專利名稱：作為藥物和基因傳輸體系的多官能枝狀和超支化聚合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多官能枝狀體和超支化聚合物的合成，尤其但不僅僅是涉及其表面端基的改性，以便它們可用作有效的藥物和基因傳輸體系。
背景技術(shù)：
枝狀體和超支化聚合物(枝狀聚合物)的結(jié)構(gòu)特征和尤其在其內(nèi)部納米空腔的存在或者在其外表面上數(shù)種基團(tuán)的存在，使得這些聚合物成為極其有用的藥物和基因傳輸應(yīng)用的候選物。生物活性的藥物化合物可包封在納米空腔內(nèi)，同時(shí)可合適地改性表面基團(tuán)，從而使得可制備多官能的枝狀聚合物。
最近研究了枝狀體作為藥物載體的應(yīng)用且已制備了功能枝狀體。這些枝狀體在其納米空腔內(nèi)包封生物活性的藥物分子。這是由于在可分別包封或者親水或者疏水化合物的納米空腔內(nèi)部疏水或者在一些其它情況下親水的環(huán)境所致。如上所述，枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)特征使得可能控釋摻入的生物活性化合物。然而，難以制備下述多官能枝狀聚合物，所述多官能枝狀聚合物同時(shí)顯示出所有所需的性能，以便有效地充當(dāng)藥物載體，和具體地說顯示出生物相容性和生物降解性，為了在人體內(nèi)長時(shí)間地循環(huán)，生物穩(wěn)定，為了在細(xì)胞受體上被連接，帶有靶配體，且具有包封的生物活性化合物的控釋性能。上述性能之一的缺少使得藥物載體無效。因此，若所使用的藥物載體不顯示出以上所述的多官能特征的話，則數(shù)種生物活性的藥物化合物不可能商業(yè)化。
在通用的治療術(shù)中，病毒載體廣泛用作基因材料的載體。盡管病毒載體一般來說是有效的，但它們引起患者健康的問題。為此，最近引入了合成載體，例如用于基因材料的非病毒載體。例如脂質(zhì)體和枝狀體，因其在基因治療術(shù)中的應(yīng)用獲得廣泛關(guān)注，這是因?yàn)榕c病毒載體相比，它們的安全性所致。具體地說，用于基因材料的合成非病毒載體在染色體組內(nèi)存在很小的基因重組危險(xiǎn)。
用合成的非病毒載體轉(zhuǎn)染的特征還在于低的細(xì)胞毒性、高的再現(xiàn)性和容易使用。
然而，目前已知的合成載體，由于與病毒載體相比，它們的有效性通常低，和它們不能用于靶基因的表達(dá)，因此存在缺點(diǎn)。具體地說，對于有效的基因表達(dá)來說，必須在細(xì)胞核的內(nèi)部轉(zhuǎn)移基因，和該工序必須克服一系列的胞內(nèi)和胞外障礙。這些障礙包括細(xì)胞的靶向(targeting)、有效輸送載體和通過細(xì)胞膜攜帶它們的基因材料，以及需要在胞飲作用之后從核內(nèi)體中釋放載體。
關(guān)于文獻(xiàn)中描述的合成載體，解決了一些或所有這些問題，然而，卻沒有實(shí)現(xiàn)所需的最終目的。本發(fā)明的目的在于，通過在枝狀體或超支化聚合物的表面上引入合適的官能團(tuán)，同時(shí)解決或克服所有以上所述的問題。以上所述的問題要求開發(fā)將基因材料輸送到細(xì)胞核上的新型且有效的載體。具體地說，這些載體應(yīng)當(dāng)同時(shí)具有靶向能力，在生物體系內(nèi)顯示出穩(wěn)定性，具有與連接的基因材料一起通過細(xì)胞膜有效輸送的能力，和后一絡(luò)合物可在胞飲作用之后從核內(nèi)體中釋放。
這種穩(wěn)定和有效的合成基因載體可以是枝狀體或者超支化聚合物。與通常不穩(wěn)定的脂質(zhì)體相反，枝狀體和超支化聚合物可作為穩(wěn)定的納米顆粒形式提供，枝狀體的尺寸取決于其生成，同時(shí)可在其表面上方便地引入的官能團(tuán)的多樣性會決定性地影響其性能和因此其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備多官能的枝狀聚合物，它可用作生物活性藥物化合物和基因材料用的有效藥物載體。優(yōu)選的枝狀聚合物包括對稱的枝狀聚合物和不對稱的超支化聚合物。通過采用這些多官能的枝狀體和超支化聚合物(枝狀聚合物)，使得采用常規(guī)的不可能商業(yè)化的載體藥物化合物可商業(yè)化。另外，基因可轉(zhuǎn)移到用于基因治療的細(xì)胞上。
超支化聚合物沒有廣泛用作藥物載體。
它們的應(yīng)用是非常令人感興趣的，因?yàn)榕c枝狀聚合物相比，它們的制備容易且成本低。
可合適地改性枝狀和超支化聚合物的端基，以便變?yōu)槎喙倌?，且使得可能在其納米空腔內(nèi)包封藥物化合物。
枝狀和超支化聚合物的合適地選擇的結(jié)構(gòu)特征使得這些分子同時(shí)生物相容和可生物降解。
此外，可攜載合適的靶向配體，以便連接到細(xì)胞受體上，和該分子可顯示出生物穩(wěn)定性，以便長時(shí)間地在生物流體內(nèi)循環(huán)?？稍试S控釋包封的藥物化合物。
當(dāng)這些聚合物在其表面上荷正電時(shí)，一旦與寡聚核苷或DNA相互作用，則它們可形成絡(luò)合物。
本發(fā)明涉及多官能枝狀聚合物的制備，除了其荷正電的表面以外，所述多官能枝狀聚合物還導(dǎo)致與荷負(fù)電的DNA形成絡(luò)合物，它們也可帶有官能團(tuán)，正如以下所述的那些，這有助于輸送基因材料。
所提出的這些聚合物尤其用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的聚合物的結(jié)構(gòu)特征如下所述a.在枝狀或超支化聚合物的表面上存在官能團(tuán)。這些官能團(tuán)可分階段引入。b.取決于其納米環(huán)境，在可包封各種化合物的聚合物內(nèi)部存在納米空腔，這后一種特性使化合物可以特別作為藥物載體使用。c.當(dāng)用于基因傳輸時(shí)，要求在這些聚合物內(nèi)存在陽離子電荷，這是因?yàn)樗鼈儗⑴c荷負(fù)電的DNA相互作用，從而導(dǎo)致形成各種絡(luò)合物。如此形成的絡(luò)合物可通過胞飲作用引入到用于基因治療的細(xì)胞核內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，提供具有對稱化學(xué)結(jié)構(gòu)的枝狀聚合物和不對稱的超支化聚合物，其特征在于對它們進(jìn)行改性，以便顯示出—能形成三個(gè)或更多個(gè)化學(xué)鍵的至少一個(gè)化學(xué)元素的原子，—鍵合到所述至少一個(gè)原子上的各種不同的端基官能團(tuán)，所述端基官能團(tuán)總體來說a)具有低毒性或根本沒有毒性，b)使得可從細(xì)胞的互補(bǔ)受體中識別上述聚合物的分子，c)使得聚合物在有機(jī)體的生物環(huán)境內(nèi)穩(wěn)定，和d)有助于所述聚合物通過細(xì)胞膜輸送。
優(yōu)選地，陽離子化該聚合物以供與DNA形成絡(luò)合物，當(dāng)所述化合物將成為基因傳輸系統(tǒng)，例如基因材料的載體時(shí)。
方便地，可通過在枝狀體的端基上引入銨、季銨或胍鎓基，從而陽離子化該聚合物。
有利地，化學(xué)元素的原子能形成三或更多個(gè)化學(xué)鍵，它可以是氮或者其它合適的特征基團(tuán)，例如碳或硅。
優(yōu)選地，改性的枝狀聚合物可以是二氨基丁烷聚(亞丙基亞氨基)枝狀體(DAB)，或者類似結(jié)構(gòu)的其它枝狀分子，例如PAMAM枝狀體。
方便地，改性的超支化非對稱聚合物可衍生于縮聚酸酐，例如琥珀酸酐、鄰苯二甲酸酐或四氫鄰苯二甲酸酐與二烷基胺，例如二異丙胺。
有利地，改性的超支化的非對稱聚合物可衍生于陰離子聚合環(huán)氧衍生物與1，1，1-三(羥烷基)丙烷。
方便地，改性的超支化的非對稱聚合物可衍生于陰離子聚合縮水甘油與1，1，1-三(羥甲基)丙烷(PG-5)。
方便地，改性的枝狀聚合物或者改性的超支化的非對稱聚合物可在其表面官能團(tuán)上具有例如聚亞烷基二醇和優(yōu)選聚(乙二醇)，其中所述表面官能團(tuán)包括各種分子量的聚合物鏈。
有利地，改性枝狀聚合物或改性的超支化的非對稱聚合物可包括下述官能團(tuán)，所述官能團(tuán)包括與細(xì)胞的受體位點(diǎn)互補(bǔ)的至少一個(gè)基團(tuán)，例如胍鎓基，碳水化合物(例如甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、葉酸、RGD受體、堿基(如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸鹽。
有利地，改性枝狀聚合物或改性的超支化的非對稱聚合物可包括有助于通過細(xì)胞膜輸送枝狀聚合物或改性的超支化聚合物與任何包封的活性藥物成分或基因材料的至少一種基團(tuán)，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚環(huán)氧丙烷部分。
方便地，改性枝狀聚合物或改性的超支化的非對稱聚合物可包括含至少一種靶向配體的官能團(tuán)，例如胍鎓基，碳水化合物(例如甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、葉酸、RGD受體、堿基(如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸鹽。
優(yōu)選地，改性枝狀聚合物和改性的超支化的非對稱聚合物可用作生物活性的藥物化合物的藥物載體或者用于攜載基因材料。
方便地，由改性的枝狀聚合物或改性的超支化的非對稱聚合物攜載的生物活性的藥物化合物可以是倍他米松或倍他米松衍生物。
本發(fā)明還提供合成多官能枝狀體和超支化聚合物的方法，以便它們可用作用于生物活性藥物化合物的藥物載體，該方法的特征在于，分階段改性這些聚合物的表面，其中包括a.用羥基、羧基或季銨基，或其它無毒基團(tuán)取代表面上的氨基或其它有毒基團(tuán)，b.在枝狀載體或超支化聚合物，例如聚(乙二醇)的表面上引入各種分子量的聚合物鏈(PEG化)，以便保護(hù)聚合物免遭有機(jī)體的MPS(單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng))的，c.引入與受體或組織互補(bǔ)的可識別基團(tuán)，即胍鎓基，碳水化合物部分(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、葉酸或RGD受體、堿基(腺嘌呤—胸腺嘧啶、胍—胞嘧啶)或巴比妥酸鹽，以便提高載體的靶向能力。d.引入有助于通過細(xì)胞膜輸送載體和包封的活性藥物成分的基團(tuán)，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚環(huán)氧丙烷部分。
優(yōu)選地，該方法包括進(jìn)行枝狀體或超支化聚合物的外部氨基或羥基與合適的保護(hù)聚合物的起始反應(yīng)，所述保護(hù)聚合物在一端帶有反應(yīng)性基團(tuán)，如異氰酸酯、環(huán)氧化物或N-羥基琥珀酰亞胺；隨后進(jìn)行所得聚合物的最大部分的氨基與異氰酸乙酯的反應(yīng)，用以取代有毒的氨基；隨后使前面所得聚合物反應(yīng)，用以將氨基轉(zhuǎn)化成可識別基團(tuán)如胍鎓基；隨后引入有助于通過細(xì)胞膜輸送載體的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)，如聚精氨酸或環(huán)氧丙烷鏈。
方便地，陽離子化所述聚合物用以與DNA形成絡(luò)合物，當(dāng)所述化合物將成為基因輸送系統(tǒng)，例如它們將成為基因材料的載體時(shí)。
有利地，該方法的特征在于，當(dāng)表面的有毒基團(tuán)是氨基時(shí)，可引入具有小于8個(gè)碳原子，優(yōu)選2或3個(gè)碳原子的小的脂族鏈以供取代。
本發(fā)明提供藥物配方，所述配方包括包封在改性的多官能枝狀或改性的多官能超支化的非對稱聚合物內(nèi)的生物活性的藥物化合物或基因材料。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)藥物配方用以輸送生物活性的藥物化合物或基因材料的方法，該方法包括通過分階段改性該聚合物的表面，合成對稱的枝狀體或者非對稱的超支化的聚合物，其中包括a.用羥基、羧基或季銨基或其它無毒基團(tuán)取代表面的氨基或其它有毒基團(tuán)，b.在枝狀載體或超支化聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG化)的表面上引入各種分子量的聚合物鏈，以便如此保護(hù)聚合物，免遭有機(jī)體的MPS(單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng))。c.引入與受體或組織互補(bǔ)的可識別基團(tuán)，即胍鎓基，碳水化合物部分(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、葉酸或RGD受體、堿基(腺嘌呤—胸腺嘧啶、胍—胞嘧啶)或巴比妥酸鹽，以便提高載體的靶向能力。d.引入有助于通過細(xì)胞膜輸送載體和包封的生物活性藥物化合物的基團(tuán)，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚環(huán)氧丙烷部分；和用所述改性聚合物包封生物活性的藥物化合物或基因材料。
優(yōu)選地，陽離子化所述聚合物用以與DNA形成絡(luò)合物，當(dāng)所述化合物將成為基因材料的載體時(shí)。
方便地，包括包封的生物活性的藥物化合物或攜載基因材料的改性枝狀聚合物或改性的超支化的非對稱聚合物用于治療應(yīng)用。
有利地，包括包封的生物活性的藥物化合物或攜載治療用基因材料的改性枝狀聚合物或改性的超支化的非對稱聚合物用于制造藥物劑型。
方便地，包括包封的生物活性的藥物化合物或攜載基因材料的改性枝狀聚合物或改性的超支化的非對稱聚合物用于制造治療與該化合物或基因材料相同疾病或病況的藥物。


圖1示出了一個(gè)本發(fā)明的目的具有對稱枝狀結(jié)構(gòu)的通式I的分子，其中符號(.)可以是能形成3或更多個(gè)化學(xué)鍵的化學(xué)元素的原子，例如氮或者合適的特征基團(tuán)，直線(-)對應(yīng)于脂族鏈和外部官能團(tuán)X、Y、Z總體來說是a)使得可從細(xì)胞的互補(bǔ)受體中識別上述聚合物分子，b)使得同一聚合物在生物環(huán)境內(nèi)穩(wěn)定和c)有助于這些聚合物通過細(xì)胞膜輸送的基團(tuán)。
圖2和3示出了兩種不同的非對稱的超支化聚合物的分子結(jié)構(gòu)(它是本發(fā)明的目的)，其中符號(g)可以是能形成3或更多個(gè)化學(xué)鍵的化學(xué)元素的原子，例如氮或者合適的特征基團(tuán)，直線(-)對應(yīng)于脂族鏈和外部官能團(tuán)X、Y、Z總體來說是a)使得可從細(xì)胞的互補(bǔ)受體中識別上述聚合物分子，b)在生物環(huán)境內(nèi)提供這些聚合物穩(wěn)定性和c)它們有助于這些聚合物通過細(xì)胞膜輸送的基團(tuán)。
圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案在枝狀體(或超支化聚合物)的表面上逐步引入官能團(tuán)，亦即在第一步中，使枝狀體中的外部氨基或羥基與帶有反應(yīng)性基團(tuán)，如環(huán)氧或N-羥基琥珀酰亞胺的合適的聚合物反應(yīng)。
在第二步中，殘留在枝狀體表面上的較大部分的氨基例如與異氰酸乙酯反應(yīng)，以取代有毒的氨基。
在第三步中，引入識別基團(tuán)，例如胍鎓基。
在第四步中，引入有助于載體與包封的藥物化合物通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移的基團(tuán)，如胍鎓基、寡聚精氨酸或聚精氨酸。
圖5圖示了在枝狀載體和DNA或寡聚核苷之間絡(luò)合物的形成及其通過細(xì)胞膜的輸送。
圖6示出了包封的戊酸倍他米松的釋放作為氯化鈉水溶液濃度的函數(shù)的圖表。
圖7示出了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在超支化聚合物的表面上官能團(tuán)的引入，亦即在一步反應(yīng)中，引入在端羥基上連接的兩種官能團(tuán)，例如保護(hù)的PEG鏈和葉酸酯靶向配體。
具體實(shí)施例方式
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及合成多官能的對稱枝狀體。由圖1中所示的通式(I)列出了這些多官能的對稱枝狀體。這種聚合物可以是例如二氨基丁烷聚(亞丙基亞氨基)枝狀體。
本發(fā)明還涉及多官能的非對稱的超支化聚合物的合成。由圖2中所示的通式(II)列出了這些多官能的非對稱的超支化聚合物和圖3示出了式(III)的超支化聚合物。
這種非對稱的聚合物例如是由縮聚琥珀酸酐、鄰苯二甲酸酐或四氫鄰苯二甲酸酐與二異丙胺而得到的聚合物或者由陰離子聚合縮水甘油與1，1，1-三(羥甲基)丙烷而得到的聚合物。
在式I、II和III中，符號(y)是可形成三個(gè)或更多個(gè)化學(xué)鍵的化學(xué)元素的原子，例如氮或其它合適的特征基團(tuán)，例如叔氨基，直線(-)相當(dāng)于脂族鏈和外部官能團(tuán)X、Y、Z總體來說可以a)使得可從細(xì)胞的互補(bǔ)受體中識別上述聚合物的分子，b)使得上述聚合物在生物環(huán)境內(nèi)穩(wěn)定，和c)有助于這些聚合物通過細(xì)胞膜輸送。
使得本發(fā)明所述的聚合物尤其可用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的那些特征性結(jié)構(gòu)特征是下述a)在枝狀體或超支化聚合物的表面上存在功能性特征基團(tuán)，這些功能性特征基團(tuán)來自于在聚合物表面上的逐步引入，例如如圖4所示，和b)取決于其納米環(huán)境，在聚合物內(nèi)部存在可包封各種化合物的納米空腔。
在第一階段引入正電荷的情況下改性枝狀體或超支化聚合物表面(分子設(shè)計(jì)枝狀或超支化聚合物的表面)，使得該聚合物適于粘接負(fù)電荷的基因材料(DNA、質(zhì)粒、寡聚核苷)。如此形成的枝狀或超支化聚合物載體—基因材料的絡(luò)合物最終通過胞飲作用引入到用于基因治療的細(xì)胞核內(nèi)。
為了制備這種多官能的枝狀和超支化聚合物(它們是本發(fā)明的目的)，使用可商購的枝狀體，例如購于DSM公司且以名稱DAB-32和DAB-64銷售。在合適的反應(yīng)器內(nèi)和在合適的實(shí)驗(yàn)條件下，通過逐步引入官能團(tuán)來改性其結(jié)構(gòu)。圖4示出了用于合成例如多官能的枝狀藥物傳輸系統(tǒng)的反應(yīng)流程。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可在合適的反應(yīng)器內(nèi)相同地使用PAMAM而不是DAB。
在本發(fā)明中，生物活性的化合物可主要引入到枝狀體或超支化聚合物的納米空腔內(nèi)部，同時(shí)在其外表面上引入旨在形成納米尺寸載體的合適官能團(tuán)，所述載體總體來說具有下述特征它們具有低的毒性或者無毒，它們在生物環(huán)境內(nèi)穩(wěn)定且它們擁有朝向特異細(xì)胞的靶向和輸送能力。
當(dāng)使用枝狀體或超支化聚合物作為基因材料的合適載體(用于基因傳輸)時(shí)，例如通過在枝狀體或超支化聚合物的端基處引入銨基、季銨或胍鎓離子，從而引入正電荷，用以粘接荷負(fù)電的基因材料(DNA、質(zhì)粒、寡聚核苷)，正如以下所述。
隨后，在枝狀體或超支化聚合物的表面上引入各種官能團(tuán)，和最終目的是在細(xì)胞核內(nèi)輸送基因材料。具體地說，選擇無毒的枝狀體或超支化聚合物，或者改性起始化合物，以便使之無毒和生物相容。
隨后，引入下述官能團(tuán)，所述官能團(tuán)i)使得DNA—載體的絡(luò)合物在生物環(huán)境內(nèi)穩(wěn)定，ii)提供靶向特異細(xì)胞或組織的性能，iii)有助于它們通過膜輸送，和iv)具有在胞飲作用之后從核內(nèi)體中釋放的能力。
如此形成的枝狀體或超支化聚合物與基因材料的絡(luò)合物最后可通過胞飲作用引入到細(xì)胞中。基因材料通過胞間過程最后進(jìn)入用于基因治療的核內(nèi)。
根據(jù)以下所述的方法實(shí)現(xiàn)全部這些性能，其中根據(jù)所述方法，合適地改性枝狀體或超支化聚合物的外部端基(按照公知的合成有機(jī)化學(xué)方法，在合適的一系列反應(yīng)中，分子設(shè)計(jì)枝狀體或超支化聚合物)，為的是實(shí)現(xiàn)a)用無毒，例如羥基、羧基或季銨基取代有毒的端基，例如氨基，b)在枝狀體或超支化聚合物的表面上引入各種分子量的聚合物鏈，例如聚(乙二醇)(PEG化)。如此保護(hù)聚合物，免遭有機(jī)物的MPS(單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng))。c.引入與細(xì)胞的受體互補(bǔ)的可識別基團(tuán)，例如胍鎓基，碳水化合物部分(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、葉酸或RGD受體、核堿部分(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸鹽基，以便提高載體的靶向能力。d.引入有助于通過細(xì)胞膜輸送載體和包封的活性藥物成分或基因的基團(tuán)，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚環(huán)氧丙烷部分?？梢牒烧姷牟糠?，如銨、季銨、胍鎓用以與基因材料(DNA、質(zhì)粒、寡聚核苷)形成絡(luò)合物。
可通過使用可商購的枝狀體或者超支化聚合物，實(shí)現(xiàn)這種多官能枝狀體的合成。圖4示出了例舉的實(shí)施例，該實(shí)施例表明了合成多官能枝狀體的步驟。
最初使枝狀體或超支化聚合物的外部氨基或羥基與帶有反應(yīng)性基團(tuán)，例如異氰酸酯、環(huán)氧化物或N-羥基琥珀酰亞胺部分的選擇分子量的聚(乙二醇)聚合物反應(yīng)。在這第一步之后，使所得枝狀體中殘留氨基的大部分例如與異氰酸乙酯反應(yīng)，以降低外表面上有毒伯氨基的存在。在第三步中，最后殘留的伯氨基可轉(zhuǎn)移到靶向基團(tuán)，例如胍鎓基上。在另一階段中，可引入有助于通過細(xì)胞膜輸送藥物載體以及包封的活性成分的基團(tuán)，例如寡聚精氨酸或聚精氨酸部分。在本發(fā)明的情況下，作為靶向配體引入的胍鎓基可有助于通過細(xì)胞膜輸送包封活性藥物成分的傳輸系統(tǒng)。要求陽離子化枝狀體或超支化聚合物以供荷負(fù)電的基因材料連接到枝狀聚合物上用以與將轉(zhuǎn)移到細(xì)胞上的基因材料形成各種穩(wěn)定的絡(luò)合物。
以上所述的反應(yīng)可在室溫下在含水介質(zhì)中進(jìn)行?？赏ㄟ^使副產(chǎn)物流經(jīng)半滲透膜，通過滲析進(jìn)行產(chǎn)物的純化。
可在本發(fā)明中使用的典型的枝狀體或超支化聚合物例如是對稱的二氨基丁烷聚(亞丙基亞氨基)枝狀體或不對稱的超支化聚合物，例如由縮聚琥珀酸酐、鄰苯二甲酸酐或四氫鄰苯二甲酸酐與二異丙胺得到的聚合物或者由陰離子聚合縮水甘油與1，1，1-三(羥甲基)丙烷而得到的聚合物。
可用作枝狀體的保護(hù)涂層的聚合物例如是具有各種分子量的聚乙二醇，所述聚乙二醇帶有與枝狀體或超支化聚合物反應(yīng)的活性基團(tuán)，例如異氰酸酯、環(huán)氧化物或N-羥基琥珀酰亞胺部分，例如使用平均分子量為5000的甲氧基聚(乙二醇)的異氰酸酯衍生物。
可通過與異氰酸烷酯或烷基環(huán)氧化物反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)有毒基團(tuán)，例如氨基的取代或反應(yīng)。后者使伯氨基轉(zhuǎn)化成仲氨基醇。在本發(fā)明中，優(yōu)選異氰酸乙酯，因?yàn)樗奖愕嘏c伯氨基反應(yīng)。
此外，為了引入靶向配體(在以上所述的實(shí)施例中是胍鎓基)，可使用1H-吡唑并-1-羧脒基(carboxamidine)鹽酸鹽，將所討論的枝狀體的外伯氨基轉(zhuǎn)化成這一基團(tuán)。胍鎓基以及寡聚和聚精氨酸部分有助于通過細(xì)胞膜輸送載體。對于基因傳輸應(yīng)用來說，圖5圖示了絡(luò)合物的制備及其輸送。
使用在水中完全不溶的親脂的生物活性化合物，例如戊酸倍他米松，進(jìn)行枝狀體用作藥物載體的實(shí)施例。發(fā)現(xiàn)，這些化合物在多官能團(tuán)枝狀體內(nèi)部增溶達(dá)14.5％。
它們受到聚(乙二醇)鏈(PEG)的保護(hù)，和它們具有胍鎓基作為靶向配體，所述胍鎓基使得該聚合物能靶向細(xì)胞或組織受體。還確立了甚至在酸性環(huán)境下，戊酸倍他米松保持包封在這些多官能枝狀體內(nèi)。然而，在添加NaCl水溶液的情況下，生物活性的皮質(zhì)類甾醇化合物從枝狀體的納米空腔中釋放(圖6)。
由于枝狀聚合物與類似的多官能超支化聚合物的共同的結(jié)構(gòu)特征，因此強(qiáng)烈希望后一聚合物顯示出與來自于多官能枝狀體的那些相類似或幾乎相同的作為藥物載體的行為和性能。圖7示出了基于可商購的聚合物，例如PG-s5，合成多官能的超支化聚合物的反應(yīng)流程。
在該說明書中，以下實(shí)施例提及的用量以摩爾計(jì)，除非另有說明。
實(shí)施例材料與方法在外表面上分別具有32和64個(gè)氨基的第4和5代二氨基丁烷聚(亞丙基亞胺)枝狀體(在以下的流程中-DAB-32和DAB-64用No.1表示，DSM Fine Chemicals)用作起始材料。
甲氧基聚(乙二醇)異氰酸酯(在以下的流程-MW5000中用No.2表示，ShearwaterPolymers，INC)、異氰酸乙酯(Aldrich)和1H-吡唑-1-羧脒基鹽酸鹽(Fluka)(在以下的流程中用No.3表示)用于枝狀聚合物的多官能化。
由意大利的EFFECHEM S.R.L.提供戊酸倍他米松(在以下的流程中用No.4表示)(它是一種親脂藥物)，和它用于包封和釋放研究。
縮水甘油基三甲基氯化銨(在以下的流程中用No.5表示)和葉酸(在以下的流程中用No.6表示)購于Flika。
超支化的聚醚多元醇(在以下的流程中-MW5000，PG5用No.7表示)購于Hyperpolymers GmbH且在親脂化之后使用。
以下流程中示出了以上所述的枝狀聚合物和堿性有機(jī)起始材料。
流程A枝狀體的多官能化實(shí)施例1步驟1.二氨基聚(亞丙基亞氨基)枝狀體0.001mol(它是第5代商購產(chǎn)品)(或任何其它代的產(chǎn)品)和0.004mol分子量為5000的甲氧基聚(乙二醇)異氰酸酯溶解在水中。在所得溶液中添加小量三乙胺水溶液，獲得pH＝13的溶液。在室溫下攪拌該溶液數(shù)小時(shí)。隨后通過經(jīng)半滲透膜滲析，純化該溶液24小時(shí)，為的是從反應(yīng)混合物中除去所有小分子量的雜質(zhì)。采用NMR光譜確定來自步驟1的在枝狀體內(nèi)引入的聚(乙二醇)部分。
1H NMR δ＝6.20和5.90(s，NHCONH)，3.55(s，OCH2CH2O)，3.25(s，OCH3)，3.15(m，CH2NHCONHCH2)，2.70(m，CH2NH2)，2.45(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH2，NCH2CH2CH2NH)，1.55(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH)，1.42(NH2).
13C NMR δ＝159.7(NHCONH)，71.5(OCH2CH2O)，58.5(OCH3)，53.5(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，51.2(NCH2CH2CH2NH2)，50.5(NCH2CH2CH2NHCO)，43.5(NHCONHCH2CH2)，42.4(NCH2CH2CH2NHCO)，39.5(CH2NH2)，30.4(CH2CH2NH2)，27.9(NCH2CH2CH2NHCO)，24.8(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N).
步驟2.向溶解在水內(nèi)的0.001moll中添加同樣溶解在水內(nèi)的0.052mol異氰酸酯乙酯。通過添加40％三甲胺水溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH到13。使該混合物在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(shí)，用截留值為12400的膜滲析，除去低分子量的化合物，和最后凍干，從而提供化合物II。通過H和NMR確立第二步的官能化。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝6.05(broad s，NHCONH)，3.50(s，OCH2CH2O)，3.25(s，OCH3)，3.05(m，CH2NHCONHCH2)，2.70(m，CH2NH2)，2.35(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH2，NCH2CH2CH2NH)，1.45(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH)，1.35(NH2)，0.98(t，CH3).
13C NMR(62.9MHz，D2O)δ＝159.7(NHCONH)，71.5(OCH2CH2O)，58.5(OCH3)，53.5(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，51.2(NCH2CH2CH2NH2)，50.5(NCH2CH2CH2NHCO)，43.5(NHCONHCH2CH2O)，42.4(NCH2CH2CH2NHCO)，39.5(CH2NH2)，37.8(NHCONHCH2CH3)，30.4(CH2CH2NH2)，27.9(NCH2CH2CH2NHCO)，24.8(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，14.8(CH3).
步驟3.向溶解在干燥DMF內(nèi)的0.001mol步驟1中制備的枝狀體中添加同樣溶解在干燥DMF內(nèi)的0.01mol1H-吡唑-1-羧脒基鹽酸鹽和0.01mol二異丙基乙胺。使反應(yīng)混合物在室溫下反應(yīng)過夜，和用二乙醚沉淀所得產(chǎn)物并離心。將固體化合物溶解在水中，并用截留值為12400的膜滲析。除去溶劑，和充分干燥剩余材料，從而提供化合物III。通過1H和13C NMR確立胍鎓基的引入。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝7.65(broad s，NH of guanidinium group)，6.95(broad s，NH2+)，6.05(broad s，NHCONH)，3.50(s，OCH2CH2O)，3.25(s，OCH3)，3.05(m，CH2NHCONHCH2，NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+)，2.35(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH)，1.45(m，NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2NH)，0.98(t，CH3).
13C NMR(62.9MHz，D2O)δ＝159.7(NHCONH)，157.2(NHC(NH2)2+)，71.5(OCH2CH2O)，58.5(OCH3)，53.5(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，50.5(NCH2CH2CH2NHCO，NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+)，43.5(NHCONHCH2CH2O)，42.4(NCH2CH2CH2NHCO)，42.2(NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+)，37.8(NHCONHCH2CH3)，28.2(NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+)，27.9(NCH2CH2CH2NHCO)，24.8(NCH2CH2CH2N，NCH2CH2CH2CH2N)，14.8(CH3).
實(shí)施例2步驟1.二氨基丁烷聚(亞丙基亞胺)枝狀體的季化。
如下所述進(jìn)行聚(亞丙基亞胺)枝狀體的部分季化向在10ml水內(nèi)的0.113mmolDAB-32(0.398g)溶液中添加1.938mmol縮水甘油基三甲基氯化銨(260pl)。使該混合物反應(yīng)過夜，然后用截留值為1200的膜相對于H2O滲析，以除去未反應(yīng)的環(huán)氧化物，并凍干。通過在D2O中記錄的1H和13C NMR光譜確立季銨的引入。在1H光譜中，在2.60、3.16、3.34和4.26ppm處，和在13C NMR光譜中，在55.1、56.9、67.4和71.8ppm處的預(yù)期的4個(gè)新信號的出現(xiàn)證明發(fā)生了季化。另外，在13C NMR光譜中，在28.0和49.5ppm處出現(xiàn)兩個(gè)新的信號，這對應(yīng)于相對于新形成的仲氨基的α和β亞甲基碳。根據(jù)對于在1.58ppm處的信號(對應(yīng)于連接到枝狀體的叔、仲和伯氨基上的所有β-亞甲基質(zhì)子)，在3.16ppm處的信號(對應(yīng)于季甲基質(zhì)子)的積分比，估計(jì)取代度。發(fā)現(xiàn)取代度為33％。
葉酸活性酯的合成這是一種不可商購的有機(jī)中間體，和它被要求用于下一步通過下述工序制備多官能枝狀體在氮?dú)夥諊?，使溶解?.5ml無水DMSO內(nèi)的葉酸0.594mmol與在1ml無水溶劑內(nèi)的0.595mmol TEA(82.5pl)和0.595mmol DCC(0.123g)反應(yīng)1小時(shí)。向該混合物中添加在1ml干燥DMSO內(nèi)的0.594mmolN-羥基琥珀酰亞胺，使之在惰性條件下反應(yīng)過夜。
通過過濾回收DCU，并在干燥中沉淀并通過過濾收集。真空干燥活性酯約2小時(shí)，然后用于與前面獲得的季化DAB-32反應(yīng)。
步驟2.引入葉酸到季化DAB-32上將前面制備的葉酸活性酯用作起始材料，用于根據(jù)下述工序?qū)⑷~酸靶向配體引入到枝狀體內(nèi)將在7ml無水DMSO內(nèi)的0.0137mmol季化DAB-32加入到溶解在1ml相同的干燥溶劑內(nèi)的0.0413mmol葉酸-NHS活性酯中。在5天的時(shí)間段之后，在干燥Et2O中沉淀該產(chǎn)物，首先相對于pH7.4的磷酸鹽緩沖液滲析，之后用截留值為1200的膜相對于H2O滲析并凍干。
在D2O中記錄1H和13C NMR光譜這二者。通過在8.6ppm處的特征信號(對應(yīng)于在喋呤環(huán)的位置7處的次甲基)，以及在6.7和7.7ppm處的兩個(gè)雙峰(對應(yīng)于芐環(huán)部分的芳族質(zhì)子)，從而證明葉酸的存在。根據(jù)在8.6ppm處的信號(對應(yīng)于在喋呤環(huán)的位置7處的質(zhì)子)與在4.54ppm處的信號(對應(yīng)于帶有縮水甘油基試劑的羥基中的次甲基，其來自于環(huán)氧環(huán)的開環(huán))的積分比，估計(jì)每一共軛物中葉酸分子的平均數(shù)。估計(jì)在枝狀體衍生物內(nèi)的葉酸酯殘基的平均數(shù)為3。此外，還使用消光系數(shù)值ζ280＝74620M-1cm-1，通過UV光譜在PBS(7.4)內(nèi)測定在這些枝狀體內(nèi)的葉酸酯的含量。通過13C NMR光譜進(jìn)一步證明這些結(jié)果。季化最終產(chǎn)物(引入陽離子電荷)，并通過靶向葉酸酯配體，從而官能化，同時(shí)其氨基(伯、仲和叔)也可在生物環(huán)境內(nèi)質(zhì)子化，從而顯示出緩沖能力。
B.超支化聚合物的官能化 聚甘油PG-5的PEG化向溶解在pH13.0三甲胺水溶液內(nèi)的在10ml水中的0.04094mmolPG-5溶液中，添加溶解在10ml水內(nèi)的1639mmol甲氧基聚(乙二醇)異氰酸酯。使該混合物在惰性氛圍下反應(yīng)約4小時(shí)，用截留值為12400的膜滲析，除去未反應(yīng)的聚合物和PEG-異氰酸酯，最后凍干并真空干燥，得到PEG化的PG5。
在D2O中記錄1H和13C NMR光譜。在3.32ppm處出現(xiàn)的信號(對應(yīng)于該試劑中的端甲基)，以及在3.25ppm處的信號(對應(yīng)于相對于酰胺鍵(CONHCH2-)的CH2質(zhì)子)證明引入了PEG部分。還通過13C NMR光譜確立PEG化的超支化聚合物多元醇的形成。根據(jù)在3.24ppm處的信號(對應(yīng)于相對于酰胺鍵(CONHCH2-)的CH2質(zhì)子)與在0.82ppm處的信號(對應(yīng)于核心部分的甲基)的積分比，估計(jì)取代度。每一聚合物中m-PEG的平均數(shù)為2。
合成NH2-PEG-葉酸酯通過在含1摩爾當(dāng)量二環(huán)己基碳二亞胺和吡啶的干燥二甲亞砜內(nèi)，使聚氧亞乙基雙胺(Nektar，MW3400)與等摩爾量的葉酸反應(yīng)，合成NH2-PEG-葉酸酯。在室溫下在暗處攪拌反應(yīng)混合物過夜。在反應(yīng)最后，添加雙倍體積的水，和通過離心過濾不溶副產(chǎn)物，二環(huán)己基脲。然后相對于5mM的NaHCO3緩沖液(pH9.0)，然后相對于去離子水，滲析上清液，除去混合物中未反應(yīng)的葉酸(截留值1200)。然后通過用過量5mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)預(yù)洗滌的纖維素磷酸鹽陽離子交換樹脂分批吸收，除去痕量未反應(yīng)的聚氧亞乙基雙胺。再次相對于水滲析產(chǎn)物NH2-PEG-葉酸酯，凍干，并在D2O中記錄1H和13C NMR光譜。通過在產(chǎn)物內(nèi)，在1H光譜中，在8.64ppm處的特征信號(對應(yīng)于在喋呤環(huán)的位置7處的次甲基)以及在6.74和7.60ppm處的兩個(gè)雙峰(對應(yīng)于芐基部分的芳族質(zhì)子)，證明葉酸的存在。根據(jù)在8.64ppm處的信號與在3.15ppm處的信號(對應(yīng)于與其余氨基相鄰的α-亞甲基)的積分比，估計(jì)每一共軛物中葉酸分子的平均數(shù)。根據(jù)13CNMR光譜，通過其在30.4ppm處的α-亞甲基信號被在32.6ppm處的新信號取代，說明僅僅葉酸中的y-羧基反應(yīng)。
合成PG5-PEG-葉酸酯通過在略微升高的溫度下，使聚甘油PG-5與過量的琥珀酸酐在DMF中反應(yīng)過夜，以便實(shí)現(xiàn)5-10％的聚甘油羥基反應(yīng)，從而合成PG5-PEG-葉酸酯。相對于水滲析反應(yīng)產(chǎn)物，和通過1H和13C NMR實(shí)驗(yàn)證明其結(jié)構(gòu)。在1H光譜中，在2.5和2.6ppm處出現(xiàn)兩個(gè)新的信號，這兩個(gè)信號分別對應(yīng)于新形成的酯鍵中的α-和3-亞甲基。另外，如上所述，在干燥DMF中，和在二環(huán)己基碳二亞胺和吡啶存在下，通過使NH2-PEG-葉酸酯與改性的聚甘油PG5反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)酰胺鍵的形成。相對于水滲析反應(yīng)產(chǎn)物(截留值為5000)，和再次通過1H和13C NMR實(shí)驗(yàn)證明葉酸酯的引入。通過在1H光譜中，在8.64ppm處的特征信號證明在超支化聚合物上存在PEG-葉酸酯。根據(jù)在8.64ppm處的信號與在0.82ppm處的信號(對應(yīng)于在聚合物的核心基團(tuán)上的甲基)的積分比，估計(jì)每一共軛物中葉酸分子的平均數(shù)。此外，還使用消光系數(shù)值ζ280＝74620M-1cm-1，在PBS(pH7.4)內(nèi)，通過定量UV光譜測定共軛物中分子內(nèi)的葉酸酯含量。
倍他米松衍生物的包封和釋放采用下述方法進(jìn)行在實(shí)施例1中制備的多官能枝狀體內(nèi)倍他米松衍生物的包封在氯仿/甲醇的混合物內(nèi)溶解枝狀體和戊酸倍他米松衍生物。在蒸餾溶劑之后，獲得薄膜，所述薄膜可在水中分散。具有包封化合物的枝狀體在水相中，而非包封的物質(zhì)仍然不溶于水，并通過離心除去。表1給出了在多官能枝狀體內(nèi)包封的戊酸倍他米松的百分?jǐn)?shù)。為了比較，包括來自包封例如苝，一種公知的探針的數(shù)據(jù)。
表1.苝(PY)和戊酸倍他米松(BV)在母體和多官能枝狀體內(nèi)的溶解度比較

采用逐滴添加氯化鈉水溶液，實(shí)現(xiàn)例如戊酸倍他米松的釋放(圖6)。觀察到一旦添加0.8M的氯化鈉，生物活性的化合物幾乎完全從多官能的枝狀體中釋放。
攜帶基因材料的多官能枝狀體的制備將正電荷的多官能枝狀體加入到質(zhì)粒DNA(3-7mg)中，以便在各種介質(zhì)如天然血清、300mM氯化鈉水溶液、RPMI-1640中，枝狀體對DNA的電荷比為3.5∶1至8.5∶1。
術(shù)語“包括”、“含”及其各種變體，當(dāng)在說明書和權(quán)利要求書中使用時(shí)，是指包括特定的特征、步驟、組分或整數(shù)。該術(shù)語不應(yīng)當(dāng)解釋為排除存在其它特征、步驟、組分或整數(shù)。
在前述說明書或者下述權(quán)利要求或者附圖中披露的特征(用其具體形式或者用實(shí)現(xiàn)所披露的功能的手段，或者達(dá)到所披露的結(jié)果的方法或工藝的方式表達(dá))，可獨(dú)立地或者以這些特征的任何結(jié)合方式，用于實(shí)現(xiàn)各種形式的本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種具有對稱的化學(xué)結(jié)構(gòu)的枝狀聚合物或者非對稱的超支化聚合物，其特征在于改性該聚合物，以便包括能形成3或更多個(gè)化學(xué)鍵的至少一個(gè)化學(xué)元素的原子；鍵合到所述至少一個(gè)原子上的各種不同的端基官能團(tuán)，所述端基官能團(tuán)全部a)具有低的毒性或根本沒有毒性，b)使得可從細(xì)胞的互補(bǔ)受體中識別上述聚合物的分子，c)使得聚合物在生物環(huán)境內(nèi)穩(wěn)定，和d)有助于所述聚合物通過細(xì)胞膜輸送。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的枝狀聚合物或者超支化的非對稱聚合物，其中陽離子化該聚合物用以與DNA形成絡(luò)合物，當(dāng)所述化合物將成為基因材料的載體時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的枝狀聚合物或者超支化的非對稱聚合物，其中通過在該枝狀體的端基上引入銨、季銨或胍鎓基，從而陽離子化該聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的枝狀聚合物或者超支化的非對稱聚合物，其中能形成3或更多個(gè)化學(xué)鍵的化學(xué)元素的原子是氮、碳或硅。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的改性的枝狀聚合物，它是二氨基丁烷聚(亞丙基亞氨基)枝狀體(DAB)或者PAMAM枝狀體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的改性的超支化的非對稱聚合物，其中超支化聚合物衍生于縮聚酸酐，例如琥珀酸酐、鄰苯二甲酸酐或四氫鄰苯二甲酸酐，與二烷胺，例如二異丙胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的改性的超支化的非對稱聚合物，其中超支化聚合物衍生于陰離子聚合環(huán)氧衍生物與1，1，1-三(羥烷基)丙烷。
8.權(quán)利要求1的改性的超支化的非對稱聚合物，其中超支化聚合物衍生于陰離子聚合縮水甘油與1，1，1-三(羥甲基)丙烷(PG-5)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)的改性的枝狀聚合物或者改性的超支化的非對稱聚合物，其中官能團(tuán)包括在枝狀聚合物或者超支化聚合物，例如聚(亞烷基二醇)和優(yōu)選聚(乙二醇)的表面上的各種分子量的聚合物鏈。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)的改性的枝狀聚合物或者改性的超支化的非對稱聚合物，其中官能團(tuán)包括與細(xì)胞的受體位點(diǎn)互補(bǔ)的至少一個(gè)基團(tuán)，例如胍鎓基、碳水化合物(例如甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、葉酸、RGD受體、堿基(如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)的改性的枝狀聚合物或者改性的超支化的非對稱聚合物，其中官能團(tuán)包括有助于通過細(xì)胞膜輸送枝狀聚合物或改性的超支化聚合物與任何包封的活性藥物成分或基因材料的至少一種基團(tuán)，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚環(huán)氧丙烷部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)的改性的枝狀聚合物或者改性的超支化的非對稱聚合物，其中官能團(tuán)包括至少一種靶向配體，例如胍鎓基，碳水化合物(例如甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、葉酸、RGD受體、堿基(如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胍、胞嘧啶)或巴比妥酸鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任何一項(xiàng)的枝狀聚合物或者超支化的非對稱聚合物，它包括包封的生物活性的藥物化合物或者攜載基因材料。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12任何一項(xiàng)的枝狀聚合物或者超支化的非對稱聚合物，其中生物活性的藥物化合物是倍他米松或倍他米松衍生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任何一項(xiàng)的多官能的枝狀體或超支化聚合物的合成方法，其特征在于分階段改性這些聚合物的表面，其中包括a.用羥基、羧基或季銨基，或其它無毒基團(tuán)取代表面上的氨基或其它有毒基團(tuán)，b.在枝狀載體或超支化聚合物，例如聚(乙二醇)的表面上引入各種分子量的聚合物鏈(PEG化)，以便保護(hù)聚合物免遭有機(jī)體的MPS(單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng))，c.引入與受體或組織互補(bǔ)的可識別基團(tuán)，即胍鎓基，碳水化合物部分(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)、葉酸或RGD受體、核堿部分(腺嘌呤-胸腺嘧啶、胍-胞嘧啶)或巴比妥酸鹽，以便提高載體的靶向能力，和d.引入有助于通過細(xì)胞膜輸送載體和包封的活性藥物化合物的基團(tuán)，如胍鎓部分、寡聚精氨酸或聚精氨酸衍生物或聚環(huán)氧丙烷部分。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的合成方法，其中進(jìn)行枝狀體或超支化聚合物的外部氨基或羥基與合適的保護(hù)聚合物的起始反應(yīng)，所述保護(hù)聚合物在一端帶有反應(yīng)性基團(tuán)，如異氰酸酯、環(huán)氧化物或N-羥基琥珀酰亞胺；隨后進(jìn)行所得聚合物的最大部分的氨基與異氰酸乙酯的反應(yīng)，用以取代有毒的氨基；隨后使前面所得聚合物反應(yīng)，用以將氨基轉(zhuǎn)變成可識別基團(tuán)如胍鎓基；隨后引入有助于通過細(xì)胞膜輸送載體的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)，如聚精氨酸或環(huán)氧丙烷鏈。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的合成方法，其特征在于，陽離子化所述聚合物用以與DNA形成絡(luò)合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17任何一項(xiàng)的合成方法，其特征在于，當(dāng)表面的有毒基團(tuán)是氨基時(shí)，引入具有小于8個(gè)碳原子，優(yōu)選2或3個(gè)碳原子的[小]脂族鏈以供取代。
19.一種藥物配方，其特征在于它包括包封在權(quán)利要求1-14任何一項(xiàng)的改性的多官能枝狀或改性的多官能超支化的非對稱聚合物內(nèi)的生物活性的藥物化合物或基因材料。
20.一種生產(chǎn)藥物配方用以輸送生物活性的藥物化合物或基因材料的方法，該方法包括合成權(quán)利要求15-18任何一項(xiàng)的聚合物，和用其包封生物活性的藥物化合物或基因材料。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-14任何一項(xiàng)的改性的枝狀聚合物或者改性的超支化的非對稱的聚合物，它包括包封的生物活性藥物化合物或者攜載用于治療的基因材料。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-14任何一項(xiàng)的改性的枝狀聚合物或者改性的超支化的非對稱的聚合物用于制造藥物劑型的用途，它包括包封的生物活性藥物化合物或者攜載用于治療的基因材料。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-14任何一項(xiàng)的改性的枝狀聚合物或者改性的超支化的非對稱的聚合物在制造治療與包封的生物活性藥物化合物或基因材料相同疾病或病況的藥物中的用途，它包括該化合物或者攜載基因材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作生物活性的藥物化合物的藥物傳輸系統(tǒng)和基因傳輸系統(tǒng)(基因材料的載體)的多官能的枝狀和超支化聚合物的合成，其中后者通過與基因材料縮合。具體地說，本發(fā)明涉及基于在其表面上引入官能團(tuán)X、Y、Z的合適的枝狀或超支化聚合物的多官能的化合物的合成。另外，為了基因傳輸?shù)郊?xì)胞上，這些多官能系統(tǒng)將變?yōu)殛栯x子系統(tǒng)用于與荷負(fù)電的基因材料形成絡(luò)合物。該官能團(tuán)使得該傳輸系統(tǒng)可被互補(bǔ)的細(xì)胞受體識別。此外，它們使得該系統(tǒng)在生物環(huán)境內(nèi)穩(wěn)定且有助于其通過細(xì)胞膜輸送。
文檔編號A61K47/48GK1747988SQ200480004047
公開日2006年3月15日 申請日期2004年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月13日
發(fā)明者康斯坦提納斯·帕里奧斯, 第密特洛斯·查瓦斯, 奧利奧茲里·賽德雷托 申請人:“德默克里托斯”國家科學(xué)研究中心, 康斯坦提納斯·帕里奧斯, 第密特洛斯·查瓦斯, 奧利奧茲里·賽德雷托