLA大分子和NIPAAM單體之間的不同摩爾比，例如0.02、0.05和0.1mol％。通過隨溫度測量透光率以UV可見光譜評價、通過隨溫度測量流體動力學大小以光散射評價得到的樹枝狀聚合物的LCST。
通過與N-異丙基甲基丙烯酰胺(NIMAAM)的共聚增加樹枝狀聚合物的LCST。在50、60、和70％的NIPAAM單體時，隨著NIMAAM單體的增加，得到的樹枝狀聚合物分別表現出36、42、和44℃的LCST。以此方式，我們已經設計了生物智能的、能通過局部高溫靶向于腫瘤從而將疏水性化療劑釋放于實體瘤的樹枝狀聚合物，所述疏水性化療劑包括能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的第二信使?？梢酝ㄟ^使用超聲波或熱貼片裝置把局部腫瘤溫度升高到樹枝狀聚合物的LCST之上，從而實施局部加熱。該過程稱作“生理的高溫的藥物傳遞”。
樹枝狀聚合物的細胞存活性。
下面的實施例將進一步說明。
實施例3-合成用于全身傳遞的含有神經酰胺的具有磷硅酸鈣外殼的可再吸收的納米顆粒使用未經進一步純化的非離子型表面活性劑聚(氧乙烯)壬基苯基醚(Igepal CO-520，Aldrich Chemical Co.)制備了反膠束。環(huán)己烷、去離子水和C6-神經酰胺原樣用于合成。
在快速攪拌下，在環(huán)境溫度、30mL小瓶中制備了由4mL Igepal、10mL環(huán)己烷和去離子水組成的總體積為20mL的微乳。這生成了均勻的混合物，向其中加入在水相中的痕量C6作為水和藥物的膠束混合物。得到的含有C6的膠束結構被CPS包裹，CPS的組成為Cax(PO4)yzSiO2，其中0.1≤x≤100.1，0.1≤y≤10，并且0≤z≤10。通過改變水和表面活性劑的比率(R＝[水]/[表面活性劑])控制得到的納米顆粒的大小。
將反膠束包封在CPS包衣中后，洗滌納米顆粒，使用為用于具有含C6的外殼的納米顆粒特別改進的尺寸排阻高效液相色譜(SEC)濃縮。使用比普通柱短的、含有直徑約20微米的微孔硅顆粒的洗脫柱，向其中加入乙醇作為洗脫劑。為了分散納米顆粒，將烷基胺硅烷偶聯劑、氨基丙基三氯硅烷加入懸浮液中。該偶聯劑也加入用于填充SEC柱的微孔硅顆粒中。根據需要，通過加入醋酸或氫氧化鈉將懸浮的納米顆粒的pH維持在約7.0。另外，使碳二亞胺-介導的聚乙二醇(PEG)偶聯劑結合到烷基胺偶聯劑上。
實施例4-水凝膠作為C6-神經酰胺釋放載體合成并表征了9種多功能的具有熱反應性和可生物降解性質的水凝膠。水凝膠是共聚的網絡，其由下述組分組成N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAM)作為熱反應性成分、聚(L-乳酸)(PLLA)作為可水解地降解的和疏水性成分、且葡聚糖作為可酶促地降解的和親水性成分。由于它們的多功能性質，設計的水凝膠適用于生化應用，包括藥物傳遞和組織工程(圖16)。
水凝膠表現出熱反應性的性質，且LCST是約32℃，對于PNIPAAM是典型的。在約4個月后，水凝膠也是可隨孔徑的增加而水解地生物降解的。在高于(37℃)和低于(25℃)LCST的溫度下，水凝膠的溶脹行為是不同的，且強烈地依賴于共聚物的親水性和疏水性?？傊?，通過改變其共聚物組分和熱反應性和可生物降解性質，水凝膠具有很大的潛力來受控地和持續(xù)地釋放C6-神經酰胺。
應當明白，本文所述的實施例和實施方案僅僅用于解釋目的，本領域的技術人員參考它們會作出各種改進或變化，這些改進或變化也包括在本申請的精神和范圍內。
權利要求
1.一種用于將治療性化合物傳遞給需要這種傳遞的動物或人的系統(tǒng)，其包括納米級裝配系統(tǒng)，所述納米級裝配系統(tǒng)含有能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑。
2.權利要求1的系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物選自以下組中神經酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚連接的甘油二酯、醚連接的磷脂酸、鞘氨醇和二氫鞘氨醇。
3.權利要求1的系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物是短鏈神經酰胺類似物。
4.權利要求1的系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物包括在SN-2位含有2-10個碳的短鏈脂肪酸的神經酰胺或其衍生物。
5.權利要求1的系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物包括在SN-2位含有12-24個碳的長鏈脂肪酸的生理神經酰胺或其衍生物。
6.權利要求1的系統(tǒng)，其中基因治療劑選自以下組中寡核苷酸、核酶、DNA-酶(DNA-zyme)、質粒、反義或Si-RNA。
7.權利要求1的系統(tǒng)，其中含有能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑的納米級裝配系統(tǒng)通過靜脈內、導管傳遞、輸液泵、微球或藥膏全身傳遞。
8.權利要求1的系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑被全身地傳遞以治療涉及細胞生長障礙的病理。
9.權利要求8的系統(tǒng)，其中病理選自以下組中癌癥、腫瘤、動脈炎癥疾病、動脈粥樣硬化、再狹窄或易損斑塊以及糖尿病。
10.權利要求1的系統(tǒng)，其中納米級裝配系統(tǒng)是脂質體組合物，其具有一個或多個包含能使生長停滯的、衍生于脂質的、生物活性化合物和膽固醇的膜。
11.權利要求1的系統(tǒng)，其中納米級裝配系統(tǒng)是脂質體組合物，其具有一個或多個包含能使生長停滯的、促進凋亡的、衍生于脂質的生物活性化合物、膽固醇和陽離子脂質的膜。
12.權利要求11的系統(tǒng)，其中陽離子脂質是二油?；?1，2-二?；?3-三甲基銨-丙烷。
13.權利要求1的系統(tǒng)，其中納米級裝配系統(tǒng)是脂質體組合物，其具有一個或多個包含能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物、膽固醇和PEG化的脂質的膜。
14.權利要求13的系統(tǒng)，其中PEG化的脂質是聚乙二醇-450-C8-神經酰胺。
15.權利要求14的系統(tǒng)，其中將PEG化的脂質體配制為含有大小為750-5000的PEG化的可透過細胞的神經酰胺(PEG-C8)和/或大小為2000-5000的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG DSPE)。
16.權利要求15的系統(tǒng)，其中含有PEG-C8的PEG化的脂質體穩(wěn)定脂質雙層，從而允許脂質體含有濃度高達至少40mol％的游離生物活性C6神經酰胺。
17.權利要求16的系統(tǒng)，其中含有PEG-C8的PEG化的脂質體是所述含有生物活性神經酰胺和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑的脂質體的必備成分。
18.權利要求17的系統(tǒng)，其中含有PEG-C8的PEG化的脂質體確保游離的神經酰胺向富含小窩蛋白的脂筏中的最佳插入和定位，這是膜內在化和向亞細胞器如線粒體中轉移的先決條件。
19.權利要求18的系統(tǒng)，其中含有PEG-C8的PEG化的脂質體確保線粒體功能障礙并隨后誘導靶組織或腫瘤的細胞凋亡或程序性細胞死亡。
20.權利要求1的系統(tǒng)，其中納米級裝配系統(tǒng)是脂質體組合物，其具有一個或多個包含能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物、膽固醇和融合脂質的膜，所述的脂質體組合物含有用于傳遞給動物或人的治療性化合物。
21.權利要求20的系統(tǒng)，其中融合脂質是去穩(wěn)定脂質，其在水溶液中形成六角形的構象，生成反膠束。
22.權利要求1的系統(tǒng)，其中納米級裝配系統(tǒng)包含具有磷硅酸鈣外殼的可再吸收的納米顆粒，所述的可再吸收的納米顆粒含有能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑。
23.權利要求22的系統(tǒng)，其中可再吸收的納米顆粒的直徑范圍為約1-300nm。
24.權利要求22的系統(tǒng)，其中可再吸收的納米顆粒的直徑小于50nm。
25.權利要求22的系統(tǒng)，其中可再吸收的納米顆粒的直徑為約20nm或更小。
26.一種合成權利要求22的可再吸收的納米顆粒的方法，其包含a)通過混合非離子型表面活性劑、疏水性有機溶劑、水和能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑制備反膠束；b)用磷硅酸鈣外殼包裹反膠束；c)向磷硅酸鈣外殼中加入分散劑；以及d)洗滌并使用包含洗脫柱和直徑約20微米的微孔硅顆粒的改進的尺寸排阻高壓液相色譜技術濃縮可再吸收的納米顆粒，其中將與加入到磷硅酸鈣外殼中的相同的分散劑加入微孔硅顆粒中。
27.權利要求26的方法，其中分散劑是酸、金屬-有機化合物或無機化合物。
28.權利要求27的方法，其中酸選自以下組中檸檬酸、酒石酸和醋酸。
29.權利要求27的方法，其中金屬-有機化合物是烷基胺硅烷偶聯劑或烷基羧酸硅烷偶聯劑。
30.權利要求29的方法，其中烷基胺硅烷偶聯劑選自以下組中氨基丙基三氯硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APS)、3-氨基丙基硅倍半氧烷)、3-環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPS)、三甲氧基甲硅烷基-丙基二亞乙基三胺(DETA)、3-三甲氧基甲硅烷基丙基琥珀酐、以及烷基羧酸硅烷偶聯劑如酰胺-連接的羧基。
31.權利要求30的方法，其中烷基羧酸硅烷偶聯劑是酰胺-連接的羧基。
32.權利要求27的方法，其中無機化合物選自以下組中鈣、磷酸鹽和焦磷酸鹽。
33.權利要求26的方法，其還包括將碳二亞胺-介導的聚乙二醇(PEG)偶聯劑加入分散劑中，以為結合體提供結合點。
34.權利要求33的方法，其中結合體是靶向于身體的致癌的或發(fā)炎的或增殖的細胞或組織的抗體或受體配體。
35.權利要求26的方法，其中改進的尺寸排阻高壓液相色譜技術包括縮短洗脫柱和使用乙醇代替其中的水或丙酮。
36.權利要求1的系統(tǒng)，其中納米級裝配系統(tǒng)是包含能傳遞化療劑的生物智能鏈段和可生物降解鏈段的聚合材料，其中可生物降解鏈段包括疏水性鏈段和親水性鏈段。
37.權利要求36的系統(tǒng)，其中疏水性或親水性鏈段可水解地或酶促地降解。
38.權利要求36的系統(tǒng)，其中智能鏈段包括聚(N-異丙基丙烯酰胺)、聚(N-烷基丙烯酰胺)、聚(N-正丙基丙烯酰胺)、聚(N-異丙基甲基丙烯酰胺)、聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙烷)、彈性蛋白樣多肽、或其衍生物。
39.權利要求36的系統(tǒng)，其中生物智能鏈段是對物理的、化學的或生物學刺激有反應的，且在由不限于靶向的、局部超聲波和/或熱貼片導致的局部高溫誘導后釋放選自以下組中的物質疏水性生物活性脂質、化療劑和基因物質。
40.權利要求36的系統(tǒng)，其中聚合材料是用于增強所述的化療劑的傳遞的樹枝狀聚合物，其中所述的樹枝狀聚合物包括聚(N-異丙基丙烯酰胺)鏈段或其衍生物、聚(賴氨酸)鏈段或其衍生物、以及聚(乳酸)鏈段或其衍生物。
41.權利要求40的系統(tǒng)，其中樹枝狀聚合物是生物智能的、可生物降解的、LCST大于37℃的、用于生理性高溫藥物傳遞的納米樹枝狀聚合物，其包括用聚(DL-乳酸)代替聚(乳酸)，混入超過3代的PLL樹突；增加NIPAAM與聚(乳酸)或聚(DL-乳酸)的比率，以及使NIPAAM和NIMAAM(N-異丙基-甲基-丙烯酰胺)共聚。
42.權利要求36的系統(tǒng)，其中聚合材料是水凝膠。
43.權利要求42的系統(tǒng)，其中水凝膠材料包含生物智能鏈段和可生物降解鏈段，其中可生物降解鏈段包括葡聚糖、聚乳酸、或其衍生物。
44.一種將組合物施用于需要它的動物或人的方法，其包括將權利要求1的納米級裝配系統(tǒng)施用于動物或人。
45.權利要求44的方法，其中包含在納米級裝配系統(tǒng)中的能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑的濃度高達約1000mg/ml。
46.權利要求45的方法，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑占組合物的約40wt％。
47.一種用于將治療性化合物傳遞給需要這種傳遞的動物或人的脂質體組合物，其包括具有一個或多個膜的脂質體，所述的膜包含膽固醇和選自以下組中的能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物神經酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚連接的甘油二酯、醚連接的磷脂酸、鞘氨醇和二氫鞘氨醇；其中所述的脂質體組合物中含有選自以下組中的能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物神經酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚連接的甘油二酯、醚連接的磷脂酸、鞘氨醇和二氫鞘氨醇；和/或疏水性化療劑和/或選自以下組中的基因治療劑寡核苷酸、核酶、DNA酶、質粒、反義或Si-RNA。
48.權利要求47的脂質體組合物，其中神經酰胺和/或其衍生物包含在SN-2位的具有2-10個碳的短鏈脂肪酸或在SN-2位的12-24個碳的長鏈脂肪酸。
49.權利要求48的脂質體組合物，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑被全身地傳遞以治療涉及細胞生長障礙的病理。
50.權利要求49的脂質體組合物，其中病理選自癌癥、腫瘤、動脈炎癥疾病、動脈粥樣硬化、再狹窄、易損斑塊和糖尿病。
51.一種將組合物施用于需要它的動物或人的方法，其包括將權利要求50的脂質體組合物施用于動物或人，其中所包含的能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑的濃度高達1000mg/ml。
52.權利要求51的方法，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑占組合物的約40wt％。
53.一種用于將能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑傳遞給需要這種傳遞的動物或人的可再吸收的納米顆粒裝配系統(tǒng)，其包括含有能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑的具有磷硅酸鈣外殼的納米顆粒，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物選自以下組中神經酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚連接的甘油二酯、醚連接的磷脂酸、鞘氨醇和二氫鞘氨醇；且基因治療劑選自以下組中寡核苷酸、核酶、DNA-酶、質粒、反義或Si-RNA。
54.權利要求53的可再吸收的納米顆粒裝配系統(tǒng)，其中可再吸收的納米顆粒的直徑為約20nm或更小。
55.權利要求54的可再吸收的納米顆粒裝配系統(tǒng)，其中神經酰胺和/或其衍生物包含在SN-2位的2-10個碳的短鏈脂肪酸或在SN-2位的12-24個碳的長鏈脂肪酸。
56.權利要求55的可再吸收的納米顆粒裝配系統(tǒng)，其中使分散劑結合到磷硅酸鈣外殼上以防止納米顆粒的聚集，所述的分散劑選自以下組中氨基丙基三氯硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APS)、3-氨基丙基硅倍半氧烷)、3-環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPS)、三甲氧基甲硅烷基丙基二亞乙基三胺(DETA)、3-三甲氧基甲硅烷基丙基琥珀酐、和烷基羧酸硅烷偶聯劑如酰胺-連接的羧基。
57.權利要求56的可再吸收的納米顆粒裝配系統(tǒng)，其中將碳二亞胺-介導的聚乙二醇(PEG)偶聯劑加入到分散劑中為結合體如抗體提供結合點。
58.權利要求57的可再吸收的納米顆粒裝配系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑被全身地傳遞以治療涉及細胞生長障礙的病理。
59.權利要求58的可再吸收的納米顆粒裝配系統(tǒng)，其中病理選自癌癥、腫瘤、動脈炎癥疾病、動脈粥樣硬化、再狹窄、易損斑塊和糖尿病。
60.一種將組合物施用給需要它的動物或人的方法，其包括將權利要求59的可再吸收的裝配系統(tǒng)施用給動物或人，其中所包含的能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑的濃度高達約1000mg/ml。
61.權利要求60的方法，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑占組合物的約40wt％。
62.一種用于將能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑傳遞給需要這種傳遞的動物或人的樹枝狀聚合物裝配系統(tǒng)，其中樹枝狀聚合物包含聚(N-異丙基丙烯酰胺)鏈段或其衍生物、聚(賴氨酸)鏈段或其衍生物、以及聚(乳酸)鏈段或其衍生物，且另外其中樹枝狀聚合物載有能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑。
63.權利要求62的樹枝狀聚合物裝配系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物選自以下組中神經酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚連接的甘油二酯、醚連接的磷脂酸、鞘氨醇和二氫鞘氨醇；且基因治療劑選自以下組中寡核苷酸、核酶、DNA-酶、質粒、反義或Si-RNA。
64.權利要求63的樹枝狀聚合物裝配系統(tǒng)，其中神經酰胺和/或其衍生物包含在SN-2位的2-10個碳的短鏈脂肪酸或在SN-2位的12-24個碳的長鏈脂肪酸。
65.權利要求64的樹枝狀聚合物裝配系統(tǒng)，其中聚(賴氨酸)鏈段或其衍生物是聚(L-賴氨酸)或其衍生物，且聚(乳酸)鏈段或其衍生物是聚(D，L-乳酸)鏈段或其衍生物。
66.權利要求65的樹枝狀聚合物裝配系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑被全身地傳遞以治療涉及細胞生長障礙的病理。
67.權利要求66的樹枝狀聚合物裝配系統(tǒng)，其中病理選自以下組中癌癥、腫瘤、動脈炎癥疾病、動脈粥樣硬化、再狹窄、易損斑塊和糖尿病。
68.一種將組合物施用給需要它的動物或人的方法，該方法包括將權利要求67的樹枝狀聚合物裝配系統(tǒng)施用給動物或人，其中所包含的能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑的濃度高達約1000mg/ml。
69.權利要求68的方法，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑占組合物的約40wt％。
70.一種用于將能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑傳遞給需要這種傳遞的動物或人的水凝膠裝配系統(tǒng)，其中水凝膠包含生物智能鏈段和可生物降解鏈段，其中可生物降解鏈段包含葡聚糖、聚乳酸、或其衍生物，且另外其中可生物降解鏈段包含能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑。
71.權利要求70的水凝膠裝配系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物選自以下組中神經酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚連接的甘油二酯、醚連接的磷脂酸、鞘氨醇和二氫鞘氨醇；且基因治療劑選自以下組中寡核苷酸、核酶、DNA-酶、質粒、反義或Si-RNA。
72.權利要求71的水凝膠裝配系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物選自以下組中神經酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚連接的甘油二酯、醚連接的磷脂酸、鞘氨醇和二氫鞘氨醇；且基因治療劑選自以下組中寡核苷酸、核酶、DNA-酶、質粒、反義或Si-RNA。
73.權利要求72的水凝膠裝配系統(tǒng)，其中神經酰胺和/或其衍生物包含在SN-2位的2-10個碳的短鏈脂肪酸或在SN-2位的12-24個碳的長鏈脂肪酸。
74.權利要求73的水凝膠裝配系統(tǒng)，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物和/或疏水性化療劑和/或基因治療劑被全身地傳遞以治療涉及細胞生長障礙的病理。
75.權利要求74的水凝膠裝配系統(tǒng)，其中病理選自以下組中癌癥、腫瘤、動脈炎癥疾病、動脈粥樣硬化、再狹窄、易損斑塊和糖尿病。
76.一種將組合物施用給需要它的動物或人的方法，該方法包括將權利要求75的水凝膠裝配系統(tǒng)施用給動物或人，其中所包含的能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑的濃度高達約1000mg/ml。
77.權利要求76的方法，其中能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性化合物或基因治療劑占組合物的約40wt％。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于優(yōu)化將能使生長停滯的、衍生于脂質的生物活性藥物或基因治療劑全身地傳遞給需要這種物質的動物或人的系統(tǒng)和方法，其使用納米級裝配系統(tǒng)如脂質體、可再吸收的和非聚集的納米顆粒分散體、金屬或半導體納米顆粒、或聚合材料如樹枝狀聚合物或水凝膠，其分別具有更高的脂溶性、細胞透性、增長的循環(huán)半衰期，并具有更高的腫瘤或血管靶向性的藥物動力學特征。
文檔編號A61K48/00GK1812766SQ200480017899
公開日2006年8月2日 申請日期2004年4月26日 優(yōu)先權日2003年4月25日
發(fā)明者馬克·凱斯特, 托馬斯·斯托弗, 盧濤, 詹姆斯·阿代爾, 金榮申 申請人:賓州研究基金會