專利名稱：羽扇豆球蛋白用于治療Ⅱ型糖尿病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及羽扇豆球蛋白用于治療II型糖尿病的用途。
背景技術(shù)：
羽扇豆(Lupinus albus)是豆科一年生草本植物，自古以來它就生長在地中海和中東地區(qū)，它的種子既可以用于營養(yǎng)目的(由于它們不同尋常的蛋白質(zhì)含量)又可以在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中用作驅(qū)蟲藥和抗寄生物藥。
羽扇豆的種子含有毒性喹諾里西啶環(huán)(quinolizidine)類生物堿如白羽扇豆堿、13-氧-白羽扇豆堿、薔薇苷及其衍生物以及甲基-白羽扇豆賓(albin)，已知它們可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生致抑郁和致麻痹的作用。所述生物堿可通過在水中浸漬而除去，它們是羽扇豆種子苦味的來源，在野生的羽扇豆種子中大量存在，但是在所謂的甜羽扇豆(Lupinus albus)中含量卻很少。
羽扇豆種子中含量最高的蛋白質(zhì)成分是球蛋白，占總蛋白含量的87％。所述成分包括可溶于稀生理鹽水的水溶性蛋白質(zhì)(Duranti等，Phytochemistry，20，2071-2075，1981)。羽扇豆球蛋白γ約占總球蛋白的6％。由凝膠濾過法測定的蛋白質(zhì)表觀分子量約為199,000Da(Duranti等，凝集素生物學(xué)、生物化學(xué)、臨床-生物化學(xué)-第十一卷(Van Driesche E，Rouge P，Beeckams S，Bog-Hahsen TC編)1997，Textop Publ.，Hellerup，Denmark，pp.881-85，1997中)。羽扇豆球蛋白γ由表觀分子量為47,000Da的單體組成。將該單體還原的結(jié)果表明它由兩條通過一個二硫鍵橋相連的多肽鏈組成，表觀分子量分別為30,000Da和17,000Da(Restani等，Phytochemistry，20，2077-2083，1981)。
在天然條件下和變性條件下獲得的分子質(zhì)量值已表明羽扇豆球蛋白γ具有四聚體結(jié)構(gòu)。已發(fā)現(xiàn)羽扇豆球蛋白γ的輕亞基不含有共價鍵合的碳水化合物，而重鏈則是糖基化的。
它的氨基酸組成與大多數(shù)羽扇豆儲備蛋白顯著不同(Restani等，1981，同上)。實(shí)際上，羽扇豆球蛋白γ含有許多硫酸化的氨基酸和相當(dāng)數(shù)量的賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸，已證明它對內(nèi)源性和外源性蛋白酶的蛋白水解作用具有很強(qiáng)的抵抗力(Duranti，Narhung，30，271-274，1986)。
對于該蛋白氨基酸序列的認(rèn)識(Scarafoni等，Biochim.Biophys.Acta1519，147-151，2001)使得我們可以排除它與儲備蛋白、催化蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白以及其它來源的蛋白的任何序列同源性。羽扇豆球蛋白γ顯示出與其它蛋白如大豆BG7S(70％同源性)(Kagawa等，F(xiàn)ebs Letters，226，145-149，1987；Komatsu等，Biosci.Biotech.Biochem.58，1705-1706，1994)和功能尚待澄清的胡蘿卜種子中的糖蛋白EDGP(58％同源性)(Satoh等，Planta，188，432-438，1992)具有同源性或相似性。
Horvath描述了羽扇豆全提取物用于降血糖的用途(J.Pharmacol.(Amer.)，38，303，1930)，并提出在輕度至中度糖尿病中用它來代替胰島素。隨后Clementi和Torrisi(Boll.Soc.It.Biol.Sper.，9，1004，1935e Arch.Fisiol.，34，290，1935)鑒定了生物堿白羽扇豆堿中的降血糖活性成分，但是它的作用卻很短暫。
最近Mario Villaroel等在Archivos Latinoamericanos de Nutrición，Vol.46，N.3，1996，pp.234-237中也描述了羽扇豆粉的降血糖作用，該文表明含有羽扇豆粉的李子醬可以用于糖尿病患者的食物療法中。
就羽扇豆球蛋白γ而言，Duranti等(Phytochem.56(6)，529-533，2001)描述了它與不同金屬的相互作用能力。在中性pH中，羽扇豆球蛋白γ與Zn2+離子的親和力最強(qiáng)。而且，羽扇豆球蛋白γ還與復(fù)合了Zn2+和Ni2+的親和色譜柱相結(jié)合；結(jié)合的蛋白可以使用pH低于6或含有EDTA或咪唑的緩沖試劑洗脫。羽扇豆球蛋白γ在金屬親和柱中的保留曲線與組氨酸側(cè)基(pKa＝6)的滴定曲線一致。
然而迄今為止，尚未見羽扇豆球蛋白γ用于治療II型糖尿病的報道。
根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)羽扇豆球蛋白γ以及與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質(zhì)可產(chǎn)生顯著的降血糖作用。
與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的已知蛋白質(zhì)的實(shí)例有大豆BG7S(70％同源性)(Kagawa等，F(xiàn)ebs Letters，226，145-149，1987；Komatsu等，Biosci.Biotech.Biochem.58，1705-1706，1994)和EDGP(58％同源性)(Satoh等，Planta，188，432-438，1992)。
還證明對大鼠施用葡萄糖后，羽扇豆球蛋白γ和同源蛋白具有很強(qiáng)的降低血漿曲線作用。
因此本發(fā)明涉及羽扇豆球蛋白γ以及與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質(zhì)用于制備治療II型糖尿病的藥物、食品補(bǔ)充劑或食品的用途。
本發(fā)明還涉及含有羽扇豆球蛋白γ或與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質(zhì)的藥物組合物或營養(yǎng)組合物。
羽扇豆球蛋白γ優(yōu)選基本上純凈的蛋白質(zhì)或含有所述羽扇豆球蛋白γ的羽扇豆蛋白的混合物或提取物?；旧霞儍羰侵笣舛韧ǔ?yīng)高于80重量％，優(yōu)選高于90％。
羽扇豆球蛋白γ可通過圖3所示的工藝獲得。
根據(jù)所述方法，將羽扇豆壓碎，將核仁去皮并制成薄片，用溶劑提取去油。然后將已去油的薄片在酸性條件下通過提取步驟A獲得提余物A和酸性提取物A，再進(jìn)行進(jìn)一步處理。
從提余物A開始，進(jìn)行以下步驟B)在輕度堿性條件下對提余物A連續(xù)進(jìn)行兩次提取，獲得提余物B和提取物B，棄去提余物B；C)用酸處理提取物B以沉降蛋白質(zhì)；D)將蛋白質(zhì)分離，除去固體蛋白質(zhì)，澄清上清液(SP)待用于后續(xù)步驟。
同時從酸提取步驟A得到的酸性提取物A開始，進(jìn)行以下步驟
E)凈化提取物A，獲得澄清的提取物(AEP)；F1)對AEP進(jìn)行超濾，獲得F1-滲余物；F2)對合并SP和F1-滲余物所得的混合物進(jìn)行透析過濾，獲得滲余物DFP和F2-滲透物(棄去)；G)將DFP進(jìn)行巴斯德滅菌和噴霧干燥后獲得NCGP(天然羽扇豆球蛋白γ)。
以下報告了羽扇豆球蛋白γ的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
在大鼠中與二甲雙胍(對照標(biāo)準(zhǔn)品)相比較測試了羽扇豆球蛋白γ的降血糖活性。
實(shí)施例1使用起始體重為275-300g的雄性CD種大鼠。將動物飼養(yǎng)于?？寺』\中，環(huán)境中具有自動控制的燈光(12小時光照/12小時黑暗)，溫度(21±1℃)，濕度(60±5％)。
羽扇豆球蛋白γ通過實(shí)施例2中報告的方法制備。向100只大鼠(分為5組，每組20只)預(yù)先施用(時間-30分鐘)以下物質(zhì)第1組載體(1％羧甲基纖維素[CMC]；2ml/kg口服)第2組羽扇豆球蛋白γ(50mg/kg口服，在1％CMC中的溶液)第3組羽扇豆球蛋白γ(100mg/kg口服，在1％CMC中的溶液)第4組羽扇豆球蛋白γ(200mg/kg口服，在1％CMC中的溶液)第5組二甲雙胍(50mg/kg口服，在1％CMC中的溶液)隨后以口服途徑給予(時間0分鐘)全部大鼠葡萄糖(2g/kg)以升高血糖水平。
在臨施用葡萄糖之前(時間0分鐘)和施用葡萄糖之后30、60和90分鐘處，用戊硫巴比妥鈉(50mg/kg腹膜內(nèi)注射)將全部動物(每個時間點(diǎn)n＝5只大鼠)麻醉并從腔靜脈取5ml血。將血樣收集于含有抗凝血劑EDTA(7.5mM)的注射器中，立即離心(在4℃下，2000g×10min)以獲得葡萄糖酶定量所需要的血漿。
大鼠血漿中葡萄糖的定量通過酶測定法(505nm處的吸光度)一式三份地進(jìn)行，葡萄糖濃度表達(dá)為mg/dl。
更精確地講，使用含有Trinder反應(yīng)(葡萄糖氧化酶法)所必需的全部試劑的酶試劑盒(來自Sigma Aldrich的Glucose-Trinder，目錄號315-500)。
此外，分光光度計(jì)的校正和對不同血漿樣品的讀取質(zhì)量使用Sigma-Aldrich的標(biāo)準(zhǔn)試劑(Calibrator，目錄號A-2539；ACCUTROLNormal，目錄號A-2034；ACCUTROL Abnormal，目錄號A-3034)驗(yàn)證。所使用的羽扇豆球蛋白γ來自于實(shí)施例2。二甲雙胍、羧甲基纖維素及用于葡萄糖定量、質(zhì)量控制和儀器校正的各種試劑盒均購買于Sigma-Aldrich(意大利米蘭)。
表中報告的數(shù)值均表達(dá)為平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(M.S.E)。使用曲線(圖2)下面積值進(jìn)行第1組(接受載體的大鼠)與第2、3、4和5組(接受不同濃度羽扇豆球蛋白γ或二甲雙胍的動物)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，首先進(jìn)行方差分析(單向)，然后進(jìn)行多重比較的Dunnett檢驗(yàn)(雙側(cè))。當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異是顯著的。
結(jié)果

圖1和圖2概括了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
口服給予2g/kg葡萄糖使對照組大鼠(載體)的血漿葡萄糖水平升高了2.7倍(從85±6達(dá)到232±18mg/dl；P＜0.001)。所述的升高在給予葡萄糖后30分鐘達(dá)到峰值，在隨后的90分鐘內(nèi)逐漸降低(圖1)。
在給予大鼠葡萄糖之前30分鐘，預(yù)先口服施用劑量為50、100和200mg/kg的羽扇豆球蛋白γ引起血漿葡萄糖水平顯著降低，而且這種降低作用具有劑量依賴性(圖1和圖2)。
更具體地講，從圖2中報告的曲線下面積(AUC)值中可以看出，口服200mg/kg的羽扇豆球蛋白γ的作用(AUC＝2090±238)與第5組(向動物預(yù)先口服施用50mg/kg的二甲雙胍)中觀察到的效果(AUC＝1565±201)沒有顯著差異。
所得結(jié)果表明向大鼠預(yù)先施用羽扇豆球蛋白γ可以顯著降低口服給予2g/kg葡萄糖后升高的血漿葡萄糖水平。
實(shí)施例2羽扇豆薄片的制備將約4500kg的羽扇豆壓碎，將核皮與核仁分離得到3440kg核仁和1060kg核皮。將核仁壓碎后用軋制機(jī)制成薄片，為防止蛋白質(zhì)變性，將滾筒溫度保持在40℃以下。得黃色盤狀薄片，堆積密度為300至330kg/m3。
除去油分將步驟a)所得的薄片按每批500kg裝入直徑為900mm的直立管子中，填充高度不高于2m，用己烷浸濾去油。
將抽提操作重復(fù)4次，其包括以下步驟1)用純己烷(white hexane)浸濾直至接收罐中回收的混合物達(dá)500l為止，2)將混合物再循環(huán)15分鐘，3)在第1至3次，使液體部分排放15分鐘，在最后一次抽提步驟中，排放30分鐘。
將已去油的薄片在真空(250mbar)下攪拌150分鐘，以除去其中仍存在的己烷，至己烷終含量為250ppm后，吹入空氣使之降至50ppm。得到約430kg的白色薄片。
A)在酸性條件下提取蛋白質(zhì)在13.5至15.2℃下，將185kg白色薄片懸浮于1800l pH4.5-4.8的冷的酸性水中，將機(jī)械攪拌速率調(diào)至55rpm提取1小時。整個提取過程中大約使用了23.6l 3M的HCl來保持酸性pH。離心后得到385kg提余物A和1600l酸性提取物A。
B)在輕度堿性條件下從提余物中分離蛋白質(zhì)提取物第一步，在28.2至31.5℃下將385kg提余物A用900l pH7.2-7.4的水提取，以速度60rpm機(jī)械攪拌1小時。向溶液中加入50ml消泡劑Struktol SB 2010。整個提取過程中使用了大約19.6l 3M的NaOH來保持堿性pH。
離心后從提余物中獲得約945l蛋白提取物。
第二步，在29.0至32.0℃下，將離心后獲得的提余物用540l pH7.3-7.4的水提取15分鐘。整個提取過程中使用了0.3l 3M的NaOH來保持堿性pH。獲得約595l蛋白提取物II和242kg提余物B。
合并蛋白提取物I和II得到1450l蛋白提取物B。
C)在酸性條件下從蛋白提取物中沉淀蛋白質(zhì)向蛋白提取物B(1540l)中加入16l 3M的HCl將pH調(diào)至4.6-4.5，加入50ml上述的消泡劑，機(jī)械攪拌速率為85rpm。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)析出(pH4.5)。
D)使沉淀的蛋白與上清液分離步驟C)中的蛋白質(zhì)分散體(約1550l)中的固體含量為11.0至11.5體積％，將其用盤式分離器以6830rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行分離。所得的澄清提取物中的固體含量為0.0至0.1體積％。分離出約1330l澄清上清液(SP)和213l的淤渣。澄清上清液中的干物質(zhì)含量為0.4-0.5％，而干物質(zhì)含有70％的總蛋白。
E)凈化酸性提取物A來自于酸性提取過程A的酸性提取物A(1600l)中的干物質(zhì)含量在2至2.5體積％范圍內(nèi)，用盤式分離器以7,500rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行分離。所得的澄清提取物中固體的含量在0.1至0.15體積％之間。分離得到約1500l澄清提取物(AEP)和100l淤渣。澄清提取物(AEP)中的固體含量為2.2-2.5體積％，干物質(zhì)含有25％的總蛋白。
F1)超濾澄清提取物(AEP)將700l AEP由pH4.5調(diào)至pH6.0-7.0，在壓力3巴、40℃下，經(jīng)膜超濾作用濃縮直至終體積減少為起始體積的十分之一。
F1-滲余物的干物質(zhì)含量約為7％，干物質(zhì)含有50％的總蛋白。棄去F1-滲透物。
F2)透析過濾SP和AEP將來自于步驟D)的233l澄清上清液(SP)逐步加入F1-滲余物中，將混合物在膜中再循環(huán)直至體積減少至與滲余物的起始體積相同。在最后的稀釋步驟之后，將混合物繼續(xù)再循環(huán)直至透析過濾的滲余物(DFP)中的干物質(zhì)含量達(dá)到最高水平，即14.5至15.0％之間，干物質(zhì)含有約84％的總蛋白。棄去F2-滲透物。
G)巴斯德滅菌和噴霧干燥，獲得NCGP將透析過濾的滲余物(DFP)從pH6.5調(diào)至pH約為5.2，在熱交換器中加熱至40-65℃然后進(jìn)料至噴霧干燥器中，熱交換器含有一個加套的導(dǎo)管，導(dǎo)管的內(nèi)徑為6mm。進(jìn)氣口的溫度調(diào)至195℃，DFP的進(jìn)料速率為每小時8至10l。使用旋風(fēng)分離器將干燥粉末從氣流中分離出來。干物質(zhì)的含量在94.0至95.2％之間。從40l的DFP中可得到大約4.5kg的天然羽扇豆球蛋白γ(NCGP)。
根據(jù)該工藝制備的羽扇豆球蛋白γ含有約84.7％的蛋白質(zhì)、0.6％的油和6.4％的干物質(zhì)。干物質(zhì)中含有計(jì)算量的8.3％的不含氮的物質(zhì)(NFE)。在pH7時，NCGP在1％水溶液中的氮可溶性指數(shù)為72.5％。
根據(jù)本發(fā)明，羽扇豆球蛋白γ將以口服途徑施用，可單獨(dú)施用或與其它具有有益活性或互補(bǔ)活性的物質(zhì)一同施用，可制備成片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、糖漿劑等。藥物制劑可以通過傳統(tǒng)方法制備，使用該技術(shù)中已知的成分，例如賦形劑、配體、崩解劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑等。劑量隨癥狀、患者體重、疾病嚴(yán)重程度等的不同而不同。在成年人類患者的情況下，羽扇豆球蛋白γ每天的總劑量將在150至750mg之間，優(yōu)選50至250mg，單劑量或多劑量給藥，如每天一至三次。
權(quán)利要求
1.羽扇豆球蛋白γ或與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質(zhì)用于制備治療II型糖尿病的藥物、食品補(bǔ)充劑或食品的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的羽扇豆球蛋白γ的用途。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質(zhì)選自大豆BG7S或胡蘿卜EDGP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的含有羽扇豆球蛋白γ的羽扇豆蛋白質(zhì)混合物或提取物的用途。
5.含有羽扇豆球蛋白γ或與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質(zhì)作為活性成分的藥物組合物或營養(yǎng)組合物。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物或營養(yǎng)組合物，其包含含有羽扇豆球蛋白γ的羽扇豆蛋白質(zhì)的混合物或提取物。
7.作為治療劑的羽扇豆球蛋白γ。
8.作為降血糖劑的羽扇豆球蛋白γ。
全文摘要
本發(fā)明公開了羽扇豆球蛋白γ或與羽扇豆球蛋白γ具有50％以上同源性的蛋白質(zhì)用于制備治療II型糖尿病的藥物、食品補(bǔ)充劑或食品的用途，含有羽扇豆球蛋白γ的藥物組合物或營養(yǎng)組合物，羽扇豆球蛋白γ作為治療劑、特別是作為降血糖劑的用途。羽扇豆球蛋白γ可以以純凈的形式或以提取物、混合物或濃縮物的形式使用。
文檔編號A61K36/23GK1747739SQ200480003911
公開日2006年3月15日 申請日期2004年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月11日
發(fā)明者P·莫拉佐尼, M·杜蘭蒂 申請人:因德納有限公司