專利名稱：利用igsf9和liv－1的、用于治療癌癥的組合物及方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及組合物，具體是IGSF9和LIV-1的抗體和抗原結(jié)合片段，以及使用所述組合物檢測和治療腫瘤性疾病的方法。
背景技術(shù)：
在美國，癌癥是位居第二的致死主要原因，占超過總死亡率的1/5。癌癥細(xì)胞由兩種可遺傳的性質(zhì)定義它們及其子代(1)抗拒正常抑制而增殖和(2)侵入和移植到正常情況下為其它細(xì)胞保留的區(qū)域。癌癥細(xì)胞不受控制的增殖導(dǎo)致腫瘤或贅生物的產(chǎn)生。
癌癥細(xì)胞對正常細(xì)胞產(chǎn)物的獨特成分的表達(dá)是腫瘤免疫學(xué)所依據(jù)的基本假設(shè)?，F(xiàn)在存在實質(zhì)性的和令人信服的證據(jù)清楚的支持以下內(nèi)容腫瘤性轉(zhuǎn)化與哺乳動物細(xì)胞表面的抗原變化有關(guān)(Reisfeld，R.A.和Cheresh，D.A.，Ad Immunol 40323-377(1987))。已采用了各種血清學(xué)策略來確定至少在人腫瘤細(xì)胞上表達(dá)增加的一大群細(xì)胞表面抗原(Old，L.J.，Cancer Res 41361-375(1981)；Rosenberg S A，(ed.)Serologic Analysis of Huma71 CancerAntigens.Academic Press，New York.1980)。兩種這樣的抗原是IGSF9和LIV-1。
其特征在于存在免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白超家族成員，介導(dǎo)同種結(jié)合和異種結(jié)合(Doudney，等，Genomics 79663-670(2002))。免疫球蛋白通常介導(dǎo)細(xì)胞外配體和細(xì)胞內(nèi)第二信使級聯(lián)之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，許多免疫球蛋白具有跨膜區(qū)和與細(xì)胞外環(huán)境相互作用的胞質(zhì)羧末端序列。例如，帶有胞質(zhì)受體酪氨酸激酶或磷酸酶結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白直接通過它們的酶活性施加其細(xì)胞內(nèi)信號的影響力，而其它免疫球蛋白通過結(jié)合并激活細(xì)胞內(nèi)激酶發(fā)揮作用。免疫球蛋白配體結(jié)合對src家族酪氨酸激酶的活化導(dǎo)致對細(xì)胞框架動力學(xué)的影響，提供了細(xì)胞粘附與同胚胎發(fā)育形態(tài)發(fā)生運動有關(guān)的細(xì)胞形狀改變之間的重要連接。
IGSF9(免疫球蛋白超家族成員9)是在以定位克隆(positioning cloning)分離鼠Lp基因的過程中鑒別出的免疫球蛋白超家族NCAM亞類的新成員(Doudney，等，Genomics 79663-670(2002))。IGSF9的同系物是黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中參與神經(jīng)發(fā)育的蛋白Turtle。另外，IGSF9可能代表參與人類腫瘤形成和侵襲的重要候選物。經(jīng)常觀察到帶有染色體lq22-q23區(qū)域重復(fù)(duplication)的腫瘤，而且免疫球蛋白表達(dá)上調(diào)是人類腫瘤中通常觀察到的現(xiàn)象，并可能促成細(xì)胞功能失調(diào)和腫瘤侵襲。
LIV-1是與轉(zhuǎn)移性乳腺癌相關(guān)的雌激素調(diào)節(jié)的基因。對LIV-1結(jié)構(gòu)的研究顯示它是一個富含組氨酸的蛋白質(zhì)，并且可結(jié)合和/或轉(zhuǎn)運Zn2+離子。Zn2+被主動轉(zhuǎn)運穿過生物膜，并且它的攝取和釋放受到嚴(yán)密調(diào)節(jié)，因為Zn2+既是細(xì)胞必需的又是對細(xì)胞有毒性的(Taylor，K.M.，IUBMB Life 49249-253(2000))。
LIV-1是唯一已知的激素調(diào)節(jié)的Zn2+結(jié)合蛋白。其它Zn2+結(jié)合蛋白是否在轉(zhuǎn)移癌中發(fā)揮作用仍需確定。然而，組織陣列中的某些Zn2+結(jié)合蛋白已與細(xì)胞死亡和神經(jīng)疾病聯(lián)系起來。
發(fā)明概述本發(fā)明通常涉及，可用于檢測和治療癌癥的組合物，并提供了癌癥的檢測和治療的方法。
下文提供的試驗結(jié)果證明IGSF9和LIV-1在各種腫瘤性細(xì)胞中差異表達(dá)。這種差異表達(dá)使IGSF9和LIV-1可作為靶來檢測和治療各種腫瘤，包括乳腺癌，結(jié)腸癌，卵巢癌，肺癌和前列腺癌。
本發(fā)明涉及與IGSF9或LIV-1或所述蛋白的片段相結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。更具體的，分離的抗體或其抗原結(jié)合片段與以下氨基酸序列結(jié)合

圖1B所示的IGSF9(SEQ ID NO2)的21-718位氨基酸，SEQ IDNO8的21-734位氨基酸，SEQ ID NOS22-27所示的氨基酸；或圖22B所示的LIV-1(SEQ ID NO29)的28-317位，373-417位，674-678位或742-749位氨基酸。
本發(fā)明還涉及分離的抗IGSF9或抗LIV-1抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段包含結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。結(jié)構(gòu)域缺失的抗體或其抗原結(jié)合片段可進(jìn)一步包含細(xì)胞毒藥劑。一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞毒藥劑是放射性核素。
本發(fā)明的抗IGSF9或抗LIV-1抗體或抗原結(jié)合片段還可以是人源化的或靈長類源化的(primatized)。
本發(fā)明還涉及結(jié)合IGSF9或LIV-1的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段抑制IGSF9或LIV-1的一種或多種功能。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含與IGSF9或LIV-1結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。
一個優(yōu)選實施方案中，治療腫瘤性疾病的方法包括將結(jié)構(gòu)域缺失的抗IGSF9或抗LIV-1抗體或抗原結(jié)合片段與一個或多個雙功能螯合劑共價連接。雙功能螯合劑選自MX-DTPA和CHX-DTPA。
本發(fā)明還涉及治療表現(xiàn)出腫瘤性疾病的哺乳動物的方法，包括給予治療有效量的與IGSF9或LIV-1結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段的步驟。所述方法進(jìn)一步包括將治療有效量的至少一種化學(xué)治療劑給予所述哺乳動物；其中所述化學(xué)治療劑和所述抗體或其抗原結(jié)合片段以任意順序或同時給予。一個優(yōu)選實施方案中，將抗IGSF9或抗LIV-1抗體或抗原結(jié)合片段給予需要治療的哺乳動物。抗IGSF9或抗LIV-1抗體或抗原結(jié)合片段可被修飾成缺失CH2區(qū)，和/或人源化的，并進(jìn)一步包含細(xì)胞毒藥劑。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療癌癥的疫苗，其包含IGSF9或LIV-1多肽或其片段以及生理上可接受的載體。一個優(yōu)選實施方案中，抗癌疫苗包含圖1B所示的IGSF9(SEQ ID NO2)的1-1163位氨基酸或21-718位氨基酸；或圖22B所示的LIV-1(SEQ ID NO29)的1-749位，28-317位，373-417位氨基酸。該疫苗進(jìn)一步包含與T輔助細(xì)胞的肽(T helper peptide)融合的肽IGSF9或LIV-1。另外，該疫苗進(jìn)一步包含生理上可接受的載體，諸如佐劑或免疫刺激劑等。一個更優(yōu)選實施方案中，該疫苗進(jìn)一步包含佐劑PROVAXTM。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用所述疫苗誘導(dǎo)需要治療或預(yù)防癌癥的病人中的免疫反應(yīng)的方法。
本發(fā)明還涉及檢測IGSF9或LIV-1，或其片段的過表達(dá)的方法，包括a.從需要診斷癌癥的個體獲得樣品；b.檢測IGSF-9或LIV-1或其片段在所述樣品中的表達(dá)；c.檢測IGSF9或LIV-1或其片段在對照樣品中的表達(dá)，所述樣品來自正常個體，或來自正被診斷的個體的正常組織；和d.將IGSF9或LIV-1的表達(dá)水平與從對照樣品獲得的表達(dá)水平相比較，其中所述比較使得可診斷癌癥。
本發(fā)明一個實施方案中，用核酸擴增，雜交或通過使用抗IGSF9或LIV-1的抗體，或其抗原結(jié)合片段來檢測過表達(dá)。另一個實施方案中，IGSF9片段包含外顯子5-10。
本發(fā)明還涉及確定接受癌癥治療的個體的預(yù)后的方法，包括a.從所述需要進(jìn)行癌癥治療預(yù)后的個體獲得樣品；b.檢測IGSF9或LIV-1或其片段在所述樣品中的表達(dá)；c.檢測IGSF9或LIV-1或其片段在對照樣品中的表達(dá)，所述樣品來自正常個體，或來自正被診斷的個體的正常組織；和d.將IGSF或LIV-1的表達(dá)水平與從對照樣品獲得的表達(dá)水平相比較，其中所述比較使得能得到癌癥的預(yù)后。
一個實施方案中，IGSF9片段包含外顯子5-10。
本發(fā)明還涉及一種疫苗，其包含在免疫學(xué)上類似IGSF9或LIV-1抗原或其片段的抗獨特型抗體作為活性成分。
本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含本文所述的各種多核苷酸，多肽，抗體和抗原結(jié)合片段，以及使用它們治療和檢測癌癥的說明書。
本發(fā)明還涉及治療哺乳動物中的腫瘤疾病的方法，其中腫瘤細(xì)胞表達(dá)IGSF9或LIV-1抗原，所述方法包括給予所述哺乳動物包含藥物有效量的抗IGSF9或LIV-1抗體，或其抗原結(jié)合片段的組合物。一個優(yōu)選實施方案中，使用疫苗來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，所述疫苗包含可藥用載體以及抗腫瘤免疫反應(yīng)誘導(dǎo)有效量的包含IGSF9或LIV-1的致免疫制劑。
本發(fā)明還涉及長度達(dá)50個核苷酸的反義核酸，其至少包含抑制IGSF9或LIV-1表達(dá)的IGSF9或LIV-1的8核苷酸部分。本發(fā)明的反義核酸可包含至少一處經(jīng)修飾的核苷酸間鍵合。此外，本發(fā)明涉及抑制IGSF9或LIV-1在細(xì)胞或組織中表達(dá)的方法，包括將所述細(xì)胞或組織與所述反義核酸接觸使IGSF9或LIV-1的表達(dá)被抑制。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離的核酸，其包括各種形式的IGSF9(SEQ ID NOS1，7和12-21)。本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NOS1，7和12-15的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離的多肽和組合物，其包含SEQ ID NOS2，8和22-27。本發(fā)明還涉及如上所述包含多肽SEQ ID NOS2，8和22-27以及生理上可接受的載體的疫苗。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含短型IGSF9-Ig的分離的核酸(SEQ ID NO3)。本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO3的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離的多肽和包含多肽SEQ ID NO4的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上所述包含多肽SEQ ID NO4和生理上可接受的載體的、用于治療癌癥的疫苗。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含長型IGSF9-Ig的分離的核酸(SEQ ID NO5)。本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO5的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含多肽SEQ ID NO6的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上所述包含多肽SEQID NOS6和生理上可接受的載體的、用于治療癌癥的疫苗。
附圖簡述圖1A和1B分別是人IGSF9的核苷酸(SEQ ID NO1)和蛋白質(zhì)(SEQ IDNO2)序列。圖1B中粗體的部分表示預(yù)測的信號序列，加下劃線的部分表示預(yù)測的胞外區(qū)，粗體斜體的部分表述預(yù)測的跨膜區(qū)。
圖2是用Gene Logic datasuite測定的顯示IGSF9基因表達(dá)圖譜的電子(electronic)Northern圖譜。
圖3是IGSF9在正常組織中的表達(dá)。上方的圖顯示的是IGSF9的表達(dá)，下方的圖顯示的是3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)。每個泳道中的cDNA樣品如下(1)腦，(2)胎盤，(3)肺，(4)肝，(5)骨骼肌，(6)腎，(7)胰腺，(8)脾，(9)胸腺，(10)前列腺，(11)睪丸，(12)卵巢，(13)小腸，(14)結(jié)腸，(15)外周血白細(xì)胞，(16)陽性對照，(17)陰性對照。
圖4是IGSF9在一組人卵巢腫瘤樣品和細(xì)胞系中的表達(dá)。上方的圖顯示的是IGSF9的表達(dá)，下方的圖顯示的是GAPDH的表達(dá)。每個泳道上面的數(shù)字對應(yīng)下述卵巢腫瘤樣品(1)中等分化的囊腺癌，(2)低分化的乳頭狀漿液性腺癌，(3)低分化的乳頭狀漿液性腺癌，(4)低分化的子宮內(nèi)膜樣(endometriod)腺癌，(5)乳頭狀漿液性腺癌，(6)子宮內(nèi)膜樣腺癌，(7)低分化的腺癌，(8)低分化的乳頭狀漿液性腺癌，(9)Ovcar-3細(xì)胞系，(10)PA-1細(xì)胞系，(11)陽性對照，和(12)陰性對照。
圖5是IGSF9在乳腺腫瘤樣品和配對的正常乳腺樣品中的表達(dá)。上面的凝膠顯示的是IGSF9的表達(dá)，下面的凝膠顯示的是GAPDH的表達(dá)。(N)正常組織，(T)腫瘤組織。腫瘤樣品如下(患者A)浸潤性導(dǎo)管癌(infiltratingductal carcinoma)，(患者B)浸潤性導(dǎo)管癌，(患者C)導(dǎo)管腺癌(tubularadenocarcinoma)，(患者D)浸潤性導(dǎo)管癌，(患者E)浸潤性導(dǎo)管癌，(患者T)高級別原位和浸潤性導(dǎo)管癌，(患者X)導(dǎo)管腺癌，(患者W)混合性導(dǎo)管和小葉腺癌，(患者GH19)高級別浸潤性導(dǎo)管癌，(患者GH17)低級別導(dǎo)管內(nèi)癌。
圖6是IGSF9在肺腫瘤中的表達(dá)。上面一組顯示的是IGSF9的表達(dá)，下面一組顯示的是GAPDH的表達(dá)。(N)正常組織，(T)腫瘤組織。所分析的腫瘤樣品如下(患者A)浸潤性導(dǎo)管癌，(患者B)鱗狀細(xì)胞角化癌(squamouscell keratinizing carcinoma)，(患者C)腺鱗癌(adenosquamous carcinoma)，(患者D)角化性鱗狀細(xì)胞癌(keratinizing squamous cell carcinoma)，(患者E)鱗狀細(xì)胞癌。
圖7是IGSF9在結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)。上面一組顯示的是IGSF9的表達(dá)，下面一組顯示的是GAPDH的表達(dá)。樣品如下(1)3級腺癌，(2)2級腺癌，(3)1級腺癌，(4)2級腺癌，(5)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HCT116。
圖8是由RT-PCR分析的IGSF9在人腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。測定了IGSF9在以下組織的細(xì)胞系中的相對表達(dá)胰臟(有斑點的)，卵巢(垂直線)，乳腺(向下的斜線)，肺(實心、有斑點的)和結(jié)腸(向上的斜線)。
圖9是各種IGSF9構(gòu)建體的核苷酸序列和氨基酸序列。圖9A和9B分別是短型可溶性IGSF9-Ig的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO4)。圖9C和9D分別是長型可溶性IGSF9-Ig的核苷酸序列(SEQID NO5)和氨基酸序列(SEQ ID NO6)。圖9E和9F分別是長型全長IGSF9-Ig的核苷酸序列(SEQ ID NO7)和氨基酸序列(SEQ ID NO8)。圖9G是長型和短型IGSF9-Ig的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NOS9-11)的比較。圖9H是腫瘤異種移植樣品的外顯子5-11區(qū)域中IGSF9交替剪接形式(alternate spliceform)的核苷酸序列(SEQ ID NOS12-15)。
圖10是重組表達(dá)并純化的IGSF9多肽的SDS-PAGE分析。泳道1和2分別表示短型和長型可溶性IGSF9-Ig。
圖11是IGSF9在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系中的Northern印跡分析。每個泳道中的樣品如下(1)未轉(zhuǎn)染的野生型CHO DG44細(xì)胞；(2)表達(dá)全長短型IGSF9的、穩(wěn)定CHO 5nM甲氨喋呤(MTX)擴增物(amplificant)；(3)表達(dá)短型可溶性IGSF9-Ig的穩(wěn)定CHO 5nM MTX擴增物；(4)表達(dá)短型可溶性IGSF9-Ig的穩(wěn)定CHO 50nM MTX擴增物；(5)表達(dá)長型可溶性IGSF9-Ig的穩(wěn)定CHO G418克隆。
圖12是ELISA測定的小鼠血清中抗純化的短型IGSF9-Ig的抗IGSF9抗體滴度。
圖13是短型IGSF9在轉(zhuǎn)染的G418抗性和MTX擴增的CHO DG44細(xì)胞系表面表達(dá)的FACS分析，所述細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)短型IGSF9。顯示了IGSF9在未轉(zhuǎn)染的CHO DG44細(xì)胞(DG44)；G418抗性細(xì)胞(G418)；5nM MTX放大(5nM)；和50nM MTX放大(50nM)的表面表達(dá)。
圖14是長型IGSF9在穩(wěn)定表達(dá)長型IGSF9的轉(zhuǎn)染的G418抗性和MTX放大的CHO DG44細(xì)胞系的表面表達(dá)的FACS分析。顯示了IGSF9在未轉(zhuǎn)染的CHO DG44細(xì)胞(CHO)；和G418抗性細(xì)胞(G418)表面的表達(dá)。
圖15是NCI-H69腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性IGSF9的表面表達(dá)的FACS分析。檢測了2o對照細(xì)胞，同種型匹配的對照抗體(2B8)，和多種濃度的一級檢測抗體8F3。
圖16是IGSF9在人腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)的western印跡分析。顯示了兩種不同的曝光時間30分鐘(左側(cè)一組)和5秒(右側(cè)一組，僅示出了2、3泳道)。每個泳道中所用的細(xì)胞系如下(1)模擬轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞(5μg)；(2)用全長IGSF9瞬時轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞(5μg)；(3)表達(dá)全長IGSF9的穩(wěn)定的CHO G418克隆(50μg)；(4)MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞系(50μg)；(5)ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞系(50μg)；(6)NCI-H69小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(50μg)；(7)Ovcar-3卵巢癌細(xì)胞系(50μg)；(8)PA-1卵巢癌細(xì)胞系(50μg)。
圖17是用免疫熒光顯微技術(shù)顯影，IGSF9在乳腺腫瘤細(xì)胞系ZR-75的細(xì)胞表面的表達(dá)。
圖18是在Ovcar-3和NCI-H69鼠腫瘤異種移植物和培養(yǎng)的細(xì)胞中，細(xì)胞表面IGSF9表達(dá)的FACS分析。
圖19是在LS174T和NCI-H69腫瘤細(xì)胞系的兩次體內(nèi)傳代(P0和P1)以及源自鼠異種移植物的Ovcar-3細(xì)胞中，IGSF9表達(dá)的RT-PCR分析。
圖20顯示IGSF9的交替剪接形式是由鼠異種移植腫瘤表達(dá)的。圖20A顯示從下述細(xì)胞系獲得的PCR產(chǎn)物(1)NCI-H69腫瘤細(xì)胞系；(2)Ovcar-3腫瘤細(xì)胞系；(3)NCI-H69小鼠異種移植物；(4)Ovcar-3小鼠異種移植物；(5)陰性對照。圖20B是Ovcar-3和NCI-H69腫瘤異種移植物中所發(fā)現(xiàn)的新剪接變體的比對示意圖。上面的圖顯示的是已知IGSF9變體(短型和長型)的外顯子5-10。下面的圖顯示的是新IGSF9同種型的外顯子5-11。
圖21是衍生自鼠異種移植組織的新IGSF9同種型的IGSF9序列比對。圖21A是包含外顯子8-10的開放閱讀框的1138-1155位核苷酸的部分長型核苷酸序列與Ovcar-3和NCI-H69異種移植腫瘤中表達(dá)的獨特剪接變體的相應(yīng)部分序列的比對。圖21B是外顯子8-11中所含氨基酸285-426的經(jīng)翻譯的氨基酸序列與Ovcar-3和NCI-H69異種移植腫瘤中表達(dá)的獨特剪接變體的相應(yīng)部分序列的比對。比對中表示的序列如下(1)長型IGSF9(SEQ IDNOS16和22)；(2)從Ovcar-3異種移植物，克隆2獲得的序列(SEQ ID NOS17和23)；(3)從Ovcar-3異種移植物，克隆1獲得的序列(SEQ ID NOS18和24)；(4)從NCI-H69異種移植物，克隆1獲得的序列(SEQ ID NOS19和25)；(5)從NCI-H69異種移植物，克隆2獲得的序列(SEQ ID NOS20和26)；和(6)共有序列(SEQ ID NOS21和27)。
圖22A和22B分別是人LIV-1的核苷酸序列(SEQID NO28)和蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO29)。圖22B中粗體表示預(yù)測的信號序列，下劃線表示預(yù)測的胞外區(qū)，粗體斜體表述預(yù)測的跨膜區(qū)。
圖23是電子Northern圖，顯示用Gene Logic datasuite測定的LIV-1基因表達(dá)圖譜。
圖24顯示LIV-1在正常組織的表達(dá)。上面一組顯示的是LIV-1的表達(dá)，下面一組顯示的是GAPDH的表達(dá)。每個泳道中的cDNA樣品如下(1)心臟，(2)腦，(3)胎盤，(4)肺，(5)肝，(6)骨骼肌，(7)腎，(8)胰腺，(9)陰性對照，和(10)陽性對照。
圖25是LIV-1在乳腺腫瘤樣品和配對的正常乳腺樣品中的表達(dá)。上面的凝膠顯示的是LIV-1的表達(dá)，下面的凝膠顯示的是GAPDH的表達(dá)。圖右側(cè)的箭頭表示LIV-1 PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。腫瘤樣品如下(1-患者A)浸潤性導(dǎo)管癌，(2-患者B)浸潤性導(dǎo)管癌，(3-患者C)導(dǎo)管腺癌，(4-患者D)浸潤性導(dǎo)管癌，(5-患者E)浸潤性導(dǎo)管癌，(6-患者A)正常，(7-患者B)正常，(8-患者C)正常，(9-患者D)正常，(10-患者E)正常，(11)陰性對照，(12)陽性對照，(13-患者G19)高級別浸潤性導(dǎo)管癌，(14-患者G17)低級別導(dǎo)管內(nèi)癌，(15-患者X)導(dǎo)管腺癌，(16-患者W)混合性導(dǎo)管和小葉腺癌，(17-患者T)高級別原位和浸潤性導(dǎo)管癌，(18-患者G19)正常，(19-患者G17)正常，(20-患者X)正常，(21-患者W)正常，(22-患者T)正常，(23)陰性對照，和(24)陽性對照。
圖26是LIV-1在結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)。上面一組顯示的是LIV-1的表達(dá)，下面一組顯示的是GAPDH的表達(dá)。樣品如下(1)3級腺癌，(2)2級腺癌，(3)1級腺癌，(4)2級腺癌，(5)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HCT116，(6)陽性對照，(7)陰性對照。
發(fā)明詳述本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是IGSF9和LIV-1在腫瘤性細(xì)胞和正常細(xì)胞之間差異表達(dá)，所述腫瘤具體是乳腺、卵巢、結(jié)腸、肺和前列腺的腫瘤。這些基因的過度表達(dá)可作為癌癥標(biāo)記?？衫眠@個信息制備特異于基因及其表達(dá)產(chǎn)物的診斷和治療試劑，具體是抗體及其抗原結(jié)合片段。還可用于為癌癥病人，具體是患有乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌的病人提供適合療法的診斷和治療方法。
本發(fā)明的抗體IGSF9或LIV-1的肽可用于激發(fā)多克隆抗體和單克隆抗體。本發(fā)明至少部分以下述事實為基礎(chǔ)可修飾或改變與瘤性細(xì)胞相關(guān)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合片段，以便當(dāng)用于癌癥患者的治療方案時，提供增強的生物化學(xué)特性和改善的效力。優(yōu)選，修飾的抗體與細(xì)胞毒藥劑，諸如放射性核素或抗腫瘤劑等相結(jié)合。
本文所用的術(shù)語“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分。這種抗體包括但不限于，多克隆，單克隆，嵌合，單鏈，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′和Fab′2片段，F(xiàn)v以及Fab表達(dá)文庫。通常，從人類獲得的抗體分子涉及IgG，IgM，IgA，IgE和IgD中的任意種類，其由于分子中存在的重鏈的性質(zhì)而彼此不同。一些種類還具有亞類，如IgG1，IgG2，以及其它種類。此外，人類中，輕鏈可以是κ鏈或λ鏈。此處關(guān)于抗體的參考文獻(xiàn)包括關(guān)于所有這些抗體的類，亞類和型的參考文獻(xiàn)。
已證明抗體片段可以行使結(jié)合抗原的功能。本文所用的“抗原結(jié)合片段”包括但不限于(i)由VL，VH，CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由單鏈抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward，E.S.等，Nature 341544-546(1989))；(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab′)2片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域由允許兩個結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成抗原結(jié)合位點的肽接頭連接(Bird，等，Science 242423-426(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988))；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)通過基因融合構(gòu)建的雙抗體(diabody)，多價或多特異性片段(W094/13804；P.Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993))。
本發(fā)明的分離多肽可作為抗原，或其部分或片段，還可用于通過使用制備多克隆抗體和單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生與抗原免疫特異性結(jié)合的抗體?？墒褂萌L蛋白，或可選，本發(fā)明提供IGSF9和LIV-1的抗原肽片段作為免疫原?？乖钠伟LIGSF9或LIV-1蛋白的氨基酸序列的至少6個氨基酸殘基，如圖1B，9B，9D，9F，21B，或22B所示的氨基酸序列(SEQ ID NOS2，4，6，8，22-27，或29)，并且包括其表位使得抗所述肽的抗體與全長蛋白或包含所述表位的任意片段形成特異性免疫復(fù)合物。優(yōu)選，抗原肽包含至少10個氨基酸殘基，或至少15個氨基酸殘基，或至少20個氨基酸殘基，或至少30個氨基酸殘基。
本發(fā)明一個實施方案中，抗原肽包括的至少一個表位是位于蛋白表面的IGSF9或LIV-1的區(qū)域，例如親水區(qū)。對人IGSF9和LIV-1蛋白序列(圖1B和22B)的疏水性分析已表明了這些蛋白的哪些區(qū)域是具體親水的，并因此有可能編碼有利于靶向抗體產(chǎn)生的表面殘基(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157；105-142(1982))。因此，抗原肽包括的優(yōu)選抗原表位是位于其表面的IGSF9和LIV-1的區(qū)域，例如從IGSF9的約21-約718位氨基酸(圖1B)；IGSF9的約21-約734位氨基酸(圖9F)；圖21B所示的氨基酸序列；或LIV-1(圖22B)的約28-約317位氨基酸；約373-約417位氨基酸；約674-約678位氨基酸；約742-約749位氨基酸(SEQID NOS2，4，6，8，22-27，或29)。
為生產(chǎn)多克隆抗體，用IGSF9或LIV-1肽，合成變體，衍生物，或其片段通過一次或多次注射免疫各種適合的宿主動物(例如，兔，山羊，小鼠或其它哺乳動物)。適合的免疫原性制品可包含，例如天然存在的免疫原性蛋白，代表免疫原性蛋白的化學(xué)合成的多肽，或重組表達(dá)的免疫原性蛋白的多肽，或其片段。此外，蛋白可與已知在被免疫哺乳動物中具有免疫原性的第二種蛋白結(jié)合。這種免疫原性蛋白的例子，包括但不限于，鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，血清白蛋白，牛甲狀腺球蛋白，和大豆胰蛋白酶抑制劑。制品進(jìn)一步包括佐劑。用于提高免疫反應(yīng)的各種佐劑包括但不限于，弗氏佐劑(完全和不完全)，礦物凝膠(例如氫氧化鋁)，MPL-TDM(單磷酸脂質(zhì)A-合成海藻糖二霉菌酸酯(monophosphoryl lipidA-synthetic trehalose dicorynmycolate))和PROVAXTM。
抗IGSF9或LIV-1的多克隆抗體可從經(jīng)免疫的哺乳動物分離，并用本領(lǐng)域公知技術(shù)，諸如使用蛋白A或蛋白G的親和層析法等進(jìn)一步純化。
雖然可從哺乳動物血清中收獲所得抗體以提供多克隆制品，但通常希望從脾臟，淋巴結(jié)或外周血分離個體淋巴細(xì)胞，以提供單克隆抗體的均質(zhì)制品。優(yōu)選，從脾臟獲得淋巴細(xì)胞。
本文所用的“單克隆抗體”(MAb)指只含有由獨特的輕鏈基因產(chǎn)物和獨特的重鏈基因產(chǎn)物組成的抗體分子中的一種分子種類。具體是，Mab的互補決定區(qū)在該群體的所有分子中是相同的。因此，MAb包含能與抗原具體表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點，其特征在于對表位具有獨特的結(jié)合親和性。
在這個公知過程中(Kohler等，Nature 256495(1975))，來自已注射了抗原的哺乳動物的相對短壽、或終會死亡(mortal)的淋巴細(xì)胞與永生的(immortal)腫瘤細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系)融合，因此產(chǎn)生永生的并能夠產(chǎn)生B細(xì)胞遺傳編碼的抗體(genetically coded antibody of the B cell)的雜合細(xì)胞或“雜交瘤”。通過篩選，稀釋并與每種包含用于形成單個抗體的具體基因的個體品系再生，使獲得的雜合子分離成單個遺傳品系。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種并培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，其優(yōu)選含有一種或多種可抑制未融合、親代骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解用于雜交瘤形成、篩選和生長的試劑、細(xì)胞系和培養(yǎng)基可從許多來源購得，并且標(biāo)準(zhǔn)程序也已建立。通常，分析其中生長著雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中抗所需抗原的MAb的產(chǎn)生。優(yōu)選，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過下述方法測定免疫沉淀法或體外測定法，諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)等。鑒別出產(chǎn)生具有所需特異性、親和性和/或活性的雜交瘤細(xì)胞之后，所得克隆可通過有限稀釋步驟并用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)而得以亞克隆(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp 59-103(Academic Press，1986))。還應(yīng)理解亞克隆分泌的單克隆抗體可通過常規(guī)純化步驟，諸如蛋白-A羥基磷灰石層析法(Protein A，hydroxylapatite chromatography)，凝膠電泳，透析或親和層析從培養(yǎng)基，腹水或血清中分離。
本文所用的術(shù)語“修飾的抗體”指可與IGSF9或LIV-1發(fā)生免疫反應(yīng)的任意抗體，或抗原結(jié)合片段或其重組體，其中一或多個恒定區(qū)的至少一部分被缺失或改變，以提供所需的生物化學(xué)特性，諸如與完整的、未經(jīng)改變的、具有大約相同的結(jié)合特異性的抗體相比而言，增強的腫瘤定位或降低的血清半衰期。一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明修飾的抗體至少有一個恒定區(qū)的一部分被缺失。為此，這種構(gòu)建體定義為“結(jié)構(gòu)域缺失的”。優(yōu)選，修飾的抗體的恒定區(qū)的一個完整結(jié)構(gòu)域被缺失，甚至更優(yōu)選完整的CH2結(jié)構(gòu)域被缺失。如下文將要詳細(xì)討論的，用公知技術(shù)從完整前體或親本抗體可以容易地制備或構(gòu)建每種所需變體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的化合物，組合物和方法有利于治療顯示(exhibit)性疾病，腫瘤或惡性腫瘤。如上所述，本發(fā)明修飾的抗體可與IGSF9或LIV-1發(fā)生免疫反應(yīng)。即，所公開的修飾的抗體的抗原結(jié)合部分(即可變區(qū)或免疫反應(yīng)性片段或其重組體)與惡性腫瘤的IGSF9或LIV-1結(jié)合。更常見的，用于本發(fā)明的修飾的抗體可從與IGSF9或LIV-1反應(yīng)的任意抗體(包括文獻(xiàn)中以前報道過的)獲得或衍生。此外，用于產(chǎn)生所公開修飾的抗體的親本或前體抗體，或其片段可以是鼠，人，嵌合，人源化，非人靈長類或靈長類源化的。另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的修飾的抗體可包含具有本文所述改變的恒定區(qū)的單鏈抗體構(gòu)建體(如，US5,892,019所公開的，摻入此處作為參考)。結(jié)果，根據(jù)本文的教導(dǎo)修飾的任意這些類型的抗體與本發(fā)明相容。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選連接和結(jié)合IGSF9或LIV-1。相應(yīng)的，如下文將詳細(xì)討論的，本發(fā)明的修飾抗體可從與IGSF9或LIV-1反應(yīng)的許多抗體中的任意一種衍生，產(chǎn)生或制備。一個優(yōu)選實施方案中，修飾的抗體可用常規(guī)遺傳工程技術(shù)衍生，使至少一個或多個恒定區(qū)的一部分缺失或改變以提供所需的生物化學(xué)特性，諸如降低的血清半衰期等。更具體的，如下文所例證的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地分離對應(yīng)于受試抗體的可變區(qū)和/或恒定區(qū)的遺傳序列，并且缺失或改變適合的核苷酸以提供本發(fā)明的修飾的抗體。還應(yīng)理解修飾的抗體可用已建立的方案來表達(dá)并在臨床或商業(yè)規(guī)模制備。
在選擇的實施方案中，用于本發(fā)明的修飾抗體衍生自已知的抗IGSF9或LIV-1抗體。這通過獲得親本抗體的核苷酸或氨基酸序列，并如本文所述進(jìn)行修飾改造可以輕易完成。對其它實施方案，可能希望只使用已知抗體的抗原結(jié)合區(qū)(例如，可變區(qū)或互補決定區(qū))，并將它們與修飾的恒定區(qū)結(jié)合以產(chǎn)生所需的修飾的抗體。相容的單鏈構(gòu)建體可通過類似方式產(chǎn)生。無論如何，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明抗體也可如本領(lǐng)域所常見的那樣被改造以改善親和性或降低免疫原性。例如，本發(fā)明的修飾抗體可從人源化或嵌合抗體衍生或制備。因此，與本發(fā)明一致的修飾的抗體可衍生自和/或包含天然存在的鼠，靈長類(包括人)或其它哺乳動物的單克隆抗體，嵌合抗體，人源化抗體，靈長類源化抗體，雙特異性抗體或單鏈抗體構(gòu)建體以及每種類型的免疫反應(yīng)性片段。
除了上述抗體，需要提供修飾的抗體，其衍生自或包含用免疫法與上述常規(guī)免疫技術(shù)所產(chǎn)生新抗體的抗原結(jié)合片段。
在其它相容性實施方案中，用常規(guī)方法(例如，通過使用能特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)可以容易地對編碼所需單克隆抗體的DNA進(jìn)行分離和測序。分離的和亞克隆的雜交瘤細(xì)胞作為這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，DNA可置于表達(dá)載體中，隨后轉(zhuǎn)染入原核或真核宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞，猴COS細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或否則不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞。更具體的，分離的DNA(可如本文所述進(jìn)行修飾)可用于克隆恒定區(qū)和可變區(qū)序列以制備如Newman等，US5,658,570(并入本文作為參考)所描述的抗體?；旧?，這使得需要從所選擇的細(xì)胞抽提RNA，轉(zhuǎn)變成cDNA，并用免疫球蛋白特異性引物通過PCR擴增cDNA。如下文將詳細(xì)討論的，表達(dá)所需抗體的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以以相對大的數(shù)量生長以提供免疫球蛋白的臨床和商業(yè)供給。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解編碼抗體或抗體片段的DNA還可衍生自例如EP 368684 B1和US 5,969,108所述的抗體噬菌體文庫，每篇文獻(xiàn)都包含在本文中作為參考。一些出版物(例如Marks等Bio/Technology10779-783(1992))已描述了通過鏈改組，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建大的噬菌體文庫的策略來生產(chǎn)高親和性人抗體。這種步驟提供了傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)的可行的替代方案，用以單克隆抗體的分離及隨后的克隆，并因此明顯包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明其它實施方案包括在不能內(nèi)源性產(chǎn)生免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中生產(chǎn)本質(zhì)上的(substantially)人抗體(參見例如US 6,075,181，5,939,598，5,591,669和5,589,369，每個都包含在此處作為參考)。例如，已描述了嵌合的種系突變小鼠中的抗體重鏈連接區(qū)的純合型缺失導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生。將人免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種種系突變小鼠中將導(dǎo)致在抗原攻擊時產(chǎn)生人抗體。用SCID小鼠生產(chǎn)人抗體的另一優(yōu)選方式在共同擁有的US 5,811,524中公開了，并入本文作為參考。應(yīng)當(dāng)理解與這些人抗體有關(guān)的遺傳物質(zhì)也可如本文所述被分離和處理。
Newman，Biotechnology 101455-146(1992)公開了產(chǎn)生重組抗體的另一高效方式。具體是，這種技術(shù)導(dǎo)致產(chǎn)生包含猴可變區(qū)和人恒定區(qū)的靈長類源化抗體。這篇參考文獻(xiàn)整體并入本文作為參考。而且，共同轉(zhuǎn)讓的US5,658,570，5,693,780和5,756,096也描述了這種技術(shù)，每個都并入本文作為參考。
應(yīng)進(jìn)一步理解本發(fā)明的范圍包括本文所描述的DNA序列的所有等位基因，變體和突變體。
眾所周知，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如異硫氰酸胍(guanidinium isothiocyanate)提取并隨后通過離心或?qū)游龀恋?，可從原始雜交瘤細(xì)胞或從其它轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分離RNA。需要時，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如oligodT纖維素上的層析等從總RNA中分離mRNA。適于這些目的的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟悉的并且在先前的參考文獻(xiàn)中描述過。
使用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶依照公知方法，可同時或分別制備編碼抗體輕鏈和重鏈的cDNA。這可根據(jù)已公開的重鏈和輕鏈的DNA和氨基酸序列用共有恒定區(qū)引物或更特異性引物開始進(jìn)行。如上所述，PCR也可用于分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆。這種情況中，可用共有引物或較大的同源探針，諸如鼠恒定區(qū)探針等篩選文庫。
DNA，一般是質(zhì)粒DNA可如本文所述從細(xì)胞中分離，根據(jù)先前涉及重組DNA技術(shù)的參考文獻(xiàn)中所詳述的標(biāo)準(zhǔn)公知技術(shù)進(jìn)行限制性酶切作圖并測序。當(dāng)然，可根據(jù)本發(fā)明在分離過程或隨后的分析過程中的任意時間點修飾DNA。
根據(jù)本發(fā)明，可修改技術(shù)使其適應(yīng)于制備對本發(fā)明多肽具有特異性的單鏈抗體(參見US 4,946,778)。此外，可修改方法使其適應(yīng)于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse，等，Science 2461275-1281(1989))，以便迅速有效地鑒別對IGSF9或LIV1，或其衍生物，片段，類似物或同系物具有所需特異性的單克隆Fab片段。包含本發(fā)明多肽獨特型的抗體片段可采用本領(lǐng)域的技術(shù)制備，包括但不限于(a)用胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片段；(b)還原F(ab′)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab片段，(c)用木瓜蛋白酶和還原試劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段，和(d)Fv片段。
雙特異性抗體也在本發(fā)明范圍內(nèi)。雙特異性抗體是對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選人抗體或人源化抗體。目前的情況中，一種結(jié)合特異性是針對本發(fā)明抗原多肽(IGSF9或LIV-1，或其片段)，第二種結(jié)合靶點是任意其它抗原，最好是細(xì)胞表面蛋白，或受體或受體亞基。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)的雙特異性抗體重組制備是基于兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達(dá)，其中兩個重鏈具有不同的特異性(Milstein和Cuello，Nature 305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分類(assortment)，這些雜交瘤(quadroma)產(chǎn)生十種不同抗體分子的可能的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。該正確分子的純化通常通過親和層析來完成。
具有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)可與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。優(yōu)選與包含至少部分鉸鏈區(qū)，CH2區(qū)和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選第一重鏈恒定區(qū)(CH1)包含存在于至少一種融合體中的輕鏈結(jié)合所必需的位點。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA，并且如果需要，將編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA，插入分離的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到適合的宿主生物體中。生產(chǎn)雙特異性抗體的其它細(xì)節(jié)可見Suresh等，Methods inEnzynology121210(1986)。
雙特異性抗體可制成全長抗體或抗體片段。從抗體片段生產(chǎn)雙特異性抗體的技術(shù)在文獻(xiàn)中已有描述。例如，用化學(xué)連接制備雙特異性抗體。此外，Brennan等，Science 22F81(1985)描述了將完整抗體經(jīng)過蛋白水解切割產(chǎn)生F(ab′)2片段的方法。
另外，F(xiàn)ab′片段可直接從大腸桿菌中收集并經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體(Shalaby等，J.Exp.Med.175217-225(1992))。這些方法可用于生產(chǎn)完全人源化的雙特異性抗體F(ab′)2分子。
還涉及兩價以上的抗體。例如，可制備三特異性抗體(Tutt等，J.Immunol 14760(1991))。
示例性雙特異性抗體可與兩種不同的抗原表位結(jié)合，其中至少一種表位起源于本發(fā)明的多肽?；蛘?，免疫球蛋白的抗-抗原臂可這樣的臂結(jié)合，所述臂與白細(xì)胞上的觸發(fā)分子諸如T細(xì)胞受體分子(例如CD2，CD3，CD28，或B7)，或IgG的Fc受體相結(jié)合，使細(xì)胞防御機制集中于表達(dá)特定抗原的細(xì)胞。雙特異性抗體還可用于使細(xì)胞毒藥劑針對表達(dá)特定抗原的細(xì)胞。這些抗體擁有抗原結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒藥劑或放射性核素螯合劑諸如EOTUBE、DPTA、DOTA、或TETA等的臂。
異偶聯(lián)抗體(heteroconjugate antibody)也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。異偶聯(lián)抗體由兩個共價連接的抗體組成。例如已提議用這種抗體將免疫細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(US 4,676,980)。預(yù)期可用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中的已知方法，包括涉及交聯(lián)劑的方法在體外制備所述抗體。例如，用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵構(gòu)建免疫毒素。為此目的的適合試劑的例子包括亞胺硫醇(iminothiolate)和甲基-4-巰基丁酰亞胺酯(butyrimidate)。
為本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)理解修飾的抗體可包含使抗體與多肽IGSF9或LIV-1結(jié)合的任意類型的可變區(qū)。在這點上，可變區(qū)可包含或衍生自任意類型的哺乳動物，所述哺乳動物能被誘導(dǎo)發(fā)生體液反應(yīng)并產(chǎn)生抗所需腫瘤相關(guān)抗原的免疫球蛋白。因此，修飾的抗體的可變區(qū)可以是，例如人、鼠、非人靈長類(例如，短尾猴(cynomolgus monkey)，恒河猴(macaque)，等)、或狼來源的。一個具體優(yōu)選實施方案中，修飾的抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人的。另一個所選實施方案中，相容抗體的可變區(qū)(通常衍生自非人來源)可被改造或特別定制(tailor)以改善該分子的結(jié)合特性或降低免疫原性。在這方面，用于本發(fā)明的可變區(qū)可以是人源化的或通過包括輸入的氨基酸序列而得以改變。
“人源化抗體”指保留或基本保留親本抗體的抗原結(jié)合特性，但對人免疫原性較弱的衍生自非人來源的抗體，一般是鼠抗體。這種抗體可通過各種方法獲得，包括(a)將全部非人可變區(qū)移植到人恒定區(qū)產(chǎn)生嵌合抗體；(b)在保留或不保留臨界框架殘基的情況下，將一個或多個非人互補決定區(qū)(CDR)的至少一部分移植到人框架以及恒定區(qū)中；或(c)移植全部非人可變區(qū)，但通過取代表面殘基用人樣部分“掩飾(cloak)”它們。這種方法在Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-6855(1984)；Mornson等，Adv.Imrnuizol.4465-92(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)；Padlan，Molec.Irnmun.28489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31169-217(1994)，和US 5,585,089，5,693,761和5,693,762中公開，所有這些文獻(xiàn)都以全文包含在此處作為參考。
人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補決定區(qū)(CDR)的殘基被具有所需特異性，親和性和載量的殘基取代，所述殘基來自非人物種(供體抗體)諸如小鼠，大鼠或兔等的CDR。一些情況中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。人源化抗體還包含在受體抗體或在輸入的CDR或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體包含基本上全部的至少一個，一般是兩個可變區(qū)，其中全部或基本上全部的CDR區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，并且全部或基本上全部FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。最佳地，人源化抗體還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分(Jones等，Nature321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992))。
使非人抗體人源化的方法是本領(lǐng)域公知的。通常，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱作“輸入”殘基，一般是從“輸入”可變區(qū)獲得的。人源化可基本上根據(jù)Winter及其同事的方法[Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)]來實施，所述方法通過用嚙齒目動物的CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列進(jìn)行。相應(yīng)地，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(US 4,816,567)，其中基本上少于完整的人可變區(qū)被非人物種的相應(yīng)序列取代。實際上，人源化抗體一般是人抗體，其中一些CDR殘基并可能有一些FR殘基被來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基所取代。
當(dāng)抗體用于人類治療應(yīng)用時，用于制備人源化抗體的人重鏈和輕鏈可變區(qū)的選擇對降低抗原性和HAMA反應(yīng)(人抗小鼠抗體)是非常重要的。根據(jù)所謂的“最佳-擬合(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變區(qū)的序列篩選整個已知人可變區(qū)序列的文庫。鑒別最接近嚙齒類V區(qū)的人V區(qū)序列，并且接受其中的人框架區(qū)(FR)作為人源化抗體(Sims等，J.Immunol 1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一方法使用了衍生自具體輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列的具體框架區(qū)。相同的框架區(qū)可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J Immunol.1512623(1993))。
使抗體人源化的同時使其保留對抗原的高結(jié)合親和性以及其它有利的生物學(xué)特性也很重要。為達(dá)到這個目的，根據(jù)優(yōu)選方法，使用親本序列和人源化序列的三維模型通過對親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的分析方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可獲得并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。說明和展示所選擇的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序是可得到的。檢驗這些展示使得可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中所起的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。以這種方式，可選出并組合來自受體和輸入序列的FR殘基，以獲得所需的抗體特性，諸如提高的靶抗原親和性等。通常，超變區(qū)殘基直接并最為充分地參與對抗原結(jié)合的影響。
可預(yù)期人源化抗體的各種形式。例如，人源化抗體可以是抗體片段，諸如Fab，其與一或多種細(xì)胞毒藥劑可選偶聯(lián)以產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物。或者人源化抗體可以是完整抗體，諸如完整的IgG1抗體等。
作為人源化的備選方案，可生產(chǎn)人抗體。例如，目前有可能制備一經(jīng)免疫就能生產(chǎn)完整人抗體庫，而缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已描述了嵌合種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合型缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體產(chǎn)生完全被抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種種系的突變小鼠中導(dǎo)致在抗原攻擊時產(chǎn)生人抗體。參見，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immunol.733(1993)；US 5,545,806，5,569,825，5,591,669(全部是GenPharm的專利)；US 5,545,807；和WO 97/17852。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348552-553(1990))可用于在體外從未經(jīng)免疫的供體的免疫球蛋白可變區(qū)(V)基因庫產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)這種技術(shù)，將抗體V區(qū)基因框內(nèi)克隆到絲狀噬菌體，如M13或fd的主要或次要衣殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片段展示到噬菌體顆粒的表面上。因為絲狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特性進(jìn)行的篩選也導(dǎo)致選出編碼顯示這些特性的抗體的基因。因此，噬菌體模擬了B細(xì)胞的一些特性?？梢远喾N形式進(jìn)行噬菌體展示，例如Johnson，K.S.和Chiswell，D.J.，Current Opinion in Structural Biology3564-571(1993)的綜述。數(shù)種來源的V基因片段可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature 352624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾臟V基因的小隨機組合文庫中分離了抗唑酮抗體的各種陣列。可構(gòu)建來自未經(jīng)免疫人供體的V基因庫，并且基本上根據(jù)Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所描述的技術(shù)可分離抗各種抗原陣列(包括自身抗原)的抗體。還可參見US 5,565,332和5,573,905。
如上所述，還可通過體外活化B細(xì)胞產(chǎn)生人抗體(參見US 5,567,610和5,229,275)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解將完整非人可變區(qū)移植到人恒定區(qū)將產(chǎn)生“經(jīng)典的”嵌合抗體。本發(fā)明上下文中，術(shù)語“嵌合抗體”指其中的免疫反應(yīng)區(qū)域或位點從第一物種獲得或衍生，恒定區(qū)(依照本發(fā)明可以是完整的，部分的經(jīng)或修飾的)從第二物種獲得的任意抗體。優(yōu)選實施方案中，抗原結(jié)合區(qū)或位點來自非人來源(例如小鼠)而恒定區(qū)是人的。雖然可變區(qū)的免疫原特異性通常不受其來源的影響，來自人的人恒定區(qū)與來自非人來源的恒定區(qū)相比，不太可能會激發(fā)免疫反應(yīng)。
優(yōu)選，重鏈和輕鏈中的可變區(qū)可通過至少部分取代一個或多個CDR，如果有必要，通過部分框架區(qū)取代和序列改變而得以改變。雖然CDR可衍生自與衍生出框架區(qū)的抗體同類或甚至為其亞類的抗體，但希望從不同類的抗體并優(yōu)選從來自不同物種的抗體獲得CDR。必需強調(diào)不必用來自供體可變區(qū)的完整CDR取代所有CDR來將一個可變區(qū)的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移到另一個。更合適的是，僅需轉(zhuǎn)移維持抗原結(jié)合位點活性所必需的那些殘基。參考US 5,585,089，5,693,761和5,693,762的解釋，通過例行試驗或通過實驗(trial)與誤差檢驗(error testing)來獲得具有降低的免疫原性的功能性抗體在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。
盡管改變了可變區(qū)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明修飾的抗體包含抗體或其免疫活性片段，其中一個或多個恒定區(qū)的至少一部分被缺失或改變，以提供所需的生物化學(xué)特性，諸如當(dāng)與具有大約相同的免疫原性并包含天然的或未改變的恒定區(qū)的抗體比較時，增強的腫瘤定位或降低的血清半衰期。一個優(yōu)選實施方案中，修飾的抗體的恒定區(qū)包含人恒定區(qū)。與本發(fā)明相容的對恒定區(qū)的修飾包含添加，缺失或取代一或多種結(jié)構(gòu)域中的一個或多個氨基酸。即，本文所公開的經(jīng)修飾抗體可包含對三種重鏈恒定區(qū)(CH1，CH2或CH3)中的一或多個和/或?qū)p鏈恒定區(qū)(CL)的改變或修飾。如下文所要詳細(xì)討論的和實施方案中所顯示的，本發(fā)明優(yōu)選實施方案包含其中一個或多個結(jié)構(gòu)域被部分或全部缺失的修飾恒定區(qū)。一個特別優(yōu)選實施方案中，修飾的抗體包含其中全部CH2結(jié)構(gòu)域被缺失的結(jié)構(gòu)域缺失的構(gòu)建體或變體(ΔCH2構(gòu)建體)。另一優(yōu)選實施方案中，缺失的恒定區(qū)被短氨基酸間隔區(qū)(例如，10個氨基酸)取代，其能提供一些通常由缺失的恒定區(qū)所賦予的分子柔性。
除了構(gòu)型，本領(lǐng)域已知恒定區(qū)介導(dǎo)數(shù)種效應(yīng)物功能(effector function)。例如，補體C1成分與抗體的結(jié)合可活化補體系統(tǒng)。補體的活化對調(diào)理作用和細(xì)胞病原體的溶解很重要。補體的活化還刺激炎癥應(yīng)答并且還參與自身免疫性超敏反應(yīng)。此外，抗體經(jīng)由Fc區(qū)與細(xì)胞結(jié)合，其中抗體Fc區(qū)上的Fc受體位點與細(xì)胞的Fc受體(FcR)結(jié)合。有許多對不同種類抗體具有特異性的Fc受體，所述抗體包括IgG(γ受體)，IgE(η受體)，IgA(α受體)和IgM(μ受體)。抗體與細(xì)胞表面Fc受體的結(jié)合引發(fā)許多重要的和多樣的生物反應(yīng)，包括抗體包被的顆粒的吞噬和破壞，免疫復(fù)合物的清除，殺傷細(xì)胞對抗體包被的靶細(xì)胞的溶解(叫做抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒，或ADCC)，炎癥介質(zhì)的釋放，免疫球蛋白生成的胎盤轉(zhuǎn)移和控制。雖然各種Fc受體和受體位點已研究到一定程度，但關(guān)于它們的位置，結(jié)構(gòu)和功能仍有許多是未知的。
雖然不是限制本發(fā)明的范圍，我們相信包含如本文所述進(jìn)行修飾的恒定區(qū)的抗體提供了改變的效應(yīng)物功能，并反過來影響所給予的抗體的生物學(xué)圖譜。例如，恒定區(qū)的缺失或滅活(通過點突變或其它方式)可減少Fc受體與循環(huán)型修飾的抗體的結(jié)合，由此增強腫瘤定位。另一種情況中，與本發(fā)明一致的恒定區(qū)修飾可減少(moderate)補體結(jié)合并因此降低與偶聯(lián)的細(xì)胞毒素的血清半衰期和非特異性結(jié)合。恒定區(qū)的其它修飾可用于消除由于提高的抗原特異性或抗體柔性使得定位增強的二硫鍵或寡糖部分。更普遍的，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如本文所述修飾的抗體可產(chǎn)生許多會或者不會被意識到的細(xì)微影響。相似地，使用熟練技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的公知生物化學(xué)或分子工程技術(shù)可以很容易的進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的恒定區(qū)修飾。
應(yīng)注意，可改造修飾的抗體使CH3區(qū)直接與各個修飾的抗體的鉸鏈區(qū)融合。其它構(gòu)建體中，希望在鉸鏈區(qū)和修飾的CH2區(qū)和/或CH3區(qū)之間提供肽間隔區(qū)。例如，可表達(dá)其中CH2區(qū)被缺失、剩余的CH3區(qū)(修飾的或未修飾的)通過5-20個氨基酸的間隔區(qū)與鉸鏈區(qū)連接的相容構(gòu)建體。這方面，一種優(yōu)選的間隔區(qū)具有氨基酸序列IGKTISKKAK(SEQ ID NO44)。可添加這種間隔區(qū)以，例如保證恒定區(qū)的調(diào)節(jié)元件保持游離且可接近的狀態(tài)，或保證鉸鏈區(qū)保持柔性。然而應(yīng)注意，一些情況中證實氨基酸間隔區(qū)是免疫原性的并引發(fā)不需要的抗構(gòu)建體免疫反應(yīng)。相應(yīng)地，優(yōu)選添加到構(gòu)建體的任意間隔區(qū)是相對非免疫原性的，或者如果修飾的抗體的所需生化特性可以保留，甚至更優(yōu)選完全缺省所述間隔區(qū)。
除了缺失全部恒定區(qū)，應(yīng)當(dāng)理解可通過部分缺失或取代一些或甚至單個氨基酸來提供本發(fā)明的抗體。例如，CH2結(jié)構(gòu)域的被選區(qū)域中單個氨基酸突變足以基本減少Fc結(jié)合并因此增強腫瘤定位。相似地，希望簡單地缺失一或多個恒定區(qū)的一部分，所述部分控制待調(diào)節(jié)的效應(yīng)物功能(例如，補體CLQ結(jié)合)。這種恒定區(qū)的部分刪除可改進(jìn)抗體的被選特性(血清半衰期)，而目標(biāo)恒定區(qū)的其它所需相關(guān)功能保持完整。此外，如上所述，所公開的抗體恒定區(qū)可通過突變或取代一個或多個能增強所獲得的構(gòu)建體圖譜(profile)的氨基酸進(jìn)行修飾。這方面，可能會破壞保守結(jié)合位點(例如，F(xiàn)c結(jié)合)提供的活性而基本維持修飾的抗體的構(gòu)型和免疫原性。另一優(yōu)選實施方案包含在恒定區(qū)添加一個或多個氨基酸以增強所需特性，諸如效應(yīng)物功能或連接更多的細(xì)胞毒素或碳水化合物。這個實施方案中，希望插入或復(fù)制衍生自所選擇的恒定區(qū)的具體序列。
一個特別優(yōu)選實施方案中，將克隆的可變區(qū)基因與如上所述進(jìn)行修飾的重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因(優(yōu)選人)一起插入表達(dá)載體。優(yōu)選使用稱為NEOSPLA的IDEC，Inc專有(proprietary)表達(dá)載體進(jìn)行。這個載體包含巨細(xì)胞病毒啟動子/增強子，小鼠β珠主要啟動子，SV40復(fù)制起始點，牛生長激素多腺苷酸化序列，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子1和外顯子2，二氫葉酸還原酶基因和前導(dǎo)序列。如在下文實施方案中所見到的，一旦摻入可變區(qū)和恒定區(qū)基因，轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞，隨后在含G418的培養(yǎng)基中篩選并進(jìn)行甲氨喋呤擴增，發(fā)現(xiàn)這個載體導(dǎo)致非常高水平的抗體表達(dá)。在共同轉(zhuǎn)讓的US5,736,137和5,658,570中基本公開了這個載體系統(tǒng)，每篇專利文獻(xiàn)都全文并入本文作為參考。這個系統(tǒng)提供高表達(dá)水平，即＞30pg/細(xì)胞/天。
另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的修飾的抗體用多順反子構(gòu)建體表達(dá)，所述多順反子構(gòu)建體諸如2001年11月16日提交的美國臨時申請60/331,481(全文并入本文作為參考)所公開的構(gòu)建體。在這些新的表達(dá)系統(tǒng)中，可從單個多順反子構(gòu)建體制備目標(biāo)多基因產(chǎn)物，諸如抗體的重鏈和輕鏈等。這些系統(tǒng)有利地使用了內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)以在真核宿主細(xì)胞中提供相對高水平的修飾的抗體。US專利6,193,980公開了相容的IRES序列，該文獻(xiàn)也并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這種表達(dá)系統(tǒng)可用于有效生產(chǎn)全部范圍的本申請公開的修飾的抗體。
更普遍的，一旦制備了包含本發(fā)明多肽，諸如經(jīng)修飾抗體的載體或DNA序列，就可將表達(dá)載體引入適合的宿主細(xì)胞。即，該宿主細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化。將質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)來完成。這些技術(shù)包括，但不限于轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)，原生質(zhì)體融合，磷酸鈣沉淀，細(xì)胞與包裹的DNA融合，顯微注射，以及用完整病毒進(jìn)行感染。參見，Ridgway，A.A.G.″Mammalian Expression Vectors″Chapter 24.2，pp.470-472Vectors，Rodriguez和Denhardt，Eds.(Butterworths，Boston，Mass.1988)。更優(yōu)選，經(jīng)由電穿孔將質(zhì)粒引入宿主。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在適宜生產(chǎn)輕鏈和重鏈的條件下培養(yǎng)，并測定其重鏈和/或輕鏈蛋白合成。示例性測定技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，放射免疫測定法(RIA)，或熒光活化的細(xì)胞分選分析(FACS)，免疫組織化學(xué)，等等。
本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”以廣義含義使用，指使DNA進(jìn)入受體宿主細(xì)胞的任意引入過程，所述引入可改變基因型并最終導(dǎo)致受體細(xì)胞的改變。
在這些相同細(xì)胞系中，“宿主細(xì)胞”指由利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建并含有至少一個異源基因的載體所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。如本文所定義的，由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體或其修飾是由于這種轉(zhuǎn)化造成的。在對從重組宿主中分離抗體的過程的描述中，可互換使用術(shù)語“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”來表示抗體來源，除非另有清楚的說明。換句話說，從“細(xì)胞”收集抗體指從沉降的完整細(xì)胞收集，或從包含培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物收集。
用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞系最優(yōu)選是哺乳動物來源的；相信本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力優(yōu)先確定最適合表達(dá)所需基因產(chǎn)物的特定宿主細(xì)胞系。示例性的宿主細(xì)胞系包括，但不限于，DG44和DUXB 11(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系，DHFR HELA(人宮頸癌)，CVI(猴腎細(xì)胞系)，COS(帶有SV40T抗原的CVI衍生物)，R1610(中國倉鼠成纖維細(xì)胞)，BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)，HAK(倉鼠腎細(xì)胞系)，SP2/0(小鼠骨髓瘤)，P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)，BFA-lclBPT(牛上皮細(xì)胞)，RAJI(人淋巴細(xì)胞)和293(人腎細(xì)胞)。特別優(yōu)選CHO細(xì)胞。宿主細(xì)胞系一般從商業(yè)機構(gòu)，從美國組織培養(yǎng)物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或從出版的文獻(xiàn)獲得。
體外生產(chǎn)允許大規(guī)模產(chǎn)生出大量所需抗體。在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括例如在氣升式(air-lift)反應(yīng)器或連續(xù)攪拌反應(yīng)器中進(jìn)行同質(zhì)懸浮培養(yǎng)，或例如在空心纖維，微膠囊，或瓊脂糖微珠或陶筒中進(jìn)行固定化(immobilized)或截留化的(entrapped)細(xì)胞培養(yǎng)。為分離修飾的抗體，培養(yǎng)上清液中的免疫球蛋白首先被濃縮，例如通過硫酸銨沉淀，用吸濕材料諸如PEG透析，用選擇性膜過濾等等濃縮。如果必要和/或需要，用常規(guī)層析方法，例如凝膠過濾，離子交換層析，DEAE-纖維素或(免疫)親和層析來純化濃縮的抗體。
本發(fā)明的修飾免疫球蛋白基因和/或多肽還可在非哺乳動物細(xì)胞，如細(xì)菌或酵母中表達(dá)。在這方面，應(yīng)當(dāng)理解也可轉(zhuǎn)化各種單細(xì)胞非哺乳動物生物體，如細(xì)菌；即能在培養(yǎng)基或發(fā)酵物中生長的生物體。對轉(zhuǎn)化敏感的細(xì)菌，包括腸桿菌科的成員，如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株；沙門氏菌(salmonella)菌株；芽胞桿菌科(Bacillaceae)菌株，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；肺炎球菌屬(Pneumococcus)菌株；鏈球菌屬(Streptococcus)菌株，和流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)菌株。還應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá)時，免疫球蛋白的重鏈和輕鏈通常成為包涵體的一部分。然后所述鏈必須被分離，純化并隨后組裝成為功能性免疫球蛋白分子。
除原核生物之外，還可以使用真核微生物。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，或普通面包酵母(common baker′s yeast)是最常用的真核微生物，雖然許多其它菌株也是通?？色@得的。
對于在酵母(Saccharomyces)中的表達(dá)，通常使用，例如YRp7質(zhì)粒(Stinchcomb等，Nature 28239(1979)；Kingsman等，Gene 7141(1979)；Tschemper等，Gene 10157(1980))。這個質(zhì)粒已包含trpl基因，該基因提供了不能在色氨酸中生長的酵母突變株，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics 8512(1977))的選擇標(biāo)記。作為酵母宿主細(xì)胞基因組的特征的trpl損傷提供了通過在缺乏色氨酸的條件下生長來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。
不管獲得了多少臨床上有用的量，本發(fā)明修飾的抗體可以以許多偶聯(lián)的(即免疫偶聯(lián)物)或非偶聯(lián)的形式的中任意一種形式使用。具體是，本發(fā)明的抗體可以與細(xì)胞毒素，諸如放射性同位素，治療劑，細(xì)胞生長抑制劑，生物毒素或前體藥物偶聯(lián)。或者，本發(fā)明修飾的抗體可以非偶聯(lián)的或“裸露”的形式使用從而利用包括補體依賴的細(xì)胞毒(CDC)和抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)在內(nèi)的個體天然防御機制來消除惡性細(xì)胞。一個具體的優(yōu)選實施方案中，使用許多公知螯合劑的任意一種或直接標(biāo)記，可將修飾的抗體與放射性同位素，如90Y，125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166Ho，177Lu，186Re和188Re偶聯(lián)。其它實施方案中，公開的組合物可包括與藥物，前體藥物或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，諸如氨甲喋呤、阿霉素、和淋巴因子諸如干擾素等偶聯(lián)的修飾的抗體。本發(fā)明其它實施方案包含使用與特異性生物毒素，諸如篦麻毒素(ricin)或diptheria毒素偶聯(lián)的修飾的抗體。另一些實施方案中，修飾的抗體可與其它免疫活性配體(例如抗體或其片段)復(fù)合，得到的分子與腫瘤性細(xì)胞以及效應(yīng)細(xì)胞諸如T細(xì)胞等結(jié)合。選擇使用哪種偶聯(lián)的或非偶聯(lián)的經(jīng)修飾抗體將依賴于癌癥的類型和階段，輔助治療的使用(例如，化療或外部輻射)以及患者的狀態(tài)。應(yīng)當(dāng)理解本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)可以容易地進(jìn)行這種選擇。
本文所用的“細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒藥劑”指對細(xì)胞的生長和增殖有害，并且當(dāng)暴露于它時可減輕，抑制或破壞惡性腫瘤的任何藥劑。示例性細(xì)胞毒素包括，但不局限于，放射性核素，生物毒素，細(xì)胞生長抑制劑或細(xì)胞毒治療劑，前體藥物，免疫活性配體和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物諸如細(xì)胞因子等。如下文將要更詳細(xì)討論的，放射性核素細(xì)胞毒素特別優(yōu)選用于本發(fā)明。然而，任何阻止或延緩惡性細(xì)胞生長或消除惡性細(xì)胞、并可與本文公開的經(jīng)修飾抗體結(jié)合的細(xì)胞毒素在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
應(yīng)當(dāng)理解在早先的研究中，已成功地使用同位素標(biāo)記的抗腫瘤抗體來破壞實體腫瘤的細(xì)胞以及動物模型，有時是人模型的淋巴瘤/非白血性白血病。放射性核素通過產(chǎn)生電離輻射而發(fā)揮作用，所述電離輻射引起核DNA中的多鏈斷裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用于產(chǎn)生治療性偶聯(lián)物的同位素一般產(chǎn)生具有治療有效徑長(path length)的高能α-，γ-或β-微粒。這種放射性核素殺死與其緊密接近的細(xì)胞，例如偶聯(lián)物已附著或進(jìn)入的瘤性細(xì)胞。它們通常很少影響或不影響非定位化的(non-localized)細(xì)胞。放射性核素基本上是非免疫原性的。
關(guān)于本發(fā)明放射標(biāo)記的偶聯(lián)物的使用，修飾的抗體可被直接標(biāo)記(如通過碘化作用)或通過使用螯合劑間接標(biāo)記。本文所用的術(shù)語“間接標(biāo)記”和“間接標(biāo)記方法”都是指螯合劑與抗體共價連接并且至少一種放射性核素與螯合劑結(jié)合。這種螯合劑一般被稱為雙功能螯合劑，因為它們同時與多肽和放射性同位素結(jié)合。具體優(yōu)選的螯合劑包括1-isothiocycmatobenzyl-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(“MX-DTPA”)和環(huán)己基二乙烯三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其它螯合劑包括P-DOTA和EDTA衍生物。用于間接標(biāo)記的具體優(yōu)選的放射性核素包括111In和90Y。
本文所用的術(shù)語“直接標(biāo)記”和“直接標(biāo)記方法”都是指放射性核素直接與抗體共價連接(一般經(jīng)由氨基酸殘基)。更具體地，這些連接技術(shù)包括隨機標(biāo)記和定點標(biāo)記。在后一種情況中，標(biāo)記是針對二聚體或四聚體上的特定位點，如僅存在于偶聯(lián)物Fc部分的N-連接的糖殘基。此外，各種直接標(biāo)記技術(shù)和方案與本發(fā)明相容。例如，可如下制備锝-99m標(biāo)記抗體通過配體交換過程，用二價錫離子溶液還原高锝酸根(TcO4-)，將還原的锝螯合在葡聚糖凝膠柱上并將抗體加樣在這個柱上，或通過批量標(biāo)記技術(shù)，例如通過溫育高锝酸根、還原劑如SnCl2、緩沖液如鄰苯二甲酸鉀鈉(sodium-potassium phthalate)溶液和抗體。無論如何，用于直接標(biāo)記抗體的優(yōu)選放射性核素是本領(lǐng)域公知的，用于直接標(biāo)記的具體優(yōu)選放射性核素是經(jīng)由酪氨酸殘基共價連接的131I。根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾抗體可用例如，放射活性碘化鈉或碘化鉀以及化學(xué)氧化劑如次氯酸鈉、氯胺T等等，或酶氧化劑如乳過氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖等衍生。然而，對于本發(fā)明的目的，具體優(yōu)選間接標(biāo)記方法。
涉及螯合劑和螯合劑偶聯(lián)物的專利是本領(lǐng)域已知的。例如Gansow的US專利4,831,175涉及多取代的二乙烯基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid)螯合物和包含它的蛋白偶聯(lián)物及其制備方法。Gansow的US專利5,099,069，5,246,692，5,286,850，5,434,287和5,124,471還涉及多取代的DTPA螯合物。這些專利全文包含于此處。相容的金屬螯合劑的其他例子是乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙烯三胺五乙酸(DPTA)，1，4，8，11-四氮雜十四烷(tetraazatetradecane)，1，4，8，11-四氮雜十四烷-1，4，8，11-四乙酸，1-氧雜-4，7，12，15-四氮雜十七烷-4，7，12，15-四乙酸，等等。環(huán)己基DTPA或CHX-DTPA是具體優(yōu)選的并在下文中進(jìn)行了廣泛地舉例說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地辨別其它相容性螯合劑，包括那些還有待于發(fā)現(xiàn)的螯合劑，并且它們明顯包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
優(yōu)選選擇相容性螯合劑，包括在未決系列申請08/475,813，08/475,815和08/478,967中用于促進(jìn)螯合作用的特異性雙功能螯合劑，以提供對三價金屬的高親和性，顯示增加的腫瘤/非腫瘤比例和減少的骨吸收，以及放射性核素在靶位點，即B細(xì)胞淋巴瘤位點，更大的體內(nèi)積留。然而，可能具有或可能不具有所有這些特性的其它雙功能螯合劑是本領(lǐng)域已知的并且也有益于腫瘤治療。
還應(yīng)理解，根據(jù)本文的教導(dǎo)，為了診斷和治療目的，修飾的抗體可與不同的放射標(biāo)記偶聯(lián)。為此目的，上述共同未決申請(全文內(nèi)容包含在本文中作為參考)，公開了用于在給予治療性抗體之前對腫瘤進(jìn)行診斷性“成像”的放射標(biāo)記的治療性偶聯(lián)物?！癐n2B8”偶聯(lián)物包含對人CD20抗原具有特異性的鼠單克隆抗體2B8，其經(jīng)由雙功能螯合劑，即包含1-isothiocyanatobenzyl-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-isothiocyanatobenzyl-DTPA的1∶1混合物的MX-DTPA(二乙烯三胺五乙酸)與111In連接。具體優(yōu)選111In作為診斷用放射性核素，因為給予約1mCi至約10mCi是安全的，沒有可檢測的毒性；并且圖像數(shù)據(jù)通常預(yù)示著隨后的90Y標(biāo)記抗體的分布。大多數(shù)成像研究使用5mCi111In標(biāo)記的抗體，因為這個劑量不僅安全而且與較低劑量相比，提高了成像效率，其中最佳成像發(fā)生在給予抗體之后的3-6天。參見，例如Murray，J.Nuc.Med.263328(1985)和Carraguillo et al，J.Nuc.Med.2667(1985)。
如上所述，各種放射性核素都適用于本發(fā)明，并且相信本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定在各種情況下哪種放射性核素是最合適的。例如，131In是公知用于定向免疫療法的放射性核素。然而，131In的臨床有用性受一些因素的限制，包括8天的物理半衰期；血液中和腫瘤位點的經(jīng)碘化的抗體的脫鹵作用；和亞最適于腫瘤中局部劑量沉積(localized dose deposition)的發(fā)射特性(例如，大γ成分)。隨著更好的螯合劑的出現(xiàn)，將金屬螯合基團(tuán)與蛋白連接的機會增加了使用其它放射性核素如111In和90Y的機會。90Y提供了用于放射免疫治療應(yīng)用的一些益處90Y 64小時的半衰期對于允許腫瘤的抗體積聚而言足夠長，不像例如131I，90Y是一種高能純β發(fā)射體，在其衰變中沒有伴隨的γ輻射，在組織中的范圍是100至1,000細(xì)胞直徑(with a range oftissue of 100 to 1,000 cell diameters)。此外，貫穿輻射(penetrating radiation)的最小量使得可以給予門診病人90Y標(biāo)記抗體。另外，標(biāo)記的抗體的內(nèi)化作用不是殺死細(xì)胞所需的，并且電離輻射的局部發(fā)射對缺乏靶抗原的鄰近腫瘤細(xì)胞是致死性的。
90Y標(biāo)記的經(jīng)修飾抗體的有效單次治療劑量(即，治療有效量)是約5mCi至約75mCi，更優(yōu)選約10mCi至約40mCi。131I標(biāo)記的抗體的有效單次治療非骨髓燒蝕劑量是約5mCi至約70mCi，更優(yōu)選約5mCi至約40mCi。131I標(biāo)記抗體的有效單次治療燒蝕劑量(effective single treatmentnon-marrow ablative dosage)(即可能需要自體骨髓移植)是約30mCi至約600mCi，更優(yōu)選約50mCi至小于約500mCi。對于嵌合抗體，由于鼠抗體較長的循環(huán)半衰期，碘-131標(biāo)記的嵌合抗體的有效單次治療非骨髓燒蝕劑量是約5mCi至40mCi，更優(yōu)選小于約30mCi。例如111In標(biāo)記的成像標(biāo)準(zhǔn)一般是小于約5mCi。
雖然已經(jīng)獲得了許多關(guān)于131I和90Y的臨床經(jīng)驗，其它放射標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的并用于類似目的。還有其它放射性同位素用于成像。例如，與本發(fā)明范圍一致的其它放射性同位素包括，但不限于，123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153Sm，188Re，199Au，225Ac，211At，和213Bi。在這方面，α，γ和β發(fā)射體全部與本發(fā)明相容。此外，根據(jù)本文的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多的試驗就可以容易地確定哪些放射性核素與所選療程一致。為此，已經(jīng)用于臨床診斷的其它放射性核素包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga，和111In?？贵w也可用各種放射性核素標(biāo)記以便可能用于定向免疫療法Peirersz等Immunol.Cell Biol.65111-125(1987)。這些放射性核素在較低程度上包括188Re和186Re以及199Au和67Cu。US專利5,460,785提供了關(guān)于這種放射性同位素的附加數(shù)據(jù)，并包含于此作為參考。
除放射性核素之外，本發(fā)明修飾的抗體可與許多生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，藥物試劑，毒素或免疫活性配體中的任何一種偶聯(lián)或結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道根據(jù)所選擇的細(xì)胞毒素使用各種技術(shù)可組裝這些非放射性的偶聯(lián)物。例如帶有生物素的偶聯(lián)物可通過，例如將修飾的抗體與生物素的活化的酯，諸如生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)來制備。類似地，帶有熒光標(biāo)記的偶聯(lián)物可在存在偶聯(lián)劑，例如上文列出的偶聯(lián)劑時制備，或通過與異硫氰酸酯，優(yōu)選熒光素-異硫氰酸酯反應(yīng)來制備。本發(fā)明的嵌合抗體與細(xì)胞生長抑制劑/細(xì)胞毒物質(zhì)及金屬螯合物的偶聯(lián)物以類似的方式制備。
用于本發(fā)明的優(yōu)選試劑是細(xì)胞毒藥物，具體是用于癌癥療法的細(xì)胞毒藥物。這種藥物通常包括，細(xì)胞生長抑制劑，烷化劑，抗代謝物，抗增殖劑，微管蛋白結(jié)合劑，激素和激素拮抗劑，等等。與本發(fā)明一致的示例性細(xì)胞生長抑制劑包括烷基化物質(zhì)，諸如氮芥(mechlorethamine)，三亞乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，異磷酰胺(ifosfamide)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，白消安(busulfan)，美法蘭(mephalan)或三亞胺醌(triaziquone)，還有亞硝基脲(nitrosourea)化合物，如卡莫司汀(carmustine)，羅莫司汀(lomustine)，司莫司汀(semustine)。細(xì)胞毒藥劑的其它優(yōu)選類別包括，例如蒽環(huán)類抗生素家族的藥物，長春花屬藥物(vinca drug)，絲裂霉素(mitomycin)，博來霉素(bleomycin)，細(xì)胞毒性核苷(cytotoxicnucleoside)，蝶啶(pteridine)家族的藥物，diynenes，和鬼臼霉素(podophyllotoxin)。這些類別中特別有用的成員包括，例如，阿霉素(adriamycin)，洋紅霉素(carminomycin)，柔紅霉素(daunorubicin)(道諾霉素(daunomycin))，多柔比星(doxorubicin)，氨蝶呤(aminopterin)，氨甲喋呤(methotrexate)，甲基葉酸(methopterin)，光神霉素(mithramycin)，鏈黑菌素(streptonigrin)，二氯甲氨蝶呤(dichloromethotrexate)，絲裂霉素C，放線菌素D(actinomycin-D)，泊非霉素(porfiromycin)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，氟尿苷(floxuridine)，呋氟尿嘧啶(ftorafur)，6-巰基嘌呤(mercaptopurine)，阿糖胞苷(cytarabine)，胞嘧啶阿拉伯糖甙(cytosine arabinoside)，鬼臼霉素或鬼臼霉素衍生物如依托泊苷(etoposide)或依托泊苷磷酸鹽，美法蘭，長春堿(vinblastine)，長春新堿(vinscristine)，異長春堿(leurosidine)，長春地辛(vindesine)，長春羅新(leurosine)等等。與本文教導(dǎo)一致的其它細(xì)胞毒素包括紫杉醇(taxol)，紫杉烷(taxane)，細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B)，短桿菌肽D(gramicidin D)，溴化乙錠(ethidium bromide)，吐根堿(emetine)，tenoposide，秋水仙堿(colchicin)，二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)，米托蒽醌(mitoxantrone)，普魯卡因(procaine)，丁卡因(tetracain)，利多卡因(lidocaine)，普萘洛爾(propranolol)，和嘌呤霉素(puromycin)及其類似物或同系物。激素和激素拮抗劑，如皮質(zhì)類固醇，例如潑尼松，黃體酮(progestin)，例如羥孕酮或medroprogesterone，雌激素，例如己烯雌酚(diethylstilbestrol)，抗雌激素藥例如他莫昔芬(tamoxifen)，雄激素例如睪酮，芳香酶抑制劑例如氨魯米特也與本發(fā)明的教導(dǎo)一致。如先前所述的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對所需的化合物進(jìn)行化學(xué)修飾以使用于制備本發(fā)明偶聯(lián)物的化合物的反應(yīng)更方便地發(fā)生。
一個具體優(yōu)選的細(xì)胞毒素的例子包括抗腫瘤抗生素enediyne家族的成員或衍生物，包括刺孢霉素(calicheamicin)，esperamicins或dynemicin。這些毒素非常有效并通過切割核DNA而發(fā)揮作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。不像在體內(nèi)可斷裂產(chǎn)生許多失活的但有免疫原性的多肽片段的蛋白質(zhì)毒素，毒素諸如刺孢霉素(calicheamicin)，esperamicins和其它enediynes等是基本上無免疫原性的小分子。這些非肽毒素通過先前用于標(biāo)記單克隆抗體和其它分子的技術(shù)與二聚體或四聚體通過化學(xué)方法連接。這些連接技術(shù)包括經(jīng)由僅存在于偶聯(lián)物Fc部分的N-連接的糖殘基的位點特異性連接。這種定點連接方法的優(yōu)點是其降低了連接對偶聯(lián)物結(jié)合特性的可能影響。
如上所述，相容的細(xì)胞毒素可包含前體藥物。本文所用的術(shù)語“前體藥物”是指這樣的藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其與親本藥物相比對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，并且能被酶活化或變?yōu)楦钴S的親本形式。適于本發(fā)明的前體藥物包括，但不局限于，含磷酸鹽的前體藥物，含硫代磷酸鹽的前體藥物，含硫酸鹽的前體藥物，含肽的前體藥物，含β-內(nèi)酰胺的前體藥物，含任選取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或含人選取代的苯乙酰胺的前體藥物，可變?yōu)楦呋钚缘臒o細(xì)胞毒單體藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？裳苌蔀橛糜诒景l(fā)明的前體藥物形式的細(xì)胞毒藥物的其它例子包含如上所述的化學(xué)治療劑。
除了其它細(xì)胞毒素，應(yīng)當(dāng)理解抗體還可與下述生物毒素結(jié)合，如篦麻毒素亞基A，相思豆毒素，diptheria toxin，肉毒桿菌毒素(botulinum)，cyanginosin，海藻毒素(saxitoxin)，志賀毒素(shigatoxin)，破傷風(fēng)(tetanus)，河豚毒素(tetrodotoxin)，單端孢霉烯(richothecene)，verrucologen或毒性酶。這種構(gòu)建體優(yōu)選使用允許抗體-毒素構(gòu)建體直接表達(dá)的遺傳工程技術(shù)制備?？膳c本發(fā)明修飾的抗體結(jié)合的其它生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物包含細(xì)胞因子如淋巴因子和干擾素。此外，如上所述，還可用類似構(gòu)建體使免疫活性配體(例如抗體或其片段)與本發(fā)明修飾的抗體結(jié)合。優(yōu)選，這些免疫活性配體針對免疫活性效應(yīng)細(xì)胞表面的抗原。在這些情況中，構(gòu)建體可用于使效應(yīng)細(xì)胞，諸如T細(xì)胞或NK細(xì)胞等，緊密靠近帶有腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞從而激發(fā)所需的免疫反應(yīng)。根據(jù)本文的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員用常規(guī)技術(shù)可以容易地形成這種構(gòu)建體。
可與所公開修飾的抗體聯(lián)用的另外一類適宜的細(xì)胞毒素是可有效針對腫瘤細(xì)胞的放射增敏(radiosensitizing)藥物。這種藥物增強對電離輻射的敏感性，從而提高放射療法的效力。腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的抗體偶聯(lián)物將放射增敏劑遞送到接近輻射致敏作用最大的細(xì)胞核。與修飾的抗體連接的未結(jié)合型放射增敏劑很快從血液中清除，使剩余的放射增敏劑局限在靶腫瘤中并且正常組織中的吸收最小。從血液中快速清除之后，以下述三種途徑中的其中一種給予輔助放射療法1)特異性針對腫瘤的外部線束輻射，2)直接植入腫瘤的放射活性，或3)使用相同的靶向抗體(targeting antibody)的全身性放射免疫治療。這種方法可能的吸引人的變化是將治療用放射性同位素與放射增敏的免疫偶聯(lián)物連接，從而方便地將單一藥物給予患者。
不管所公開的抗體是以偶聯(lián)的或非偶聯(lián)的形式使用，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的主要優(yōu)點是能在骨髓抑制的患者，具體是正在接受或已接受輔助治療諸如放療或化療的患者中，使用這種抗體。即，修飾的抗體的有利遞送圖譜(beneficial delivery profile)(即相對短的血清停留時間和增強的定位)使得它們特別有利于治療紅骨髓儲備減少并對骨髓毒性(myelotoxicity)敏感的患者。在這方面，修飾的抗體的獨特遞送圖譜使得它們能非常有效地將放射性標(biāo)記的偶聯(lián)物給予骨髓受抑制的癌癥患者。因而，修飾的抗體的偶聯(lián)或非偶聯(lián)的形式在先前已接受過輔助治療諸如外部射線輻射或化療的患者中是有用的。在其它優(yōu)選實施方案中，修飾的抗體(也為偶聯(lián)或非偶聯(lián)的形式)可以和化學(xué)治療劑一起用于聯(lián)合治療方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這種療法可包含所公開抗體與一種或多種化學(xué)治療劑的相繼(sequential)、同時(simultaneous)、并存(concurrent)或同延(coextensive)給藥。本發(fā)明這個方面的具體優(yōu)選實施方案包含給予放射標(biāo)記的抗體。
雖然可如上所述給予修飾的抗體，必需強調(diào)在其它實施方案中可將偶聯(lián)的和非偶聯(lián)的修飾的抗體作為第一線治療劑給予其他方面健康的癌癥患者。在這種實施方案中，可將修飾的抗體給予患有腫瘤的患者和/或給予目前為止沒有和現(xiàn)在沒有接受輔助治療如外部射線輻射或化療的患者。
本發(fā)明的多肽本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有圖1B，9F，21B或22B所示的氨基酸序列(SEQID NOS2，4，6，8，22-27或29)的IGSF9或LIV-1多肽，或包括上述多肽一部分的肽或多肽。認(rèn)為術(shù)語“肽”和“寡肽”是同義的(如同通常所認(rèn)為的那樣)，并且每個術(shù)語可以根據(jù)上下文需要交換使用，以表示通過肽基連接所偶聯(lián)的至少2個氨基酸的鏈(a chain of at least to amino acids coupledby peptidyl linkages)。本文術(shù)語“多肽”指包含多于十個氨基酸殘基的鏈。本文所有寡肽和多肽的通式或序列是從左至右從氨基末端到羧基末端的方向書寫。
本領(lǐng)域已知IGSF9或LIV-1多肽的一些氨基酸序列可改變而不會顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。如果考慮到序列中的這種差異，應(yīng)當(dāng)記住蛋白中存在決定活性的關(guān)鍵(critical)區(qū)域。通常，有可能替換形成三級結(jié)構(gòu)的殘基，條件是使用執(zhí)行類似功能的殘基。在其它情況中，如果改變發(fā)生在蛋白的非關(guān)鍵區(qū)域，則殘基的類型完全不重要。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括IGSF9或LIV-1多肽的變體，其包含IGSF9或LIV-1蛋白的區(qū)域，如下文討論的蛋白部分。這種突變體包括缺失，插入，翻轉(zhuǎn)(inversion)，重復(fù)，和類型取代(例如，規(guī)則是用一個親水性殘基取代另一個親水性殘基，而不是用強親水性殘基取代強疏水性殘基)。小變化或這種“中性”氨基酸取代通常對活性影響很小。
一般被看作保守性取代的是脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中一個替換另一個；羥基殘基Ser和Thr的交換，酸性殘基Asp和Glu的交換，酰胺殘基Asn和Gln之間的取代，堿性殘基Lys和Arg的交換以及芳香族殘基Phe，Tyr的替換。
如上文詳細(xì)描述的，在Bowie，J.U.，等，“Deciphering the Message inProtein SequencesTolerance to Amino Acid Substitutions，”Science2471306-1310(1990)中可發(fā)現(xiàn)關(guān)于哪些氨基酸改變可能是表型沉默的(即，不可能對功能具有顯著有害作用)的進(jìn)一步地指導(dǎo)。
因此，圖1B，9B，9D，9F，21B，或22B所示的多肽片段，衍生物或類似物(SEQ ID NOS2，4，6，8，22-27或29)可以是(i)其中一個或多個氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基取代(優(yōu)選保守氨基酸殘基)并且這種被取代的氨基酸殘基由或不由遺傳密碼編碼，或(ii)其中一個或多個氨基酸殘基包括取代基團(tuán)，或(iii)其中成熟多肽與另一化合物，如增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)融合，或(iv)其中添加的氨基酸與成熟多肽，諸如IgG Fc融合區(qū)的肽或前導(dǎo)序列或分泌序列或用于純化成熟多肽或前蛋白序列的序列融合。根據(jù)的本文教導(dǎo)，認(rèn)為這種片段，衍生物和類似物在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
本發(fā)明IGSF9或LIV-1蛋白中對功能必需的氨基酸可用本領(lǐng)域的公知方法鑒別，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham and Wells，Science2441081-1085(1989))。后一方法在分子的每個殘基引入單個丙氨酸突變。然后測試所獲得的突變分子的生物學(xué)活性。對配體-受體結(jié)合很重要的位點也可通過結(jié)構(gòu)分析諸如結(jié)晶、核磁共振或光親和標(biāo)記而確定(Smith et al，J.Mol.Biol.224899-904(1992)和de Vos等Science 255306-312(1992))。
本發(fā)明多肽優(yōu)選以分離的形式提供?！胺蛛x的多肽”指離開其天然環(huán)境的多肽。因此，認(rèn)為重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽和/或包含在重組宿主細(xì)胞中的多肽對本發(fā)明來說是分離的?！胺蛛x的多肽”還指已部分或基本從重組宿主細(xì)胞純化的多肽。
可使用本領(lǐng)域已知的各種方法獲得任意一種本發(fā)明的分離多肽。在最簡單的水平，可用購得的肽合成儀合成氨基酸序列。通過合成方法構(gòu)建的蛋白序列，由于與蛋白具有共同的一級，二級或三級結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象特性，可具有與其相同的生物學(xué)特性，包括蛋白活性。這個技術(shù)對生產(chǎn)小肽和較大多肽的片段特別有用。片段用于，例如，產(chǎn)生抗天然多肽的抗體。因此，可使用它們作為在篩選治療性化合物以及抗體開發(fā)的免疫學(xué)過程中的天然純化蛋白的生物活性或免疫學(xué)替代物。
本發(fā)明多肽或者可從經(jīng)改變而表達(dá)所需多肽的細(xì)胞中純化。本文中，當(dāng)細(xì)胞通過遺傳操作改造成產(chǎn)生它通常不產(chǎn)生或通常以低水平產(chǎn)生的多肽時，我們說細(xì)胞被改變而表達(dá)所需的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地使該方法適應(yīng)于在真核細(xì)胞或者原核細(xì)胞中引入和表達(dá)重組體或合成序列，以便生成產(chǎn)生本發(fā)明多肽之一的細(xì)胞。這些物質(zhì)包括上述質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。例如，重組產(chǎn)生的IGSF9或LIV-1多肽可通過Smith和Johnson，Gene6731-40(1988)所述的一步法基本純化。
本發(fā)明的IGSF9或LIV-1多肽包括含有前導(dǎo)肽的多肽；不含前導(dǎo)肽的成熟多肽(即，成熟蛋白質(zhì))；包含圖1B中約21至約718位氨基酸的多肽(SEQID NO2)；包含圖9F中約1至約1179位氨基酸的多肽(SEQ ID NO8)；包含圖9F中約21至約1179位氨基酸的多肽(SEQ ID NO8)；包含SEQ IDNOS4，6，22-27所示序列的多肽；包含圖22B中約28至約317位氨基酸的多肽(SEQ ID NO29)；包含圖22B中約373至約417位氨基酸的多肽(SEQ ID NO29)；包含圖22B中約674至約678位氨基酸的多肽(SEQ IDNO29)；包含圖22B中約742至約749位氨基酸的多肽(SEQ ID NO29)；以及這樣一種多肽，其與上述多肽至少80％相同，更優(yōu)選至少90％或95％相同，更優(yōu)選至少96％，97％，98％或99％相同，并且還包括至少30個氨基酸更優(yōu)選至少50氨基酸的這種多肽的一部分。
兩種多肽的“％相似性”指用Bestfit程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University ResearchPark，575 Science Drive，Madison，Wis.53711)和用于測定相似性的默認(rèn)設(shè)置來比較兩種多肽的氨基酸序列所產(chǎn)生的相似性得分。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2482-489，1981)來找到兩個序列之間最相似的片段。
具有與IGSF9或LIV-1多肽的參照氨基酸序列至少，例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽是指，所述多肽的氨基酸序列與參照序列相同，除了在IGSF9或者LIV-1多肽的參照氨基酸的每100個氨基酸中所述多肽序列最多可包括5個氨基酸改變。換句話說，為獲得具有與參照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，參照序列中多至5％的氨基酸殘基可被缺失或用其它氨基酸取代，或多至占參照序列全部氨基酸殘基5％的氨基酸可被插入到參照序列中。參照序列的這些改變可發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基末端的位置或羧基末端或在這些末端位置之間的任何地方，個別地散布在參照序列的殘基中或在參照序列的一個或多個鄰接基團(tuán)中。
作為現(xiàn)實問題，任意特定多肽與例如圖1B和22B所示的氨基酸序列(SEQ ID NOS2和29)是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，可用已知的計算機程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)常規(guī)確定。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序列對比程序來確定具體序列與本發(fā)明參照序列是否例如95％相同時，當(dāng)然要設(shè)置參數(shù)以便計算相對于全長參照氨基酸序列的同一性百分比，并且允許在與參照序列全部氨基酸殘基達(dá)5％同源的殘基中存在間隙(gaps inhomology of up to 5％ of the total number of amino acid residues in the referencesequence are allowed)。
本發(fā)明多肽作為以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知方法的SDS-PAGE凝膠或分子篩凝膠過濾柱的分子量標(biāo)記物是有用的。
經(jīng)純化的多肽可用于本領(lǐng)域公知可用于鑒別與多肽結(jié)合的分子的體外結(jié)合試驗。這些分子包括，但不局限于，例如，小分子，來自組合文庫的分子，抗體或其它蛋白。
此外，能與肽結(jié)合的本發(fā)明肽或分子可與毒素，例如篦麻毒素或霍亂毒素，或與其它對細(xì)胞有毒性的化合物復(fù)合。然后毒素-結(jié)合分子復(fù)合物通過結(jié)合分子對圖1B，9B，9D，9F，21B，或22B所示多肽(SEQ ID NOS2，4，6，8，22-27或29)的特異性從而靶向腫瘤或其它細(xì)胞。
如先前詳細(xì)描述的，本發(fā)明多肽可用于激發(fā)多克隆抗體和單克隆抗體，所述抗體可用于如下所述在診斷試驗中檢測IGSF9或LIV-1蛋白的表達(dá)，或作為能增強或抑制IGSF9或LIV-蛋白功能的激動劑和拮抗劑。此外，這種多肽可用于酵母雙-雜合系統(tǒng)(yeast two hybrid system)去“捕獲”也是本發(fā)明激動劑和拮抗劑候選物的IGSF9或LIV-1蛋白結(jié)合蛋白。Fields and Song，Nature 340245-246(1989)描述了酵母雙雜合系統(tǒng)。
本發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明還提供了包含編碼上述IGSF或LIV-1多肽的多核苷酸的分離的核酸分子。
除非另有說明，本文所述的每個“核苷酸序列”是脫氧核糖核苷酸(縮寫A，G，C和T)序列。然而，核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”，對于DNA分子或多核苷酸而言，是指脫氧核糖核苷酸序列，對RNA分子或多核苷酸而言，是指相應(yīng)的核糖核苷酸序列(A，G，C和U)，其中具體的脫氧核苷酸序列中的每個胸苷脫氧核苷酸(T)被核糖核苷酸尿苷(U)替代。例如，具有用脫氧核糖核苷酸縮寫表示的SEQ ID NO1序列的RNA分子是指具有下述序列的RNA分子，其中SEQ ID NO1的每個脫氧核苷酸A，G或C已被相應(yīng)的核糖核苷酸A，G或C替代，并且每個脫氧核苷酸T已被核糖核苷酸U替代。
用本文提供的信息，如圖1A，9A，9C，9E，9H，21A，和22A中的核苷酸序列，可用標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選方法，如用mRNA作為起始材料克隆cDNA的那些方法，獲得編碼IGSF9或LIV-1多肽的本發(fā)明核酸分子。分離的核酸還可如上所述克隆到載體中并在宿主細(xì)胞中增殖，這也是本領(lǐng)域公知的。
圖1A中所示的IGSF9的確定核苷酸序列包含編碼約1163個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放閱讀框，其具有位于圖1A-1B所示核苷酸序列(SEQ IDNOS1-2)位置1的起始密碼子，以及約20個氨基酸殘基的預(yù)測的前導(dǎo)序列。預(yù)測的IGSF9蛋白的氨基酸序列進(jìn)一步包含如圖1B所示從約21位氨基酸至約718位氨基酸的胞外區(qū)。
圖8A中所示LIV-1的確定核苷酸序列包含編碼約749個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放閱讀框，其具有位于圖22A-22B所示核苷酸序列(SEQ IDNOS28-29)位置1的起始密碼子，以及約27個氨基酸殘基的預(yù)測的前導(dǎo)序列。預(yù)測的LIV-1蛋白的氨基酸序列進(jìn)一步包含從約28位氨基酸至約317位氨基酸，從約373位氨基酸至約417位氨基酸，從約674位氨基酸至約678位氨基酸，和從約742位氨基酸至約749位氨基酸的胞外域，如圖22B所示。
本發(fā)明所述的核酸分子可以是RNA形式，諸如mRNA，或是DNA形式，包括例如通過克隆或合成方法產(chǎn)生的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈，也稱作有義鏈，或是非編碼鏈，也稱作反義鏈。
“分離的”核酸分子指已從其天然的環(huán)境去除的核酸分子，DNA或RNA。例如認(rèn)為載體中包含的重組DNA分子為本發(fā)明目的而是分離的。分離的DNA的其它例子包括保留在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子或溶液中純化的(部分或基本上)DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的分離核酸分子進(jìn)一步包括由合成方法產(chǎn)生的這種分子。
本發(fā)明的分離的核酸分子包括包含開放閱讀框(ORF)和圖1A和22A所示核苷酸序列(SEQ ID NOS1和28)位置1位的起始密碼子的DNA分子；包含圖1A和22A所示成熟IGSF9和LIV-1蛋白編碼序列(SEQ ID NOS1和28)的DNA分子；包含圖9A，9C，9E，9H和21A所示編碼序列(SEQ ID NOS3，5，7和12-21)的DNA分子；和包含基本不同于上述序列，但由于遺傳密碼簡并性仍然編碼IGSF9或LIV-1蛋白的序列的DNA分子。當(dāng)然，遺傳密碼是本領(lǐng)域公知的。因此產(chǎn)生上述簡并變體對本領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本文所述分離的核酸分子的片段。具有圖1A，9A，9C，9E，9H，21A，或22A所示核苷酸序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21或28)的分離核酸分子的片段是指這樣的片段，其長度至少約15個核苷酸(nt)，更優(yōu)選至少約20nt，還更優(yōu)選至少約30nt，甚至更優(yōu)選至少約40nt，可用作本文所述的診斷探針和引物。當(dāng)然，長度為50-500nt的較大片段根據(jù)本發(fā)明也可用作對應(yīng)于大部分(如果不是全部的話)圖1A，9A，9C，9E，9H，21A，或22A所示核苷酸序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21或28)的片段。例如長度至少為20nt的片段是指包括來自圖1A，9A，9C，9E，9H，21A，或22A所示核苷酸序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21或28)的20個或更多個鄰接堿基的片段。本發(fā)明的優(yōu)選核酸片段包括編碼IGSF9或LIV-1蛋白表位攜帶部分的核酸分子。這種分離的分子，具體是DNA分子，可用作探針，其通過與染色體的原位雜交進(jìn)行基因定位，通過例如Northern印跡分析檢測IGSF9或LIV-1基因在人類組織中的表達(dá)。如下文詳細(xì)描述的，檢測到的某些組織或體液中改變的IGSF9或LIV-1基因表達(dá)預(yù)示著某種腫瘤疾病。
另一個方面提供的編碼本發(fā)明多肽的分離核酸分子包含在嚴(yán)格雜交條件下與上述本發(fā)明核酸分子中的部分多核苷酸雜交的多核苷酸?！皣?yán)格雜交條件”是指在42℃在包含下述物質(zhì)的溶液中過夜溫育50％甲酰胺，5×SSC(750mM NaCl，75mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH 7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/mL變性的經(jīng)剪切的鮭精DNA，然后用0.1×SSC在約65℃洗滌濾紙。與“部分”多核苷酸雜交的多核苷酸是指與參照多核苷酸的至少約15nt，更優(yōu)選至少約20nt，還更優(yōu)選至少約30nt，甚至更優(yōu)選約30-70nt雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。這些可用作如上所述的診斷探針和引物并在下文更詳細(xì)描述。
當(dāng)然，與參照多核苷酸的較大部分例如長度為50-750nt的部分或甚至全長參照多核苷酸雜交的多核苷酸也可作為本發(fā)明探針，如與對應(yīng)于大部分(如果不是全部的話)圖1A，9A，9C，9E，9H，21A，或22A所示核苷酸序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21或28)的多核苷酸那樣。“長度至少20nt”的部分多核苷酸是指，例如來自參照多核苷酸的核苷酸序列的20個或更多個鄰接核苷酸。所述這種部分作為根據(jù)常規(guī)DNA雜交技術(shù)的探針或者作為通過例如Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd.edition，edited bySambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.and Maniatis，T.，(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增靶序列的引物，在診斷上是有用的，上述文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容引入此處作為參考。
由于圖1A，9A，9C，9E，9H，21A，或22A提供了IGSF9和LIV-1的核苷酸序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21，或28)，生成與部分IGSF9或LIV-1分子雜交的多核苷酸對本領(lǐng)于技術(shù)人員來說是常規(guī)的。例如，通過限制性核酸內(nèi)切酶裂解或超聲波剪切，可以容易地利用IGSF9或LIV-1分子生成各種大小的DNA部分，所述DNA是與全長IGSF9或LIV-1分子的一部分雜交的多核苷酸。或者，本發(fā)明的雜交多核苷酸可以按照已知技術(shù)通過合成產(chǎn)生。當(dāng)然，僅與聚A序列雜交的多核苷酸(例如IGSF9或LIV-1多核苷酸的3′末端聚(A)片段(tract))，或與T(或U)片段互補鏈雜交的多核苷酸，不包括在用于與本發(fā)明核酸的一部分雜交的本發(fā)明多核苷酸的范圍內(nèi)，因為這種多核苷酸與含有(A)片段或其互補鏈的任意核酸分子雜交。
如上所述，編碼IGSF9或LIV-1多肽的本發(fā)明核酸分子包括，但不限于，本身編碼成熟多肽的氨基酸序列的核酸分子；成熟多肽和附加序列的編碼序列，例如編碼約20個氨基酸的前導(dǎo)序列或分泌序列的序列，有如前蛋白，或原蛋白(pro-protein)或前原蛋白序列；成熟多肽的編碼序列，該序列有或沒有上述附加編碼序列，同時有附加非編碼序列，包括例如，但不限于，內(nèi)含子和非編碼5′和3′序列，諸如在轉(zhuǎn)錄、mRNA加工(包括例如剪接和多聚腺苷酸化信號)、mRNA的核糖體結(jié)合和穩(wěn)定中起作用的已轉(zhuǎn)錄的、非翻譯的序列；編碼附加氨基酸諸如提供額外功能的氨基酸等的附加編碼序列。因此，編碼多肽的核酸序列可與標(biāo)記序列融合，所述標(biāo)記序列諸如編碼促進(jìn)融合的多肽的純化的肽的序列。在本發(fā)明這方面的具體優(yōu)選實施方案中，標(biāo)記氨基酸序列是六-組氨酸肽，諸如pQE載體(Qiagen，Inc.)提供的標(biāo)記，其中許多是可購得的。例如，如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA86821-824(1989)所述，六-組氨酸為純化融合蛋白提供了方便?！癏A”標(biāo)記是另一個有利于純化的肽，對應(yīng)于如Wilson等，Cell 37767(1984)所述的得自流感血凝素(influenza hemagglutinin)蛋白的表位。其它此類融合蛋白包括在氨基末端或羧基末端與IgG Fc融合的IGSF9或LIV-1。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼IGSF9或LIV-1蛋白的一部分，類似物或衍生物的本發(fā)明核酸分子的變體。變體可以是天然存在的，諸如天然等位基因變體?！暗任换蜃凅w”是指占據(jù)生物體染色體上指定基因座的基因的若干替代形式中的一種。Genes II，Lewin，ed。用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)可制備非天然存在的變體。
這種變體包括通過核苷酸取代，缺失或添加而制備的變體。取代，缺失或添加可涉及一個或多個核苷酸。變體可在編碼區(qū)或非編碼區(qū)或在兩者中都被改變。編碼區(qū)的改變可產(chǎn)生保守的或非保守的氨基酸取代，缺失或添加。其中尤其優(yōu)選不改變IGSF9或LIV-1蛋白或其一部分的性質(zhì)和活性的沉默取代，添加或缺失。這方面還特別優(yōu)選保守取代。最優(yōu)選編碼具有圖1A，9A，9C，9E，和22A所示氨基酸序列(SEQID NOS1，3，5，7和28)的成熟IGSF9或LIV-1蛋白的核酸分子。
本發(fā)明另一實施方案包括分離的核酸分子，所述核酸分子包含具有與下述序列至少90％相同，更優(yōu)選至少95％，96％，97％，98％或99％相同的多核苷酸(a)編碼具有圖1A，9A，9C，9E，9H，21A，或22A所示序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21或28)的IGSF9或LIV-1多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有圖1B中約21-約718位(SEQID NO2)，圖22B中約28-約317位(SEQID NO29)，圖22B中約373-約417位(SEQID NO29)，圖22B中約674-約678位(SEQID NO29)，或圖22B中約742-約749位(SEQIDNO29)氨基酸序列的成熟IGSF9或LIV-1多肽的核苷酸序列；和(c)與上述(a)，或(b)中任意核苷酸序列互補的核苷酸序列。
具有與編碼IGSF9或LIV-1多肽的參照核苷酸序列至少，例如95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸是指，多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相同，除了在編碼IGSF9或者LIV-1多肽的參照核苷酸序列的每100個核苷酸中，多核苷酸序列可包括多至5個點突變。換句話說，為獲得具有的核苷酸序列與參照核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參照序列中達(dá)5％的核苷酸殘基可被缺失或用其它核苷酸取代，或多至參照序列總核苷酸5％的核苷酸可被插入到參照序列中。參照序列的這些突變可發(fā)生在參照核苷酸序列的5’末端或3’末端位置或在這些末端位置之間的任何地方，分別地散布在參照序列的核苷酸中或在參照序列的一個或多個鄰接基團(tuán)中。
作為現(xiàn)實的問題，任意特定核酸分子與，例如1A，9A，9C，9E，9H，21A或22A所示核苷酸序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21或28)是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，可用已知的計算機程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，GeneticsComputer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，Wis.53711)常規(guī)確定。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advancesin Applied Mathematics 2482-489，1981)來找到兩個序列之間最同源的片段。當(dāng)使用Bestfit或任何其它序列對比程序來確定特定序列與本發(fā)明參照序列是否例如95％相同時，當(dāng)然要設(shè)置參數(shù)以便計算全長參照核苷酸序列的同一性百分比，并且允許在與參照序列全部氨基酸殘基達(dá)5％同源的殘基中存在間隙。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域技術(shù)人員將立即意識到序列與圖1A，9A，9C，9E，9H，21A，或22A所示核酸序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21或28)至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的大量核酸分子編碼具有IGSF9或LIV-1蛋白活性的多肽。事實上，由于這些核苷酸序列的簡并變體都編碼相同的多肽，所以即使不進(jìn)行上述對比分析，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員也是清楚的。在本領(lǐng)域中將進(jìn)一步認(rèn)識到，對于不是簡并變體的這種核酸分子，相當(dāng)多的核酸分子也編碼具有IGSF9或LIV-1蛋白活性的多肽。這是由于本領(lǐng)域技術(shù)人員非常了解很少會或不會顯著影響蛋白質(zhì)功能的氨基酸取代(例如，用第二種脂肪族氨基酸代替第一種脂肪族氨基酸)。
例如，Bowie，J.U.，et al，″Deciphering the Message in ProteinSequencesTolerance to Amino Acid Substitutions，″Science2471306-1310(1990)提供了關(guān)于如何進(jìn)行表型沉默的氨基酸取代的指導(dǎo)，其中作者表明存在兩種主要的研究氨基酸序列對改變的耐受性的方法。第一種方法依賴于進(jìn)化過程，其中通過自然選擇接受或拒絕突變。第二種方法使用遺傳工程在克隆基因的具體位置引入氨基酸改變，并通過選擇或篩選鑒別能維持功能性的序列。如作者所述，這些研究揭示了蛋白質(zhì)能驚人地耐受氨基酸取代。作者進(jìn)一步表明氨基酸改變在蛋白質(zhì)的某些位置是允許的。例如，大多數(shù)隱藏氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，反之只有很少的表面?zhèn)孺湹男再|(zhì)通常是保守的。Bowie，J.U.，et al，出處同上，和此處引用的參考文獻(xiàn)中描述了其它表型沉默的取代。
癌癥診斷和治療本發(fā)明的多肽參與癌細(xì)胞產(chǎn)生，增殖或轉(zhuǎn)移。檢測本發(fā)明多核苷酸或多肽的存在或量有利于診斷和/或預(yù)后一種或多種類型的癌癥。例如，本發(fā)明多核苷酸/多肽的存在或表達(dá)增加可以表明癌癥的遺傳風(fēng)險，癌前病變，或發(fā)展中的惡性腫瘤。反之，基因缺陷或缺少多肽可能與癌癥狀態(tài)相關(guān)。鑒別伴隨癌癥或癌癥傾向性的單核苷酸多態(tài)性也有利于診斷或預(yù)后。
癌癥治療通過下列方式促進(jìn)腫瘤退化抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制血管生成(支持腫瘤生長所必需的新血管的生長)和/或通過減少腫瘤細(xì)胞活動性或浸潤性阻止轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的治療組合物對成人和兒科腫瘤有效，所述腫瘤包括實體瘤/惡性腫瘤，肺癌包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，乳腺癌包括小細(xì)胞癌和導(dǎo)管癌，胃腸癌包括食道癌，胃癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌以及伴隨結(jié)腸直腸瘤的息肉，包括膀胱癌和前列腺癌的泌尿系統(tǒng)癌癥，和雌性生殖道惡性腫瘤包括卵巢癌，子宮癌(包括子宮內(nèi)膜癌)和卵泡中的實體瘤。
可給予本發(fā)明的多肽，多核苷酸，抗體(或其抗原結(jié)合片段)或多肽調(diào)節(jié)劑(包括本發(fā)明多肽的生物活性的抑制劑和激活劑)以治療癌癥。治療組合物可以治療有效量單獨給予，或與輔助性癌癥療法，諸如手術(shù)，化療，放療，溫?zé)岑煼ǎ图す獐煼?lián)合使用，并且可以產(chǎn)生有益效果，例如減少腫瘤大小，減緩腫瘤生長速率，抑制轉(zhuǎn)移，或改善總體臨床病癥，而不會必然地根除癌癥。
組合物還可將治療有效量給藥作為抗癌混合物(anti-cancer cocktail)的一部分。抗癌混合物是除了用來遞送的可藥用載體之外，本發(fā)明多肽或調(diào)節(jié)劑以及一種或多種抗癌藥物的混合物。用抗癌混合物作為癌癥療法是常規(guī)的。本領(lǐng)域公知的并且可與本發(fā)明多肽或調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用用于治療的抗癌藥物包括放線菌素D(Actinomycin D)，氨魯米特(Aminoglutethimide)，天冬酰胺酶(asparaginase)，博來霉素(Bleomycin)，白消安(Busulfan)，卡鉑(Carboplatin)，卡莫司汀(Carmustine)，苯丁酸氮芥(Chalorambucil)，順鉑(Cisplatin)(順式DDP)，環(huán)磷酰胺(Cyclophophamide)，阿糖胞苷鹽酸鹽(Cytarabine HCl)(胞嘧啶阿拉伯糖甙(Cytosine arabinoside))，氮烯咪胺(Dacarbazine)，更生霉素(Dactinomycin)，柔紅霉素鹽酸鹽(DaunorubicinHCl)，阿霉素鹽酸鹽(Doxorubicin HCl)，雌氮芥磷酸鈉(Estramustine phosphatesodium)，依托泊苷(Etoposide)(V16-213)，5-氟脫氧尿苷(Floxuridine)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-Fu)，氟他胺(Flutamide)，羥基脲(Hydroxyurea)(羥基脲(Hydroxycarbamide))，異環(huán)磷酰胺(Ifoslamide)，干擾素α-2a，干擾素α-2b，醋酸亮丙瑞林(Leuprolide acetate)(LHRH釋放因子類似物)，羅莫司汀(Lomustine)，雙氯乙基甲胺鹽酸鹽(Mechlorethamine HCl)(氮芥)，美法侖(Melphalan)，巰嘌呤(Mercaptopurine)，巰乙磺酸鈉(Mesna)，氨甲喋呤(MTX)，絲裂霉素(Mitomycine)，米托蒽醌鹽酸鹽(Mitoxantrone HCl)，奧曲肽(Octreotide)，普卡霉素(Plicamycine)，丙卡巴肼鹽酸鹽(Procarbazine HCl)，鏈唑霉素(streptozocin)，枸櫞酸它莫西芬(Tamoxifen citrate)，巰鳥嘌呤(Thioguanine)，塞替派(Thiotepa)，硫酸長春堿(Vinblastine sulfate)，硫酸長春新堿(Vincristine sulfate)，安吖啶(Amsacrine)，阿扎胞苷(Azacitidien)，六甲密胺(Hexamethylmelamine)，干擾白細(xì)胞素-2，丙脒腙(Mitoguazone)，噴司他丁(Pentostatine)，司莫司汀(Semustine)，替尼泊苷(Teniposide)，和乙酰長春地辛(Vindesine sulfate)。
另外，本發(fā)明的治療性組合物可以用于癌癥的預(yù)防性治療。本領(lǐng)域已知存在使個體傾向于患癌癥的遺傳疾病和/或環(huán)境情況(例如，暴露于致癌物)。在這些情況下，用治療有效量的本發(fā)明多肽治療這些個體有益于減少患癌癥的風(fēng)險。
可以用體外模型測定本發(fā)明多肽作為潛在癌癥療法的有效劑量。這些體外模型包括培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的增殖試驗，在軟瓊脂中培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的生長(參見Freshney，(1987)Culture of Animal CellsAManual of BasicTechnique，Wily-Liss，New York，NY Ch18 and Ch21)，Giovanella等，J.Natl.Can inset.52921-30(1974)中描述的裸鼠腫瘤系統(tǒng)，Pilkington等，Asltica71cer Res.174107-9(1997)中描述的Boyden Chamber分析中的腫瘤細(xì)胞的移動性和浸潤能力，和Ribatta等，Intl.J.Dev.Biol.401189-97(1999)和Li等，Clin.Exp.Metastasis 17423-9(1999)分別描述的如誘導(dǎo)雞絨膜尿囊膜血管化作用或誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的血管發(fā)生試驗。合適的腫瘤細(xì)胞系可從例如美國典型組織保藏中心(American Type Tissue Culture Collection)的目錄得到。
然而，如上面所討論的，本發(fā)明的選擇實施方案包括將修飾的抗體給予癌癥患者或?qū)⑺隹贵w與一種或多種輔助療法，如放療或化療組合或聯(lián)合使用(即組合療法)。本文所述與輔助療法聯(lián)合或組合給予修飾的抗體指，相繼的、同時的、同延的(coextensive)、并存的(concurrent)、相伴的(concomitant)或同時期的(contemporaneous)給藥或所述療法及所公開抗體的應(yīng)用。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可定時給予或應(yīng)用組合療法的各種組分以增強治療總有效性。例如，可在標(biāo)準(zhǔn)的公知治療過程中給予化療劑，接下來的幾周內(nèi)使用本發(fā)明的放射免疫偶聯(lián)物。反之，可經(jīng)由靜脈內(nèi)給予與細(xì)胞毒素結(jié)合的修飾的抗體，然后進(jìn)行局限于腫瘤的外部線束輻射。在其它實施方案中，一次治療中可以同時給予修飾的抗體和一種或多種所選的化療劑。熟練技術(shù)人員(例如有經(jīng)驗的腫瘤學(xué)專家)根據(jù)所選的輔助療法和本說明書的教導(dǎo)，無需過多的實驗就能輕易辨別有效的組合療法。
在這方面，應(yīng)當(dāng)理解修飾的抗體(有或者沒有細(xì)胞毒素)和化療劑的組合物可以任意順序、在能對患者提供治療益處的任意時間段內(nèi)給予。也就是說，化療劑和修飾的抗體可以以任意順序或同時給予。在選擇實施方案中，將本發(fā)明修飾的抗體給予在此前已經(jīng)進(jìn)行過化療的患者。在其它實施方案中，修飾的抗體和化療療法基本同時或并存地給予。例如，在患者接受一個化療療程的同時，對其給予修飾的抗體。優(yōu)選實施方案中，在給予任意化療劑或治療1年內(nèi)給予修飾的抗體。另一優(yōu)選實施方案中，在給予任意化療劑或治療的10，8，6，4或2個月內(nèi)給予修飾的抗體。還有另一優(yōu)選實施方案，在給予任意化療劑或治療的4，3，2或1周內(nèi)給予修飾的抗體。另一優(yōu)選實施方案中，給予所選化療劑或治療的5，4，3，2或1天內(nèi)給予修飾的抗體。應(yīng)進(jìn)一步理解在數(shù)小時或數(shù)分鐘內(nèi)(即基本同時)將兩種試劑或療法給予病人。
在這方面，應(yīng)進(jìn)一步理解本發(fā)明修飾的抗體可以與可清除、減少、抑制或控制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的任意化療劑或試劑或療法聯(lián)合或組合(例如提供組合療法)。如上所述，這種試劑通常引起紅骨髓儲備減少。本發(fā)明化合物的降低的骨髓毒性可以完全或部分彌補這種減少，從而有利于對這種患者進(jìn)行攻擊性(aggressive)腫瘤治療。在其它優(yōu)選實施方案中，本文公開的放射標(biāo)記的免疫偶聯(lián)物可與增加腫瘤細(xì)胞對放射性核素敏感性的放射增敏劑一同有效地使用。例如，在放射標(biāo)記的經(jīng)修飾抗體已經(jīng)大量地從血流中清除，但仍然以治療有效水平保留在腫瘤部位之后，可給予放射增敏化合物。
關(guān)于本發(fā)明的這些方面，與本發(fā)明一致的示例性化療劑包括烷化劑，長春花堿(例如，長春新堿和長春堿)，丙卡巴肼，氨甲喋呤和潑尼松。4種藥物的組合MOPP(雙氯乙基甲胺(氮芥)，長春新堿(安可平)，丙卡巴肼和潑尼松)對治療各種類型淋巴瘤非常有效，且包括本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。在MOPP耐受性患者中，可以用ABVD(例如，阿霉素，博來霉素，長春堿和氮烯咪胺)，Ch1VPP(苯丁酸氮芥，長春堿，丙卡巴肼和潑尼松)，CABS(羅莫司汀，阿霉素，博來霉素和鏈唑霉素)，MOPP加ABVD，MOPP加ABV(阿霉素，博來霉素和長春堿)或BCVPP(卡莫司汀，環(huán)磷酰胺，長春堿，丙卡巴肼和潑尼松)的組合。Amold S.Freedman和Lee M.Nadler，MalignantLymphomas，in HARRISON′S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE1774-1788(Kurt J.Isselbacher等，eds.，13th ed.1994)和V.T.DeVita等，(1997)和此處引用的參考文獻(xiàn)描述了標(biāo)準(zhǔn)劑量和進(jìn)程。這些療法可以不經(jīng)變化使用，或根據(jù)具體患者的需要進(jìn)行改變，與本文所述的一種或多種修飾的抗體聯(lián)合使用。
可以用于本發(fā)明范圍的其他療法包括使用單一烷化劑例如環(huán)磷酰胺或苯丁酸氮芥，或使用組合如CVP(環(huán)磷酰胺，長春新堿和潑尼松)，CHOP(CVP和阿霉素)，C-MOPP(環(huán)磷酰胺，長春新堿，潑尼松和丙卡巴肼)，CAP-BOP(CHOP加丙卡巴肼和博來霉素)，m-BACOD(CHOP加氨甲喋呤，博來霉素和甲酰四氫葉酸)，ProMACE-MOPP(潑尼松，氨甲喋呤，阿霉素，環(huán)磷酰胺，依托泊苷和甲酰四氫葉酸加標(biāo)準(zhǔn)MOPP)，ProMACE-CytaBOM(潑尼松，阿霉素，環(huán)磷酰胺，依托泊苷，阿糖胞苷，博來霉素，長春新堿，氨甲喋呤和甲酰四氫葉酸)和MACOP-B(氨甲喋呤，阿霉素，環(huán)磷酰胺，長春新堿，固定劑量的潑尼松，博來霉素和甲酰四氫葉酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地測定每種療法的標(biāo)準(zhǔn)劑量和進(jìn)程。CHOP還可與博來霉素，氨甲喋呤，丙卡巴肼，氮芥，胞嘧啶阿拉伯糖甙和依托泊苷聯(lián)合使用。其它相容的化療劑包括，但不限于，2-氯脫氧腺苷(chlorodeoxadenosine)(2-CDA)，2′-脫氧助間型霉素(2’-deoxycoformycin)和氟達(dá)拉濱(fludarabine)。
與本發(fā)明修飾的抗體聯(lián)合用的化療劑的量可依據(jù)受試者而改變，或根據(jù)本領(lǐng)域公知常識給予。參見例如，Bruce A Chabner等，AntineoplasticAgents，in GOODMAN & GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASISOF THERAPEUTICS 1233-1287((Joel G.Hardman et al eds.，9thed 1996)。
如前面所討論的，本發(fā)明修飾的抗體，其免疫活性片段或重組體可以藥物有效量給藥用于哺乳動物惡性腫瘤的體內(nèi)治療。在這方面，應(yīng)該理解所公開的抗體可以制成制劑以便易于給予并促進(jìn)活性劑的穩(wěn)定性。優(yōu)選本發(fā)明藥物組合物包含可藥用的、無毒的、無菌的載體，如生理鹽水，非毒性緩沖液，防腐劑等等。為本申請的目的，與治療劑偶聯(lián)或不偶聯(lián)的修飾的抗體，免疫活性片段或其重組體的藥物有效量，是指足以實現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞上的所選免疫反應(yīng)性抗原有效結(jié)合并且增加這些細(xì)胞死亡的量。當(dāng)然，本發(fā)明藥物組合物可以以單劑量或多劑量給予，以提供修飾的抗體的藥物有效量。
更具體地說，公開的抗體和方法有利于減少腫瘤大小，抑制腫瘤生長和/或延長患腫瘤動物的存活時間。相應(yīng)的，本發(fā)明還涉及一種治療人類或其它動物中腫瘤的方法，包括將有效的、非毒性量的修飾的抗體給予這種人或動物。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能通過常規(guī)實驗測定修飾的抗體達(dá)到治療惡性腫瘤的目的的有效、無毒性的量。例如，修飾的抗體的治療活性量可根據(jù)下述因素變化，如疾病的階段(例如，階段I相對階段IV)，年齡，性別，醫(yī)學(xué)上的并發(fā)癥(例如，免疫抑制性病癥或疾病)和受試者的體重，以及抗體在受試者中誘發(fā)所需反應(yīng)的能力?？梢哉{(diào)節(jié)給藥方案以提供最佳治療反應(yīng)。例如，可以每天給予若干分劑量，或根據(jù)治療情況中的緊急事件的指示按比例減少劑量。然而，通常，預(yù)期有效劑量是約0.05mg至100mg/公斤體重/天，更優(yōu)選約0.5mg至10mg/公斤體重/天。
在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)，本發(fā)明修飾的抗體根據(jù)上述治療方法以足以產(chǎn)生達(dá)治療或預(yù)防程度效果的量給予人類或其它動物。本發(fā)明的抗體以根據(jù)已知技術(shù)將本發(fā)明抗體和常規(guī)可藥用載體或稀釋劑組合而制備的常規(guī)劑型給予所述人類或其它動物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可藥用載體或稀釋劑的形式和性質(zhì)由與其組合的活性成分的量，給藥途徑以及其它眾所周知的變量確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)進(jìn)一步理解，包含一種或多種本發(fā)明單克隆抗體的混合物被證明特別有效。
制備和給予抗體、其免疫活性片段或重組體與治療劑的偶聯(lián)物的方法是公知的或是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易確定的。本發(fā)明抗體(或其片段)的給藥途徑可以是經(jīng)口服，胃腸外給藥，經(jīng)吸入或局部給藥。本文所用的術(shù)語胃腸外包括靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，經(jīng)直腸或陰道給藥。通常優(yōu)選靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，皮下和肌內(nèi)形式的胃腸外給藥。雖然所有這些給藥途徑都顯然在本發(fā)明范圍內(nèi)，優(yōu)選的給藥方式是注射用溶液，具體是用于靜脈或動脈內(nèi)注射或滴注的溶液。通常，用于注射的合適的藥物組合物可包含緩沖液(例如乙酸鹽，磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液)，表面活性劑(例如聚山梨酸酯)，任選的穩(wěn)定劑(例如人白蛋白)，等等。然而，在與本文教導(dǎo)相一致的其它方法中，修飾的抗體可以直接傳遞到對惡性腫瘤部位從而增加腫瘤組織對治療劑的暴露。
胃腸外給藥制劑包括無菌的含水或不含水溶液，懸浮液，和乳液。不含水溶劑的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，和可注射的有機酯如油酸乙酯。含水載體包括水，含醇/含水溶液，乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖的介質(zhì)。在本發(fā)明內(nèi)容中，可藥用載體包括，但不限于，0.01-0.1M，優(yōu)選0.05M磷酸鹽緩沖液或0.8％鹽水。其它常用胃腸外載體包括磷酸鈉溶液，林格氏(Ringer′s)葡萄糖溶液，葡萄糖和氯化鈉溶液(dextrose and sodiumchloride)，乳酸化林格氏液，或不揮發(fā)性油。靜脈載體包括液體和營養(yǎng)補充劑，電解質(zhì)補充劑，如基于林格氏葡萄糖溶液的補充液等等。還可存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑，和惰性氣體等等。
更具體的，適合注射的藥物組合物包括無菌含水溶液(水溶性)或分散劑和用于制備即配即用型無菌注射液或分散劑的無菌粉劑。在此情況下，所述組合物必須是無菌的并且是易于注射的液體。它在制備和儲存條件下是穩(wěn)定的，并優(yōu)選可防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液體聚乙二醇，等等)，及其合適的混合物。適當(dāng)?shù)牧鲃有钥扇缦戮S持例如，通過使用涂層如卵磷脂，對于分散劑的情況下通過維持所需的粒徑，和通過使用表面活性劑。
微生物作用的防止可通過各種抗菌劑和抗真菌藥，例如對羥苯甲酸，氯代丁醇，苯酚，抗壞血酸，硫柳汞等等來實現(xiàn)。在很多情況下，優(yōu)選組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇，諸如甘露醇，山梨醇，或氯化鈉等。延長可注射組合物的吸收可通過在上述組合物中包括可延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)。
在任何情況下，無菌注射溶液可如下制備通過將所需量的活性化合物(例如單獨的修飾的抗體或與其它活性劑的組合)和本文列舉的一種成分或各種成分的組合摻入合適的溶劑中，隨后根據(jù)需要過濾除菌。通常，通過將活性化合物摻入無菌載體來制備分散液，所述無菌載體含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上面列舉的所需其它成分。對于用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，產(chǎn)生含有活性成分以及來自前述無菌過濾溶液的任意其他所需成分的粉劑。制備注射劑，裝入容如安瓿，袋，瓶子，注射器或小玻璃試管，并在無菌條件下根據(jù)本領(lǐng)域已知方法密封。此外，可以包裝上述制劑并且以試劑盒的形式出售，例如共同未決的US 09/259,337和US 09/259,338中描述的，并入本文作為參考。這種產(chǎn)品優(yōu)選具有標(biāo)簽或包裝插入物，說明聯(lián)合型組合物有利于治療患有或易患癌癥、惡性腫瘤或腫瘤疾病的受試者。
如上詳細(xì)所述，本發(fā)明提供用于治療需要治療的哺乳動物受試者中的腫瘤疾病的化合物，組合物，試劑盒和方法。優(yōu)選所述受試者是人。腫瘤性疾病(例如癌癥和惡性腫瘤)可以包括實體瘤諸如黑素瘤，膠質(zhì)瘤，肉瘤，和癌以及骨髓的或血液的惡性腫瘤諸如淋巴瘤和白血病。通常，公開的發(fā)明可用于預(yù)防性地或治療性地治療含有IGSF9或LIV-1作為抗原性標(biāo)記的任意腫瘤，所述抗原性標(biāo)記使得修飾的抗體可靶向癌癥細(xì)胞。可以治療的示例性癌癥包括，但不限于，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌和肺癌。除上述腫瘤性疾病之外，應(yīng)當(dāng)理解所公開的發(fā)明有利于治療帶有IGSF9或LIV-1的其他惡性腫瘤。
受體/配體活性本發(fā)明的多肽還顯示了作為受體，受體配體或受體/配體相互作用的抑制劑或激動劑的活性。本發(fā)明的多核苷酸可編碼顯示這種特性的多肽。這種受體和配體的例子包括，但不限于，細(xì)胞因子受體及其配體，受體激酶及其配體(包括但不限于，細(xì)胞粘附分子(諸如選擇蛋白(selectin)，整聯(lián)蛋白(intergrin)及其配體))以及參與抗原呈遞、抗原識別以及細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)發(fā)展的受體/配體對)。受體和配體還可用于篩選相關(guān)受體/配體相互作用的潛在肽或小分子抑制劑。本發(fā)明的多肽(包括但不限于，受體和配體的片段)本身可以用作受體/配體相互作用的抑制劑。
測定本發(fā)明多肽受體-配體活性的適合的試驗包括，但不限于下列文獻(xiàn)中描述的那些Current Protocols in Immunology，Ed by J.E.Coligan，等，Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 7.28，Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28.1-7.28.22)，Takai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846864-6868，1987；Bierer等，J.Exp.Med.1681145-1156，1988；Rosenstein等，J.Exp.Med.169149-160 1989；Stoltenborg等，J.Immunol.Methods 17556-98，1994；Stitt等，Cell80661-670，1995。
例如，本發(fā)明的多肽可以用作配體的受體從而傳遞配體的生物學(xué)活性。配體可通過結(jié)合試驗，親和層析法，雙雜交篩選試驗，BIAcore試驗，凝膠覆蓋試驗，或其它本領(lǐng)域已知的方法可鑒別。
其特征是以藥物或蛋白質(zhì)作為激動劑或拮抗劑或部分激動劑或部分拮抗劑的研究需要用另一種蛋白質(zhì)作為競爭配體。因此，本發(fā)明的多肽或配體可以通過常規(guī)方法與放射性同位素，測熱分子(calorinteric molecule)或毒素分子偶聯(lián)進(jìn)行偶聯(lián)。(″Guide to Protein Purification″Murray P.Deutscher(ed)Methods in Enzymology Vol.182(1990)Academic Press，Inc.SanDiego)。放射性同位素的例子包括，但不限于氚和碳-14。比色分子(colorimetric molecule)的例子包括，但不限于熒光分子，諸如熒光胺(fluorescamine)，或若丹明或其它比色分子。毒素的例子包括，但不限于蓖麻毒。
受體活性分析本發(fā)明還提供了檢測本發(fā)明多肽，例如配體或受體的特異性結(jié)合的方法。本領(lǐng)域提供了特別有利于鑒別以前未知的、本發(fā)明受體多肽結(jié)合配偶體的大量分析方法。例如，利用哺乳動物或細(xì)菌細(xì)胞的表達(dá)克隆，或雙雜交篩選試驗可以用于鑒別編碼結(jié)合配偶體的多核苷酸。另一個實施方案中，帶有適當(dāng)?shù)墓潭ɑ谋景l(fā)明多肽的親和色譜法可用于分離可識別并結(jié)合本發(fā)明多肽的多肽。存在許多可用來鑒別調(diào)節(jié)(即，增加或減少)本發(fā)明多肽生物學(xué)活性的化合物、具體是小分子化合物的不同文庫。本發(fā)明受體多肽的配體還可通過添加外源性配體，或兩種細(xì)胞群體配體的混合物來鑒別，所述兩種細(xì)胞群體在遺傳上相同，但其對本發(fā)明受體的表達(dá)不同一種細(xì)胞群體表達(dá)本發(fā)明的受體，而另一種不表達(dá)。然后比較兩種細(xì)胞群體對加入配體的反應(yīng)?；蛘?，表達(dá)文庫與本發(fā)明多肽在細(xì)胞中共表達(dá)，并測定自分泌反應(yīng)以鑒別潛在的配體。另一個實施方案中，BIAcore試驗，凝膠覆蓋試驗，或本領(lǐng)域已知的其它方法可以用于鑒別結(jié)合配偶體多肽，包括(1)有機和無機化合物庫，(2)天然產(chǎn)物庫，和(3)含有隨機肽，寡聚核苷酸或有機分子的組合庫。
可以測定下游細(xì)胞內(nèi)信號分子在本發(fā)明多肽的信號級聯(lián)放大中的作用。例如，在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生一種嵌合蛋白，其中本發(fā)明多肽的胞質(zhì)區(qū)與其配體已被鑒定的蛋白質(zhì)的胞外部分融合。然后將所述細(xì)胞和嵌合蛋白細(xì)胞外部分的特異性配體一同培養(yǎng)，從而激活嵌合受體。然后可分析參與細(xì)胞內(nèi)信號的已知下游蛋白的預(yù)期修飾，即磷酸化作用。本領(lǐng)域其它已知方法也可以用于鑒別與受體活性有關(guān)的信號分子。
反義寡核苷酸本發(fā)明的另一方面涉及與包含圖1A，9A，9C，9E，9H，21A，或22A所示核苷酸序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21，28)的核酸分子，或其片段，類似物或衍生物雜交或互補的分離的反義核酸分子。反義核酸包含與編碼蛋白質(zhì)的有義核酸互補的核苷酸序列。具體方面，提供了包含與至少約10，25，50，100，250或500個核苷酸或完整編碼鏈互補，或僅與其一部分互補的序列的反義核酸分子。此外提供了編碼圖1B，9B，9D，9F，21B，或22B所示蛋白(SEQ ID NOS2，4，6，8，22-27，或29)的片段，同系物，衍生物和類似物的核酸分子，或與圖1A，9A，9C，9E，9H，21A或22A所示核酸序列(SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21，或28)互補的反義核酸。
一個實施方案中，反義核酸分子對本發(fā)明核苷酸序列的編碼鏈的編碼區(qū)是反義的。術(shù)語編碼區(qū)是指含有被翻譯為氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列的區(qū)域。另一個實施方式中，反義核酸分子對本發(fā)明核苷酸序列的編碼鏈的非編碼區(qū)是反義的。術(shù)語非編碼區(qū)是指不被翻譯為氨基酸的側(cè)接于編碼區(qū)的5′和3′序列(即，也稱為5′和3′非翻譯區(qū))。
本文所用的術(shù)語反義核酸包括天然類型的寡聚核酸部分，諸如DNA和RNA的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，以及能與天然核酸結(jié)合的人工類似物。本發(fā)明的寡聚核苷酸可以基于由磷酸二酯鍵連接，或由以膦酸甲酯，硫代磷酸，或其它鍵連接的類似物所連接的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體。它們還包含具有改變的堿基結(jié)構(gòu)或其它修飾，但仍然保留與天然存在的DNA和RNA結(jié)構(gòu)相結(jié)合的能力的單體部分。
根據(jù)編碼本文公開的核酸(例如SEQ ID NOS1，3，5，7，12-21，或28)的編碼鏈序列，依據(jù)Watson和Crick或Hoogsteen堿基配對原則可設(shè)計本發(fā)明的反義核酸。反義分子可以與mRNA的整個編碼區(qū)互補，但更優(yōu)選是僅針對mRNA翻譯起始位點周圍的部分編碼或非編碼區(qū)反義的寡聚核苷酸。反義寡核苷酸的長度可以是，例如約5，10，15，20，25，30，35，40，45或50個核苷酸。為了選擇反義寡核苷酸的優(yōu)選長度，必須打破平衡以獲得最有利的特性。10-15個堿基長度的較短的寡聚核苷酸容易進(jìn)入細(xì)胞，但基因特異性較低。相比之下，20-30個堿基的較長的寡聚核苷酸提供更優(yōu)越的基因特異性，但顯示降低的細(xì)胞吸收動力學(xué)。參見Stein等，PHOSPHOROTHIOATE OLIGODEOXYNUCLEOTIDE ANALOGUES in″Oligodeoxynucleotides--Antisense Inhibitors of Gene Expression″Cohen，Ed.McMillan Press，London(1988)。
用本領(lǐng)域已知的方法，通過化學(xué)合成或酶連接反應(yīng)可構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸。例如，反義核酸可用天然存在的核苷酸或各種經(jīng)修飾的核苷酸通過化學(xué)方法合成，所述修飾核苷酸被設(shè)計成能增加分子的生物穩(wěn)定性，或能增加反義核酸和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性(例如可以用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸)。
可用于產(chǎn)生反義核酸的經(jīng)修飾的核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-galactoslqueosine，肌苷，N6-異戊烯腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-mannosylqueosine，5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-羥乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-巰基胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯，尿嘧啶-5-羥乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。或者反義核酸可利用含有以反義方向亞克隆的核酸的表達(dá)載體通過生物方法來制備(即，由插入核酸轉(zhuǎn)錄出的RNA是目標(biāo)靶核酸的反義方向，在下面部分將進(jìn)一步描述)。
一般本發(fā)明反義核酸分子被給予受試者或在原位產(chǎn)生，以便與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，從而例如通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來抑制蛋白表達(dá)。雜交可以通過常規(guī)核苷酸互補性而形成穩(wěn)定的雙鏈體，或是例如，在與DNA雙鏈體結(jié)合的反義核酸分子的情況下，經(jīng)由在雙螺旋大溝內(nèi)的特異性相互作用?？筛淖兎戳x核酸分子給藥途徑的例子以靶向所選細(xì)胞，然后全身給藥。例如，對于全身給藥，可以修飾反義分子，使它們與所選細(xì)胞表面上表達(dá)的受體或抗原特異性結(jié)合，例如通過將反義核酸分子同與細(xì)胞表面受體或抗原相結(jié)合的肽或抗體連接來進(jìn)行。也可使用此處所述的載體將反義核酸分子傳遞到細(xì)胞。為了使反義分子在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到足夠的濃度，優(yōu)選其中反義核酸分子在強pol II或pol III啟動子控制下的載體構(gòu)建體。
在另一個實施方式中，本發(fā)明的反義核酸分子是α-異頭物核酸分子。α-異頭物核酸分子與互補RNA形成特異性雙鏈雜交產(chǎn)物，其中與普通β-單元相反，兩條鏈彼此平行(Gaultier et aL，Nucleic Acids Res156625-6641(1987))。反義核酸分子也可包含2′-鄰-甲基核苷酸(Inoue等，Nucleic Acids Res 156131-6148(1987))或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等，F(xiàn)EBS Lett 215327-330(1987))。
腫瘤疫苗本發(fā)明的肽或其類似物可以以疫苗組合物的形式用于治療或預(yù)防腫瘤疾病。可以修飾具有免疫刺激活性的本發(fā)明的肽或其類似物，以提供除了改善的血清半衰期之外的其它所需性質(zhì)。例如，通過與包含至少一種能夠誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞反應(yīng)的抗原表位的序列連接可增強所述肽誘導(dǎo)CTL活性的能力。具體優(yōu)選的免疫原性肽/T輔助細(xì)胞偶聯(lián)物通過間隔分子連接。間隔分子一般由相對小的中性分子組成，如在生理條件下基本不帶電荷并且具有線性或分枝側(cè)鏈的氨基酸或氨基酸類似物。間隔分子一般選自，例如丙氨酸，甘氨酸，或非極性氨基酸或中性極性氨基酸的其它中性間隔分子。可以理解，任選存在的間隔分子不需要由相同的殘基組成，并因此可以是一種異低寡聚物或同寡聚物。當(dāng)存在間隔分子時，間隔分子通常是至少一個或兩個殘基，更通常3-6個殘基。或者，所述CTL肽可以不通過間隔分子而與T輔助細(xì)胞肽連接。
免疫原性肽與T輔助細(xì)胞肽可以直接連接，或經(jīng)由在所述CTL肽的氨基末端或者羧基末端的間隔分子與T輔助細(xì)胞肽連接。免疫原性肽或T輔助細(xì)胞肽的氨基末端可以是?；?。示例性T輔助細(xì)胞肽包括破傷風(fēng)類毒素830-843，流感307-319，瘧疾環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoite)382-398和378-389。
在某些實施方式中，希望在本發(fā)明疫苗組合物中包括至少一種免疫刺激組分。因此，本發(fā)明在某些方面還包括非核酸佐劑的利用。一些實施方式中的非核酸佐劑是產(chǎn)生長效(depo)效應(yīng)的佐劑，免疫刺激佐劑，或產(chǎn)生長效效應(yīng)并且刺激免疫系統(tǒng)的佐劑。優(yōu)選產(chǎn)生長效效應(yīng)的佐劑選自基于明礬(alum)(例如，氫氧化鋁，磷酸鋁)乳液的制劑，包括礦物油，非礦物油，油包水或水包油乳劑，如Montanide佐劑的Seppic ISA系列；MF-59；和PROVAXTM。在一個更優(yōu)選實施方式中，免疫刺激劑是PROVAXTM。
在某些實施方式中，免疫刺激佐劑選自從Q.肥皂草樹(Q.saponaria tree)的樹皮中純化的皂苷，如QS21；脂多糖的聚[二[2(carboxylatophenoxy)磷腈(PCPP)]衍生物，諸如單磷酸脂質(zhì)(MPL)，胞壁酰二肽(MDP)和蘇氨酰胞壁酰二肽(tMDP)；OM-174；和利什曼原蟲延伸因子(leishmania elongation factor)。在一個實施方式中，產(chǎn)生長效效應(yīng)并且刺激免疫系統(tǒng)的佐劑選自ISCOMS；SB-AS2；SB-AS4；形成膠束的非離子嵌段共聚物，諸如CRL 1005；和Syntex佐劑制劑。
免疫原性肽可通過合成方法或重組DNA技術(shù)制備，或從天然來源諸如完整病毒或腫瘤分離得到。雖然所述肽優(yōu)選基本不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其片段，在某些實施方式中，所述肽可與天然片段或顆粒通過合成方法偶聯(lián)。多肽或肽可以是各種長度，可以是中性形式(不帶電荷的)或是鹽的形式，可以不經(jīng)修飾諸如糖基化、側(cè)鏈氧化或磷酸化，或者包含這些修飾，條件是所述修飾不破壞本文所述的多肽的生物學(xué)活性。
或者，可使用重組DNA技術(shù)，其中將編碼目標(biāo)免疫原性肽的核苷酸序列插入到表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞并且在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)。這些步驟通常是本領(lǐng)域已知的，如Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)所述，并入本文作為參考。因此，包含本發(fā)明一種或多種肽序列的融合蛋白可以用于呈遞合適的T細(xì)胞表位。
本發(fā)明的肽及其藥物和疫苗組合物有利于給予哺乳動物，具體是人，以治療腫瘤?？捎帽景l(fā)明免疫原性肽治療的腫瘤性疾病的例子包括肺癌，卵巢癌，乳腺癌和前列腺癌。
將含有本發(fā)明肽的疫苗組合物給予易于或可能患病毒感染或癌癥的患者，以誘發(fā)針對抗原的免疫反應(yīng)，并因此增強患者的自身免疫應(yīng)答能力。這種量定義為“致免疫有效劑量”。在這種用途中，精確劑量也取決于患者的健康狀態(tài)和體重，給藥方式，制劑的性質(zhì)等等，但通常是約1.0ug至約5000ug/70公斤患者，更通常約10ug至約500ug/70公斤體重。
對于治療或免疫目的，本發(fā)明的肽也可由經(jīng)減毒的病毒宿主諸如牛痘或禽痘等表達(dá)。這個方法涉及使用牛痘病毒作為載體以表達(dá)編碼本發(fā)明肽的核苷酸序列。一旦引入到急性或慢性感染的宿主中或引入到非感染的宿主中，重組牛痘病毒就表達(dá)免疫原性肽，從而誘發(fā)宿主CTL反應(yīng)。US4,722,848描述了用于免疫方案的牛痘載體和方法，摻入此處作為參考。另一種載體是BCG(卡介苗)。Stover等，Nature 351456-460(1991)描述了BCG載體，所述文獻(xiàn)包含于此處作為參考。根據(jù)本文的描述，可用于本發(fā)明肽治療性給藥或免疫的廣泛多種的其它載體諸如傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)載體等等對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
抗原性肽也可用于誘發(fā)回體CTL。產(chǎn)生的CTL可以用于治療患者的慢性感染(病毒或細(xì)菌)或腫瘤，所述患者對其它常規(guī)治療形式不應(yīng)答，或?qū)﹄囊呙绡煼ú粦?yīng)答。對特定病原體，可通過將患者的CTL前體細(xì)胞(CTLp)與抗原呈遞細(xì)胞(APC)源以及合適的免疫原性肽一起在組織培養(yǎng)中保溫來誘導(dǎo)(傳染原或腫瘤抗原)的回體CTL反應(yīng)。保溫合適的時間后(通常1-4周)，其中CTLp被活化、成熟并擴增為效應(yīng)CTL，將上述細(xì)胞再次輸注回患者，所述細(xì)胞將破壞特異性靶細(xì)胞(感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)。
還發(fā)現(xiàn)肽可用作診斷試劑。例如，本發(fā)明的肽可用于確定具體個體對使用所述肽或相關(guān)肽的療法的敏感性，因此有助于修改現(xiàn)有治療方案或確定受影響個體的預(yù)后。此外，所述肽還可以用于預(yù)測哪些個體有患慢性感染的危險。
抗獨特型抗體本發(fā)明還涉及利用抗獨特型抗體用于腫瘤免疫治療以及免疫預(yù)防的方法。本發(fā)明涉及操作免疫系統(tǒng)的獨特型網(wǎng)絡(luò)以獲得治療益處。用抗獨特型抗體(Ab2)進(jìn)行免疫可誘導(dǎo)形成抗-抗-獨特型免疫球蛋白，其中一些與用于衍生該抗獨特型的抗體(Abl)之抗原特異性相同。這產(chǎn)生了通過提供在免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生和放大抗原-特異性識別的機制來操作免疫反應(yīng)的有效范例。對腫瘤的免疫應(yīng)答看起來涉及腫瘤抗原的獨特型-特異性識別；本發(fā)明涉及操縱這個識別以獲得治療益處的策略。本發(fā)明的具體實施方式
包括，使用抗獨特型抗體針對腫瘤進(jìn)行免疫，激活用于過繼性(adoptive)免疫療法中的淋巴細(xì)胞，和阻止由抑制性T細(xì)胞或由表達(dá)針對腫瘤抗原的獨特位(idiotope)的抑制因子所介導(dǎo)的免疫抑制。抗獨特型抗體或其片段也可用于監(jiān)測患者中的抗抗體誘導(dǎo)，所述患者通過給予抗腫瘤抗體而獲得對腫瘤抗原的被動免疫。
在一個
具體實施例方式
中，通過給予抗腫瘤抗體或免疫細(xì)胞或表現(xiàn)出抗腫瘤獨特型的因子在體內(nèi)誘導(dǎo)抗獨特型抗體可具有治療價值。
本發(fā)明還涉及識別直接針對IGSF9或LIV-1的獨特型的抗獨特型MAb分子，或抗獨特型MAb分子的片段，或其修飾物。
本發(fā)明的MAb分子包括完整的單克隆抗體分子和片段，或這些分子的任意化學(xué)修飾物，它包含與另一對IGSF9或LIV-1特異的抗體分子的獨特型結(jié)合的抗原結(jié)合位點。包含獨特型MAb分子的單克隆抗體片段可通過各種技術(shù)制備。這些片段包括但不限于用胃蛋白酶處理抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片段，還原F(ab′)2片段的二硫鍵而產(chǎn)生的Fab′片段，和用木瓜蛋白酶和可還原二硫鍵的還原劑處理抗體分子而產(chǎn)生的2Fab或Fab片段。
根據(jù)目的用途，用本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)技術(shù)，通過與各種化合物的任意一種進(jìn)行連接，可對本發(fā)明的抗獨特型抗體進(jìn)行化學(xué)修飾。這包括但不限于，用于例如為了免疫分析目的而與放射性同位素的連接中的酶手段(zymatic means)，氧化取代，螯合作用等。
化合物與分子的化學(xué)連接或偶聯(lián)可以定位在不參與獨特型結(jié)合的位點，例如分子的Fc區(qū)。這可以通過在進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)之前，保護(hù)所述分子的結(jié)合位點來實現(xiàn)。例如，分子可以在偶聯(lián)反應(yīng)前與其所識別的獨特型結(jié)合。偶聯(lián)完成后，破壞復(fù)合物以產(chǎn)生對分子結(jié)合位點影響最小的修飾分子。
本發(fā)明的抗獨特型抗體，或抗體分子的片段可以用作免疫原來誘導(dǎo)，修飾，或調(diào)節(jié)具體細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫。這包括但不限于，在抗同基因型腫瘤的免疫中使用這些分子。
試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步提供了用本發(fā)明的核酸探針或抗體，其任選地與合適的標(biāo)記偶聯(lián)或結(jié)合，來鑒別試驗樣品中本發(fā)明所述多核苷酸或多肽或其同系物之一的存在或表達(dá)的方法。
概括的說，檢測本發(fā)明多核苷酸的方法可包含，使樣品和與多核苷酸結(jié)合并形成復(fù)合物的化合物接觸一段足以形成復(fù)合物的時間，檢測所述復(fù)合物，使得如果檢測到復(fù)合物，則在樣品中檢測到本發(fā)明的多核苷酸。這種方法也可包含，將樣品在嚴(yán)格雜交條件下和在此條件下與本發(fā)明多核苷酸退火的核酸引物接觸，并擴增退火的多核苷酸，使得如果多核苷酸被擴增，則在樣品中檢測到本發(fā)明的多核苷酸。
概括的說，檢測本發(fā)明多肽的方法可包含，使樣品和與多肽結(jié)合并形成復(fù)合物的化合物接觸一段足以形成復(fù)合物的時間，檢測所述復(fù)合物，使得如果檢測到復(fù)合物，則在樣品中檢測到本發(fā)明的多肽。
詳細(xì)的說，這種方法包括將試驗樣品與一種或多種本發(fā)明抗體或一種或多種本發(fā)明核酸探針一起溫育，并分析核酸探針或抗體與試驗樣品中的組分的結(jié)合。
核酸探針或抗體與試驗樣品一同溫育的條件可以變化。溫育條件取決于分析所采用的形式，所使用的檢測方法，和分析所用的核酸探針或抗體的類型和性質(zhì)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道任何一種常規(guī)的雜交，擴增或免疫學(xué)分析形式可以容易地經(jīng)改變而適于使用本發(fā)明核酸探針或抗體。這種分析的例子見于Chard，T.，An Introduction to Radioimmunoassay and RelatedTechniques，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1986)；Bullock，G.R.等，Techniques in Immunocytochemistry，Academic Press，Orlando，F(xiàn)L Vol.1(1982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985)；Tijssen，P.，Practice andTheory of immunoassaysLaboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1985)。本發(fā)明的試驗樣品包括細(xì)胞，蛋白質(zhì)或細(xì)胞的膜提取物，或生物液體諸如唾液，血液，血清，血漿，或尿等。用于上述方法的試驗樣品可根據(jù)分析形式，檢測方法的性質(zhì)和用作被分析樣品的組織、細(xì)胞或提取物而改變。制備蛋白質(zhì)提取物或細(xì)胞膜提取物的方法是本領(lǐng)域公知的，并且可以容易地被修改以獲得與所使用的系統(tǒng)相容的樣品。
在本發(fā)明另一個實施方式中，提供了含有進(jìn)行本發(fā)明分析所必需的試劑的試劑盒。具體地，本發(fā)明提供了一種分室試劑盒(compartment kit)以在密封室內(nèi)容納一個或多個容器，其中包括(a)第一容器，含有本發(fā)明的探針或抗體中的一種；和(b)一個或多個其它容器，其含有一種或多種下列物質(zhì)洗滌劑，能夠檢測結(jié)合型探針或抗體的存在的試劑。
具體地，分室試劑盒包括其中試劑包含在分隔的容器內(nèi)的任意試劑盒。這種容器包括小玻璃容器，塑料容器或塑料條帶或紙。這種容器使得能夠有效地將試劑從一個隔室轉(zhuǎn)移到另一個隔室，因此樣品和試劑不會被交叉污染，并且每個容器內(nèi)的試劑或溶液可以以定量形式從一個隔室添加到另一個隔室中。這種容器包括接受試驗樣品的容器，包含分析所用的抗體或探針的容器，包含洗滌液(例如磷酸鹽緩沖鹽水，Tris緩沖劑等等)的容器，和含有用于檢測結(jié)合型抗體或探針的試劑的容器。檢測試劑的類型包括標(biāo)記型核酸探針，經(jīng)標(biāo)記的第二抗體，或可選擇地，如果初級抗體被標(biāo)記，包括能與經(jīng)標(biāo)記抗體反應(yīng)的酶或抗體結(jié)合試劑。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員清楚地知道本發(fā)明公開的探針和抗體可以容易地?fù)饺氡绢I(lǐng)域公知的已確定的試劑盒中。
實施例實施例1IGSF9表達(dá)在各種正常組織和腫瘤組織中檢測IGSF9基因表達(dá)。圖2是用GeneLogic datasuite測定的描繪該基因的基因表達(dá)圖譜的‘電子Northem’。Y軸的值代表在Gene Logic units中的表達(dá)強度。圖中每個藍(lán)圈代表單獨的患者樣品。圖左邊的柱狀圖表示了發(fā)現(xiàn)其表達(dá)基因片段的每種組織類型的百分比。每種組織類型的樣品總數(shù)如下惡性(malignant)乳腺(60)；惡性結(jié)腸(91)；惡性肺(40)；惡性卵巢(37)；惡性前列腺(26)；正常乳腺(30)；正常結(jié)腸(30)；正常食管(17)，正常腎(27)；正常肝臟(19)；正常肺(34)；正常淋巴結(jié)(9)；正常卵巢(22)；正常胰腺(18)；正常前列腺(21)；正常直腸(22)；正常脾(9)；正常胃(21)。
此外，使用購得的人類cDNA組和從人類組織及細(xì)胞系自制的cDNA樣品進(jìn)行PCR實驗，來進(jìn)一步研究正常的和惡性人類組織中IGSF9的表達(dá)。這些實驗的結(jié)果列于下面的圖3-7中。合成下列PCR引物并且用于所有實驗中。
5′-TCTTATCTTCTCTCCGACCGGGAAG-3′(SEQ ID NO30)5′-GCCACAGGGCTGATGTCTTCAATGC-3′(SEQ ID NO31)這些引物的序列包含在IMAGE克隆#2013096/ATCC目錄(catalog)#3068496的IGSF9部分中，來自該克隆質(zhì)粒DNA在每項實驗中用作陽性對照。這些引物從含有IGSF9基因的任意cDNA模板擴增出387bp的PCR產(chǎn)物。在所有實驗中，測定3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)作為cDNA完整性的對照。GAPDH是在所有人類組織中大量表達(dá)的持家基因。用于擴增GAPDH基因的引物是5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(SEQ ID NO32)5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(SEQ ID NO33)這些引物從編碼GAPDH基因的任意cDNA模板擴增出482bp的產(chǎn)物。在所有情況下，還包括陽性和陰性對照；陽性對照是IMAGE克隆4762143的質(zhì)粒DNA，陰性對照是水(無模板)。
圖3是使用Clontech′s人類多組織cDNA組(Clontech′s Human MultipleTissue cDNA panels)(BD Biosciences，目錄#K1420-1 and K1421-1)測定的IGSF9在正常組織中的表達(dá)。上面一組顯示IGSF9表達(dá)，下面一組顯示GAPDH的表達(dá)。每個泳道中的cDNA樣品如下(1)腦，(2)胎盤，(3)肺，(4)肝臟，(5)骨骼肌，(6)腎，(7)胰腺，(8)脾，(9)胸腺，(10)前列腺，(11)睪丸，(12)卵巢，(13)小腸，(14)結(jié)腸，(15)外周血白細(xì)胞，(16)陽性對照，和(17)陰性對照。圖右邊的箭頭表示IGSF9 PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。圖中的數(shù)據(jù)表明IGSF9在正常肝臟，胰腺，前列腺，睪丸和結(jié)腸中的表達(dá)微弱，且在所有其它正常組織中缺失。
圖4是IGSF9在一組人類卵巢腫瘤樣品和兩種卵巢腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。卵巢腫瘤樣品得自Cooperative Human Tissue Network(CHTN)；細(xì)胞系Ovcar-3和PA1得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville MD)。用Qiagen′s RNeasy試劑盒(catalog#75162)從每份樣品和細(xì)胞系中分離RNA。用Invitrogen′s cDNA合成系統(tǒng)(catalog#11904-018)從總RNA制備cDNA。上面一組顯示IGSF9表達(dá)，下面一組顯示GAPDH表達(dá)。每個泳道上面的數(shù)字對應(yīng)的卵巢腫瘤樣品如下(1)中等分化的囊腺癌，(2)低分化的乳頭狀漿液性腺癌，(3)低分化的乳頭狀漿液性腺癌，(4)低分化的子宮內(nèi)膜腺癌，(5)乳頭狀漿液性腺癌，(6)子宮內(nèi)膜腺癌，(7)低分化的腺癌，(8)低分化的乳頭狀漿液性腺癌，(9)Ovcar-3細(xì)胞系，(10)PA-1細(xì)胞系，(11)陽性對照，和(12)陰性對照。圖右邊的箭頭指示IGSF9PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。上述組中的數(shù)據(jù)表明IGSF9在8種腫瘤樣品中的7種中表達(dá)，在其中的5種中強表達(dá)。它還在兩種卵巢腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)。
圖5是IGSF9在乳腺癌樣品和對應(yīng)正常乳腺樣品中的表達(dá)。使用Clontech′s人類乳腺匹配的cDNA對組(Clontech′s Human Breast MatchedcDNA pair panel)(BD Biosciences，目錄#K1432-1前5組樣品)測定在乳腺組織和得自La Mesa CA的Grossmont醫(yī)院的5個自制匹配樣品中的表達(dá)。使用TRIzol試劑(Invitrogen，目錄#15596026)從每份樣品中分離RNA。用Gibco BRL cDNA合成系統(tǒng)(Life Technologies，目錄#18267-021)從總RNA制備cDNA。上面一組凝膠顯示IGSF9表達(dá)；下面一組凝膠顯示GAPDH表達(dá)。(N)正常組織，(T)腫瘤組織。腫瘤樣品如下(患者A)浸潤性導(dǎo)管癌；(患者B)浸潤性導(dǎo)管癌，(患者C)導(dǎo)管腺癌；(患者D)浸潤性導(dǎo)管癌，(患者E)浸潤性導(dǎo)管癌，(患者T)高級別原位&浸潤性導(dǎo)管癌，(患者X)導(dǎo)管腺癌，(患者W)混合型導(dǎo)管和小葉腺癌，(患者GH19)高級別浸潤性導(dǎo)管癌，(患者GH17)低級別導(dǎo)管內(nèi)癌。圖右邊的箭頭指示IGSF9 PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。此處的數(shù)據(jù)表明IGSF9在10份乳腺腫瘤樣品的8份中表達(dá)，但僅僅在10份正常樣品的4份中表達(dá)。
圖6是IGSF9在肺癌中的表達(dá)。用Clontech′s人肺匹配的cDNA對組(BDBiosciences，catalog#K1432-1)測定上述表達(dá)。上面一組顯示IGSF9表達(dá)，下面一組顯示GAPDH表達(dá)。(N)正常樣品；(T)腫瘤樣品。所分析的腫瘤樣品如下(患者A)浸潤性導(dǎo)管癌，(患者B)鱗狀細(xì)胞角化癌，(患者C)腺鱗癌，(患者D)角化型鱗狀細(xì)胞上皮瘤，(患者E)鱗狀細(xì)胞癌。圖右邊的箭頭指示IGSF9PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。此處顯示的數(shù)據(jù)表明IGSF9存在于所有5份肺癌樣品中，但僅僅存在于5份正常樣品的2份中。
圖7是IGSF9在結(jié)腸癌中表達(dá)。結(jié)腸癌樣品得自La Mesa，CA的Grossmont醫(yī)院。結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HCT116得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)，使用Qiagen′s RNeasy試劑盒(目錄#75162)從每份樣品和細(xì)胞系分離RNA。用Gibco BRL cDNA合成系統(tǒng)(LifeTechnologies，目錄#18267-021)從總RNA制備cDNA。上面一組顯示IGSF9表達(dá)，下面一組顯示GAPDH表達(dá)。樣品如下(1)3級腺癌，(2)2級腺癌，(3)1級腺癌，(4)2級腺癌，(5)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HCT116。圖右邊的箭頭指示IGSF9 PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。圖中的數(shù)據(jù)表明IGSF9在結(jié)腸癌細(xì)胞系HTC116中表達(dá)，在4份腫瘤樣品的至少1份中也可微弱表達(dá)。
綜上所述，此處顯示的數(shù)據(jù)表明IGSF9在多個卵巢腫瘤，乳腺腫瘤，肺腫瘤和結(jié)腸腫瘤樣品中以顯著水平表達(dá)。因此IGSF9可代表泛癌抗原(pancarcinoma antigen)和對上述任意適應(yīng)癥中腫瘤治療的合適靶位。
實施例2通過RT-PCR測定IGSF9在人類腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)通過RT-PCR研究IGSF9在得自ATCC(Manassas，VA)和亞利桑那癌癥中心(Arizona Cancer Center)(Tucson，AZ)的人類腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。圖8描述了這個實驗的結(jié)果，表明IGSF9在許多不同的腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)。
使用下列腫瘤細(xì)胞系胰腺PANC-1。
乳腺ZR-75-1，MDA-MB468，MAD-MB231，ME-180，UACC812。
卵巢UACC326。
肺A549(NSCLC)，NCI-H69(小細(xì)胞)，NCI-H1299(NSCLC)，NCI-H2126(NSCLC)。
結(jié)腸HT 29，LoVo，SW 620，Colo201，Colo205，Colo320。
用Qiagen RNeasys試劑盒從每個細(xì)胞系中分離RNA，隨后用InvitrogencDNA合成系統(tǒng)從總RNA制備cDNA。圖8解釋了PCR實驗的結(jié)果，其中每份樣品中IGSF9的相對表達(dá)表示成IGSF9的強度對內(nèi)標(biāo)3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)強度的比例。
合成下列PCR引物，并將其用于所有實驗。
5′-TCTTATCTTCTCTCCGACCGGGAAG-3′(SEQ ID NO34)5′-GCCACAGGGCTGATGTCTTCAATGC-3′(SEQ ID NO35)這些引物從含有IGSF9基因的任意cDNA模板擴增出387bp的PCR產(chǎn)物。在所有實驗中測量GAPDH的表達(dá)作為cDNA完整性的對照。用于擴增GAPDH基因的引物是5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(SEQ ID NO36)5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(SEQ ID NO37)上述引物可從編碼GAPDH基因的任意cDNA模板擴增出482bp的產(chǎn)物。
實施例3產(chǎn)生表達(dá)IGSF9構(gòu)建體的穩(wěn)定哺乳動物細(xì)胞系在公共數(shù)據(jù)庫中鑒別出IGSF9的兩種可選形式，此處稱為‘短型’和‘長型’IGSF9。長型IGSF9是在位于2個Ig域之間的胞外區(qū)中含有17個氨基酸插入的可選剪接的變體。圖1A和1B顯示了短型IGSF9的核苷酸和蛋白質(zhì)序列。圖9E和9F分別描繪了長型IGSF9的核苷酸和蛋白質(zhì)序列。
使用以標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)以及合成的寡核苷酸引物，從購得的EST質(zhì)粒構(gòu)建編碼短型IGSF9和長型IGSF9的全長cDNA。然后將全長克隆插入專利哺乳動物表達(dá)載體(U.S.專利Nos.5,648,267，5,733,779，6,017,733，和6,159,730中描述，但也可使用購得的載體，諸如Invitrogen的pIND/hygro；Stratagene的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXTl和pSG；和Pharmacia的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL等)。短型IGSF9和長型IGSF9的可溶形式，也可通過將編碼分子胞外區(qū)的cDNA與編碼人IgG1 Fc區(qū)(免疫粘附素)的cDNA進(jìn)行基因融合來構(gòu)建。以全長基因作為模板，通過PCR方法制備短型和長型IGSF9的胞外區(qū)。然后將這些構(gòu)建體插入含有IgG1 Fc基因序列的專利哺乳動物表達(dá)載體中?？寺∫餓GSF9胞外區(qū)和IgG1 Fc N-末端的框內(nèi)融合(所有序列參見圖9)。
上述所有構(gòu)建體隨后用于產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。簡單的說，通過電穿孔將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到DHFR-CHO DG44細(xì)胞中(Urlaub et.al.，1985.Som.Cell.Mol.Gen.，12555-566)。洗滌細(xì)胞，計數(shù)并重懸于冰冷的SBS緩沖液(7mM NaPO4，1mM MgCl2，272mM蔗糖，pH7.4)中。質(zhì)粒DNA線性化可通過PacI限制消化進(jìn)行，1μg/ml或0.5μg/ml的DNA與4×106DG44細(xì)胞混合并且進(jìn)行電穿孔。細(xì)胞接種入96孔微量滴定培養(yǎng)平板，并且在補充了次黃嘌呤和胸苷(HT，Gibco)的CHO S SFM II培養(yǎng)基(Gibco)中篩選對G418耐受的細(xì)胞系。通過ELISA篩選用最低濃度的DNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)板，顯示良好細(xì)胞生長的孔中代用(surrogate)標(biāo)記的表達(dá)(全長構(gòu)建體的情況下為B7Ig，免疫粘附素構(gòu)建體的情況下為CTLA4Ig)。產(chǎn)生免疫粘附素最多的細(xì)胞系在搖瓶培養(yǎng)中擴增，用A蛋白親和色譜法從培養(yǎng)上清液中純化免疫粘附素分子，并隨后用作產(chǎn)生鼠單克隆抗體的免疫原(參見實施方案4)。
圖10是純化的免疫粘附素的SDS-PAGE分析。從10升培養(yǎng)上清液中純化物質(zhì)。通過考馬斯藍(lán)染色使蛋白質(zhì)顯色。僅僅觀察到長型IGSF9的預(yù)期分子量的較粗條帶(條帶2)。短型IGSF9(條帶1)導(dǎo)致產(chǎn)生多重降解產(chǎn)物。圖10中的數(shù)據(jù)表明重組IGSF9分子可在哺乳動物細(xì)胞中成功地高水平表達(dá)。
以最高水平表達(dá)全長IGSF9構(gòu)建體的細(xì)胞系在5nM氨甲喋呤(MTX)隨后在50nM MTX中擴增。簡單的說，以2倍的增量按1.5細(xì)胞/板至3000細(xì)胞/板的密度接種細(xì)胞，并且在含有5nM MTX或50nM MTX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。用ELISA篩選存活細(xì)胞中代用標(biāo)記的表達(dá)，產(chǎn)量最高的克隆較移到搖瓶培養(yǎng)中擴增。通過RT-PCR和Northern印跡證實，IGSF9在得到的細(xì)胞系中的表達(dá)信息。圖11是一個代表性的Northern印跡。對于Northern分析，使用Qiagen RNeasyMaxi試劑盒，根據(jù)制造商的方案，從1×108細(xì)胞抽提總RNA。使用推薦的批量方案，用Qiagen OligotexmRNA DirectMidi/Maxi試劑盒分離mRNA。在含有3％甲醛的1％瓊脂糖凝膠上分離3μgmRNA，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法顯色。根據(jù)制造商的說明(Roche)，使用digoxygenin(DIG)標(biāo)記型(DIG-labelling)核苷酸混合物，通過PCR用DIG來標(biāo)記特異于IGSF9胞外區(qū)的核苷酸探針以及GAPDH對照探針。利用總計50ng/ml的相等濃度的IGSF9探針和15ng/ml的GAPDH探針，使印跡于50℃在DIG EasyHyb溶液(Roche)中雜交。根據(jù)制造商的說明(Roche)，用DIG洗液和封閉檢測系統(tǒng)對該印跡進(jìn)行洗滌和檢測。隨后使印跡暴露于薄膜大約16小時。圖11的泳道2-5中可見預(yù)期大小的主要產(chǎn)物，如圖所示。第二個較大轉(zhuǎn)錄物的出現(xiàn)可能是由于連綴轉(zhuǎn)錄。此圖中的數(shù)據(jù)證實重組IGSF9分子以可檢測水平在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。
實施例4抗IGSF9單克隆抗體8F3的產(chǎn)生用基因槍向6-8周齡雄性BALB/c小鼠注射編碼短型可溶性IGSF9-Ig的cDNA構(gòu)建體5次，以產(chǎn)生單克隆抗體。隨后用通過A蛋白親和層析法從穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞系的上清液中純化得到的短型IGSF9-Ig融合蛋白(參見前述實施例)對小鼠進(jìn)行加強。在11天內(nèi)，包括5組、每組12次注射的快速免疫技術(shù)中，給小鼠注射純化蛋白。在第12天對小鼠取血，通過ELISA在由純化的短型IGSF9-Ig包被的96孔板上測定IGSF9特異性抗體的滴度。在第13天，從顯示最高滴度的小鼠體內(nèi)取出脾，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)(Kohler，G.and Milstein，C.1975.Nature 256，p495)與小鼠骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞融合。圖12顯示了代表性ELISA測定，其測定如上免疫的2只小鼠的連續(xù)稀釋血清中的IGSF9反應(yīng)性。
最初通過ELISA篩選所有雜交瘤對短型IGSF9-Ig的反應(yīng)性，然后用不相關(guān)的Ig融合蛋白篩選所有陽性雜交瘤，以排除任何交叉反應(yīng)抗體。最高產(chǎn)量的克隆通過有限稀釋進(jìn)行亞克隆并且最終轉(zhuǎn)移至搖瓶中進(jìn)行擴增。10-12天后通過蛋白-A親和層析法從培養(yǎng)物上清液純化抗體，根據(jù)制造商的說明用小鼠免疫球蛋白ELISA試劑盒(Pharmingen)測定同種型?；谄涓叩味群蛯GSF9的結(jié)合特異性，篩選出1種稱為8F3的單克隆抗體用于進(jìn)一步研究。實施例5和6描述了使用這種抗體檢測IGSF9在各種相關(guān)組織中表達(dá)的實驗。
實施例5用單克隆抗-IGSF9抗體檢測的IGSF9在穩(wěn)定細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)測定的IGSF9在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的表面表達(dá)用生物素?；目笽GSF9單克隆抗體8F3通過流式細(xì)胞術(shù)證實重組IGSF9分子在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞表面的表達(dá)。使用ECL蛋白質(zhì)生物素?；K根據(jù)制造商的說明(Amersham Pharmacia)對抗體進(jìn)行生物素?；?br> 對于流式細(xì)胞術(shù)，收獲細(xì)胞并用PBS洗滌兩次。3-5×105細(xì)胞隨后按等分加入96孔圓底培養(yǎng)板中并且用FACS緩沖液(含有10％正常山羊血清，0.2％BSA，和0.1％NaN3的PBS)洗滌3次。將細(xì)胞團(tuán)和100μl、10μg/ml的初級抗體(生物素?；?F3或同種型對照)重懸于100μl FACS緩沖液，冰上保溫1小時。然后將該培養(yǎng)板離心，用針狀物吸出上清液。然后如上所述用FACS緩沖液再洗滌細(xì)胞沉淀物兩次。隨后，細(xì)胞與1∶500稀釋的Streptavidin-PE(BD Pharmingen)一起再次于冰上保溫1小時，之后如上所述洗滌細(xì)胞并重懸于500μl、含有5μl碘化丙錠的FACS緩沖液中，以便將活細(xì)胞與死細(xì)胞分離。熒光強度用Becton Dickinson FACScalibur血細(xì)胞計數(shù)器測定，篩選(gated for)HLA-APC陽性和碘化丙錠陰性細(xì)胞群體。
圖13和14見短型IGSF9和長型IGSF9在穩(wěn)定的CHO轉(zhuǎn)染體中表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。這些圖中的數(shù)據(jù)表明兩者在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面上均有表達(dá)，并且短型轉(zhuǎn)染體的增加的MTX擴增導(dǎo)致分子的表面表達(dá)增加。
流式細(xì)胞術(shù)測定的IGSF9在腫瘤細(xì)胞系的表面表達(dá)除了檢測到初級抗體8F3的多個濃度之外，基本如上所述用流式細(xì)胞術(shù)測定IGSF9在人類肺腫瘤細(xì)胞系NCI-H69中的內(nèi)源性表面表達(dá)。圖15顯示了這個實驗的結(jié)果。這個實驗表明發(fā)現(xiàn)在人類腫瘤細(xì)胞系表面有內(nèi)源性表達(dá)的IGSF9。
western印跡法測定的IGSF9在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)使用得自人類腫瘤細(xì)胞系的蛋白水解產(chǎn)物，以抗IGSF9單克隆抗體8F3為探針的免疫印跡法實驗證實，IGSF9蛋白在許多人類腫瘤細(xì)胞系中以可檢測水平表達(dá)。此數(shù)據(jù)見圖16。在SDS凝膠樣品緩沖液中通過直接細(xì)胞溶解作用制備總蛋白水解產(chǎn)物，并用SDS-PAGE分離。根據(jù)制造商的說明，用DC蛋白分析試劑盒(BioRad)測定水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度。細(xì)胞水解產(chǎn)物用SDS-PAGE(6％丙烯酰胺凝膠)分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用純化的抗IGSF9mAb(8F3；10μg/ml)在4℃過夜進(jìn)行免疫印記，然后與1∶1,000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)的抗小鼠IgG二級抗體(BioRad)一起保溫。根據(jù)制造商的說明，用ECL試劑(Amersham Pharmacia)顯影免疫印跡。
熒光顯微術(shù)測定的IGSF9在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)在聚L-賴氨酸包被的蓋玻片上生長的ZR-75-1乳腺腫瘤細(xì)胞與抗IGSF9單克隆抗體8F3(10μg/ml)一起保溫16小時。用PBS洗滌細(xì)胞并用冰冷的甲醇固定。固定的細(xì)胞在封閉緩沖液(含有3％山羊血清，0.5％BSA的PBS)中封閉，在室溫下與DAPI(0.5μg/ml)以及1∶2000稀釋的Alexa488-山羊抗小鼠二級抗體(Molecular Probes)一起溫育45分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞，用ProLongAntifade試劑盒(Molecular Probes)將細(xì)胞固定在載玻片上，并用BioRad Radiance 2100共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(60×物鏡)檢測。這個實驗的結(jié)果見圖17。此圖證實了乳腺腫瘤細(xì)胞的表面染色。
總之，圖13-17的數(shù)據(jù)表明單克隆抗體8F3對IGSF9具有反應(yīng)性，并用來證實IGSF9是細(xì)胞表面蛋白。這些數(shù)據(jù)還支持下述假設(shè)IGSF9可能是人類腫瘤的合適的免疫治療靶位，因為發(fā)現(xiàn)它以顯著水平在人類腫瘤細(xì)胞系表面表達(dá)。
實施例6IGSF9在鼠腫瘤異種移植物中的表達(dá)如下產(chǎn)生鼠腫瘤異種移植物收獲體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系NCI-H69(肺)和ZR-75-1(乳腺)，LS174T(結(jié)腸)和Ovcar-3(卵巢)，使細(xì)胞懸液通過裝有22號針的注射器以分散細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞經(jīng)洗滌，計數(shù)，重懸于PBS中。
將2-10×106細(xì)胞/100μL經(jīng)皮下注射(s.c.)到裸鼠的右側(cè)脅腹。生長4-8周后切除腫瘤塊。為了體內(nèi)再傳代，2mm的腫瘤塊經(jīng)s.c.再次注入裸鼠脅腹部，并生長4-8周。
用抗IGSF9單克隆抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)測定IGSF9在鼠腫瘤異種移植物和細(xì)胞系表面的表達(dá)為進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，將新鮮腫瘤樣品切碎，在37℃用含5％BSA和0.05％NaN3的膠原酶溶液消化1小時。通過密度梯度離心將活細(xì)胞與死細(xì)胞及其它碎屑分離。然后細(xì)胞鋪入96孔圓底培養(yǎng)板，并如實施方案5所述進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。用非酶緩沖液分散在培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，洗滌，鋪入96孔板，并如前述進(jìn)行處理。
圖18是代表性FACS實驗，其測定IGSF9在NCI-H69和Ovcar-3鼠腫瘤異種移植物和培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)。圖18的數(shù)據(jù)表明IGSF9在培養(yǎng)基中所生長的細(xì)胞或者源自鼠異種移植物的體內(nèi)傳代細(xì)胞的表面均有表達(dá)。IGSF9在體內(nèi)生長的人類腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)進(jìn)一步支持了下述假設(shè)IGSF9是合適的治療靶位。
RT-PCR檢測的鼠腫瘤異種移植物中的IGSF9信息用人IGSF9-特異性引物和GAPDH對照引物，通過RT-PCR測定IGSF9在腫瘤異種移植樣品中的表達(dá)。如前所述產(chǎn)生并切除異種移植樣品。用Qiagen RNeasy試劑盒從0.25g組織樣品中分離總RNA，經(jīng)DNase處理，并用Qiagen minElute柱純化。用寡-dT引物和Invitrogen′s超轉(zhuǎn)錄第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen′s Super Script First-Strand Synthesis system)合成cDNA。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR。用于擴增IGSF9的PCR引物如下正向引物5′-GTGGGCCGGGGGCTGCAAGGCCAG-3′(SEQ ID NO38)反向引物5′-AGCAGACAAGACGATTTCGCTGAA-3′(SEQ ID NO39)代表性的RT-PCR實驗結(jié)果見圖19。在LS174T和NCI-H69腫瘤細(xì)胞系的兩代體內(nèi)傳代細(xì)胞(P0和P1)以及源自鼠異種移植物的Ovcar-3細(xì)胞的至少一代細(xì)胞(P0)中，檢測到了IGSF9的信息。
在鼠異種移植物腫瘤中表達(dá)的IGSF9的交替剪接形式對從鼠異種移植物樣品獲得的PCR產(chǎn)物的序列分析表明IGSF9的多個同種型在腫瘤來源的細(xì)胞中表達(dá)。用設(shè)計成能與IGSF9的區(qū)域側(cè)接的引物如上所述進(jìn)行RT-PCR分析，其中先前所述的短型和長型同種型的序列不一致(在外顯子9中)。所述PCR引物如下正向引物5′-CAGGAACTGGAGCCTGTGACCCT-3′(SEQ ID NO40)反向引物5′-CTCTATAAAAGCTGGGGGAGCCTT-3′(SEQ ID NO41)
用PCR4-TOPO TA克隆系統(tǒng)(Invitrogen)，通過鳥槍法(shortgun)克隆PCR產(chǎn)物，并用ABI自動DNA序列測定儀對插入序列進(jìn)行測序。在源自NCI-H69異種移植物的克隆中鑒定出兩種新的同種型，在源自O(shè)vcar-3異種移植物的克隆中鑒定出另外一種不同的新同種型。
所有新的同種型遵循AG/GT剪接規(guī)則，說明它們是真正的剪接變體(Breathnach R.et al，1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75；4853-7)。圖20描繪了代表性的PCR凝膠，以及受交替剪接影響的IGSF9外顯子的示意圖。獲得的每個核苷酸序列的框內(nèi)翻譯預(yù)示所有新序列將產(chǎn)生缺少跨膜區(qū)的截短型蛋白。獲得的核苷酸的實際序列，以及其相應(yīng)的預(yù)測的蛋白質(zhì)序列的比對見圖21。部分核苷酸序列與長型IGSF9的外顯子5-10相比對。
此處的序列數(shù)據(jù)表明IGSF9的多個亞型存在于人類腫瘤中，并且許多亞型是潛在的免疫療法靶位。
實施例7LIV-1表達(dá)圖22是用Gene Logic datasuite測定的電子Northern，其顯示這個基因的基因表達(dá)圖譜。Y軸的值代表在Gene Logic單元(unit)中的表達(dá)強度。圖中每個藍(lán)圈代表單獨的患者樣品。圖左邊的柱狀圖描繪了被發(fā)現(xiàn)表達(dá)該基因片段的每種組織類型的百分比。每種組織類型的樣品總數(shù)如下惡性乳腺(60)；惡性結(jié)腸(91)；惡性肺(40)；惡性卵巢(37)；惡性前列腺(26)；正常乳腺(30)；正常結(jié)腸(30)；正常食管(17)，正常腎(27)；正常肝臟(19)；正常肺(34)；正常淋巴結(jié)(9)；正常卵巢(22)；正常胰腺(18)；正常前列腺(21)；正常直腸(22)；正常脾(9)；正常胃(21)。
如上述實施方案所述，用購得的人類cDNA組(panel)和從人類組織和細(xì)胞系自制的cDNA樣品，通過PCR實驗進(jìn)一步研究LIV-1在正常的和惡性人類組織中的表達(dá)。這些實驗的結(jié)果見圖23-25。合成下列PCR引物并用于所有實驗。
5′-GGATGGTGATAATGGGTGATGGC-3′(SEQ ID NO42)5′-GGTCACTAGCATCATTGTGCAGC-3′(SEQ ID NO43)這些引物的序列包含在IMAGE克隆#4697878/ATCC目錄#6645729的LIV-1的部分中，其中來自該克隆質(zhì)粒DNA在每個實驗中用作陽性對照。這些引物從含有LIV-1基因的任何cDNA模板擴增出360bp的PCR產(chǎn)物。如先前實施方案中所述，在所有實驗中，測定GAPDH的表達(dá)作為cDNA完整性的對照。
LIV-1引物從編碼GAPDH基因的任何cDNA模板擴增出482bp的產(chǎn)物。在所有情況下，還包括陽性和陰性對照；陽性對照是IMAGE克隆4697878的質(zhì)粒DNA，陰性對照是水(無模板)。
圖23是用Clontech′s人類多組織cDNA組(Clontech′s Human MultipleTissue cDNA Panels)(BD Biosciences，目錄#K1420-1和K1421-1)測定的LIV-1在正常組織中的表達(dá)。上面一組顯示LIV-1表達(dá)，下面一組顯示GAPDH表達(dá)。每個泳道中的cDNA樣品如下(1)心臟，(2)腦，(3)胎盤，(4)肺，(5)肝臟，(6)骨骼肌，(7)腎，(8)胰腺，(9)陰性對照，和(10)陽性對照。圖右邊的箭頭指示LIV-1PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。此處的數(shù)據(jù)表明LIV-1在正常腦，胎盤，肺，肝臟和腎中微弱表達(dá)，在正常胰腺中以稍高程度表達(dá)。
圖24是LIV-1在乳腺腫瘤樣品和匹配的正常乳腺樣品中的表達(dá)。使用Clontech′s人類匹配的cDNA對組(Clontec h′s Human Matched cDNA PairPanel)(BD Biosciences目錄#K1432-1，測定在乳腺組織中的表達(dá)(左面一組)以及在得自GLa Mesa CA的rossmont醫(yī)院的5個自制匹配樣品中的表達(dá)(右面一組)。用TRIzol試劑(Invitrogen，目錄#15596026)從每份樣品中分離RNA。用Gibco BRL cDNA合成系統(tǒng)(Life Technologies，目錄#18267-021)從總RNA制備cDNA。上部凝膠顯示LIV-1表達(dá)；下部凝膠顯示GAPDH表達(dá)。圖右邊的箭頭指示LIV-1PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。腫瘤樣品如下(1-患者A)浸潤性導(dǎo)管癌，(2-患者B)浸潤性導(dǎo)管癌，(3-患者C)導(dǎo)管腺癌，(4-患者D)浸潤性導(dǎo)管癌，(5-患者E)浸潤性導(dǎo)管癌，(6-患者A)正常，(7-患者B)正常，(8-患者C)正常，(9-患者D)正常，(10-患者E)正常，(11)陰性對照，(12)陽性對照，(13-患者G19)高級別浸潤性導(dǎo)管癌，(14-患者G17)低級別導(dǎo)管內(nèi)癌，(15-患者X)管狀腺癌，(16-患者W)混合型導(dǎo)管和小葉腺癌(mixedductal and lobular adenocarcinoma)，(17-患者T)高級別原位&浸潤性導(dǎo)管癌(high grade in situ & invasive ductal carcinoma)，(18-患者G19)正常，(19-患者G17)正常，(20-患者X)正常，(21-患者W)正常，(22-患者T)正常，(23)陰性對照，和(24)陽性對照。該圖所示數(shù)據(jù)表明LIV-1在所分析的全部10個乳腺癌樣品中表達(dá)。在10個樣品的4個中，腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于相匹配的正常樣品中的表達(dá)。
圖25是LIV-1在結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)。結(jié)腸腫瘤樣品得自La Mesa，CA的Grossmont醫(yī)院。結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HCT116得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。用Qiagen′s RNeasy試劑盒(目錄#75162)從每份樣品和細(xì)胞系中分離RNA。用Gibco BRL cDNA合成系統(tǒng)(Life Technologies，目錄#18267-021)從總RNA制備cDNA。上面一組顯示LIV-1表達(dá)，下面一組顯示GAPDH表達(dá)。樣品如下(1)3級腺癌，(2)2級腺癌，(3)1級腺癌，(4)2級腺癌，(5)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HCT116，(6)陽性對照，和(7)陰性對照。此處所示的數(shù)據(jù)表明LIV-1在被檢測的所有4個結(jié)腸腫瘤樣品中表達(dá)。
綜上所述，此處顯示的數(shù)據(jù)表明LIV-1以顯著水平在多個乳腺腫瘤和結(jié)腸腫瘤樣品中表達(dá)。Gene Logic數(shù)據(jù)表明LIV-1在前列腺腫瘤樣品中過表達(dá)。因此LIV-1代表在上述任意指征中的泛癌抗原和腫瘤治療的合適靶位。
實施例8治療癌癥的方法從患有癌癥或懷疑患有癌癥的患者獲得組織樣品。該樣品可以是活檢樣品，從組織切除腫瘤之后獲得的病理學(xué)樣品，或者以前從患者獲得的存檔樣品。對樣品的分析類似實施方案1-7。
基于對IGSF9和/或LIV-1在腫瘤樣品中的水平分析，確定利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可接受的治療替代方案的療法。這些可包括，但不限于，本文所述的方法，觀察，手術(shù)方式，非輔助療法諸如放療，和輔助療法如他莫昔芬或細(xì)胞毒化療。
本發(fā)明已確立IGSF9或LIV-1的過表達(dá)與許多腫瘤有關(guān)。因此，重要的是，本發(fā)明證明IGSF9和LIV-1的表達(dá)水平代表了多種癌癥的提示性預(yù)后標(biāo)記(informative prognostic marker)。用本發(fā)明的抗體，抗原結(jié)合片段，或多核苷酸可測定IGSF9或LIV-1的表達(dá)水平。因此，在診斷和外科切除時，對IGSF9和LIV-1在原發(fā)性腫瘤中表達(dá)水平的認(rèn)知直接影響關(guān)于輔助性激素和化療以及補充性放療的治療決定。
除了影響現(xiàn)行癌癥療法的選擇和利用，對IGSF9和LIV-1表達(dá)水平的認(rèn)知有利于應(yīng)用新的癌癥療法?；謴?fù)IGSF9和LIV-1正常表達(dá)水平的療法包括，但不限于如上所述的療法。
實施例9篩選化合物的方法制藥工業(yè)的興趣在于評估作為細(xì)胞表面受體激動劑或拮抗劑的藥學(xué)上有用的化合物。每年有數(shù)以萬計的化合物需要在入門(entry)水平或“高流量(high flux)”篩選方案中進(jìn)行檢測。在仔細(xì)檢測的數(shù)千化合物中，其中一或兩種在入門水平分析中顯示出一些活性。然后挑選這些化合物進(jìn)行進(jìn)一步的研發(fā)和檢驗。理想地，篩選方案可一次自動處理許多樣品，并且不使用導(dǎo)致安全性問題或清理問題的放射性同位素或其它化學(xué)藥品。評估對細(xì)胞表面受體活性的需要或不需要的藥物調(diào)節(jié)作用的基于抗體的方法將產(chǎn)生這些優(yōu)點，并提供了高選擇性的附加優(yōu)點。
具體地，識別IGSF9或LIV-1的抗體可用于在各種篩選方案中篩選藥物。通常使用兩種方案。基于細(xì)胞或組織的方法使用暴露于所檢測化合物的指示細(xì)胞系或組織。當(dāng)使用細(xì)胞時，認(rèn)為這個方案可以快速消除具有溶解性或膜通透性問題的藥物。基于蛋白質(zhì)或酶的篩選方案可使用經(jīng)純化的蛋白質(zhì)，并且可鑒別與IGSF9或LIV-1反應(yīng)來影響胞內(nèi)信號的藥物。
對于用來鑒別可調(diào)節(jié)(例如刺激，阻斷，抑制或遏制)IGSF9或LIV-1表達(dá)的藥物的基于細(xì)胞或組織的篩選方案，IGSF9或LIV-1表達(dá)的免疫組織化學(xué)或細(xì)胞化學(xué)可用于測定單獨試劑的影響。
可精確檢測IGSF9或LIV-1水平的基于免疫組織化學(xué)的方法，還具有下列優(yōu)勢其可與實體瘤外植體培養(yǎng)物和類器官培養(yǎng)物(organoid culture)一同使用，因此與其它方法相比，可以在與在生理學(xué)上更加相關(guān)的環(huán)境中精確地檢測IGSF9或LIV-1的調(diào)節(jié)藥物。此外，上述建議的方法還適用于篩選和監(jiān)測在所研究的動物和人類體內(nèi)的組織和細(xì)胞中，藥物對IGSF9或LIV-1的影響。在研究動物的情況下，樣品可以通過活檢(例如細(xì)針吸出物(fine needle aspiration)，切片)或組織收獲來獲得，然后對所述樣品使用本發(fā)明的方法。
上述建議的方法是高靈敏度的，這是因為原則上，可以在單個細(xì)胞中監(jiān)測IGSF9或LIV-1的表達(dá)水平。對于實際用途，可能需要更多細(xì)胞，但利用少至20-100個細(xì)胞也可得到良好的分析性估算。
上述說明書，包括具體實施方式
和實施方案，意欲說明本發(fā)明而不應(yīng)認(rèn)為是限制性的。在不偏離本發(fā)明的真實精神和范圍時，可以進(jìn)行大量其它改變和修改。所有本文引用的出版物，專利和專利申請整體引入公開內(nèi)容作為參考。
權(quán)利要求
1.分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與IGSF9或者LIV-1相結(jié)合。
2.一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與IGSF9的以下氨基酸序列相結(jié)合SEQ ID NO2所示21-718位氨基酸、SEQ ID NO8所示21-734位氨基酸、SEQ ID NO22-27所示氨基酸序列；或與LIV-1的以下氨基酸序列相結(jié)合SEQ ID NO29所示28-317位、373-417位、674-678位或742-749位氨基酸。
3.權(quán)利要求2所述的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段包含結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。
4.權(quán)利要求3所述結(jié)構(gòu)域缺失的抗體或其抗原結(jié)合片段，進(jìn)一步包含細(xì)胞毒藥劑。
5.權(quán)利要求4所述結(jié)構(gòu)域缺失的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述細(xì)胞毒藥劑是放射性核素。
6.權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是人源化的。
7.權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是靈長類源化的。
8.一種與IGSF9或LIV-1結(jié)合的抗體或其抗原片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段抑制與IGSF9或LIV-1相關(guān)的一種或多種功能。
9.一種組合物，包含與IGSF9或LIV-1結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。
10.一種治療腫瘤疾病的組合物，包含結(jié)構(gòu)域缺失的抗IGSF9抗體或抗LIV-1抗體或其抗原結(jié)合片段，上述抗體或其抗原結(jié)合片段與一或多種雙功能螯合劑共價連接。
11.權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述雙功能螯合劑選自MX-DTPA和CHX-DTPA組成的組。
12.一種治療表現(xiàn)出腫瘤疾病的哺乳動物的方法，包括給予治療有效劑量的抗體或其抗原結(jié)合片段的步驟，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段可與IGSF9或LIV-1相結(jié)合。
13.權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括將治療有效劑量的至少一種化療劑給予所述哺乳動物的步驟；其中所述化療劑以及所述抗體或其抗原結(jié)合片段可以以任意順序給予或同時給予。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述抗IGSF9抗體或抗LIV-1抗體或其抗原結(jié)合片段是結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)域缺失的抗體或其抗原結(jié)合片段缺失CH2結(jié)構(gòu)域。
16.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人源化的。
17.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與細(xì)胞毒藥劑結(jié)合。
18.權(quán)利要求12所述的方法，其中在給予所述化療劑的兩周內(nèi)給予所述抗體或其抗原結(jié)合片段。
19.一種治療癌癥的疫苗，包含IGSF9或LIV-1多肽或其片段以及生理上可接受的載體。
20.權(quán)利要求19所述的疫苗，其中所述多肽包含SEQ ID NO2所示IGSF9的1-1163位氨基酸或21-718位氨基酸；或SEQID NO29所示的LIV-1的1-749位氨基酸，28-317位氨基酸，373-417位氨基酸。
21.權(quán)利要求19所述的疫苗，其中所述生理上可接受的載體包含佐劑或免疫刺激劑。
22.權(quán)利要求21所述的疫苗，其中所述佐劑是PROVAXTM。
23.權(quán)利要求19所述的疫苗，其中所述多肽與T輔助細(xì)胞的肽融合。
24.一種在需要治療或預(yù)防癌癥的患者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括將權(quán)利要求19所述的疫苗給予所述患者。
25.一種通過檢測IGSF9或LIV-1或其片段的過表達(dá)來診斷癌癥的方法，包括e.從需要診斷癌癥的個體獲得樣品；f.檢測IGSF-9或LIV-1或其片段在所述樣品中的表達(dá)；g.檢測IGSF9或LIV-1或其片段在對照樣品中的表達(dá)，所述對照樣品來自正常個體或正接受診斷的個體的正常組織；和h.將IGSF9或LIV-1的表達(dá)水平與對照樣品中獲得的表達(dá)水平比較，其中所述比較使得可診斷癌癥。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述IGSF9片段包含外顯子5-10。
27.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述過表達(dá)通過核酸擴增或雜交來檢測。
28.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述過表達(dá)使用IGSF9或LIV-1的抗體或其抗原結(jié)合片段來檢測。
29.一種確定接受癌癥治療的個體的預(yù)后的方法，包括e.從需要確定癌癥治療預(yù)后的所述個體獲得樣品；f.檢測IGSF9或LIV-1或其片段在所述樣品中的表達(dá)；g.檢測IGSF9或LIV-1或其片段在對照樣品中的表達(dá)，所述對照樣品來自正常個體或正接受診斷的個體的正常組織；和h.將IGSF或LIV-1的表達(dá)水平與對照樣品中獲得的表達(dá)水平相比較，其中所述比較使得能確定癌癥預(yù)后。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述IGSF9片段包含外顯子5-10。
31.一種疫苗，包含免疫學(xué)上類似于IGSF9或LIV-1抗原或其片段的抗獨特型抗體作為活性成分。
32.一種試劑盒，包含權(quán)利要求9所述的組合物以及使用它治療或檢測癌癥的說明書。
33.一種治療哺乳動物中腫瘤疾病的方法，所述哺乳動物中的腫瘤細(xì)胞表達(dá)IGSF9或LIV-1抗原，該方法包括將包含藥物有效量的抗IGSF9抗體或抗LIV-1的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物給予所述哺乳動物。
34.一種疫苗，包含可藥用載體以及抗腫瘤免疫反應(yīng)誘導(dǎo)有效量的、含IGSF9或LIV-1的免疫原性制品，其中所述免疫原性制品能夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。
35.一種長度多達(dá)50個核苷酸的反義核酸，包含抑制IGSF9或LIV-1表達(dá)的、IGSF9或LIV-1的至少8個核苷酸的部分。
36.權(quán)利要求35所述的核酸，其中所述反義寡核苷酸包含至少一處經(jīng)修飾的核苷酸間鍵合。
37.一種抑制IGSF9或LIV-1在細(xì)胞或組織中表達(dá)的方法，包括將所述細(xì)胞或組織與權(quán)利要求34所述的核酸接觸，從而抑制IGSF9或LIV-1的表達(dá)。
38.一種分離的核酸，選自以下序列組成的組SEQ ID NO3；SEQ ID NO5；SEQ ID NO12；SEQ ID NO13；SEQ ID NO14；SEQ ID NO15；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO18；SEQ ID NO19；SEQ ID NO20；和SEQ ID NO21。
39.一種載體，包含權(quán)利要求38所述的核酸。
40.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求38所述的核酸。
41.一種分離的多肽，選自以下序列組成的組SEQ ID NO4；SEQ ID NO6；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23；SEQ ID NO24；SEQ ID NO25；SEQ ID NO26；和SEQ ID NO27。
42.一種組合物，其包含權(quán)利要求41所述的多肽。
43.一種治療癌癥的疫苗，其包含權(quán)利要求41所述的多肽和生理上可接受的載體。
全文摘要
公開了人IGSF9和LIV－1多肽和編碼這種多肽的DNA(RNA)。公開的多肽和/或多核苷酸具體可用于產(chǎn)生與IGSF9或LIV－1結(jié)合的修飾的抗體或天然抗體。還公開了包含本發(fā)明抗體，多肽和多核苷酸的藥物組合物和疫苗。還公開了利用這種多肽鑒別所述多肽的配體、拮抗劑和激動劑的方法。最后公開了用于腫瘤疾病的治療，診斷和/或預(yù)后的包含上述組合物的方法。
文檔編號A61K39/395GK1849337SQ200480008450
公開日2006年10月18日 申請日期2004年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月27日
發(fā)明者卡倫·麥克拉克倫, 斯科特·格拉瑟, 羅伯特·J·皮奇, 托尼·羅 申請人:比奧根艾迪克Ma公司