專(zhuān)利名稱(chēng)：超聲造影劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備可用于制備含有用于診斷造影的造影劑的氣體的干燥或凍干制劑，以及制備所述含造影劑的氣體的方法。
本發(fā)明還包括了通過(guò)此方法制備的干燥制劑，該制劑可被重建從而形成用于診斷造影的造影劑。本發(fā)明進(jìn)一步還包括了使用本發(fā)明干燥制劑和包容器或含有本發(fā)明干燥制劑的兩個(gè)組分的試劑盒而制備的充滿(mǎn)微氣泡的可用于診斷造影的氣體混懸液。
背景技術(shù)：
近年來(lái)超聲造影劑的迅速發(fā)展已孕育出了很多不同的制劑，它們可用于人體或動(dòng)物體的器官和組織的超聲造影。這些造影劑主要是聯(lián)合使用醫(yī)學(xué)回波描記儀器而用于靜脈或動(dòng)脈內(nèi)注射，所述儀器可用于例如，B-型造影成像(基于反散射組織特性的空間分布)或多普勒信號(hào)處理(基于連續(xù)波或超聲回波的脈沖多普勒處理從而測(cè)定血液或液體流動(dòng)參數(shù))。
用作超聲造影劑的一組注射用制劑包括具有幾微米直徑分散于水溶性介質(zhì)的氣泡混懸液。
在載體液體中使用氣泡混懸液作為有效的超聲反射物在本領(lǐng)域中是熟知的。微氣泡混懸液作為增強(qiáng)超聲成像的超聲藥物的發(fā)展是隨早期的觀測(cè)結(jié)果而起，即水性溶液的快速靜脈注射可導(dǎo)致溶解氣體通過(guò)形成氣泡而逃逸出溶液。由于它們參照血液的聲阻抗存在實(shí)質(zhì)性差異，因此發(fā)現(xiàn)這些血管內(nèi)氣泡是極好的超聲反射物。將氣泡在載體液體中的混懸液注射到活體血液中會(huì)大大增強(qiáng)超聲回波描記成像，從而增強(qiáng)內(nèi)部器官的顯像。由于器官和深在組織的成像對(duì)確立醫(yī)療診斷具有決定性作用，因此現(xiàn)已作出很多努力以開(kāi)發(fā)易于制備和給藥，包含最小量惰性物質(zhì)并能長(zhǎng)期保藏和分布單一的高濃度氣泡的穩(wěn)定混懸液。
然而，由于游離氣泡通常不夠穩(wěn)定從而不能用作超聲造影劑，因此這些氣泡在水性介質(zhì)中的單一分散具有有限的現(xiàn)實(shí)意義。
因此，例如利用乳化劑、油、增稠劑或糖或通過(guò)將氣體及其前體包封或包囊到各種體系中，從而穩(wěn)定用于回波描記術(shù)及其他超聲研究的氣泡的方法也具有意義。本領(lǐng)域中通常將這些穩(wěn)定的氣泡稱(chēng)作“微泡”，并可分為兩個(gè)主要種類(lèi)。
第一類(lèi)穩(wěn)定的氣泡或微泡在本領(lǐng)域中通常是指“微氣泡”并包括其中氣泡通過(guò)一種裹住排列在從氣體到液體界面的表面活性劑(即兩親性物質(zhì))的極薄氣囊而被束縛在氣/液界面的水性混懸液。第二類(lèi)微泡在本領(lǐng)域中通常是指“微氣球”或“微膠囊”并包括其中氣泡被由天然或合成聚合物形成的固體物質(zhì)氣囊包圍的混懸液。微氣球及其制備的實(shí)例被公開(kāi)在例如，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0458745中。其他種類(lèi)的超聲造影劑包括聚合物或其他固體的多孔微粒的混懸液，該混懸液將氣泡包封在微粒的孔中。本發(fā)明尤其涉及用于診斷性影像學(xué)的超聲造影劑包括氣體微氣泡的水溶性混懸液，即通過(guò)一層兩親性物質(zhì)而被基本穩(wěn)定的微泡。
微氣泡混懸液通?？砂聪路椒ㄖ苽渫ㄟ^(guò)用空氣或其他氣體接觸粉末狀的兩親性物質(zhì)，例如冷凍干燥的成形脂質(zhì)體或冷凍干燥的或噴霧干燥的磷脂混懸液，然后用水性載體通過(guò)攪拌生成微氣泡混懸液，該混懸液必須在制備后就立即給藥。
氣體微氣泡及其制備的實(shí)例可在例如US 5271928，US 5445813，US 5413774，US 5556610，US 5827504中找到。
WO97/29783公開(kāi)了另一種制備氣體微氣泡混懸液的方法，包括在適當(dāng)?shù)暮字越橘|(zhì)中生成氣體微氣泡分散體并在其后將該分散體凍干從而獲得干燥的重建產(chǎn)品。如此制備的干燥產(chǎn)品在水性介質(zhì)中只需最小限度的攪拌就可重建。如所述文獻(xiàn)中提到的，如此產(chǎn)生的微氣泡的尺寸始終是可重現(xiàn)的并實(shí)際上不受重建過(guò)程中所施用的攪拌能量大小的影響，而是由起始微氣泡分散體中形成的微氣泡的尺寸決定。然而，本申請(qǐng)人觀察到為了在含磷脂水性介質(zhì)中產(chǎn)生氣體微氣泡而使用的攪拌能量的大小可以非常高，尤其是要獲得直徑小的微氣泡時(shí)(例如，為獲得具有約3μm體積平均直徑的氣泡的分散系，10分鐘，23000rpm)。高攪拌能量可測(cè)定微氣泡的水性分散系中的局部過(guò)熱現(xiàn)象，這一現(xiàn)象可能續(xù)而導(dǎo)致水性介質(zhì)中所含的磷脂降解。另外，通常過(guò)高攪拌能量的影響難以控制并且可能產(chǎn)生終微氣泡的不可控制的粒度分布。此外，該方法包括在微氣泡產(chǎn)生期間，氣體連續(xù)流入水性介質(zhì)，因此需要使用適當(dāng)量的氣體。
WO 94/01140進(jìn)一步公開(kāi)了在水性介質(zhì)中制備可重建的微泡混懸液的方法，其中包括凍干含胃腸外可接受的乳化劑、非極性液體和脂溶性或水不溶性“構(gòu)造物”的水性乳劑。提到作為胃腸外可接受乳化劑的泊洛沙姆和磷脂，而在操作實(shí)例中使用了兩者的混合物。膽固醇是優(yōu)選的水不溶性構(gòu)造物，它被應(yīng)用在操作實(shí)例中。隨后將該凍干產(chǎn)品在水中重建從而獲得充氣微泡的水性混懸液。因此由重建步驟得到的該充氣微泡由不同物質(zhì)的包封而確定，這些物質(zhì)包括乳化劑例如泊洛沙姆和水不溶性構(gòu)造物例如膽固醇。
該方法據(jù)說(shuō)可產(chǎn)生小于4μm粒徑的乳劑，優(yōu)選小于2μm下至0.5μm。然而本申請(qǐng)人已注意到當(dāng)重建步驟可能最終產(chǎn)生數(shù)量平均直徑小于2μm的微泡時(shí)，該微泡群體相應(yīng)的粒度分布卻還是相對(duì)較寬。此外，從根據(jù)上述方法獲得的乳劑微粒轉(zhuǎn)化為氣體微氣泡的步驟導(dǎo)致了非常低的產(chǎn)率。
本申請(qǐng)人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)如果將磷脂作為上述乳劑的主要乳化劑，并且如果上述方法基本上是在不存在上述水不溶性構(gòu)造物的情況下進(jìn)行的，那么可獲得一個(gè)非常窄的微氣泡粒度分布。此外，基本不含所述的水溶性構(gòu)造物可大大增加從乳劑微粒到氣體微氣泡的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。本申請(qǐng)人進(jìn)一步還觀察到如果磷脂基本上是乳劑中的唯一乳化劑，那么上述方法可產(chǎn)生更窄的微氣泡粒度分布并使產(chǎn)率得到提高。
本申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)了通過(guò)在上述方法中對(duì)水-有機(jī)乳劑使用一個(gè)非常低的攪拌能量，就有可能獲得具有很小直徑并使粒度分布變窄的微氣泡。
發(fā)明概述本發(fā)明的一方面涉及制備凍干基質(zhì)的方法，該基質(zhì)通過(guò)接觸水性載體液體和氣體可重建成主要由磷脂穩(wěn)定的充氣微氣泡的混懸液，所述方法包含幾個(gè)步驟a)制備一種水-有機(jī)乳劑包含i)一種水性介質(zhì)；ii)一種基本上不與水混溶的有機(jī)溶劑；iii)一種包含超過(guò)50％重量比的磷脂的兩親性物質(zhì)的乳化組合物和iv)凍干保護(hù)劑；b)凍干所述經(jīng)乳化的混合物，從而獲得包含所述磷脂的凍干基質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種制備一種注射用造影劑的方法，該造影劑包含主要由磷脂穩(wěn)定的充氣微氣泡的液體水性混懸液，該方法包括幾個(gè)步驟a)制備一種水-有機(jī)乳劑包含i)一種水性介質(zhì)；ii)一種基本上不與水混溶的有機(jī)溶劑；iii)一種包含超過(guò)50％重量比的磷脂的兩親性物質(zhì)的乳化組合物和iv)一種凍干保護(hù)劑；b)凍干所述乳劑，從而獲得包含所述磷脂的凍干基質(zhì)。c)使所述凍干基質(zhì)與生物相容性氣體接觸；d)通過(guò)將其溶于生理可接受水性載體液體重建所述凍干基質(zhì)，從而獲得主要由所述磷脂穩(wěn)定的充氣微氣泡的混懸液。
制備乳劑的步驟a)優(yōu)選包括a1)通過(guò)將兩親性物質(zhì)的乳劑組合物和該凍干保護(hù)劑分散于水性介質(zhì)中而制備混懸液；a2)用有機(jī)溶劑混合所得混懸液；a3)受控?cái)嚢柙摶旌衔?，從而獲得乳劑。
根據(jù)步驟a3)的受控?cái)嚢鑳?yōu)選通過(guò)使用高壓均漿器或更優(yōu)選轉(zhuǎn)子-定子式均漿器而獲得。
本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及一種注射用造影劑，其包含通過(guò)在水性載體液體中主要含磷脂的穩(wěn)定層穩(wěn)定的充氣微氣泡的混懸液，其中所述的微氣泡具有小于1.70μm的數(shù)量平均直徑(DN)并且具有可是DV50/DN比例約為2.00或更低的體積平均直徑(DV50)。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種制備主要由磷脂穩(wěn)定的充氣微氣泡混懸液的可重建凍干基質(zhì)的方法，該方法包括制備水-有機(jī)乳劑包含i)一種水性介質(zhì)，ii)一種基本不與水混溶的有機(jī)溶劑；iii)一種磷脂和iv)一種凍干保護(hù)劑，以及隨后凍干所述乳劑。
該水性介質(zhì)優(yōu)選生理可接受的載體。術(shù)語(yǔ)“生理可接受的”包括任何可以選擇劑量在不產(chǎn)生副作用或基本上不改變其生物體健康的或正常功能(例如沒(méi)有測(cè)定出任何不可接受的毒性，不引起任何極度或不可控制的過(guò)敏反應(yīng)的情況或沒(méi)有測(cè)定出任何不正常的病理狀態(tài)或疾病情況)的情況下施用于患者的化合物、物質(zhì)或制劑。
適宜的水性液體載體有水，通常為無(wú)菌、無(wú)熱源的水(為了盡可能預(yù)防所述中間體凍干產(chǎn)品中的污染)，水溶液例如鹽水(其可有利地保持平衡從而不在注射用的終產(chǎn)品出現(xiàn)低滲)，或一種或多種張力調(diào)節(jié)物質(zhì)例如鹽或糖、糖醇、二元醇或其他非離子多元醇物質(zhì)(例如，葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。
有機(jī)溶劑此處所用的術(shù)語(yǔ)“基本上不與水混溶”是指當(dāng)所述溶劑與水混合時(shí)，形成了兩個(gè)分開(kāi)的相的有機(jī)溶劑。水不混溶溶劑在本領(lǐng)域終通常被認(rèn)為是無(wú)極性的或非極性溶劑，與極性溶劑相反(例如水)。水不混溶溶劑通?；旧喜蝗苡谒?。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，適宜與水性溶劑乳化的有機(jī)溶劑通常有那些在水中的溶解性小于10g/l的溶劑。所述溶劑在水中的溶解性?xún)?yōu)選約為1.0g/l或更低，更優(yōu)選約0.2g/l或更低，再更優(yōu)選約0.01g/l或更低。特別優(yōu)選的溶劑是具有水中溶解性為0.001g/l或更低的那些。尤其不溶的有機(jī)溶劑(例如全氟化碳)具有下至約1.0·10-6g/l的溶解性(例如全氟辛烷1.66·10-6g/l)。
所述有機(jī)溶劑優(yōu)選可凍干的，即，所述溶劑在凍干溫度下具有足夠高的蒸氣壓，例如-30℃至0℃，從而在可接受的時(shí)間內(nèi)，例如24-48小時(shí)，產(chǎn)生有效的并且完全的蒸發(fā)/升華。該有機(jī)溶劑的蒸氣壓優(yōu)選在25℃高于約0.2kPa。
如上所述，該有機(jī)溶劑可選自廣泛種類(lèi)的溶劑和任何不與水混溶并可凍干的化學(xué)個(gè)體，并且優(yōu)選在室溫下(25℃)下為液體。如果使用了一種沸點(diǎn)低于室溫的溶劑，那么裝有該乳化混合物的容器可有利地冷卻至所述溶劑的沸點(diǎn)以下，例如低至5℃或0℃。由于在凍干步驟中所述溶劑要完全除去，因此不存在特殊的約束，除了其不會(huì)含有通過(guò)凍干都不能除去或用于注射用組合物時(shí)為不可接受的污染物。
適宜的有機(jī)溶劑包括但不局限于烷、例如支鏈或優(yōu)選直鏈(C5-C10)烷，例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷；烯烴，例如(C5-C10)烯烴，例如1-戊烯、2-戊烯、1-辛烯；環(huán)-烷烴，例如任選被一個(gè)或兩個(gè)甲基取代的(C5-C8)環(huán)烷烴，例如環(huán)戊烷，環(huán)己烷，環(huán)辛烷，1-甲基-環(huán)己烷；芳族烴，例如苯和被一個(gè)或兩個(gè)甲基或乙基取代的苯衍生物，例如苯、甲苯、乙基苯、1，2-二甲苯、1，3-二甲苯；烷基醚和酮例如二丁基醚和二異丙基酮；鹵代烴或醚，例如氯仿、四氯化碳、2-氯-1-(二氟甲氧基)-1，1，2-三氟乙烷(恩氟烷)、2-氯-2-(二氟甲氧基)-1，1，1-三氟乙烷(異氟烷)、四氯-1，1-二氟乙烷，尤其是全氟化烴或醚，例如全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟甲基環(huán)己烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟苯和全氟萘烷、甲基全氟丁基醚、甲基全氟異丁醚、乙基全氟丁基醚、乙基全氟異丁醚；及其混合物。
溶劑量通常包含相對(duì)于用于溶劑的水體積的約1％至約50％。所述量?jī)?yōu)選從約1％至約20％，更優(yōu)選從約2％至15％，再更優(yōu)選從約5％至10％。如愿意，可使用上述列舉的有機(jī)溶劑兩種或多種的混合物，有機(jī)溶劑在乳化混合物中的總量在上述范圍內(nèi)。
凍干保護(hù)劑術(shù)語(yǔ)凍干保護(hù)劑或“凍干保護(hù)劑”是指當(dāng)包含在將要凍干的制劑中時(shí)，將保護(hù)所述化學(xué)化合物不受冷凍和真空操作的有害影響的化合物，這些影響諸如那些通常隨凍干出現(xiàn)的，例如因在凍干過(guò)程中使用真空而產(chǎn)生的受損、吸附和損耗。此外，經(jīng)過(guò)凍干步驟后，所述凍干保護(hù)劑優(yōu)選形成可支持凍干磷脂的固體基質(zhì)(“大塊”)。
本發(fā)明不局限于使用特殊的凍干保護(hù)劑，適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑的實(shí)例包括但不局限于碳水化合物，例如糖、單-、二-或多-糖，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉，環(huán)糊精、葡聚糖、氨茴酰牛扁堿、可溶淀粉、羥乙基淀粉(HES)，糖醇，例如甘露醇、山梨糖醇和聚二元醇例如聚乙二醇。具有凍干保護(hù)作用的重要清單記載于Acta Pharm.Technol.34(3)，pp.129-139(1988)，在此引用其內(nèi)容作為參考。所述凍干保護(hù)劑可單獨(dú)或作為一種或多種化合物的混合物形式使用。
優(yōu)選的凍干保護(hù)劑包括甘露醇和多糖例如葡聚糖(尤其分子量超過(guò)1500道爾頓的那些)、菊粉、可溶淀粉和羥乙基淀粉。
甘露醇或多糖例如葡聚糖、菊粉、可溶淀粉、羥乙基淀粉與糖例如葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖及赤蘚醇的混合物也可產(chǎn)生良好的效果。
同樣，本發(fā)明不局限于使用任何特別量的凍干保護(hù)劑。然而，凍干保護(hù)劑在凍干之前的乳劑中的最佳重量濃度包含約1至約25％，優(yōu)選約2至約20％，更優(yōu)選約5至約10％之間。
如有必要對(duì)凍干產(chǎn)品提供理想的“主體”，也可使用更高劑量。
該凍干保護(hù)劑優(yōu)選在其乳化前加入到水性-有機(jī)混合物中，因此在這種情況下該水性-有機(jī)混合物的乳化作用是在存在凍干保護(hù)劑的條件下展開(kāi)的?；蜃鰹檫x擇，可在其乳化后將該凍干保護(hù)劑加入到水性-有機(jī)混合物中。在第一種情形下，該凍干保護(hù)劑優(yōu)選在其與有機(jī)溶劑混合前被加入到水性介質(zhì)中。如愿意，還可將兩種結(jié)合起來(lái)，例如通過(guò)將部分凍干保護(hù)劑加入到用于制備乳劑的水相中，并將部分加入到由此獲得的乳劑中。如愿意，還可進(jìn)一步將防凍劑，例如甘油加入到乳劑中以保護(hù)所述化學(xué)化合物不受冷凍的有害影響。
磷脂依照本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，術(shù)語(yǔ)磷脂包括任何其分子能在最終微氣泡混懸液的氣-液交界面上形成物質(zhì)膜(通常以單-分子層形式)的兩親性磷脂化合物。相應(yīng)地，這些物質(zhì)在本領(lǐng)域中還指“膜形成磷脂”。同樣地，在乳化混合物中，這些兩親性化合物通常排列在水性介質(zhì)和基本不溶于水的有機(jī)溶劑之間的交界面上，由此穩(wěn)定了經(jīng)乳化的溶劑微粒。通過(guò)這些物質(zhì)在氣-水或水-溶劑界面上形成的膜可為連續(xù)的也可是非連續(xù)性的。然而在后一情形中，膜的不連續(xù)性應(yīng)例如分別不影響混懸微氣泡或乳化微粒的穩(wěn)定性(例如耐壓、抗聚結(jié)等)。
在此所用的術(shù)語(yǔ)“兩親性化合物”包括具有以下分子的化合物，即具有帶一個(gè)能夠與水性介質(zhì)相互作用的親水極性頭部分(例如極性或離子基團(tuán))和一個(gè)能夠與例如有機(jī)溶劑相互作用的疏水有機(jī)尾部分(例如烴鏈)。因此，這些化合物通常作為“表面活性劑”，即能夠穩(wěn)定通常另外的不混溶物質(zhì)的混合物，例如兩種不混溶液體的混合物(例如水和油)，液體與氣體的混合物(例如水中的氣體微氣泡)或液體與不溶顆粒的混合物(例如水中的金屬納米微粒)。
兩親性磷脂化合物通常包含至少一個(gè)磷脂基和至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)，親脂長(zhǎng)鏈烴基。
適宜的磷脂實(shí)例包括帶有一個(gè)或優(yōu)選兩個(gè)(相同或不同)脂肪酸和磷酸殘基的甘油酯，其中的磷酸殘基相反連于親水基團(tuán)上，例如膽堿(卵磷脂-PC)、絲氨酸(磷脂酰絲氨酸-PS)、甘油(磷脂酰甘油-PG)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺-PE)、肌醇(磷脂酰肌醇)等基團(tuán)。僅帶有一個(gè)脂肪酸殘基的磷脂的酯通常在本領(lǐng)域中是指磷脂的“溶血”形式。磷脂中的脂肪酸殘基通常為長(zhǎng)鏈脂族酸，通常含有12-24個(gè)碳原子，優(yōu)選14-22；脂族鏈可含有一個(gè)或多種不飽和部分或優(yōu)選完全飽和。在磷脂中適宜的脂肪酸的實(shí)例有，例如，月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。優(yōu)選使用飽和脂肪酸例如肉豆蔻酸，棕櫚酸，硬脂酸和花生酸。
磷脂的進(jìn)一步實(shí)例為磷脂酸，即甘油-磷酸與脂肪酸的二酯；鞘脂類(lèi)例如鞘脂類(lèi)，即那些含有脂肪酸的甘油二酯的殘基被神經(jīng)酰胺鏈代替的卵磷脂類(lèi)似物；心磷脂，即1，3-二磷脂酰甘油與脂肪酸的酯；糖脂例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1(或GM2)或腦苷脂；糖脂；硫脂和鞘糖脂。
在此所用的術(shù)語(yǔ)磷脂既包括天然存在的、也包括半合成或合成產(chǎn)品，它們既可單獨(dú)使用也可以混合物的形式使用。
天然存在的磷脂是天然卵磷脂(卵磷脂(PC)衍生物)，例如，通常地，大豆或蛋黃卵磷脂。
半合成的磷脂是天然卵磷脂的局部或全部氫化衍生物。優(yōu)選的磷脂為卵磷脂，乙基卵磷脂，磷脂酰甘油，磷脂酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸或鞘磷脂的脂肪酸二酯。
磷脂的優(yōu)選實(shí)例有，例如，二月桂?；?磷脂酰膽堿(DLPC)、二肉豆蔻?；?磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚?；?磷脂酰膽堿(DPPC)、二花生?；?磷脂酰膽堿(DAPC)、二硬脂?；?磷脂酰膽堿(DSPC)、二油酰基-磷脂酰膽堿(DOPC)、1，2二硬脂?；?sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(乙基-DSPC)、雙十五?；?磷脂酰膽堿(DPDPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕櫚?；?磷脂酰膽堿(MPPC)、1-棕櫚?；?2-肉豆蔻酰基-磷脂酰膽堿(PMPC)、1-棕櫚?；?2-硬脂?；?磷脂酰膽堿(PSPC)、1-硬脂?；?2-棕櫚酰基-磷脂酰膽堿(SPPC)、1-棕櫚?；?2-油基磷脂酰膽堿(POPC)、1-油基-2-棕櫚?；?磷脂酰膽堿(OPPC)、二月桂?；?磷脂酰甘油(DLPG)及其堿金屬鹽、二花生酰基磷脂?；?甘油(DAPG)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)及其堿金屬鹽、二棕櫚?；字８视?DPPG)及其堿金屬鹽、二硬脂?；字８视?DSPG)及其堿金屬鹽、二油?；?磷脂酰甘油(DOPG)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻?；字?DMPA)及其堿金屬鹽、二棕櫚酰基磷脂酸(DPPA)及其堿金屬鹽、二硬脂?；字?DSPA)、二花生?；字?DAPA)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻?；?磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)、二硬脂?；字；?乙醇胺(DSPE)、二油基磷脂酰基-乙醇胺(DOPE)、二花生?；字Ｒ掖及?DAPE)、二亞油基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰絲氨酸(DMPS)、二花生酰基磷脂酰絲氨酸(DAPS)、二棕櫚酰基磷脂酰絲氨酸(DPPS)、二硬脂?；字＝z氨酸(DSPS)、二油?；字＝z氨酸(DOPS)、二棕櫚酰基鞘磷脂(DPSP)和二硬脂?；柿字?DSSP)。
術(shù)語(yǔ)磷脂進(jìn)一步還包括修飾的磷脂，例如親水基團(tuán)相反連于其他親水基團(tuán)的磷脂。修飾磷脂的實(shí)例有經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾的磷脂酰乙醇胺，即親水乙醇胺部分連于不同分子量例如300-5000道爾頓的PEG分子的磷脂酰乙醇胺，例如DPPE-PEG或DSPE-PEG，即其上連有PEG聚合物的DPPE(或DSPE)。例如，DPPE-PEG2000是指與平均分子量約為2000的PEG聚合物相連的DPPE。如下所要進(jìn)行的詳細(xì)解釋?zhuān)@些PEG-修飾的磷脂優(yōu)選與非修飾磷脂結(jié)合在一起使用。
中性和帶電磷脂及其混合物都可令人滿(mǎn)意地用于本發(fā)明的方法中。此處所用的和在現(xiàn)有技術(shù)中的與磷脂相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“帶電”是指單獨(dú)的磷脂分子在整體上帶有凈電荷，其帶正電荷或更常見(jiàn)的負(fù)電荷。
整體上帶負(fù)電的磷脂的實(shí)例有，尤其是磷脂酰絲氨酸的脂肪酸二酯的衍生物，例如DMPS、DPPS、DSPS；磷脂酸的脂肪酸二酯衍生物，例如DMPA、DPPA、DSPA；磷脂酰甘油的脂肪酸二酯衍生物例如DMPG、DPPG和DSPG。還有修飾的磷脂，尤其是PEG-修飾的磷脂酰乙醇胺，例如DMPE-PEG750、DMPE-PEG1000、DMPE-PEG2000、DMPE-PEG3000、DMPE-PEG4000、DMPE-PEG5000、DPPE-PEG750、DPPE-PEG1000、DPPE-PEG2000、DPPE-PEG3000、DPPE-PEG4000、DPPE-PEG5000、DSPE-PEG750、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000、DSPE-PEG4000、DSPE-PEG5000、DAPE-PEG750、DAPE-PEG1000、DAPE-PEG2000、DAPE-PEG3000、DAPE-PEG4000或DAPE-PEG5000可作為帶負(fù)電的分子而被使用。還有上述引證的磷脂的溶血形式，例如溶血磷脂酰絲氨酸衍生物(例如溶血-DMPS、-DPPS或-DSPS)，溶血磷脂酸衍生物(例如溶血-DMPA、-DPPA或-DSPA)和溶血磷脂酰甘油衍生物(例如溶血-DMPG、-DPPG或-DSPG)可有利地作為帶負(fù)電的化合物而被使用。
整體上帶正電的磷脂的實(shí)例有，乙基磷脂酰膽堿的衍生物，尤其是乙基磷脂酰膽堿與脂肪酸的酯，例如1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(乙基-DSPC或DSEPC)、1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(乙基-DPPC或DPEPC)。
優(yōu)選使用兩種或多種磷脂的混合物，至少一種帶中性電荷和至少一種整體帶凈電荷。更優(yōu)選，使用兩種或多種磷脂的混合物，至少一種呈中性和至少一種帶負(fù)電荷。帶電荷磷脂的含量可在約占磷脂總重量的95％-約5％的范圍內(nèi)變化，優(yōu)選按重量計(jì)80％-20％。存在至少少量的帶(負(fù))電荷磷脂，例如磷脂總重量的5％-20％，可有助于防止氣泡或乳劑微滴的聚集。然而，還可以單獨(dú)使用中性或帶電荷的磷脂，或混合使用兩種或多種全是中性或全為整體帶電荷的磷脂的混合物。
優(yōu)選的磷脂為DAPC、DPPA、DSPA、DMPS、DPPS、DSPS、DPPE、DSPE、DSPG、DPPG和乙基-DSPC。最優(yōu)選的是DSPA、DPPS或DSPS。
優(yōu)選的磷脂混合物為DPPS與DPPC、DSPC或DAPC的混合物(95/5-5/95w/w)，DSPA與DSPC或DAPC(95/5-5/95w/w)的混合物，DSPG或DPPG與DSPC的混合物或DSPC與乙基-DSPC的混合物。最優(yōu)選的是DPPS/DSPC混合物(50/50-10/90w/w)或DSPA/DSPC(50/50-20/80w/w)。
磷脂的含量通常包括乳化混合物總重量的約0.005-約1.0％重量比。當(dāng)然可使用更高含量，但是考慮到終產(chǎn)品為注射用造影劑，因此優(yōu)選不使用過(guò)量的添加劑，除非為了獲得穩(wěn)定并適宜的產(chǎn)品而確實(shí)有這種必要。通常，使用高于上述平均范圍上限數(shù)量的磷脂，在氣泡數(shù)量、氣泡粒度分布和氣泡穩(wěn)定性方面，實(shí)際上觀察不到或觀察到可忽略不計(jì)的改善。通常，當(dāng)使用更大體積的有機(jī)溶劑時(shí)，需要更高含量的磷脂。因此，當(dāng)有機(jī)溶劑的體積達(dá)到約50％的水相體積時(shí)，可有利地向乳劑中加入約1％w/w的磷脂。磷脂的含量?jī)?yōu)選占乳化混合物總重量的0.01-1.0％之間，更優(yōu)選按重量計(jì)約0.05％-0.5％。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的微氣泡主要是由如上定義的磷脂來(lái)穩(wěn)定的。尤其，包圍充氣微氣泡的包封物是由超過(guò)50％(w/w)，優(yōu)選由至少80％，更優(yōu)選由至少90％如上定義的磷脂物質(zhì)構(gòu)成。適宜地，基本全部的微氣泡的穩(wěn)定包封物都是由磷脂構(gòu)成。
然而，其他兩親性物質(zhì)可以少于乳化組合物總重量50％的量與形成充氣微氣泡的穩(wěn)定包封物的磷脂混合。
適宜的附加包封物穩(wěn)定性?xún)捎H物質(zhì)的實(shí)例包括，例如，溶血脂質(zhì)；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、花生酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亞油酸或亞麻酸，以及它們分別與堿或堿金屬形成的鹽；帶有聚合物的脂質(zhì)，例如甲殼質(zhì)、透明質(zhì)酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)，也即為“pegylated脂質(zhì)”；帶有磺化單-雙-，寡或多糖的脂質(zhì)；帶有與醚或酯連接的脂肪酸的脂質(zhì)；聚合脂質(zhì)；二乙酰磷酸酯；磷酸聯(lián)十六烷酯；硬脂酰胺；神經(jīng)酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯(如聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯)；聚氧乙烯脂肪醇；聚氧乙烯脂肪醇醚；聚氧乙烯化脫水山梨糖醇脂肪酸酯；甘油聚乙二醇蓖麻醇酸酯；乙氧基化大豆甾醇；乙氧基化蓖麻油；環(huán)氧乙烷(EO)和環(huán)氧丙烷(PO)嵌段共聚物；糖酸的甾醇酯包括膽固醇葡糖苷酸、羊毛甾醇葡糖苷酸、7-脫氫膽固醇葡糖苷酸、麥角甾醇葡糖苷酸、膽固醇葡糖酸酯、羊毛甾醇葡糖酸酯、或麥角甾醇葡糖酸酯；糖酸和醇的酯包括月桂基葡糖苷酸、硬脂酰基葡糖苷酸、肉豆蔻?；咸擒账帷⒃鹿鸹咸撬狨?、肉豆蔻酰基葡糖酸酯或硬脂酰基葡糖酸酯；糖與脂肪酸的酯包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯、葡糖醛酸、葡糖酸或多糖醛酸；甘油與(C12-C24)，優(yōu)選(C14-C22)脂肪二羧酸的酯和它們分別與堿或堿金屬的鹽，例如1，2-二棕櫚?；?sn-3-琥珀?；视突?，3-二棕櫚酰基-2-琥珀?；视停辉聿蒈瞻ㄋ_灑皂草配基、菝葜配基、常春配基、石竹素、或毛地黃毒苷配基；長(zhǎng)鏈(C12-C24)醇，包括n-癸醇，月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇、或n-十八醇；6-(5-膽甾烯-3β-基氧)-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷；二半乳糖甘油二酯；6-(5-膽甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷；6-(5-膽甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脫氧基-1-硫代-β-D-甘露吡喃糖苷；12-(((7’-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲基氨基)硬脂酸；N-[12-(((7′-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲氨基)十八酰基]-2-氨基棕櫚酸；N-琥珀?；?二油基磷脂酰乙醇胺；1-十六烷基-2-棕櫚?；视?磷酸乙醇胺；棕櫚?；甙腚装彼?；包含至少一個(gè)(C10-C20)，優(yōu)選(C14-C18)，烷基鏈的烷基銨鹽，例如硬脂?；然@、十六烷基氯化銨、溴化二甲基雙十八烷基銨(DDAB)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)；包含一個(gè)或優(yōu)選兩個(gè)(C10-C20)，優(yōu)選(C14-C18)，?；埢氖寤蚣句@鹽例如，1，2-二硬脂酰基-3-三甲基銨-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕櫚?；?3-三甲基銨-丙烷(DPTAP)、1，2-油?；?3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂?；?3-二甲基銨丙烷(DSDAP)及其混合物或組合物。
少量脂肪酸和溶血形式的磷脂還可構(gòu)成原始磷脂產(chǎn)品的降解產(chǎn)物，例如由加熱乳劑產(chǎn)生。
優(yōu)選的附加包封物穩(wěn)定化兩親物質(zhì)是那些在其分子上包含一個(gè)或兩個(gè)脂肪酸殘基，尤其是一個(gè)或兩個(gè)直鏈(C10-C20)-酰基，優(yōu)選(C14-C18)-酰基鏈的物質(zhì)，例如，上述列舉的脂肪酸，它們各自的鹽及衍生物。
尤其優(yōu)選的附加包封物穩(wěn)定化兩親物質(zhì)是那些能夠?qū)⒄w凈電荷傳給穩(wěn)定的包封物上的物質(zhì)，即，帶有整體正或負(fù)凈電荷的化合物。適宜的帶負(fù)電或正電的化合物的實(shí)例有，例如溶血磷脂，即，上述引證磷脂的溶血形式，例如溶血磷脂酰絲氨酸衍生物(例如溶血-DMPS、-DPPS或-DSPS)、溶血磷脂酸衍生物(例如溶血-DMPA、-DPPA或-DSPA)和溶血磷脂酰甘油衍生物(例如溶血-DMPG、-DPPG或-DSPG)；膽汁酸鹽例如膽酸鹽、脫氧膽酸鹽或甘膽酸鹽；(C12-C24)，優(yōu)選(C14-C22)脂肪酸鹽，例如，棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、1，2-二棕櫚?；?sn-3-琥珀酰基甘油鹽或1，3-二棕櫚酰基-2-琥珀?；视望}；帶鹵素反離子(例如氯或溴)包含至少一個(gè)(C10-C20)烷基鏈，優(yōu)選(C14-C18)烷基鏈的烷基銨鹽，例如硬脂?；然@、十六烷基氯化銨、溴化二甲基雙十八烷基銨(DDAB)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)；帶有一個(gè)鹵素反離子(例如氯或溴)，包含一個(gè)或優(yōu)選兩個(gè)(C10-C20)?；湥瑑?yōu)選(C14-C18)?；埢氖寤蚣句@，例如，1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕櫚?；?3-三甲基銨-丙烷(DPTAP)、1，2-油?；?3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂?；?3-二甲基銨-丙烷(DSDAP)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，如果期望獲得“靶向”超聲造影劑，即含有在體外或體內(nèi)給藥后能選擇性結(jié)合在特殊位點(diǎn)的微氣泡的造影劑，也可直接起始于至少部分通過(guò)引入適當(dāng)選擇的靶向配位體而經(jīng)修飾的磷脂，或作為選擇地，并優(yōu)選地，起始于一種磷脂，至少其部分含有可能受保護(hù)的能夠在后期與適當(dāng)選擇的具有互補(bǔ)反應(yīng)機(jī)能的靶向配體(例如，卵白素-生物素鏈)配對(duì)的反應(yīng)基團(tuán)。
因此，在這種特定情況下，術(shù)語(yǔ)“磷脂”是指包括修飾和未修飾的磷脂，因此包括通過(guò)將靶向配體或保護(hù)性反應(yīng)基團(tuán)連接到磷脂的兩親性物質(zhì)上而被修飾的磷脂。
術(shù)語(yǔ)“靶向配體”在其含義范圍內(nèi)包括任何具有或能夠提高本發(fā)明微氣泡對(duì)活體內(nèi)生物或病理位點(diǎn)的靶向能力的化合物、部分或殘基?？勺鳛榘邢蚺湮惑w的材料或物質(zhì)包括，例如，但不局限于，蛋白質(zhì)，包括抗體、抗體片斷、受體分子、受體連接分子、糖蛋白和外源凝集素；肽，包括寡肽和多肽；擬肽；糖，包括單和多糖；維生素；類(lèi)固醇，類(lèi)固醇類(lèi)似物，激素，輔助因子，生物活性劑和遺傳物質(zhì)，包括核苷，核苷酸和多核苷酸。靶向配位體所聯(lián)合的靶器官包括組織，例如，心肌組織(包括心肌細(xì)胞和心肌肌細(xì)胞(cardiomyocites))，膜組織(包括內(nèi)皮組織和上皮組織)，層，結(jié)締組織(包括間質(zhì)組織)或腫瘤；血塊；和受體，例如，肽類(lèi)激素的細(xì)胞表面受體，神經(jīng)遞質(zhì)，抗原，補(bǔ)體片斷，和免疫球蛋白和類(lèi)固醇激素的細(xì)胞質(zhì)受體。
適宜的靶器官和靶向配位體公開(kāi)在例如US專(zhuān)利No.6139819中，在此引用作為參考。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向配位體可通過(guò)共價(jià)鍵連接在形成穩(wěn)定的包封物的兩親性分子上。
在這種情況下，當(dāng)期望得到靶向兩親性分子時(shí)，那么必須在磷脂或脂分子中存在的特定反應(yīng)部分將依賴(lài)于將被配對(duì)的具體的靶向配位體。例如，如果靶向配位體可通過(guò)氨基連接到兩親性分子上，那么兩親性分子的適宜反應(yīng)部分可為異硫氰酸酯(它將形成硫脲鍵)，反應(yīng)性酯(以形成酰胺鍵)，醛基(為了形成可被還原成烷基胺鍵的亞胺鍵)等；如果該靶向配位體能通過(guò)巰基結(jié)合到兩親性分子上，那么兩親性分子的適宜互補(bǔ)反應(yīng)部分包括鹵素乙酰衍生物或馬來(lái)酰亞胺(以形成硫醚鍵)；如果該靶向配位體可通過(guò)羧基結(jié)合到兩親性分子上，那么兩親性分子的適宜反應(yīng)部分可為胺和肼(以形成酰胺或烷基胺鍵)。該反應(yīng)部分可直接連接到磷脂分子上或連接到連接在磷脂上的修飾部分(例如PEG)上。
如上所示，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)期望得到含靶向微氣泡的造影劑時(shí)，那么至少起始磷脂的一部分將含有適宜的反應(yīng)部分，并且含有互補(bǔ)官能度的靶向配位體將在凍干之前的任何步驟中，通過(guò)在乳劑形成之前、期間、或之后，或就在重建步驟之前，向含有功能磷脂/脂質(zhì)的相中加入含互補(bǔ)官能度的靶向配位體而被連接到磷脂上。在后一種情形中，可以充分利用該體系的靈活性，因?yàn)楹兄辽俨糠殖赡ち字虿糠纸Y(jié)合的脂質(zhì)的微氣泡已適當(dāng)?shù)毓δ芑?，其可結(jié)合到任何期望的具有共同反應(yīng)性互補(bǔ)基團(tuán)的靶向配位體上。
然而，該靶向配位體不一定必須通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合到兩親性分子上。該靶向配位體還可通過(guò)物理型和/或靜電型相互作用而適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合到微氣泡上。例如，可向磷脂分子中引入具有高親和力和對(duì)互補(bǔ)部分具有選擇性的功能部分，而該互補(bǔ)部分將被連于靶向配位體上。例如，卵白素(或抗生蛋白鏈菌素)部分(對(duì)生物素具有高親和力)可被共價(jià)連于微氣泡穩(wěn)定磷脂上而該互補(bǔ)生物素部分可被結(jié)合到適當(dāng)?shù)陌邢蚺湮惑w中，例如肽或抗體。該生物素標(biāo)記的靶向配位體將因此通過(guò)卵白素-生物素偶聯(lián)體系而與卵白素標(biāo)記的微氣泡結(jié)合。根據(jù)另一個(gè)替換實(shí)施方案，含生物素的磷脂可用作形成微氣泡穩(wěn)定包封物的化合物；然后使被結(jié)合到穩(wěn)定包封物中的含生物素的磷脂先與卵白素(或neutravidin)反應(yīng)，再與含生物素的配位體反應(yīng)。磷脂和肽的生物素/卵白素標(biāo)記的實(shí)例也公開(kāi)于上述US 6139819中。作為選擇地，van derWaal′s相互作用，靜電相互作用和其他結(jié)合過(guò)程可將靶向配位體聯(lián)合或連接到兩親性分子上。
本發(fā)明微氣泡所定向的適宜特異靶器官的實(shí)例有，例如，纖維蛋白、活化血小板上的αvβ3受體或GPIIbIIIa受體。纖維蛋白和血小板實(shí)際上通常出現(xiàn)在“血栓”中，即可在血液中形成并造成血管阻塞的血塊。適宜的連結(jié)肽公開(kāi)在例如以上引述的US 6139819中。其他對(duì)纖維蛋白靶向特異性的連結(jié)肽公開(kāi)在例如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 02/055544中，在此將其引用作為參考。
其他重要的靶器官的實(shí)例包括易損斑塊和腫瘤特異性受體，例如激酶結(jié)構(gòu)域部位(kinase domin region(KDR))和VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)/KDR復(fù)合物。適用于KDR或VEGF/KDR復(fù)合物的連結(jié)肽公開(kāi)在，例如，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 03/74005和WO 03/084574中，在此都被引用作為參考。
方法可通過(guò)用適當(dāng)?shù)谋绢I(lǐng)域已知的乳劑生成技術(shù)處理水性介質(zhì)和至少存在一種磷脂的核心溶劑而展開(kāi)本發(fā)明方法的乳化步驟a)，上述已知技術(shù)例如有，超聲、振動(dòng)、高壓均化、微觀混合、薄膜乳化、高速攪拌或高剪切力混合，例如用轉(zhuǎn)子-定子式均漿器。例如可使用諸如Polytrone PT 3000這樣的轉(zhuǎn)子-定子式均漿器。可根據(jù)溶劑組分，乳劑體積及裝乳劑的容器直徑和所期望的乳劑中乳劑微滴的最終直徑而選擇該轉(zhuǎn)子-定子式均漿器的攪拌速率。一般而言，已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用將約3cm直徑的探針浸入在裝在3.5-5cm直徑燒杯中的50-80ml混合物的轉(zhuǎn)子-定子式均漿器時(shí)，約8000rpm的轉(zhuǎn)速通常足以獲得具有平均數(shù)值直徑的微滴，這一直徑已被充分降低以至在該凍干基質(zhì)的凍干和重建后能得到具有小于約1.8μm直徑的充氣微氣泡。通過(guò)增加攪拌速率至約12000rpm，一般可獲得具有小于約1.5μm數(shù)量平均直徑的充氣微氣泡，而當(dāng)攪拌速率為約14000-15000rpm時(shí)，通常則獲得約1.0μm或更低數(shù)量平均直徑的充氣微氣泡。一般而言，已發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加攪拌速度至約18000rpm以上，可進(jìn)一步輕微降低微氣泡尺寸。
作為選擇地，還可用微觀混合技術(shù)乳化該混合物。已知，微觀混合器典型地包含至少兩個(gè)進(jìn)樣口和至少一個(gè)出樣口。因此通過(guò)第一個(gè)進(jìn)樣口將該有機(jī)溶劑加入到混合物中(例如以約0.05-5ml/分鐘的流速)，而通過(guò)第二個(gè)進(jìn)樣口加入該水相(例如以2-100ml/分鐘的流速)。然后使該微觀混合器的出樣口與含水的容器相連，從而使該水相在隨后的瞬間從所述的容器中流出并流入含不斷增量的乳化溶劑的微觀混合器中。如增加溶劑的整體體積，則在額外預(yù)定的時(shí)間期間內(nèi)，例如5-120分鐘，通過(guò)微觀混合器使來(lái)自容器的乳劑再循環(huán)，以使乳化完全。
根據(jù)乳化技術(shù)，可在乳化過(guò)程中逐漸加入有機(jī)溶劑，或在乳化開(kāi)始之前一次加入。作為選擇地，可將該水性介質(zhì)在乳化過(guò)程中逐漸加入與水不混溶的溶劑中，或在乳化開(kāi)始之前一次加入。優(yōu)選，在水性介質(zhì)與有機(jī)溶劑混合之前將磷脂分散到水性介質(zhì)中。作為選擇地，可在乳化步驟之前或期間將磷脂分散到有機(jī)溶劑中或單獨(dú)加入水-有機(jī)混合物。
適宜在室溫下，例如22℃±5℃的溫度或更高，例如50℃-60℃(例如，如果核心溶劑的沸點(diǎn)高)，或在較低的溫度下，例如，0℃-10℃(例如，當(dāng)核心溶劑的沸點(diǎn)接近室溫)，展開(kāi)步驟的a)的乳化反應(yīng)。優(yōu)選將溫度保持在低于有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)，優(yōu)選至少低于所述溫度5℃，更優(yōu)選低于10℃。因?yàn)槿绻旌衔镩L(zhǎng)期暴露在高溫(例如90℃或更高)下，可能導(dǎo)致可能的磷脂降解，續(xù)而形成各自的溶血衍生物，通常優(yōu)選避免在高溫下的長(zhǎng)時(shí)間加熱。
如有必要，可對(duì)含磷脂的水性介質(zhì)進(jìn)行受控加熱以促進(jìn)其分散。例如，可在約60℃-70℃下加熱含水性混懸液的磷脂約15分鐘，然后將其冷卻至室溫，在該溫度下進(jìn)行乳化操作。
如前所述，還可向含磷脂的乳化混合物中加入附加的兩親性物質(zhì)，例如那些在前列舉的。所述附加的兩親性化合物的含量?jī)?yōu)選不高于兩親性物質(zhì)總重量的約50％，更優(yōu)選不高于20％重量比，下至例如約0.1％的含量。
如愿意，水性介質(zhì)中還可進(jìn)一步含有一種或多種賦形劑。
在此所用的術(shù)語(yǔ)“賦形劑”是指可用于本發(fā)明的任何添加劑，例如那些用于增加乳劑或凍干中間體穩(wěn)定性和/或?yàn)榱颂峁┲瓶伤幱?、穩(wěn)定的終組合物的添加劑。
有關(guān)這方面的示范賦形劑有，例如，粘度增加劑和/或磷脂的助溶劑。
適合使用的粘度增加劑和助溶劑為，例如單或多糖，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖和葡聚糖，脂族醇，例如異丙醇和丁醇，多元醇，例如甘油、1，2-丙二醇等試劑。然而，我們發(fā)現(xiàn)通常沒(méi)必要向本發(fā)明的造影劑中加入諸如粘度增加劑這樣通常用于許多現(xiàn)存造影劑制劑中的添加劑。這也是本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)，即對(duì)受體施用的組分?jǐn)?shù)量被降到最低，并且盡可能將造影劑的粘度保持很低。
如上所述，本申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)基本上沒(méi)必要向乳化混合物中加入水不溶性結(jié)構(gòu)劑，例如膽固醇。事實(shí)上，已發(fā)現(xiàn)，0.05％(相對(duì)于乳化混合物總重量的w/w)的膽固醇將顯著降低從微滴向充氣微泡的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，從而進(jìn)一步導(dǎo)致氣泡粒度的廣泛分布。因此水不溶性化合物，尤其那些在其結(jié)構(gòu)中不含一個(gè)或兩個(gè)脂肪酸殘基的化合物在乳化混合物中的含量，優(yōu)選低于乳劑總重量的0.050％重量比，更優(yōu)選低于約0.030％。
為了除去水相中多余的磷脂(未與乳劑結(jié)合)并分離和除去任選的添加劑例如粘度增加劑和助溶劑，以及不期望有的物質(zhì)例如膠粒，過(guò)小或過(guò)大乳滴，可有利地在凍干步驟b)之前將根據(jù)步驟a)制備的乳劑進(jìn)行一次或多次洗滌操作。這些洗滌可被本身已知的方式影響，利用諸如潷析、浮集、離心、交流過(guò)濾等技術(shù)分離乳劑。
如果預(yù)計(jì)進(jìn)行洗滌操作，而且如果生成乳劑前就在原始水相中存在凍干保護(hù)劑，那么可用含一種或多種凍干保護(hù)劑的水溶液進(jìn)行所述洗滌操作從而彌補(bǔ)在洗滌過(guò)程種部分損失的凍干保護(hù)劑含量。在另一方面，如果在乳化的水-有機(jī)混合物中不存在凍干保護(hù)劑，那么為了向乳化混合物中引入凍干保護(hù)劑，可用含凍干保護(hù)劑的水溶液洗滌形成的乳劑，或，作為選擇地，在凍干之前，洗滌后加入凍干保護(hù)劑。
如愿意，為了進(jìn)一步降低大尺寸微氣泡在終重建混懸液中的含量，可在凍干之前對(duì)該乳劑(就以此或經(jīng)洗滌之后)進(jìn)行超濾或微過(guò)濾操作。在微過(guò)濾過(guò)程中，例如用5μm或3μm的過(guò)濾器，實(shí)際上大尺寸的微滴被過(guò)濾器截留并被分離出剩余的小尺寸微滴，由此防止在凍干物質(zhì)的重建中形成大尺寸微氣泡。根據(jù)常規(guī)技術(shù)，例如正過(guò)濾、真空過(guò)濾或流線(xiàn)過(guò)濾可完成微過(guò)濾。過(guò)濾膜可為尼龍、玻璃纖維、纖維素、紙、聚碳酸酯或聚酯(Nuclepore)膜。
根據(jù)一個(gè)另選實(shí)施方案，根據(jù)上述教導(dǎo)，可在形成乳劑之后，經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)洗滌步驟，加入另外的兩親性化合物。尤其，為了向穩(wěn)定的包封物中加入所述化合物，優(yōu)選在攪拌和加熱(優(yōu)選至少超過(guò)80℃，例如40℃-80℃，尤其50℃-70℃)下，向形成的乳劑中加入期望的化合物的水性混懸液。該另選實(shí)施方案尤其可用于向穩(wěn)定層中后續(xù)引入如向初始乳劑混合物中加入便相反會(huì)對(duì)終產(chǎn)品性質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響的兩親性化合物。適宜在初始乳劑制備好后，作為穩(wěn)定包封物的添加成分而被后續(xù)加入兩親性化合物的實(shí)例有，例如，PEG-修飾的磷脂，尤其PEG-修飾的磷脂酰乙醇胺，例如DMPE-PEG750、DMPE-PEG1000、DMPE-PEG2000、DMPE-PEG3000、DMPE-PEG4000、DMPE-PEG5000、DPPE-PEG750、DPPE-PEG1000、DPPE-PEG2000、DPPE-PEG3000、DPPE-PEG4000、DPPE-PEG5000、DSPE-PEG750、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000、DSPE-PEG4000、DSPE-PEG5000、DAPE-PEG750、DAPE-PEG1000、DAPE-PEG2000、DAPE-PEG3000、DAPE-PEG4000或DAPE-PEG5000。同樣地，根據(jù)這一方法還可適宜地后續(xù)加入帶有反應(yīng)部分或靶向配位體(例如含生物素、馬來(lái)酰亞胺或馬來(lái)酰亞胺-肽)的PEG-修飾的磷脂。此外，還可將該技術(shù)用于向穩(wěn)定層組合物中后續(xù)加入其他成分，例如脂肽或聚合物表面活性劑。在形成乳劑后可適宜地加入的聚合物表面活性劑的實(shí)例是，例如，環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷嵌段共聚物，例如Pluronic F68、Pluronic F108、Pluronic F-127(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚氧乙基化烷基醚，例如Brij78(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚氧乙烯脂肪酸酯例如Myrj53或Myrj59(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如Tween60(Sigma Aldrich，Missouri，USA)；或聚乙二醇叔-辛基苯基醚，例如TritonX-100(Sigma Aldrich，Missouri，USA)。
實(shí)際上本申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法，使用含有限量(例如低于10％重量比)的PEG修飾的磷脂(例如DSPE-PEG或DPPE-PEG)與成膜磷脂(例如DPPS或50∶50的DAPC/DPPS)的混合物制備乳劑，與由只含成膜磷脂的乳劑制得的微氣泡的粒度分布相比，測(cè)定出其終產(chǎn)物中的粒度分布具有實(shí)質(zhì)性的增寬。在另一方面，如果先制備只含成膜磷脂的乳劑然后再向所得乳劑(例如在約60℃下攪拌1小時(shí))中加入PEG修飾的磷脂的水性混懸液，就會(huì)發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定的包封物中可在基本不因想終產(chǎn)品粒度分布的情況下混合相當(dāng)高含量(通常超過(guò)30％重量比)的PEG修飾的磷脂。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在凍干步驟之前對(duì)該乳劑進(jìn)行附加的受控加熱處理。對(duì)該乳劑的附加加熱優(yōu)選在密封容器中進(jìn)行。該加熱處理可在約15分鐘-約90分鐘范圍內(nèi)變化，其溫度約為60℃-約125℃，優(yōu)選約80℃-約120℃。一般而言，溫度越高，熱處理的時(shí)間就越短。加熱期間可任選地?cái)嚢枞閯?br> 正如申請(qǐng)人所發(fā)現(xiàn)的，雖然附加加熱處理可能導(dǎo)致磷脂的部分降解(例如，當(dāng)乳劑在約100-120℃下加熱約30分鐘，終產(chǎn)品中約5-20％w/w的溶血脂質(zhì))，但是它具有很大的優(yōu)點(diǎn)，即不受初始乳化步驟的工作條件(例如有機(jī)溶劑的類(lèi)型、乳化技術(shù)、任選的洗滌步驟等)的影響，可使得終產(chǎn)品中的粒度分布變窄并增加了微氣泡的總數(shù)量。
然后可凍干經(jīng)熱處理的乳劑，通常不需要進(jìn)行進(jìn)一步洗滌。
可用本身已知的方法和設(shè)備，通過(guò)初始冷卻該溶劑并接著凍干該冷凍乳劑而進(jìn)行根據(jù)步驟b)的乳劑凍干操作。由于在給藥前，正常情況下需要用附加的載體液體重建該干燥、凍干制品，因此在凍干前可有利地將該乳劑裝入適于銷(xiāo)售的管形瓶中以便使每個(gè)管形瓶含有準(zhǔn)確的劑量，例如用于重建為注射用形式的凍干制品的單劑量單位。通過(guò)在獨(dú)立的管形瓶中而非大批凍干乳劑，可避免對(duì)凍干制品易受損的蜂窩樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理及至少部分破壞其結(jié)構(gòu)的危險(xiǎn)。
凍干后，可通過(guò)加入為了在造影劑的終制劑中形成微氣泡的所需氣體而除去在冷凍干燥器中的真空。這將使管形瓶的頂部充滿(mǎn)所需氣體，然后再用適當(dāng)封閉方法密封管形瓶。作為選擇地，可將管形瓶置于真空中并密封，而在較晚的階段加入氣體，例如就在給藥前，例如當(dāng)氣體為放射性或超極化氣體時(shí)。
如此獲得的含適宜氣體的凍干產(chǎn)品由此可在通過(guò)將其溶于水性載體以獲得充氣微氣泡的混懸液的重建之前，被穩(wěn)定地保藏幾個(gè)月。
可使用任何可填充上述微泡的氣體、氣體前體或其混合物，該氣體的選自依賴(lài)于所選的用藥程式。
該氣體可含有，例如，空氣；氮?dú)?；氧氣；二氧化碳；氫氣；一氧化二氮；稀有或惰性氣體例如氦、氬、氙或氪；放射性氣體例如Xe133或Kr81；超極化稀有氣體例如超極化氦、超極化氙或超極化氖；低分子量烴(例如含不超過(guò)7個(gè)碳原子)，例如，諸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷或異戊烷的烷烴，諸如環(huán)丁烷或環(huán)戊烷的環(huán)烷烴，諸如丙烯、丁烯或異丁烯的烯烴或炔，諸如乙炔；醚；酮；酯；鹵化氣體，優(yōu)選氟化氣體，例如或鹵代、氟化或全氟化低分子量烴(例如含高至7個(gè)碳原子)；或任何前述氣體的混合物。如使用鹵代烴，優(yōu)選在所述化合物中的至少一些，或更優(yōu)選全部鹵原子都為氟原子。
優(yōu)選氟化氣體，尤其是全氟化氣體，尤其是在超聲成像領(lǐng)域中。氟化氣體包括含至少一個(gè)氟原子的物質(zhì)，例如，氟化烴(含一個(gè)或多個(gè)碳原子和氟的有機(jī)化合物)；六氟化硫；氟化，優(yōu)選全氟化酮，例如全氟化丙酮；和氟化，優(yōu)選全氟化的醚，例如全氟乙醚。優(yōu)選化合物為全氟化氣體，例如SF6或全氟化碳(全氟化烴)，即所有的氫原子都被氟原子取代的烴，已知它可形成特別穩(wěn)定的微氣泡混懸液，例如在EP 0554213中公開(kāi)的，在此將其引用作為參考。術(shù)語(yǔ)全氟化碳包括飽和，不飽和和環(huán)全氟化碳。生物相容的，生理上可接受的全氟化碳的實(shí)例有全氟烷，例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟-n-丁烷，任選于其他異構(gòu)體例如全氟-異丁烷混合)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟烯烴，例如全氟丙烯、全氟丁烯(例如全氟丁-2烯)或全氟丁二烯；全氟炔烴(例如全氟丁-2-炔)；和全氟環(huán)烷烴(例如全氟環(huán)丁烷、全氟甲基環(huán)丁烷、全氟二甲基環(huán)丁烷、全氟二甲基環(huán)丁烷、全氟環(huán)戊烷、全氟甲基環(huán)戊烷、全氟二甲基環(huán)戊烷、全氟環(huán)己烷、全氟甲基環(huán)己烷和全氟環(huán)庚烷)。優(yōu)選飽和的全氟化碳具有通式CnFn+2，其中n為1-12，優(yōu)選2-10，更優(yōu)選3-8，再更優(yōu)選3-6。適宜的全氟化碳包括，例如，CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、C5F12、C6F12、C6F14、C7F14、C7F16、C8F18和C9F20。
尤其優(yōu)選的氣體為SF6或選自CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10的全氟化碳及其混合物；SF6、C3F8、C4F10尤其優(yōu)選。
可有利地使用上述任何氣體以任何比例的混合物。例如，該混合物可包含常規(guī)氣體，例如氮?dú)狻⒖諝饣蚨趸己托纬煞€(wěn)定微氣泡混懸液的氣體，例如如上所示的六氟化硫或全氟化碳。適當(dāng)?shù)臍怏w混合物的實(shí)例可在例如WO 94/09829中找到，在此將其引用以做參考。以下組合尤其優(yōu)選氣體(A)和(B)的混合物，其中氣體(B)為氟化氣體，優(yōu)選選自SF6、CF4、C2F6、C3F6、C3F8、C4F6、C4F8、C4F10、C5F10、C5F12或它們的混合物，并且(A)選自空氣、氧氣、氮?dú)?、二氧化碳或它們的混合物。氣體(B)的含量為總混合物約0.5％-約95％v/v，優(yōu)選約5％-80％。
在一些情況中，需要向氣體物質(zhì)中加入前體(即能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成氣體的物質(zhì))。氣體前體和從此衍生的氣體優(yōu)選為生理上可接受的。該氣體前體可為pH活化的，光活化的，溫度活化的等。例如，某些全氟化碳可被用作溫度活化的氣體前體。這些全氟化碳，例如全氟戊烷或全氟己烷具有高于室溫(或該產(chǎn)生或保藏該制劑的溫度)，但低于體溫的液/氣相變溫度；因此，它們?cè)谌梭w內(nèi)經(jīng)歷了液/氣相變并轉(zhuǎn)化為氣體。此外，此處所用的術(shù)語(yǔ)“氣體”包括在正常人體溫度37℃下蒸汽形式的混合物。因此，在37℃下為液體的化合物還可以有限含量與其他氣體化合物混合從而獲得在37℃下為蒸汽相的混合物。
用于超聲回波描記時(shí)，該生物相容氣體或氣體混合物優(yōu)選選自空氣、氮?dú)?、二氧化碳、氦、氪、氙、氬、甲烷、鹵代烴(包括氟化氣體例如全氟化碳和六氟化硫)或它們的混合物。有利地可使用全氟化碳(尤其是C4F10或C3F8)或SF6，任選地與空氣或氮?dú)饣旌稀?br> 當(dāng)用于MRI時(shí)，微氣泡優(yōu)選包含超極化稀有氣體例如超極化氖、超極化氦、超極化氙、或它們的混合物，任選地與空氣、CO2、氧氣、氮?dú)?、氦、氙、或任何一個(gè)上述定義的鹵代烴混合。
當(dāng)用于閃爍顯像時(shí)，本發(fā)明的微氣泡將優(yōu)選包含放射性氣體例如，Xe133或Kr81，或它們的混合物，任選地與空氣、CO2、氧氣、氮?dú)狻⒑?、kripton、或任何一個(gè)上述定義的鹵代烴混合。
該凍干組合物與氣體接觸后，只需要在最小程度攪拌的情況下，例如由手輕微振動(dòng)產(chǎn)生的，便可很容易通過(guò)加入適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌含水注射用和生理可接受的載體液體而被重建，這種載體液體例如無(wú)菌無(wú)熱源注射用水，諸如生理鹽水(其有利地處于平衡狀態(tài)從而使得注射用的終產(chǎn)品不會(huì)為低滲)的水溶液，或一種或多種諸如鹽(例如含生理耐受的抗衡離子的血漿陽(yáng)離子的鹽)這樣的張度調(diào)節(jié)物質(zhì)的水溶液，或糖、糖醇、二元醇和其他非離子多元醇物質(zhì)(例如葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等)。
正如申請(qǐng)人所發(fā)現(xiàn)的，如此獲得的重建微氣泡的數(shù)量平均直徑通常稍微低于乳劑微滴的數(shù)量平均直徑。微氣泡的數(shù)量平均直徑通常時(shí)乳劑微滴的數(shù)量平均直徑的約60％-約90％。在多數(shù)情況下，只觀測(cè)到具有微滴約70-75％平均數(shù)量直徑的微氣泡的平均數(shù)量直徑。當(dāng)干燥產(chǎn)品置于管形瓶中時(shí)，適宜用隔膜密封，通過(guò)該隔膜用任選預(yù)裝注射器可注射該載體液體；作為選擇地，可在二元倉(cāng)設(shè)備例如雙室注射器中一起提供該干燥產(chǎn)品和載體液體?？捎欣卦谥亟ê蠡旌匣蜉p輕振動(dòng)產(chǎn)品。然而，如上所述，在本發(fā)明的穩(wěn)定造影劑中，氣體微氣泡的尺寸可基本上不受對(duì)重建的干產(chǎn)品施用的攪拌能量的大小的影響。相應(yīng)地，為了獲得具有一致微氣泡尺寸的可重現(xiàn)產(chǎn)品，不需要不超過(guò)輕微手振動(dòng)的攪拌。
在水或水溶液中重建產(chǎn)生的微氣泡混懸液可在至少12小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，因此，對(duì)于在注射前何時(shí)重建該凍干產(chǎn)品，可允許相當(dāng)?shù)撵`活性。
除非其含有已知需要特殊保藏條件的超極化氣體，否則可在不需要對(duì)其環(huán)境的溫度進(jìn)行控制的情況下，儲(chǔ)藏該凍干殘余物，尤其，可將其以現(xiàn)場(chǎng)制備成即用可給藥的混懸液的制劑形式提供給醫(yī)院或醫(yī)生，而不需要這些使用者具有特殊的儲(chǔ)藏設(shè)備。
在這種情況下優(yōu)選以其雙組分試劑盒的形式提供。
所述雙組分試劑盒可包括兩個(gè)獨(dú)立的容器或雙室容器。在第一種情況下，該容器優(yōu)選常規(guī)的隔膜密封的管形瓶，其中含有步驟b)的凍干殘余物的管形瓶用隔膜密封，通過(guò)該隔膜用任選預(yù)裝注射器可注射該載體液體。在這種情況下，使用的作為第二組分容器的注射器還可接著用于注射造影劑。在后一種情況下，該雙室容器優(yōu)選為雙室注射器，一旦凍干制品被重建，并隨后被適當(dāng)?shù)鼗旌匣蜉p輕振動(dòng)，該容器就可直接用于注射造影劑。在這兩種情況下，都提供了將充足的形成氣泡的能量引入容器的內(nèi)容物的方式。然而，如上所述，在本發(fā)明的穩(wěn)定造影劑種，氣體微氣泡的尺寸基本上不受對(duì)重建的凍干產(chǎn)品所使用的攪拌能量大小的影響。相應(yīng)地，為了獲得具有一致微氣泡尺寸的可重現(xiàn)產(chǎn)品，不需要不超過(guò)輕微手振動(dòng)的攪拌。
可理解的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其他能夠?qū)龈煞勰┡c水溶液以無(wú)菌方式混合的兩室重建體系也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。換言之，如果水相可被插入到水不溶性氣泡與環(huán)境之間，其尤其有利于延長(zhǎng)產(chǎn)品的貯存期限。如果形成造影劑必要的物質(zhì)不在容器中(例如在重建過(guò)程中將連于磷脂的靶向配位體)，它可被包裝在試劑盒的另一個(gè)組分中，優(yōu)選以便于與試劑盒中其他組分立即混合的形式或在這樣的容器中。
不需要特殊的容器、管形瓶或連接體系；本發(fā)明可使用常規(guī)容器、管形瓶和適配器。僅有的要求就是在塞子和容器之間的良好密封。因此，密封的質(zhì)量變成了主要關(guān)注的問(wèn)題；任何密封完整性的降級(jí)都會(huì)使不期望的物質(zhì)進(jìn)入管形瓶。除了確保無(wú)菌，真空貯留對(duì)于在周?chē)鷼鈮夯驕p壓下塞阻產(chǎn)品以保安全適當(dāng)?shù)闹亟ㄖ陵P(guān)重要。至于塞子，其可為基于彈性體的化合物或多組分制劑，例如聚(異丁烯)或丁基橡膠。
通過(guò)本發(fā)明方法獲得的造影劑可用于多種診斷成像技術(shù)中，包括尤其是超聲和磁共振中。其他可能的診斷成像應(yīng)用包括閃爍顯像，光影像和X射線(xiàn)成像，包括X射線(xiàn)相差造影成像。
它們?cè)谠\斷超聲成像和MR成像中的應(yīng)用，例如，作為易感性造影劑和超極化氣泡，構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選特征。多種成像技術(shù)可用于超聲應(yīng)用中，例如包括基諧波和諧波B型成像，脈沖或反相成像和基諧波和諧波多普勒顯像；如愿意，還可使用三維成像技術(shù)。
兔子、狗和豬的體內(nèi)超聲試驗(yàn)顯示在靜脈注射0.001ml/kg體重的低劑量后本發(fā)明造影劑可增強(qiáng)來(lái)自15-25dB心肌的反向散射信號(hào)強(qiáng)度。用更靈敏的技術(shù)例如彩色多普勒或電力脈沖倒置，可在更低劑量處觀察到信號(hào)。已發(fā)現(xiàn)在這些低劑量處，充血室例如心室中的衰減足夠低以至于可目測(cè)觀察到心肌脈管系統(tǒng)中的興趣區(qū)。試驗(yàn)證明這些將通過(guò)全血池分布的靜脈注射的造影劑因此增強(qiáng)了所有血管化組織的產(chǎn)生回聲性，并進(jìn)行再循環(huán)。還發(fā)現(xiàn)它們可用作普通的多普勒信號(hào)增強(qiáng)助劑，并還可用于超聲計(jì)算機(jī)斷層成像及生理上激發(fā)的或間歇成像中。
對(duì)于超聲應(yīng)用例如超聲心動(dòng)描記，為了保證肺系中的自由通行并與優(yōu)選約0.1-15MHz的成像頻率產(chǎn)生共振，通常使用具有0.1-10μm，例如0.5-7μm的平均尺寸的微氣泡。如上所述，為了獲得在有利于超聲心動(dòng)描記范圍內(nèi)的微氣泡分散系，可生產(chǎn)具有非常窄粒度分布的本發(fā)明造影劑，從而大大增強(qiáng)它們的產(chǎn)生回聲性及它們?cè)隗w內(nèi)的安全性，并賦予造影劑在諸如血壓測(cè)量、血流示蹤和超聲斷層成像這樣的應(yīng)用中特殊的優(yōu)點(diǎn)。
在超聲應(yīng)用中，可以以下劑量施用本發(fā)明造影劑，即例如使注射的磷脂在0.1-200ug/kg體重，通常當(dāng)對(duì)乳劑不進(jìn)行洗滌步驟時(shí)10-200ug/kg，及如在凍干前洗滌乳劑，則0.1-30ug/kg的含量范圍內(nèi)?？衫斫獾氖?，使用如此低水平的磷脂在最小化可能存在的毒副作用方面是相當(dāng)有利的。此外，在有效劑量中的低水平磷脂可使劑量增加從而在不出現(xiàn)不良影響的情況下延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的方法使得能夠獲得小粒徑，顯示出極窄粒度分布的充氣微氣泡。因此，通過(guò)適當(dāng)選擇混合物的組分及在水-有機(jī)混合物的乳化過(guò)程中施用特定大小的攪拌能量，就有可能獲得具有預(yù)期數(shù)量平均直徑和粒度分布的充氣微氣泡。
尤其，通過(guò)使用本發(fā)明的方法，就有可能獲得包含磷脂穩(wěn)定的小粒徑氣體微氣泡，以具有相對(duì)較小平均尺度和尤其有益窄和受控的粒度分布為特征的造影劑。
如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，微/納米顆粒的尺度和它們各自的粒度分布可以參數(shù)數(shù)量表征，最常用的是數(shù)量平均直徑DN，數(shù)量中位直徑DN50，體積平均直徑DV和體積中位直徑DV50。數(shù)量直徑提供了顆粒平均數(shù)量尺度的指示，而體積直徑提供了顆粒整體體積如何在整體數(shù)量中分布的信息。由于極少數(shù)大體積顆粒在小體積顆粒群體中的存在會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的DV值像高值方向移動(dòng)，因此，有時(shí)使用DV50值評(píng)價(jià)顆粒群體的分布更加方便。DV50是顯示顆粒內(nèi)部體積總值的一半在具有低于DV50直徑的顆粒中的計(jì)算值；這就降低了意外形成的大體積顆粒在粒度分布的評(píng)估中的影響。顯然，單一尺寸的顆粒顯示出一致的DN、DN50、DV和DV50值。在另一方面，不斷拓寬的顆粒分布將導(dǎo)致各個(gè)數(shù)值之間出現(xiàn)巨大差異，相應(yīng)地出現(xiàn)其各個(gè)比例的變化(例如DV/DN比例的增加)。例如，主要含小顆粒(例如約2μm的直徑)與相反小比例的大顆粒(例如直徑超過(guò)8μm)的顆粒群體顯示出相對(duì)于DN值，較高的DV或DV50值，相應(yīng)地較高的DV/DN或DV50/DN比例。
因此發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法尤其適于制備具有低于1.70μm的數(shù)量平均直徑(DN)和使得DV50/DN比例約為2.30或更低，優(yōu)選低于2.10的體積中位直徑(DV50)的微氣泡。所述DN值優(yōu)選為1.60μm或更低，更優(yōu)選1.50μm或更低，再更優(yōu)選1.30μm或更低。用本發(fā)明的方法很容易獲得具有較低DN值，例如約1μm或更低，例如0.85μm并下至0.80μm的微氣泡。DV50/DN比例優(yōu)選約1.80或更低，更優(yōu)選約1.60或更低，再更優(yōu)選約1.50或更低。可很容易地獲得具有較低DV50/DN比例，例如1.20及更低，例如1.05的微氣泡。
此外，在根據(jù)本發(fā)明可獲得的小尺寸窄分布微氣泡的混懸液中，觀測(cè)到直徑大于3μm的微氣泡數(shù)量(表示為占顆?？倲?shù)量的顆粒百分比)，尤其是DN低于約1.5μm而且DV50/DN比例低于約2.00的微氣泡，通常低于混懸液中微氣泡總數(shù)量的約3％，優(yōu)選低于約2％，更優(yōu)選低于約1％。在重建混懸液總的微氣泡濃度通常為至少1×108顆粒每毫升，優(yōu)選至少1×109顆粒每毫升。
上述DV50、DN值以及微氣泡的數(shù)量是指通過(guò)設(shè)置在30μm孔徑，和0.7-20μm的測(cè)量發(fā)范圍的庫(kù)爾特粒度儀Mark II儀器測(cè)量的結(jié)果。
這類(lèi)特殊的造影劑在超聲成像中，尤其用于如下解釋的依賴(lài)于微氣泡的非線(xiàn)性散射的成像技術(shù)時(shí)，尤其有價(jià)值。
最近的超聲造影成像技術(shù)是利用超聲造影劑的非線(xiàn)性散射特點(diǎn)。從文獻(xiàn)(例如Eatock等，Journal of the Acoustical Society ofAmerica，vol.77(5)，pp1692-1701，1985)中可知，非線(xiàn)性散射只對(duì)比共振尺寸小或與其接近的微氣泡具有顯著意義。尤其可方便地利用具有共振尺寸一半尺度的微氣泡。“共振尺寸的一半”是指具有發(fā)射超聲波的中心頻率(其對(duì)于特定應(yīng)用，可具有高達(dá)約60MHz)兩倍大共振頻率的微氣泡的尺寸。當(dāng)對(duì)一批含基于微氣泡的超聲造影劑進(jìn)行成像時(shí)，該微氣泡對(duì)組織回聲的回聲的可探測(cè)性通過(guò)微氣泡的非線(xiàn)性散射水平而增強(qiáng)，并通過(guò)由位于探針和興趣區(qū)之間的微氣泡導(dǎo)致的衰減而降低。沿發(fā)射通路的衰減減小了可用于發(fā)生非線(xiàn)性氣泡感應(yīng)的超聲能量；沿接收通路的衰減消除了能夠到達(dá)超聲探針的回聲能量。對(duì)于含廣泛微氣泡粒度分布的混懸液，主要由共振尺寸和大于共振尺寸的微氣泡，在不以有效促成非線(xiàn)性回聲信號(hào)的情況下，促成發(fā)射-接收衰減。因此，對(duì)非線(xiàn)性成像的整體聲學(xué)感應(yīng)大大受益于對(duì)具有窄粒度分布和接近共振尺寸一半大平均尺寸的微氣泡的標(biāo)刻度設(shè)定的使用。優(yōu)選使用具有相應(yīng)于約2.30或更低，優(yōu)選2.10或更低，更優(yōu)選2.00或更低的DV50/DN比例的粒度分布的微氣泡。使用的微氣泡的平均尺寸優(yōu)選約共振尺寸一半的10％，更優(yōu)選約共振尺寸一半的5％。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種診斷成像的方法，其包括對(duì)受體施用造影增強(qiáng)含量的包括具有如上說(shuō)明的尺寸和粒度分布的充氣微氣泡的造影劑，及對(duì)所述受體的至少部分進(jìn)行成像。尤其，所述的診斷成像包括通過(guò)超聲儀器以預(yù)定發(fā)射頻率發(fā)出的超聲波使所述受體接受超聲波的作用，由此可測(cè)定相應(yīng)的微氣泡共振尺寸，并施用造影劑，其含具有窄粒度分布和接近共振尺寸一半大的平均尺寸的充氣微氣泡。微氣泡的窄粒度分布和平均尺寸優(yōu)選如上定義。例如，可在診斷成像法中使用Philips的HDI 5000超聲儀(例如，以脈沖倒置模式，帶L7-4探頭和0.07的機(jī)械指數(shù))。根據(jù)這一方法，所述受體是脊椎動(dòng)物，并使所述造影劑進(jìn)入脈管系統(tǒng)或進(jìn)入所述脊椎動(dòng)物的體腔?？梢栽噭┖械男问教峁┧鲈煊皠缒切┰谇懊枋龅?，包含與用于重建的氣體和水性介質(zhì)接觸的凍干產(chǎn)品。
給出以下非限定性實(shí)施例以更好說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例下列實(shí)施例中使用了以下物質(zhì)。
磷脂DPPS二棕櫚?；字＝z氨酸(Genzyme)IUPAC1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿DPPG二棕櫚?；字８视外c鹽(Genzyme)IUPAC1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)]DSPA二硬脂?；字徕c(Genzyme)IUPAC1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸鹽DSPG二硬脂酰基磷脂酰甘油鈉鹽(Genzyme)
IUPAC1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸絲氨酸)DSPC二硬脂?；字Ｄ憠A(Genzyme)IUPAC1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿DSEPC 二硬脂酰基乙基磷脂酰膽堿(Avanti Polar Lipids)IUPAC1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿DAPC二花生?；字Ｄ憠A(Avanti Polar Lipids)IUPAC1，2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿DSTAP 1，2-二硬脂酰基-3-三甲銨-氯化丙烷(Avanti PolarLipids)DSPE-PEG2000 由PEG2000修飾的二硬脂?；字Ｒ掖及?，鈉鹽(Nektar Therapeutics)DSPE-PEG5000 由PEG5000修飾的二硬脂?；字Ｒ掖及罚c鹽(Nektar Therapeutics)DSPE-PEG2000-馬來(lái)酰亞胺 由PEG2000馬來(lái)酰亞胺修飾的二硬脂?；字Ｒ掖及?Avanti Polar Lipids)SATAN-琥珀酰亞胺基-S-乙硫酰醋酸酯(Pierce)RGD-4C H-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-NH2(AnaSpec Inc.)溶劑全氟-n-己烷(C6F14)，由Fluka提供全氟甲基環(huán)己烷(CF3-環(huán)-C6F11)，由Fluka提供全氟-n-庚烷(C7F16)，由Fluka提供全氟-n-壬烷(C9F20)，由Aldrich提供全氟萘烷，由Aldrich提供環(huán)己烷，由Fluka提供環(huán)辛烷，由Fluka提供n-癸烷，由Fluka提供n-辛烷，由Fluka提供間二甲苯，由Fluka提供二異丙基紫羅蘭酮，由Fluka提供CCl4，由Fluka提供凍干保護(hù)劑甘露糖，由Fluka提供葡萄糖，由Fluka提供山梨糖醇，由Fluka提供甘露醇，由Fluka提供麥芽糖，由Fluka提供葡聚糖6000，由Fluka提供葡聚糖15000，由Fluka提供葡聚糖40000，由Fluka提供菊粉，由Fluka提供微滴和微氣泡的特征測(cè)量乳劑微滴的粒度分度a)當(dāng)對(duì)乳劑進(jìn)行洗滌時(shí)，用庫(kù)爾特粒度儀(將Counter Mark II儀器調(diào)節(jié)在30μm孔徑0.7-20μm測(cè)量范圍)；在室溫下用100ml鹽水稀釋10μl乳劑，并在測(cè)量前將乳劑平衡3分鐘；b)如果還沒(méi)有對(duì)乳劑進(jìn)行洗滌操作，使用激光散射粒子分選機(jī)(Malvern Mastersizer，稀釋200倍，焦距45mm，標(biāo)準(zhǔn)顯示)。
用Counter Mark II儀器，將其調(diào)節(jié)在30μm孔徑，選擇0.7-20μm測(cè)量范圍，測(cè)量粒度分布，體積濃度和微氣泡的數(shù)量(凍干和用水相重建后)。用100ml鹽水在室溫下稀釋50μl的微氣泡樣品，并在測(cè)量前平衡3分鐘。
用HPLC-MS分析，以以下設(shè)置測(cè)定磷脂在最終制品(微氣泡混懸液的乳劑)中的含量Agilent 1100LC色譜儀，源自Maherey Nagel的MN CC 125/2mm-5C8柱，Agilent MSD G1946D檢測(cè)儀。
凍干凍干方法和儀器如下。先在-45℃下將乳劑(任選在洗滌步驟之后，如存在)冷凍5分鐘，然后在室溫和0.2mbar的壓力下用Christ-Alpha 2-4冷凍干燥器將其冷凍干燥(凍干)。
實(shí)施例1(制品1a-1n)將10mg的DPPS加入到約10ml的10％(w/w)甘露醇水溶液中；在65℃下加熱該混懸液15分鐘，然后冷卻至室溫(22℃)。將全氟庚烷(8％v/v)加入到水相中，然后在約4cm的燒杯中用高速均漿器(Polytron T3000，探針直徑為3cm)以表1所示的速度將其乳化1分鐘。所得乳劑微滴的體積的中位直徑(DV50)和數(shù)量的平均粒徑(DN)顯示在表1中。然后將乳劑離心(800-1200rpm，10分鐘，Sigma離心機(jī)3K10)從而除去多余的磷脂，回收分離的小丸(微滴)，以初始體積的10％甘露醇水溶液再混懸該乳劑。
然后將洗過(guò)的乳劑收集到100ml的用于凍干球形玻璃瓶中，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⑵淅鋬鋈缓罄鋬龈稍铩Ｈ缓髮龈傻漠a(chǎn)品置于含35％全氟-n-丁烷和65％氮?dú)獾臍怏w中，接著通過(guò)手輕微抖動(dòng)，將其分散于兩倍初始體積的水中。用庫(kù)爾特粒度儀分析用蒸餾水重建所得的微氣泡混懸液。微氣泡在所得的混懸液中的濃度約為1×109粒每ml。微氣泡的體積的中位直徑(DV50)，體積的平均粒徑(DV)，數(shù)量的平均粒徑(DN)，以及直徑大于3μm的微氣泡含量分別顯示在表1中(微氣泡總數(shù)量的百分比)。如果以相同的攪拌速率下進(jìn)行了多于一個(gè)的實(shí)施例，那么表1所示的數(shù)值是指每個(gè)參數(shù)的平均計(jì)算值。
表1
實(shí)施例2(制品2a-2j)采用與實(shí)施例1相同的步驟，僅有區(qū)別在于磷脂為DPPS(20％w/w)和DSPC(80％w/w)的混合物，磷脂的含量不變。結(jié)果總結(jié)在表2中。
表2
實(shí)施例3(制品3a-3p)采用與實(shí)施例2相同的步驟，僅有的區(qū)別在于DPPS/DSPC重量比例不同，如表3中所記載的。結(jié)果總結(jié)在表3中。
表3
實(shí)施例4采用與實(shí)施例2相同的步驟，僅有的區(qū)別在于制備了不同重量比例的DSPA和DPPS的混合物。結(jié)果總結(jié)在表4中。
表4
實(shí)施例5(制品5a-5i)用實(shí)施例1中相同的步驟，僅有的區(qū)別在于使用了1/1(w/w)的DPPG和DSPC磷脂混合物(總濃度為1.0mg/ml)與10％w/w(相對(duì)于磷脂總重量)棕櫚酸的混合物。結(jié)果總結(jié)在表5中。
表5
實(shí)施例6采用與實(shí)施例1相同的步驟，僅有的區(qū)別在于將DSEPC用作磷脂，并用全氟己烷作為有機(jī)溶劑。采用11000rpm的轉(zhuǎn)速。尺寸、粒度分布和直徑大于3μm的微氣泡的百分比例如下所示。
DV50(μm) DN(μm) DV50/DN＞3μm(％)1.651.11 1.490.30實(shí)施例7(制品7a-71)在70℃下加熱含作為磷脂的DPPS(10mg)的蒸餾水(10ml)15分鐘，然后將其冷卻至室溫。用高速均漿器(Polytron T3000)以10000rpm每分鐘的速度，在水相中乳化表6中所示的0.8ml的有機(jī)溶劑。將該乳劑加入到10ml的15％葡聚糖15000溶液，冷凍并凍干(0.2mbar，24小時(shí))。凍干后，向冷凍干燥器中通入空氣。用庫(kù)爾特粒度儀分析用蒸餾水重建后獲得的微氣泡混懸液。表6簡(jiǎn)要顯示了微氣泡的尺寸和粒度分布方面的結(jié)果。
表6
實(shí)施例8用全氟己烷作為有機(jī)溶劑，用同樣的方法重復(fù)實(shí)施例7，不同濃度的不同凍干保護(hù)劑顯示在表7中。表7簡(jiǎn)要顯示了微氣泡的尺寸和粒度分布方面的結(jié)果。
表7
實(shí)施例9(制品9a-9e)通過(guò)以10000rpm的速率乳化混合物重復(fù)實(shí)施例1。此外，如表8所示，通過(guò)在乳化前向水相中加入不同量的PluronicF68(相當(dāng)于聚羥亞烴188的泊洛沙姆)，重復(fù)實(shí)施例1。表8顯示了在粒度分布和微氣泡轉(zhuǎn)化產(chǎn)率方面的比較試驗(yàn)結(jié)果。轉(zhuǎn)化產(chǎn)率是指在凍干基質(zhì)重建中形成的充氣微氣泡的數(shù)量占乳劑中被測(cè)定的微滴數(shù)量的百分比。
表8
*濃度是指水相體積。
上述結(jié)果顯示了當(dāng)泊洛沙姆濃度相當(dāng)于磷脂濃度的一半(即約33％混合物中表面活性劑的總重量)時(shí)，微氣泡的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率和粒度分布都受到了負(fù)面影響。
實(shí)施例10(制品10a-10d)重復(fù)實(shí)施例9，然而在乳化之前向有機(jī)相中加入不同量的膽固醇(由Fluka提供)而不是向水相中加入PluronicF68，如表9所示。表9中的結(jié)果顯示了微氣泡在粒度分布和轉(zhuǎn)化(從乳劑的微滴)產(chǎn)率方面的比較試驗(yàn)結(jié)果。
表9
*濃度是指水相的體積。
上述結(jié)果顯示了在水相中膽固醇以0.050％(w/w)的濃度，微氣泡的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率和粒度分布都很大程度地受到了負(fù)面影響。然而以0.025％的濃度，卻可產(chǎn)生微氣泡的可接受的尺寸和粒度分布，但是轉(zhuǎn)化產(chǎn)率仍然很低。
實(shí)施例11在70℃下加熱含60mgDPPS和3g甘露醇的蒸餾水(30ml)15分鐘，然后將其冷卻至室溫。用高速均漿器(Polytron，12500rpm，1分鐘)在該水相中乳化全氟庚烷。將獲得的具有2.3μm體積中位直徑(DV50)和2.0μm數(shù)量平均粒徑的乳劑用離心法洗滌一次，在30ml 10％甘露醇的蒸餾水溶液中將其重懸，然后將其分成3份(3×10ml)。第一份(A)用于接下來(lái)的凍干步驟。第二份(B)被收集到注射器中并將其手推注射通過(guò)一個(gè)5μm的Nuclepore過(guò)濾器(47mm-聚碳酸酯)。用同樣的方法將第三份(C)過(guò)濾通過(guò)3μm的Nuclepore過(guò)濾器(47mm-聚碳酸酯)。在100ml的球形玻璃瓶中冷凍該乳劑(-45℃5分鐘)，然后再將其冷凍干燥(0.2mBar，72小時(shí))。通過(guò)加入35/65的C4F10和空氣的混合物而重建大氣壓力。將凍干物分別分散在蒸餾水(10ml)中。用庫(kù)爾特粒度儀分析如此獲得的微氣泡混懸液，結(jié)果顯示在以下表中。
DV50DNDV50/DNA部分 1.711.12 1.53B部分 1.651.12 1.47C部分 1.571.09 1.44如上結(jié)果顯示，附加的過(guò)濾步驟進(jìn)一步降低了微氣泡的尺寸并降低了各自的粒度分布。
實(shí)施例12通過(guò)使用10mg的7/3(w/w)DSPC/DSTAP混合物，以11000rpm的攪拌速度，重復(fù)實(shí)施例1。
以下顯示了乳劑微滴和微氣泡的特征
實(shí)施例13通過(guò)以10000rpm(實(shí)施例13a)乳化混合物，重復(fù)實(shí)施例1。通過(guò)向初始水性混懸液中進(jìn)一步加入約0.9mgDSPE-PEG2000(約分散磷脂總量的8.3％)而制備同樣的制品(實(shí)施例13b)。對(duì)兩中制品都不用離心法進(jìn)行洗滌。表10顯示了乳劑和微氣泡混懸液這兩種制品的特征。
表10
上述結(jié)果顯示了DSPE-PEG的濃度低于10％重量比(相對(duì)于磷脂總量)時(shí)，微氣泡的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率和粒度分布都受到負(fù)面影響。
實(shí)施例14通過(guò)用相同量的DAPC/DPPS 1∶1(w/w)混合物代替DPPS，重復(fù)實(shí)施例11。
不使用離心洗滌，將所得乳劑分為10ml的三份。
通過(guò)超聲(3mm超聲探針，Branson 250超聲儀，輸出量30％，5分鐘)將25mg的各個(gè)DSPE-PEG分散在5ml的10％甘露醇溶液中從而分別制備DSPE-PEG2000和DSPE-PEG5000的水性混懸液。
然后將10％甘露醇溶液的2.5ml部分加入到乳劑的第一份(實(shí)施例14a)中。
將制備的DSPE-PEG2000的2.5ml部分加入到乳劑的第二份(實(shí)施例14b)中。
將制備的DSPE-PEG5000的2.5ml部分加入到乳劑的第三份(實(shí)施例14c)中。
在60℃下攪拌加熱上述三種混合物1小時(shí)。冷卻至室溫后，用Malvern Mastersizer測(cè)量微滴尺寸。結(jié)果記載在表11中。
然后按照實(shí)施例11的步驟冷凍干燥該乳劑。通過(guò)加入35/65的C4F10和空氣的混合物而重建大氣壓力。將凍干物分別分散在蒸餾水(10ml)中。用庫(kù)爾特粒度儀分析如此獲得的微氣泡混懸液(參見(jiàn)表11)。
然后用蒸餾水通過(guò)離心法(180g/10分鐘)將微氣泡混懸液洗滌兩次，然后根據(jù)上述步驟將其凍干。用HPLC-MS法測(cè)定DSPE-PEG在干燥組合物中的含量。結(jié)果顯示在下表11中。
表11
從上述結(jié)果可推知，后來(lái)向形成的乳劑中加入DSPE-PEG混懸液使得在不對(duì)微氣泡最終性質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響的情況下，能夠在穩(wěn)定層的組合物中加入相對(duì)高劑量的DSPE-PEG(在這種情況下超過(guò)磷脂總重量的30％形成了穩(wěn)定包封物)。
用其他PEG-修飾磷脂，尤其是DSPE-PEG2000-生物素或DSPE-PEG2000-馬來(lái)酰亞胺，及用帶磷脂的肽，尤其是DSPE-PEG2000-馬來(lái)酰亞胺-SATA-RGD4C，可獲得相同的效果?？梢勒找阎椒?，通過(guò)使RGD-4C與SATA反應(yīng)，使SATA的巰基脫保護(hù)并使該脫保護(hù)的RGD4C-SATA與DSPE-PEG2000-馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)而制備后述的帶磷脂的肽。該制備方法記載在Bioconjugate chemistry，2002，13，737-743，Bohl Kullberg等的“用于靶向運(yùn)輸硼酸鹽化DNA-聯(lián)合劑的EGF結(jié)合脂質(zhì)體的發(fā)展”(描述了EGF蛋白在DSPE-PEG-馬來(lái)酰亞胺分子中的插入)，可方便地使用。
實(shí)施例15將10mg的1∶1(w/w)DPPS/DSPC混合物加入到約10ml的10％甘露醇水溶液中。
在70℃下將該混合物加熱15分鐘并將其冷卻至室溫(22℃)。以0.2ml/分鐘的流速通過(guò)微觀混合器的進(jìn)樣口(標(biāo)準(zhǔn)隙縫Interdigidital微觀混合器，帶鎳-蓋-銅嵌體的housing SS316Ti，40μm×300μm，Microtechnik Mainz GmbH研究所)向在室溫下以20ml/分鐘的速度循環(huán)的水相中加入環(huán)辛烷，使有機(jī)溶劑的總量達(dá)到7.4％(v/v)。加完有機(jī)溶液后，在該微觀混合器中將該乳劑再循環(huán)20分鐘。
然后將該乳劑分為每2ml的5整份，將它們裝入5個(gè)管形瓶DIN8R中。密封4個(gè)管形瓶，并如表12所示，分別在60、80、100和120℃的溫度下加熱4個(gè)管形瓶30min，而第5個(gè)不加熱。
然后將乳劑冷卻至室溫，并根據(jù)下述步驟將5個(gè)管形瓶的內(nèi)容物凍干。將每個(gè)乳劑的1ml收集入DIN8R管形瓶中，然后在-5℃下冷凍；將溫度在1小時(shí)期間降到-45℃以下，然后在-25℃，0.2mbar下冷凍干燥該乳劑12小時(shí)(Telstar Lyobeta35冷凍干燥器)，最后在30℃，0.2mbar下干燥5小時(shí)。
然后將該凍干產(chǎn)品置于含35％全氟-n-丁烷和65％氮的氣體中，接著通過(guò)手輕微抖動(dòng)將其分散在兩倍于初始體積的水中。表12顯示了微氣泡終混懸液的特征。
表12
上述結(jié)果說(shuō)明通過(guò)對(duì)形成的乳劑進(jìn)行熱處理，使得微氣泡混懸液出現(xiàn)了較窄的粒度分布，同時(shí)增加了微氣泡的數(shù)量。尤其通過(guò)增加加熱溫度至100℃以上，使得不對(duì)乳劑進(jìn)行任何洗滌操作時(shí)，獲得了微氣泡相對(duì)較窄的粒度分別，同時(shí)還增加了混懸液中微氣泡的數(shù)量。
實(shí)施例16在15分鐘內(nèi)將含10mgDPPS和1g甘露醇的蒸餾水(10ml)加熱至70℃，然后將其冷卻至室溫。加入DPPE-MPB(1，2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酰胺]鈉鹽-Avanti Polar Lipids)(4.8％重量比-0.5mg)。用超聲浴(Branson1210-3分鐘)將該磷脂分散在水相中。
用高速均漿器(PolytronT3000，15000rpm，1分鐘)在該水相(用冰浴冷卻)中乳化全氟庚烷(0.8ml，購(gòu)自Fluka)。
用Malvern Mastersizer測(cè)得所得乳劑具有2.3μm的體積中位直徑(DV50)和2.1μm的數(shù)量平均粒徑(DN)。
用離心法將該乳劑洗滌兩次，然后將其再混懸于9.5ml的10％甘露醇的蒸餾水溶液中。冷凍該乳劑(-45℃，5分鐘)，接著冷凍干燥(在0.2mBar下，24小時(shí))。
通過(guò)引入35/65的C4F10和空氣的混合物重建大氣壓。將該凍干產(chǎn)品分散在蒸餾水(20ml)中，用離心法沖洗該微氣泡一次，然后將其再分散于4ml的含EDTA，含3.4mg硫代乙?；寻姿氐牧姿猁}緩沖鹽水(摩爾組合物10mM磷酸鹽，2.7mM KCl，137mM NaCl，10mMEDTA)中，加入400μl的羥胺溶液(在PBS50mM中13.92mg，pH7.5)從而使硫代乙?；寻姿氐膸€基脫保護(hù)。通過(guò)在圓盤(pán)旋轉(zhuǎn)器(FisherScientific)上倒轉(zhuǎn)攪拌該混懸液2小時(shí)。然后加入150μl的NaOH1N。
用PBS通過(guò)離心法(10000rpm，10分鐘，Sigma離心機(jī)3K10)洗滌所得的卵白素標(biāo)記的微氣泡。用庫(kù)爾特粒度儀測(cè)量獲得的微氣泡混懸液，得到1.6μm的DV50和1.2μm的DN。
對(duì)靶向微氣泡組合物的作用進(jìn)行體內(nèi)和體外試驗(yàn)。
體外試驗(yàn)為了測(cè)驗(yàn)乙?；寻姿貙?duì)微氣泡表面的有效結(jié)合，制備兩套含孔的纖維蛋白。在第一套中，只存在纖維蛋白表面。在第二套中，用生物素標(biāo)記的抗纖維蛋白肽(DX-278，公開(kāi)于WO 02/055544)預(yù)處理纖維蛋白。
將如上制備的微氣泡混懸液加到孔中(5×108微氣泡/孔)。經(jīng)過(guò)2小時(shí)的培養(yǎng)(倒置)和數(shù)次洗滌后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到了兩套孔中的纖維蛋白表面。在不含生物素化的抗纖維蛋白肽的孔中基本上觀察不到微氣泡，而在含生物素化的抗纖維蛋白肽的孔中觀察到了大量的微氣泡覆蓋面。
體內(nèi)試驗(yàn)通過(guò)FeCl3法使兩只兔子的腹主動(dòng)脈中形成血栓(Lockyer et al，1999，Journal of Cardiovascular Pharmacology，vol 33，pp718-725)。
用HDI 5000超聲機(jī)(Philips)，以脈沖轉(zhuǎn)化模式，L7-4探針，MI0.07進(jìn)行回波成像。
然后對(duì)兩只兔子靜脈注射生物素化抗體(活化血小板的GPIIB/IIIA受體特異性的CD41)。
30分鐘后，對(duì)第一只兔子靜脈注射含卵白素標(biāo)記的微氣泡的微氣泡混懸液(1×109個(gè)微氣泡/ml)。注射15分鐘后，觀察到混懸液明顯的血栓造影。注射后至少1小時(shí)后還能看到該造影。
對(duì)第二只兔子靜脈注射相同劑量的不含卵白素標(biāo)記的微氣泡的微氣泡混懸液。只觀察到輕微的血栓造影。
權(quán)利要求
1.制備凍干基質(zhì)的方法，其基質(zhì)通過(guò)接觸水性載體液體和氣體可重建成主要由磷脂穩(wěn)定的充氣微氣泡的混懸液，所述方法包含幾個(gè)步驟a)制備一種水-有機(jī)乳劑包含i)一種水性介質(zhì)包括水；ii)一種基本上不與水混溶的有機(jī)溶劑；iii)一種包含超過(guò)50％重量比的磷脂的兩親性物質(zhì)的乳化組合物和iv)凍干保護(hù)劑；b)凍干所述經(jīng)乳化的混合物，從而獲得包含所述磷脂的凍干基質(zhì)。
2.制備注射用造影劑的方法，該造影劑包含主要由磷脂穩(wěn)定的充氣微氣泡的液體水性混懸液，該方法包括幾個(gè)步驟a)制備一種水-有機(jī)乳劑包含i)一種水性介質(zhì)包括水；ii)一種基本上不與水混溶的有機(jī)溶劑；iii)一種包含超過(guò)50％重量比的磷脂的兩親性物質(zhì)的乳化組合物和iv)一種凍干保護(hù)劑；b)凍干所述乳劑，從而獲得包含所述磷脂的凍干基質(zhì)；c)使所述凍干基質(zhì)與生物相容性氣體接觸；d)通過(guò)將其溶于生理可接受水性載體液體重建所述凍干基質(zhì)，從而獲得主要由所述磷脂穩(wěn)定的充氣微氣泡的混懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中制備該乳化劑的步驟a)包括a1)通過(guò)將乳化組合物和凍干保護(hù)劑分散于水性介質(zhì)中而制備混懸液；a2)用有機(jī)溶劑混合所得混懸液；a3)受控?cái)嚢柙摶旌衔?，從而獲得乳劑。
4.根據(jù)在前任何一個(gè)權(quán)利要求的方法，其中所述有機(jī)溶劑在水中的溶解度小于10g/l。
5.根據(jù)在前任何一個(gè)權(quán)利要求的方法，其中所述有機(jī)溶劑在水中的溶解度為1.0g/l或更低。
6.根據(jù)在前任何一個(gè)權(quán)利要求的方法，其中所述有機(jī)溶劑在水中的溶解度為0.2g/l或更低。
7.根據(jù)在前任何一個(gè)權(quán)利要求的方法，其中所述有機(jī)溶劑在水中的溶解度約為0.01g/l或更低。
8.根據(jù)在前任何一個(gè)權(quán)利要求的方法，其中所述有機(jī)溶劑在水中的溶解度為0.001g/l或更低。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的所述有機(jī)溶選自支鏈或直鏈烷、烯、環(huán)-烷，芳族烴、烷基醚、酮、鹵代烴、全氟化烴及其混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中溶劑選自戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、1-戊烯、2-戊烯、1-辛烯、環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)辛烷、1-甲基-環(huán)己烷、苯、甲苯、乙基苯、1，2-二甲苯、1，3-二甲苯、二丁基醚和二異丙基酮、氯仿、四氯化碳、2-氯-1-(二氟甲氧基)-1，1，2-三氟乙烷(恩氟烷)、2-氯-2-(二氟甲氧基)-1，1，1-三氟乙烷(異氟烷)、四氯-1，1-二氟乙烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟壬烷、全氟苯、全氟萘烷、甲基全氟丁醚、甲基全氟異丁醚、乙基全氟丁醚、乙基全氟異丁醚及其混合物。
11.根據(jù)在前任何一個(gè)權(quán)利要求的方法，其中所述有機(jī)溶劑的含量為約占水量1％-約50％的體積比。
12.根據(jù)在前任何一個(gè)權(quán)利要求的方法，其中所述凍干保護(hù)劑選自碳水化合物、糖醇、聚二元醇及其混合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中的凍干保護(hù)劑選自葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、環(huán)糊精、葡聚糖、氨茴酰牛扁堿、可溶淀粉、羥乙基淀粉(HES)、赤蘚糖醇、甘露醇、山梨糖醇、聚乙二醇及其混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，其中所述凍干保護(hù)劑的含量為約占水量的1％-約25％重量比。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中磷脂選自二月桂?；?磷脂酰膽堿(DLPC)、二肉豆蔻?；?磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚?；?磷脂酰膽堿(DPPC)、二花生?；?磷脂酰膽堿(DAPC)、二硬脂?；?磷脂酰膽堿(DSPC)、二油?；?磷脂酰膽堿(DOPC)、1，2二硬脂?；?sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(乙基-DSPC)、雙十五?；?磷脂酰膽堿(DPDPC)、1-肉豆蔻?；?2-棕櫚酰基-磷脂酰膽堿(MPPC)、1-棕櫚酰基-2-肉豆蔻?；?磷脂酰膽堿(PMPC)、1-棕櫚?；?2-硬脂酰基-磷脂酰膽堿(PSPC)、1-硬脂?；?2-棕櫚?；?磷脂酰膽堿(SPPC)、1-棕櫚?；?2-油基磷脂酰膽堿(POPC)、1-油基-2-棕櫚酰基-磷脂酰膽堿(OPPC)、二月桂酰基-磷脂酰甘油(DLPG)及其堿金屬鹽、二花生?；字；?甘油(DAPG)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻?；字８视?DMPG)及其堿金屬鹽、二棕櫚酰基磷脂酰甘油(DPPG)及其堿金屬鹽、二硬脂?；字８视?DSPG)及其堿金屬鹽、二油?；?磷脂酰甘油(DOPG)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻?；字?DMPA)及其堿金屬鹽、二棕櫚?；字?DPPA)及其堿金屬鹽、二硬脂?；字?DSPA)、二花生酰基磷脂酸(DAPA)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻?；?磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)、二硬脂酰基磷脂?；?乙醇胺(DSPE)、二油基磷脂?；?乙醇胺(DOPE)、二花生?；字Ｒ掖及?DAPE)、二亞油基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、聚乙二醇修飾的二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE-PEG)、聚乙二醇修飾的二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE-PEG)、聚乙二醇修飾的二硬脂?；字；?乙醇胺(DSPE-PEG)、聚乙二醇修飾的二油基磷脂?；?乙醇胺(DOPE-PEG)、聚乙二醇修飾的二花生酰基磷脂酰乙醇胺(DAPE-PEG)、聚乙二醇修飾的二亞油基磷脂酰乙醇胺(DLPE-PEG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰絲氨酸(DMPS)、二花生酰基磷脂酰絲氨酸(DAPS)、二棕櫚酰基磷脂酰絲氨酸(DPPS)、二硬脂?；字＝z氨酸(DSPS)、二油?；字＝z氨酸(DOPS)、二棕櫚?；柿字?DPSP)和二硬脂?；柿字?DSSP)及其混合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中兩親性物質(zhì)的乳劑組合物包含磷脂或一種整體帶凈電的兩親性物質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或13的方法，其中磷脂的含量為占所述乳劑混合物總重量的約0.005％-約1.0％重量比。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中磷脂的含量為占所述乳劑混合物總重量的0.01％-1.0％重量比。
19.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述磷脂包括靶向配體或能夠與靶向配體反應(yīng)的保護(hù)性反應(yīng)基團(tuán)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、15或16的方法，其中所述乳劑進(jìn)一步含有選自以下物質(zhì)的兩親性物質(zhì)溶血脂質(zhì)；脂肪酸及它們分別與堿或堿金屬的鹽；帶聚合物的脂質(zhì)；帶磺化單-雙-，寡或多糖的脂質(zhì)；帶有與醚或酯連接的脂肪酸的脂質(zhì)；聚合脂質(zhì)；二乙酰磷酸酯；磷酸二鯨蠟酯；硬脂酰胺；神經(jīng)酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯；聚氧乙烯脂肪醇；聚氧乙烯脂肪醇醚；聚氧乙烯化疏水山梨糖醇脂肪酸酯；甘油聚乙二醇蓖麻醇酸酯；乙氧基化大豆甾醇；乙氧基化蓖麻油；環(huán)氧乙烷(EO)和環(huán)氧丙烷(PO)嵌段共聚物；糖酸的甾醇酯；糖與脂族酸的酯；甘油與(C12-C24)脂肪二羧酸的酯和它們分別與堿或堿金屬的鹽；皂草苷；長(zhǎng)鏈(C12-C24)醇；6-(5-膽甾烯-3β-基氧)-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷；二半乳糖甘油二酯；6-(5-膽甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷；6-(5-膽甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脫氧基-1-硫代-β-D-甘露吡喃糖苷；12-(((7’-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲基氨基)硬脂酸；N-[12-(((7′-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基)甲氨基)十八?；鵠-2-氨基棕櫚酸；N-琥珀?；?二油基磷脂酰乙醇胺；1-十六烷基-2-棕櫚?；视?磷酸乙醇胺；棕櫚?；甙腚装彼?；包含至少一個(gè)(C10-C20)烷基鏈的烷基銨鹽；包含至少(C10-C20)?；溚ㄟ^(guò)(C3-C6)烯基橋連于N原子的叔或季銨鹽及其混合物或組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中在凍干步驟b)之前對(duì)步驟a)中的水-有機(jī)乳劑進(jìn)行洗滌操作。
22.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中在凍干步驟b)之前對(duì)步驟a)中的水-有機(jī)乳劑進(jìn)行微過(guò)濾操作。
23.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中進(jìn)一步包含在凍干步驟b)之前，向在步驟a)中獲得的水-有機(jī)乳劑中加入包含另外兩親性化合物的水性混懸液，由此獲得了第二個(gè)包含所述另外的兩親性化合物的水-有機(jī)乳劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中進(jìn)一步包括加熱所述水性混懸液的混合物和所述水-有機(jī)乳劑的混合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中在約40℃-約80℃的溫度加熱所述混合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的兩親性化合物為PEG-修飾的磷脂、帶反應(yīng)部分的PEG-修飾的磷脂或帶靶向配體的PEG-修飾的磷脂。
27.根據(jù)權(quán)利要求1、2或23的方法，其中進(jìn)一步包含，在凍干步驟b)之前，對(duì)該水-有機(jī)乳劑進(jìn)行受控加熱。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述的受控加熱在約60℃-125℃的溫度有效。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述的受控加熱在約80℃-120℃的溫度有效。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述的乳劑被裝在密封的管形瓶中。
31.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中生物相容的氣體選自空氣；氮?dú)猓谎鯕?；二氧化碳；氫氣；一氧化二氮；惰性氣體；低分子量烴，包括(C1-C7)烷，(C4-C7)環(huán)烷，(C2-C7)烯和(C2-C7)炔；醚；酮；酯；鹵代(C1-C7)烴，酮，醚；或任何上述物質(zhì)的混合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中鹵代烴氣體選自溴氯二氟甲烷，氯二氟甲烷，二氯二氟甲烷，溴三氟甲烷，氯三氟甲烷，氯五氟乙烷，二氯四氟乙烷，及其混合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中鹵代烴氣體為全氟化烴。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中全氟化烴氣體為全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷，全氟戊烷，全氟己烷，全氟庚烷，全氟丙烯，全氟丁烯，全氟丁二烯，全氟丁-2-炔，全氟環(huán)丁烷，全氟甲基環(huán)丁烷，全氟二甲基環(huán)丁烷，全氟三甲基環(huán)丁烷，全氟環(huán)戊烷，全氟甲基環(huán)戊烷，全氟二甲基環(huán)-戊烷，全氟環(huán)己烷，全氟甲基環(huán)己烷，全氟甲基環(huán)己烷及其混合物。
35.充有生物相容氣體并包含主要含有磷脂的穩(wěn)定微氣泡的注射用水性混懸液，其中所述微氣泡具有低于1.70μm的數(shù)量平均粒徑(DN)和使得DV50/DN比例約為2.00或更低的體積中位直徑(DV50)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的水性混懸液，其中所述的微氣泡具有1.60μm或更低，優(yōu)選1.50μm或更低，更優(yōu)選1.30μm或更低的DN。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的水性混懸液，其中所述的微氣泡具有約1.8或更低，優(yōu)選1.60或更低，更優(yōu)選1.50或更低的DV50/DN比例。
38.用于診斷成像的造影劑，包含根據(jù)權(quán)利要求35-37中任何一項(xiàng)的水性混懸液。
39.診斷成像的方法，包含對(duì)受體施用根據(jù)權(quán)利要求35-37中任何一項(xiàng)的造影增強(qiáng)量的水性混懸液，并至少對(duì)所述受體的一部分進(jìn)行成像操作。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中包括用可產(chǎn)生超聲波的超聲儀器以預(yù)定的發(fā)射頻率使受體接受超聲波作用，從該超聲波作用可測(cè)定相應(yīng)的微氣泡共振幅度，并施用包含充氣微氣泡的造影劑，該微氣泡具有較窄的粒度分布和接近共振幅度一半大的平均尺寸。
全文摘要
一種制備凍干基質(zhì)，并在重建該基質(zhì)的基礎(chǔ)上獲得各個(gè)注射用造影劑的方法，該造影劑包含主要由磷脂穩(wěn)定的充氣微氣泡的液體水溶性混懸液。該方法包括從一種水溶性介質(zhì)、磷脂和水不混溶有機(jī)溶劑中制備一種乳劑。然后將該乳劑凍干，接著在充氣微氣泡的水溶性混懸液中重建。該方法能夠獲得包含具有相對(duì)較小直徑和較窄粒度分布的微氣泡的混懸液。
文檔編號(hào)A61K9/19GK1744921SQ200480002975
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2004年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月4日
發(fā)明者M·施奈德, P·比薩, 閆鋒, C·吉約 申請(qǐng)人:伯拉考國(guó)際股份公司