專利名稱：Saposin C－DOPS:一種抗癌新藥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明研究調節(jié)擴散性癌的體積大小的合成物及方法，尤其是調節(jié)腫瘤和癌的大小。此外，本發(fā)明還研究治療癌癥的合成物及方法。
背景技術：
saposins是一族小型熱穩(wěn)定糖蛋白(～80氨基酸)，對于多種溶菌酶在糖基鞘脂分解代謝途徑上的體內水解活性而言不可或缺。(參見Grabowski等人所著的(1990)Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.25385-414；Furst等人所著的(1992)Biochim.Biophys.Acta.11261-16；Kishimoto等人所著的(1992)J.Lipid Res.331255-1267)。saposin族的四個成員(A、B、C及D)是從同一個前體蛋白前saposin(prosaposin)經蛋白水解而來(參見Fujibayashi等人所著的(1985)Am.J.Hum.Genet，37741-748；O′Brien等人所著的(1988)Science 2411098-1101；Rorman等人所著的(1989)Genomics 5486-492；Nakano等人所著的(1989)Biochem.(Tokyo)105152-154；(1989)Reiner等人所著的J Mol.Neurosci，1225-233；在此通過引用納入。saposins A，B，C及D的完整氨基酸序列已見報導，前體蛋白的染色體組結構及cDNA序列也已見報導(參見Fujibayashi等人所著的(1985)Am.J.Hum.Genet，37741-748；O′Brien等人所著的(1988)Science 2411098-1101；Rorman等人所著的(1989)Genomics 5486-492)。
Saposin定義為鞘脂催化蛋白或輔酶。從結構上看，saposins A，B，C及D四者具有大約50-60％的相似性，包括六種嚴格保存的半胱氨酸殘留物(參見Furst等人所著的(1992)Biochim.Biophys.Acta11261-16)，這些殘留物形成三個放置位置完全相同的域內二硫化物橋(參見Vaccaro等人所著的(1995)J.Biol.Chem.2709953-9960)。所有saposin均含有一個糖基部位，其保存位置在N-終端序列的一半之處，但是糖基對于saposin的活性并非必不可少(參見Qi等人所著的(1998)Biochemistry 3711544-11554以及Vaccaro等人所著的(1995)J.Biol.Chem.27030576-30580，在此通過引用將其作為整體納入)。
所有saposin和類saposin蛋白及域在溶解狀態(tài)下均含有一個“saposin褶”。此褶為多-螺旋束形狀，具有三個保存的二硫化物結構和好幾個兩親性多肽。盡管saposin和類saposin蛋白在溶解狀態(tài)下都具有saposin褶，但是二者在增強溶菌酶鞘脂(SL)和糖基鞘脂(GSL)被特定的水解酶降解上，具有不同的體內生物功能。saposin的這些作用使之在控制溶菌酶鞘脂和糖基鞘脂代謝上占有中心地位(參見Kishimoto等人所著的(1992)J.Lipid Res.331255-1267；Fujibayashi等人所著的(1985)Am.J.Hum.Genet，37741-748；O′Brien等人所著的(1988)Science 2411098-1101，在此通過引用將它們納入)。此外，saposin C還參與酸性磷脂囊的聚變和擾動(參見Vaccaro等人所著的(1994)FEBS Letters 349181-186，在此通過引用納入[在此通過引用將其作為整體納入])。
酸β-葡萄糖苷酶(Gcase，EC 3.1.2.45)要在體內和體外對葡糖苷脂酰鞘氨醇進行最佳的水解需要使用saposin C。此外，saposin C還使裂變誘向含有囊(在電子顯微鏡下可見)的磷脂酰絲氨酸(參見Vaccaro等人所著的(1994)FEBS Letters 349181-186，在此通過引用納入)。而且，saposin C具有脂膜結合活性或質膜親和力的一般屬性。saposin C通過埋入外小葉與脂膜聯(lián)合。H-1和H-5螺旋是這一過程的不可或缺的一部分，表明saposin C與脂膜的適當相互作用可影響其特性和活性。此外，saposin C還誘發(fā)脂膜發(fā)生結構性變化。Saposin C與平面磷脂雙層體之間相互作用的動態(tài)過程曾通過原子力顯微鏡得到實時的顯現(xiàn)(參見Qi等人所著的(2001)J.Biol.Chem.27627010-27017以及You等人所著的(2001)FEBS Lett.50397-102，在此通過引用納入)。
磷脂不對稱是哺乳動物質膜的一個眾所周知的特征。脂雙層體的外小葉含有豐富的磷脂酰膽堿，而氨基磷脂則優(yōu)先選擇內小葉(參見Bevers等人所著的(1998)Lupus Suppl.2S126-S131)。磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)幾乎無一例外地駐留于內小葉，而卵磷脂(PC)和鞘磷脂則在外小葉中很豐富。磷脂不對稱可能是所有細胞的一般屬性(參見Woon等人所著的(1999)Cell Calcium25(4)313-320)。質膜磷脂不對稱通過各種機制得到保持，這些機制包括氨基磷脂改位和磷脂亂位(參見美國專利申請?zhí)?0020081698)。
一般而言，腫瘤或癌細胞與通常細胞相比，生長速度快得多。這些不正常的細胞主要通過在糖酵解期間產生乳酸或通過呼吸(因為代謝速度快)產生二氧化碳而生產大量的質子。因此，這些細胞和組織周圍部位的酸性通常比正常生長速度的細胞周圍部位的酸性高。
皮膚扁平細胞癌(SCC)是具有很高細胞轉移風險的最常見皮膚癌之一。(參見Alam等人所著的(2001)N.Engl.J.Med.344975-983，在此通過引用納入)。皮膚癌分為兩類黑素瘤和非黑素瘤(NMSC)。據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，美國每年的NMSC病例數(shù)在一百萬以上。SCC大約占所有皮膚瘤的20％，美國每年大約有200,000個新SSC病例。SCC是最常見的從皮膚轉移到黏膜的惡性腫瘤，SCC也可直接發(fā)生于黏膜之上(參見Boni等人所著的(2002)Neuroendocrinology Letters23S248-51)。當前對SCC患者的治療包括電干燥法、刮除法、切除法、冷凍療法、手術切除或Mohs手術。電干燥法、刮除法、手術切除或冷凍療法如果使用得當，可以消除小的(直徑＜1厘米)、輪廓清楚的腫瘤，腫瘤轉移發(fā)生率較低。手術切除和Mohs手術對具有高風險原發(fā)性或再發(fā)性SSC患者的治愈率最高。然而，這些治療方法費用高昂，且可能發(fā)生血腫、血清腫、感染和傷口開裂。
因此，人們希望開發(fā)出有效而低成本且具有更好外觀效果的SCC治療方法。此外，開發(fā)治療其它類型的癌癥(例如乳癌、前列腺癌和淋巴癌)的有效而低成本的治療方法也很重要。
發(fā)明摘要本發(fā)明提供調節(jié)質膜的內外小葉成分分布的合成物和方法。本發(fā)明藥物包含內小葉成分和前saposin相關的多肽。“內小葉成分”是指任何自然存在于細胞質膜的內小葉中的分子或其結構類似物，這里所說的細胞尤指動物細胞，更尤指哺乳動物細胞。內小葉成分的一個具體物質是磷脂酰絲氨酸或其結構類似物，例如二油基磷脂酰絲氨酸(dioleoylphosphatidylserine)(DOPS)。前saposin的氨基酸序列在序列列表的SEQ ID NO1中有詳細說明。前saposin相關多肽與SEQID NO1中所示的氨基酸序列或其片段之間至少具有80％的相同性并保持質膜親和力。前saposin相關多肽的一個具體物質是saposin C(序列列表中的SEQ ID NO2)或仿saposin C多肽。saposin C相關多肽與SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列之間至少具有80％的相同性并保持質膜親和力。本發(fā)明藥物的多肽與內小葉成分的摩爾比率范圍在大約1∶1至大約1∶50之間，但更理想的比率范圍在大約1∶1至大約1∶25之間，更進一步理想的比率范圍在大約1∶1至大約1∶10之間，而最理想的比率為大約1∶7或1∶3。本項發(fā)明的一個具體藥物進一步包含一種制藥學上可接受的載體。本發(fā)明藥物可促進細胞死亡，例如細胞凋亡。本項發(fā)明的一個具體藥物優(yōu)先誘發(fā)超擴散性細胞的凋亡，例如(但不限于)腫瘤和癌細胞。因此，本項發(fā)明的一個具體藥物是抗癌藥物。在本發(fā)明的一個方面，發(fā)明藥物優(yōu)先誘發(fā)癌細胞的的凋亡，例如(但不限于)肉瘤細胞、成神經細胞瘤細胞和鱗片癌細胞。
本發(fā)明提供調節(jié)一個實驗對象的細胞質膜中的內小葉成分分布的方法。這些方法包括給一個實驗對象服用一種包含內小葉成分和前saposin相關多肽的藥物。這些方法可改變服藥者的細胞質膜的外小葉中的內小葉成分的分布情況。本發(fā)明的一個具體藥物可使外小葉中的內小葉成分濃度得到提高。本發(fā)明對內小葉成分分布的一個具體藥物調節(jié)可優(yōu)先發(fā)生在服藥者的超擴散性細胞上。優(yōu)先發(fā)生部位是腫瘤細胞或癌細胞這些超擴散性細胞。在本項發(fā)明的一個方面，調節(jié)質膜的外小葉的內小葉成分的濃度可誘發(fā)凋亡。
提供調節(jié)一個實驗對象的腫瘤大小的方法。這些方法包括給一個實驗對象服用一種包含內小葉成分和前saposin相關多肽的藥物。該藥物可進一步包含一種制藥學上可接受的載體。適合的實驗對象包括患有腫瘤的哺乳動物，尤其是人類。本發(fā)明的一個具體藥物可促進超擴散性細胞的死亡。細胞死亡可以通過凋亡而發(fā)生。任何腫瘤均為本發(fā)明的潛在目標。目標腫瘤包含超擴散性細胞，例如腫瘤細胞和癌細胞。這些目標腫瘤包括，但不限于，肉瘤、成神經細胞瘤以及鱗片癌細胞。本發(fā)明的一個具體藥物可調節(jié)腫瘤大小，導致腫瘤減小?？梢灶A想，超擴散性細胞未成熟即死亡應導致腫瘤減小。
提供治療一個實驗對象的癌癥的方法。這些方法包括給一個實驗對象服用一種包含內小葉成分和前saposin相關多肽的藥物。該藥物可進一步包含一種制藥學上可接受的載體。適合的實驗對象包括患有癌癥的哺乳動物，尤其是人類。本發(fā)明的一個具體藥物可促進超擴散性細胞的死亡。細胞死亡通過一個過程而發(fā)生，該過程可以是(但不限于)凋亡。任何癌癥均為本發(fā)明的潛在目標。目標癌癥包含超擴散性細胞，例如腫瘤和癌細胞。這些目標癌細胞包括，但不限于，生于肉瘤、成神經細胞瘤、乳癌以及鱗片癌上的細胞。在本發(fā)明的一個方面，給藥方法有經腸胃、不經腸胃、經皮下、經靜脈、經腹膜或局部給藥。為治療癌癥，可以給一個實驗對象單劑量或多劑量的藥物。
附圖簡要說明

圖1顯示正常永生化角質形成細胞(NIK)(A和B片區(qū))和鱗片癌細胞(SCC)(C和D片區(qū))。A和C片區(qū)內的細胞接受安慰劑治療。B和D片區(qū)的細胞接受包含8μM saposin C和26μM DOPS的本發(fā)明藥物的治療。本實驗的詳細細節(jié)在本申請的其它地方進行說明。
圖2顯示取自L5178Y-R細胞系的鼠淋巴瘤細胞。A片區(qū)內的細胞接受安慰劑治療。B片區(qū)內的細胞接受60μM DOPS的治療。C片區(qū)內的細胞接受20μM saposin C藥物治療。D片區(qū)內的細胞接受包含10μM saposin C和30μM DOPS的本發(fā)明藥物的治療。
圖3顯示評估攜帶人類鱗片癌細胞異種移植物的裸鼠在接受安慰劑(磷酸緩沖生理鹽水，以實心三角形和虛線表示)或本發(fā)明藥物(saposin C/DOPS，前者劑量為每公斤體重10mg，后者劑量為每公斤體重2mg)皮下注射之前和之后的平均腫瘤大小而得到的結果。誤差條表示標準誤差。腫瘤大小以mm3計，時間以腫瘤成長天數(shù)計算。A片區(qū)代表鼠接受兩次治療的結果。第一次和第二次注射的日期以箭頭表示。B片區(qū)顯示鼠接受一次治療的結果。注射日期以箭頭表示。本實驗的詳細細節(jié)在本申請的其它地方進行介紹。
圖4顯示取自異種移植物的人類鱗片癌細胞腫瘤組織的熒光顯微照片。A片區(qū)內的細胞接受有熒光標志的磷脂酰絲氨酸和DOPS(NBD-DOSP/DOPS)的混合物的治療。B片區(qū)內的細胞接受有熒光標志的磷脂酰絲氨酸、DOPS和saposin C的混合物的治療。本實驗的詳細細節(jié)在本申請的其它地方進行介紹。
圖5顯示取自異種移植物的人類鱗片癌細胞腫瘤組織的顯微照片。組織取自接受DOPS(每公斤體重劑量2mg，A和C片區(qū))或saposin C(每公斤體重劑量10mg)與DOPS(每公斤體重劑量2mg，B和D片區(qū))治療的腫瘤。該組織以TUNEL著色法進行著色或著蘇木精和曙紅(C和D片區(qū))。B片區(qū)內的箭頭表示凋亡細胞。D片區(qū)內的暗著色表示壞死的區(qū)域。
發(fā)明的詳細說明本發(fā)明與調節(jié)質膜中內小葉成分分布的合成物和方法有關。本發(fā)明還與調節(jié)超擴散性細胞，尤其是與牽涉到超擴散性細胞的紊亂有關，更尤其是與腫瘤和癌有關，例如鱗片癌細胞和淋巴瘤。合成物是一種包含含有前saposin相關多肽和內小葉成分的藥物，多肽確切地說是saposin C，內小葉成分確切地說是磷脂酰絲氨酸或其結構類似物，或更確切地說是二油基磷脂酰絲氨酸(dioleoylphosphatidylserine)(DOPS)。這兩個化合物的組合表現(xiàn)出抗癌活性，因此被稱為抗癌藥物。“抗癌活性”是指減少細胞擴散速度，從而降低已存在腫瘤和在治療期間出現(xiàn)的腫瘤的生長速度，和/或破壞已存在瘤性(腫瘤)細胞或新形成瘤性細胞，從而在治療期間減小腫瘤的總體大小。接受saposin C(或前saposin相關多肽)和DOPS(或內小葉成分)二者的組合治療，可引起生理反應，進而調節(jié)質膜中的內小葉成分的分布情況。
本發(fā)明藥物的抗癌活性并不限于特定的作用模式，而可以通過各種作用模式發(fā)揮作用，其中包括凋亡。環(huán)境因素有助于本發(fā)明藥物優(yōu)先作用在腫瘤細胞上。這些環(huán)境因素包括，但不限于，腫瘤細胞周圍的低酸水平、進一步缺氧條件以及腫瘤細胞的外膜上已改變的脂質表現(xiàn)。缺氧是后生因素，可刺激腫瘤細胞的血管內皮成長因素(VEGF)的表達和釋放。VEGF是已知的血管滲透性因素，在與正常脈管系統(tǒng)相對的腫瘤組織的紊亂和泄漏脈管系統(tǒng)中發(fā)揮作用。本發(fā)明的一個具體藥物saposinC-DOPS在靜脈注射后，優(yōu)先穿透腫瘤組織，而非健康組織。
本發(fā)明包括孤立的或實質上凈化的蛋白質或多肽合成物?！肮铝⒌摹被颉皟艋摹倍嚯幕蚱渖锘钚圆糠謱嵸|上或本質上不受那些通常與自然存在環(huán)境中的蛋白質伴行或相互作用的成分的束縛。因此，一種孤立或凈化的蛋白質在按基因重組法生產時，實質上不受其它細胞物質或培養(yǎng)介質的束縛，或者在其被化合時，實質上不受化學前體或其它化學物質的束縛。一種實質上不受細胞物質束縛的蛋白質包括雜質蛋白質含量(按干重計)低于大約30％、20％、10％、5％或1％的蛋白質制劑。當本發(fā)明蛋白質或其生物活性部分按基因重組法被生產時，理想的培養(yǎng)介質中化學前體和雜質蛋白質化學物的含量(按干重計)低于大約30％、20％、10％、5％或1％。
在此，“前saposin相關多肽”是指具有SEQ ID NO1中所列的前saposin氨基酸序列的任何多肽，該氨基酸序列與SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列或其蛋白水解過程的一個片段至少有80％是相同的，其中的多肽保留質膜親和力。前saposin多肽(SEQ ID NO1)的片段和變異也包括在本發(fā)明的范圍之內。前saposin經蛋白水解處理后成為四種saposin，即saposin A、B、C及D。在此，“saposin C相關多肽”是指具有SEQ ID NO2中所列的saposin C氨基酸序列或與SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列至少有80％相同性的氨基酸序列的任何多肽，其中的多肽保留質膜親和力。saposin C相關多肽(SEQ IDNO2)的片段和變異也包括在本發(fā)明的范圍之內。上述“片段”是指氨基酸序列從而也是蛋白質的一部分。前saposin蛋白質片段保留前saposin的生物活性，因而擁有質膜親和力。saposin C蛋白質片段保留saposin C的生物活性，因而擁有質膜親和力。在此，“質膜親和力”是指通過靜電或疏水作用而與磷脂表面相互作用的能力。
本發(fā)明前saposin多肽的生物活性的一個片段將編碼至少15、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510和520個相鄰氨基酸或編碼本發(fā)明前saposin多肽中的最多524個氨基酸。本發(fā)明的saposin C多肽的生物活性部分的一個片段將編碼存在于本發(fā)明的saposin C中的至少15、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80個相鄰氨基酸。
在此，“變異”是指實質上相似的序列。對于核苷酸序列，保守的變異包括那些由于遺傳密碼的簡并性而對本發(fā)明的一種前saposin多肽的氨基酸序列進行編碼的序列。像這些自然發(fā)生的等位基因變異可以視同為使用眾所周知的分子生物技術，例如使用酸聚合酶鏈反應(PCR)和雜交技術。變異核苷酸序列還包括通過合成而得的核苷酸序列，例如那些通過使用部位導向的誘變法而生成的序列，但誘變法仍然編碼一個前saposin。
在此，“變異的”蛋白質是指通過在原蛋白質的N端和/或C端刪除(所謂的截切)或增加一個或多個氨基酸而獲得的蛋白質；或通過在原蛋白質的一個或多個部分刪除或增加一個或多個氨基酸而獲得的蛋白質；或通過取代原蛋白質的一個或多個部位上的一個或多個氨基酸而獲得的蛋白質或通過合成而產生具有上述的一個氨基酸序列的多肽。本發(fā)明所包含的變異蛋白質具有生物活性，即它們繼續(xù)擁有我們所要的原蛋白質的生物活性，即這里所指的質膜親和力。上述變異可以由例如遺傳性多態(tài)現(xiàn)象或人類處理而產生。本發(fā)明前saposin天然蛋白質的生物活性變異將有至少大約80％、85％，但更理想的是有至少大約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％及更多，而最理想的是有至少大約98％、99％或更多的序列與天然蛋白質的氨基酸序列相同，天然蛋白質的氨基酸序列根據(jù)序列對齊程序并使用默認參數(shù)來確定，對齊程序在本申請的其它地方進行介紹。本發(fā)明蛋白質的生物活性變異可與該蛋白質有少至1-15個氨基酸殘留物的差異，甚至只有少至1-10，例如6-10，少至5個，少至4、3、2甚至1個氨基酸殘留物的差異。
本發(fā)明蛋白質通過各種方式發(fā)生改變，包括氨基酸取代、刪除、截切和插入。這種處理方法在本技術領域已為人普遍知曉。例如前saposin蛋白質的氨基酸序列變異可以通過DNA突變而制得。突變和核苷酸序列改變的方法是眾所周知的技術。可參見Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等人(1987)Methods inEnzymol.154367-382；美國專利號4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan PublishingCompany，New York)以及其中引用的文獻。有關不影響所得蛋白質的生物活性的適當?shù)陌被崛〈闹笇?，可參見由Dayhoff等人在(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中建立的模型以及Qi等人所著的(2001)J.Biol.Chem.27627010-27017，在此通過引用納入)?？蓛?yōu)先使用保守的取代，例如使用一種具有類似屬性的氨基酸替換另一種氨基酸。
因此，本發(fā)明的多肽和氨基酸序列包括自然存在的序列以及突變形態(tài)、變異及其修改形態(tài)。此種變異將繼續(xù)擁有我們需要的質膜親和力活性。很顯然，在編碼變異的去氧核糖核酸(DNA)中發(fā)生的突變不得將序列置于讀取框之外，并且較理想的情況是不創(chuàng)建可產生二次信使核糖核酸(mRNA)結構的互補區(qū)域。參見EP專利申請出版物編號75,444。
對本發(fā)明所包含的蛋白質序列的刪除、插入和取代預計不會使該蛋白質的特性發(fā)生根本性變化。然而，當事先預測取代、刪除或插入的準確結果有困難時，對本技術有經驗的人將希望通過常規(guī)篩選試驗對結果進行評估。也就是說，可以使用本技術領域已知的方法評估質膜親和力，這些方法包括，但不限于，熒光分光光度法、熒光共振能量轉移或圓形二色測量法。例如，可參見Qi等人所著的(2001)J.Biol.Chem.27627010-27017，在此通過引用納入}。
變異蛋白質還包括通過突變和重組程序，例如DNA攪亂法，而獲得的蛋白質。使用這一程序，可以處理一個或多個不同的saposin C序列，以創(chuàng)建一個擁有所要屬性的新的saposin C。這樣，可從一組具有相關序列、包含具有實質序列相同性的序列區(qū)域并可在體內或體外進行同源重組的多核苷酸生成重組多核苷酸庫。例如，使用這一方法，編碼一個所要域的序列基元可以在本發(fā)明前saposin基因與其它已知基因之間互換，以獲得具有所需改良屬性(例如改變質膜親和力)的蛋白質新基因編碼。這種DNA攪亂策略已為本技術領域所知。例如，參見Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad Sci.USA9110747-10751；Stemmer(1994)Nature 370389-391；Crameri等人所著的(1997)Nature Biotech.15436-438；Moore等人所著的(1997)J.Mol.Biol.272336-347；Zhang等人所著的(1997)Proc.Natl.Acad Sci.USA 944504-4509；Crameri等人所著的(1998)Nature391288-291；以及美國專利號5,605,793和5,837,458。
使用下列術語描述兩個或更多個氨基酸序列或多肽之間的序列關系(a)“參考序列”、(b)“比較窗口”、(c)“序列相同性”、(d)“序列相同性百分比”以及(e)“實質相同”。
(a)在此，“參考序列”被定義為作為序列比較依據(jù)的序列。參考序列可以是某指定序列的子集或整體；例如全長度多肽或氨基酸序列或完整多肽序列的一個片段。
(b)在此，“比較窗口”參考一個氨基酸序列的相鄰和指定的片段，其中在比較窗口中的氨基酸序列與參考序列(不包含增加或刪除)相比，可以包含增加或刪除(即空白)，使兩個序列實現(xiàn)最佳的對齊。一般而言，比較窗口的長度至少為20個相鄰氨基酸的長度，且可選長度為30、40、50、100個相鄰氨基酸的長度或更長。本技術領域有經驗者了解到，為避免由于在氨基酸序列中包含空白而與參考序列有高度的相似性，通常會引進一個空白損失并在匹配數(shù)量中減去這個空白損失。
對齊序列進行比較的方法在本技術領域已為人熟知。因此，可以使用數(shù)學算法來確定兩個序列之間的序列相同性百分比。這種數(shù)學算法的非限制性例子優(yōu)先是Myers和Miller在(1988)CABIOS 411-17中提出的算法；Smith等人在(1981)Adv.Appl.Math.2482中提出的局部同源算法；Needleman和Wunsch在(1970)J.Mol.Biol.48443-453中提出的同源對齊算法；Pearson和Lipman在(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448中提出的搜索相似性方法；Karlin和Altschul在(1990)Proc.Natl.Acad Sci.USA 872264中提出，并在(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中修正的算法。
這些數(shù)學算法的計算機實施版本可以用來進行序列比較，以便確定序列相同性。就本發(fā)明而言，應優(yōu)先使用GCG程序GAP(10.00版或更新版)及其默認參數(shù)或任何等效程序進行核苷酸或蛋白質序列比較，以確定其與本申請公開的序列相比的序列相同性百分比。在此，“等效程序”是指任何序列比較程序，其對于任意兩個待比較的序列，可以生成一個對齊，該對齊與優(yōu)先程序生成的對應對齊相比，具有相同的核苷酸或氨基酸殘留物匹配和相同的序列相同性百分比。
序列比較程序包括，但不限于包含在PC/Gene程序(美國加州Mountain View的Intelligenetics公司有售)中的CLUSTAL；包含在V8版Wisconsin Genetics Software Package中的ALIGN程序(V2.0版)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA以及TFASTA(美國的Genetics Computer Group(GCG)公司有售，地址575 Science Drive，Madison，Wis.，USA)。使用這些程序進行的對齊可以使用默認參數(shù)。CLUSTAL程序的詳細說明可參見Higgins等人所著的(1988)Gene73237-244(1988)；Higgins等人所著的(1989)CABIOS 5151-153；Corpet等人所著的(1988)Nucleic Acids Res.1610881-90；Huang等人所著的(1992)CABIOS 8155-65；以及Pearson等人所著的(1994)Meth.Mol.Biol.24307-331。ALIGN程序依據(jù)的是前述Myers和Miller(1988)算法。在比較氨基酸序列時，可以使用PAM 120重量殘留表、12空白長度損失和4空白損失與ALIGN程序配合。Altschul等人在(1990)J.Mol.Biol.215403中發(fā)表的BLAST程序所依據(jù)的是前述Karlin和Altschul(1990)算法。BLAST核苷酸搜索可以使用BLASTN程序，采用score＝100、wordlength＝12來完成，可以獲得與編碼本發(fā)明蛋白質的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可以使用BLASTX程序，采用score＝50、wordlength＝3來完成，可以獲得與本發(fā)明蛋白質或多肽同源的氨基酸序列。為了獲得序列比較所需的空白的對齊，可以使用Gapped BLAST(包含在BLAST 2.0中)，該程序的詳細說明可參見Altschul等人所著的(1997)Nucleic AcidsRes.253389。此外，還可以使用PSI-BLAST(包含在BLAST 2.0中)來執(zhí)行重復搜索，檢測分子之間的疏遠關系。參見Altschul等人于1997年發(fā)表的上述文章。當使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST時，可以使用相應程序(例如核苷酸序列BLASTN程序、蛋白質BLASTX程序)的默認參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm，nih.gov網站。對齊還可以通過目測的方法手工完成。
(c)在此，兩個核酸或多肽序列的“序列相同性”或“相同性”參考該兩個序列中的殘留物，這些殘留物在指定比較窗口長度上被對齊并達到最高對應性時，是相同的。當序列相同性百分比與蛋白質相關地使用時，我們認識到，不相同的殘留物位置通常因保守氨基酸取代而發(fā)生差異，其中，氨基酸殘留物被其它具有相似化學屬性(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘留物所取代，因此不改變分子的功能屬性。當序列因保守取代而發(fā)生差異時，可以向上調整序列相同性百分比，以修正取代的保守性。序列因這種保守取代而發(fā)生差異時，我們說它具有“序列相似性”或“相似性”。這種調整方法已為本技術領域的有經驗者所熟知。通常，這種方法包括在給保守取代評分時，將其定為部分而非完全匹配，從而提高序列相同性百分比。因此，例如當一個相同的氨基酸得到的分數(shù)是1分，一個非保守取代得到的分數(shù)是0分時，一個保守取代得到的分數(shù)將在0分和1分之間。保守取代的分數(shù)經計算而得，例如執(zhí)行PC/GENE程序(美國加州Mountain View的Intelligenetics公司出品)中的計算。
(d)在此，“序列相同性百分比”是指在比較窗口中比較兩個最佳對齊的序列而測得的值，其中，為了達到兩個序列的最佳對齊，比較窗口中的多核苷酸序列部分與參考序列(不包含增加或刪除)相比，可以包含增加或刪除(即空白)。這一百分比通過以下方法計算而得測定兩個序列出現(xiàn)相同核酸基或氨基酸殘留物的位置數(shù)，從而獲得匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較窗口中的位置總數(shù)，相除得到的商乘以100即得序列相同性百分比。
(e)(i)多核苷酸序列的“實質相同”這一術語是指多核苷酸包含一個序列，該序列通過使用上述對齊程序之一和標準參數(shù)與參考序列相比，二者的序列相同性百分比至少應為70％，更理想為至少80％，進一步理想為至少90％，而最理想為至少95％。本技術領域的有經驗者將認識到，可以對這些數(shù)值進行適當?shù)恼{整，把密碼子簡并性、氨基酸相似性讀取框定位等考慮在內，以確定由兩個核苷酸序列編碼的兩個蛋白質的相應相同性。就這些用途而言，氨基酸序列的實質相同性通常是指序列相同性至少為60％，更理想為至少70％、80％、90％，而最理想為至少95％。
表明核苷酸序列實質相同的另一個指標是，如果兩個分子在嚴格條件下彼此雜交。一般來說，所選的嚴格條件是溫度比具有確定離子強度和pH值的特定序列的熱熔點(Tm)低5℃。然而，根據(jù)所需的嚴格程度，嚴格條件包括的溫度范圍可以在比Tm低大約1℃至20℃之間，限定條件在本文的其它地方進行論述。在嚴格條件下彼此之間沒有雜交的核酸，如果它們所編碼的多肽是實質相同的，那么它們仍然是實質相同的。這在使用基因編碼所允許的最大密碼子簡并性復制核酸時可能發(fā)生。表明兩個核酸序列實質相同的一個指標是，由第一個核酸編碼的多肽與由第二個核酸編碼的多肽之間具有免疫雜交反應性。
(e)(ii)對于一種肽而言，“實質相同”這一術語表示一種肽包含一個序列，該序列在指定比較窗口中與參考序列相比，二者的序列相同性至少為70％，更理想應為80％，進一步理想應為85％，而最理想應為至少90％或95％。應優(yōu)先使用Needleman和Wunsch在(1970)J.Mol.Biol.48443-453中提出的同源對齊算法進行最佳的對齊。表明兩個肽序列實質相同的一個指標是，一個肽與抗第二個肽的抗體之間具有免疫反應性。這樣，第一個肽與第二個肽實質上是相同的，例如兩個肽之間的差異僅僅是一個保守取代而已?！皩嵸|相似的”肽共同具有上述序列，但不相同的殘留物位置可能因保守氨基酸變化而發(fā)生差異。
本發(fā)明藥物包含類前saposin肽和內小葉成分。“內小葉成分”是指任何分子或其結構類似物，這些分子或其結構類似物自然存在于細胞質膜的內小葉中，這里所說的細胞尤指動物細胞，更尤指哺乳動物細胞。一般來說，內小葉中的內小葉成分的濃度將比外小葉中的內小葉成分的濃度高。人們已認識到，在某些細胞擾動過程中，例如凋亡、壞死以及超繁殖性生長，內外小葉的正常成分發(fā)生改變。有代表性的內小葉成分包括，但不限于，磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺及其結構類似物。在此，磷脂酰絲氨酸的“結構類似物”是指任何陰離子磷脂或含有帶負電荷的頭基的酸性脂類，包括，但不限于，磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、棕櫚油酰磷脂酰絲氨酸、棕櫚反油酸磷脂酰絲氨酸、肉豆蔻油酸磷脂酰絲氨酸、二亞油基磷脂酰絲氨酸、棕櫚亞油酰磷脂酰絲氨酸、脫脂酸磷脂酰絲氨酸以及二油基磷脂酰絲氨酸。
在一個具體應用中，本發(fā)明合成物和方法專注于調節(jié)質膜中的內小葉成分的分布。在另一個具體應用中，本發(fā)明合成物和方法專注于調節(jié)和治療與超擴散性細胞(例如腫瘤和癌癥)有關的紊亂。在此，“調節(jié)”是指改變、更改、變更、修改或序列改變至少0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。調節(jié)質膜中的內小葉成分的分布是改變質膜中內小葉成分的數(shù)量、改變內小葉成分在內小葉中的相對位置或改變內小葉成分在質膜的內小葉和外小葉中所占的百分比。這種調節(jié)可導致質膜內小葉中的內小葉成分濃度的提高。調節(jié)腫瘤大小是改變腫瘤大小、改變至少一個腫瘤細胞或許多腫瘤細胞的大小。
測定質膜中的成分分布的方法在本技術領域已為人所知，其包括，但不限于，共焦顯微鏡技術、原子力顯微鏡技術、FRET、熒光淬熄、電子顯微鏡技術、圓形二色性法、NMR MALDI-TOF、發(fā)射光譜分析、光散射技術、電噴霧質譜技術。參見Chang等人所著的(1978)Anal.Biochem.911331；Kishimoto等人所著的(1992)J.LipidResearch 331255-1267；Vaccaro等人所著的(1995)J.Biol.Chem.2709953-9960；以及Fu等人所著的(1994)J Mol.Neurosci.559-67，在此通過引用將它們作為整體納入。
測定腫瘤大小的方法在本技術領域已為人所知，其包括，但不限于，游標卡尺測量、體積測量法、超聲波、磁共振成象、酶聯(lián)免疫吸附測定、身體檢查、X光、正電子放射X光斷層攝影術、骨掃描、共振拉曼光譜技術、觸覺成像、計算機X光斷層攝影術和CAT掃描。
在此，“癌癥”、“超擴散性”、“腫瘤”和“瘤性”這幾個術語是指能夠自主生長(即以快速擴散性細胞生長為特征的異常狀態(tài)或狀況)的細胞。超擴散性和瘤性疾病狀態(tài)可分為病理性，即表征或構成一種疾病狀態(tài)，和非病理性，即從常態(tài)衍生而來但與疾病狀態(tài)無關。這一術語包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉變細胞、組織或器官，而不管組織病理學類型或侵入階段?！俺瑪U散性”這一術語進一步包括產生快速擴散性細胞生長(例如見于某些原發(fā)性心肌癥)的平滑肌肉細胞?！安±硇猿瑪U散性”細胞發(fā)生于以惡性腫瘤生長為特征的疾病狀態(tài)。非病理性超擴散性細胞的例子包括與傷口修復有關的細胞繁殖。
細胞繁殖和/或差異性紊亂的例子包括癌癥，例如腫瘤、肉瘤、轉移性紊亂，或者造血瘤性紊亂，例如白血病。轉移性腫瘤可以產生于許多種原發(fā)腫瘤，包括，但不限于，那些產生于前列腺、結腸、肺、乳房和肝臟上的原發(fā)腫瘤。
“癌癥”或“腫瘤”這兩個術語包括各種器官的惡性，例如那些影響肺、乳房、甲狀腺、淋巴、胃腸或生殖尿道的惡性，以及腺癌，包括惡性，例如大多數(shù)的結腸癌、腎臟細胞癌、前列腺癌和/或睪丸瘤、肺的非小型細胞癌、小腸癌和食道癌。
“擴散性惡性腫瘤”是一個技術術語，系指上皮或內分泌組織的惡性，包括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳癌、前列腺癌、內分泌系統(tǒng)癌以及黑素瘤。典型的擴散性惡性腫瘤包括那些在子宮頸、肺部、前列腺、乳房、頭頸部、結腸和卵巢的組織上形成的腫瘤。這一術語也包括癌肉瘤，例如包括由癌瘤性和肉瘤樣組織組成的惡性腫瘤。
“腺癌”是指發(fā)生于腺組織或者其中腫瘤細胞構成可識別的腺結構的擴散性惡性腫瘤。
“肉瘤”是一個技術術語，系指間充質衍生物的惡性腫瘤。
皮膚腫瘤和癌包括，但不限于，惡性黑素瘤、良性上皮腫瘤，包括但不限于，脂溢性角化病、棘皮癥黑化、上皮纖維息肉、上皮囊腫、角化棘皮瘤、附件(附器)腫瘤；癌變前和惡性表皮腫瘤包括，但不限于，光化角化癥、鱗片細胞癌、基細胞癌和梅克爾細胞癌；真皮腫瘤包括，但不限于，良性皮膚纖維瘤、隆突皮膚纖維肉瘤、黃色瘤以及皮膚脈管瘤；細胞遷移至皮膚的腫瘤包括，但不限于，組織細胞增生癥X、蕈樣肉芽腫(皮膚T細胞淋巴瘤)和肥大細胞增生病。
骨髓細胞腫瘤和癌包括，但不限于，由這些細胞引起的紊亂。這些紊亂包括，但不限于下列疾病與造血干細胞有關的疾?。欢ㄐ土馨妥婕毎?；淋巴細胞包括B和T細胞；定型骨髓祖細胞，包括單核細胞、粒細胞和巨核細胞；以及定型祖紅細胞。這包括，但不限于，白血病包括B淋巴白血病、T淋巴白血病、未分化白血?。患t白血病、成巨核細胞白血病、單核細胞；[有分化和未分化的白血病均包括在內]；慢性和急性成淋巴細胞白血病、慢性和急性淋巴球白血病、慢性和急性粒細胞白血病、淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征、慢性和急性骨髓白血病、單核細胞白血病；慢性和急性成髓細胞白血病、慢性和急性骨髓細胞性白血病、慢性和急性早幼粒細胞白血病、慢性和急性粒細胞白血病、單核細胞-巨噬細胞系的血液惡性、例如青少年慢性骨髓性白血病；繼發(fā)性急性粒細胞白血病、先質血液紊亂；反應性皮膚血管內皮瘤??；與枝狀細胞內改變的表達有關的纖維性紊亂、紊亂包括系統(tǒng)硬化、E-M綜合征、流行性毒油性綜合征、嗜伊紅細胞性筋膜炎局限性硬皮病型、瘢痕瘤以及纖維性結腸??；血管瘤樣腫塊惡性纖維組織細胞瘤；癌，包括原發(fā)性頭頸鱗片細胞癌；肉瘤，包括卡波西肉瘤；纖維性瘤和葉狀腫瘤，包括乳腺纖維性瘤；基質瘤；葉狀腫瘤，包括組織細胞瘤；T細胞淋巴瘤；以及B細胞淋巴瘤。
心臟腫瘤和癌包括，但不限于，原發(fā)性心臟腫瘤，例如黏液瘤、脂肪瘤、乳頭纖維彈性組織瘤、橫紋肌瘤、肉瘤以及非心臟腫瘤的心臟效應。
血管腫瘤和癌包括，但不限于，血管瘤、淋巴管瘤、血管球瘤、脈管擴張、桿菌性血管瘤及中級(臨界性低級惡性)腫瘤，例如卡波西肉瘤和血管內皮瘤，以及惡性腫瘤，例如血管肉瘤和血管外皮細胞瘤。
B細胞腫瘤和癌包括，但不限于，前體B細胞瘤，例如成淋巴細胞白血病/淋巴瘤。外周B細胞瘤包括，但不限于，慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、漿細胞瘤、多骨髓瘤以及相關實體、淋巴質漿細胞淋巴瘤(瓦爾登斯特倫[Waldenstrom]巨球蛋白血癥)、套細胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤(MALToma)以及多毛細胞白血病。
肝腫瘤和癌包括，但不限于，結節(jié)性增生、腺瘤以及惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉移性腫瘤。
腦腫瘤和癌包括，但不限于，神經膠質瘤包括星形細胞瘤，包括纖維性(彌漫性)星形細胞瘤和多形性成膠質細胞瘤、纖維性星形細胞瘤、多形性黃色星形細胞瘤及腦干神經膠質瘤、少突膠質細胞瘤以及室管膜瘤和相關室旁腫塊損傷、神經性腫瘤、低分化腫瘤，包括成神經管細胞瘤以及其它腦實質腫瘤，包括原發(fā)性腦淋巴瘤、生殖細胞腫瘤及松果體腦實質腫瘤、腦膜瘤、轉移性腫瘤、副腫瘤綜合征、周圍神經鞘腫瘤，包括神經鞘瘤、纖維神經瘤、惡性周圍神經鞘瘤(惡性神經鞘瘤)及神經皮膚綜合征(斑痣性錯構瘤病)，包括神經纖維瘤，包括I型神經纖維瘤(NF1)和II型神經纖維瘤(NF2)、結節(jié)性腦硬化以及VonHippel-Lindau病。
卵巢腫瘤和癌包括，但不限于，卵巢瘤，例如體腔上皮瘤、漿液瘤、粘液性腫瘤、子宮內膜樣腫瘤、透明細胞腺癌、囊腺纖維瘤、卵巢良性纖維上皮瘤、表面上皮瘤；生殖細胞瘤，例如成熟(良性)畸胎瘤、單層細胞畸胎瘤、未成熟惡性畸胎瘤、惡性胚胎瘤、內胚竇瘤、絨毛膜癌；性索基質瘤，例如粒層細胞-泡膜細胞瘤、泡膜細胞瘤-纖維瘤以及成雄細胞瘤、山細胞瘤及性腺母細胞瘤；以及轉移性腫瘤，例如克魯根堡氏瘤。
腎臟腫瘤和癌包括，但不限于良性腫瘤，例如腎乳頭腺瘤、腎纖維瘤或錯構瘤(腎髓質間質細胞瘤)、腎血管平滑肌脂肪瘤及瘤細胞瘤，以及惡性腫瘤，包括腎細胞癌(腎上腺樣瘤、腎腺癌)，包括腎盂尿路上皮癌。
骨骼肌瘤和癌包括，但不限于，橫紋肌肉瘤。
成骨細胞瘤和癌包括，但不限于，骨瘤、骨樣骨瘤、成骨細胞瘤、骨肉瘤、骨軟骨瘤、軟骨瘤、成軟骨細胞瘤、軟骨粘液纖維瘤、軟骨肉瘤、纖維性皮質缺損、纖維性發(fā)育不良、纖維肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤、內皮性別性骨髓瘤、原始神經外胚層腫瘤、巨細胞瘤以及轉移性腫瘤。
胰腺瘤和癌包括，但不限于，囊性腫瘤和胰腺癌；腺島細胞瘤包括，但不限于，胰島瘤、促胃液素瘤以及其它罕見的腺島細胞瘤。
乳房腫瘤和癌包括，但不限于，基質瘤，例如纖維性瘤、葉狀瘤及肉瘤，以及上皮腫瘤，例如大腺管乳頭狀瘤；乳癌包括原位(非擴散性)腫瘤，包括原位(非擴散性)腺管內腫瘤(包括Paget病)和小葉原位癌以及擴散性(浸潤)癌包括，但不限于，非特別類型擴散性腺管內腫瘤、擴散性小葉癌、髓質瘤、膠樣(粘液)癌、管狀癌及擴散性乳頭狀癌，以及其它惡性腫瘤。
男性胸部腫瘤和癌包括，但不限于，擴散性惡性腫瘤。
前列腺腫瘤和癌包括，但不限于，擴散性惡性腫瘤。
結腸腫瘤和癌包括，但不限于，非瘤性息肉、腺瘤、家族綜合征、直腸癌變、直腸癌以及類癌腫瘤。
肺部腫瘤和癌包括，但不限于，支氣管癌，包括副腫瘤綜合征、細支氣管肺泡癌、神經內分泌腫瘤，例如支氣管類癌、其它腫瘤和轉移性腫瘤；胸膜瘤，包括孤立性纖維瘤(胸膜纖維瘤)和惡性間皮瘤。
胸腺腫瘤和癌包括，但不限于，胸腺瘤，包括生殖細胞瘤、淋巴瘤、霍奇金氏(Hodgkin)病和類癌。胸腺瘤可包括良性或包裹性胸腺瘤和惡性胸腺瘤I型(擴散性胸腺瘤)或II型、指定性胸腺癌。
扁桃體腫瘤和癌包括，但不限于，非霍奇金氏淋巴瘤B細胞淋巴瘤。
包含前saposin相關多肽和內小葉成分(也稱“活性藥劑”)的一種本發(fā)明藥劑可以合成為適合給某一實驗對象使用的藥物。這些藥物一般包含一種前saposin多肽、一種內小葉成分和一種制藥學上可接受的載體。在一個具體藥物中，前saposin相關多肽與內小葉成分構成一種納泡。納泡的直徑范圍在0.01至10微米之間，較理想應在0.1至1微米之間，進一步理想應在0.1至0.5微米之間，更進一步理想應在0.2至0.4微米之間，而再進一步理想則應在0.2至0.3微米之間。典型的納泡直徑包括，但不限于10納米、100納米、150納米、160納米、170納米、180納米、190納米、200納米、210納米、220納米、230納米、240納米、250納米、260納米、270納米、280納米、290納米、300納米、350納米、400納米、450納米、500納米、550納米、600納米、650納米、700納米、750納米、800納米、850納米、900納米、950納米以及1000納米。
在此，“用藥”一詞具有其最廣泛的含義，包括將本發(fā)明藥物引進某一實驗對象的任何方法?！皩嶒瀸ο蟆笔侵覆溉閯游铮缛祟?，或者實驗或動物或疾病模型。實驗對象也可以是非人類動物，例如，但不限于，非人類靈長目動物、馬、母牛、山羊、豬、兔、鼠、豚鼠、狗或其它家畜。此外，本發(fā)明藥物可以用于治療此處所述的紊亂。因此，凡治療與超擴散性細胞(例如腫瘤或癌)有關的紊亂均包括在內。在此，“治療”一詞被定義為在某一患者上應用或使用本發(fā)明藥劑，或者將本發(fā)明藥劑應用于或投藥于某一名具有疾病或疾病癥狀的患者的某一單獨組織或細胞系上，目的是治療、治愈、緩解、減輕、改變、糾正、改善、改進或影響疾病或疾病的癥狀。
在此，“制藥學上可接受的載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質、糖衣、抗菌和抗真菌藥劑、等滲或延遲吸收藥劑等等與藥物用藥相容的藥劑。在活性藥物上使用這種介質和藥劑在本技術領域已為人熟知。除非任何傳統(tǒng)介質或藥劑與活性藥物不相容，否則在藥物中使用這種介質和藥劑乃預料之中。補充性活性藥劑也可以合成到藥物中。
本發(fā)明的一種抗腫瘤藥劑或藥物經配制后，可以與其預定用藥途徑相容。用藥途徑的例子包括不經腸，例如靜脈注射、皮內注射、皮下注射、口服(例如吸入)、經皮(外用)、經黏膜、腹腔和直腸直接給藥。不經腸、皮內或皮下注射給藥的溶液或懸浮液可包括下列成分無菌稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸酯；抗氧化劑例如抗壞血酸維生素C或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩沖劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及肌肉彈性調節(jié)劑，例如氯化鈉或葡萄糖。酸堿度可以根據(jù)酸或堿進行調節(jié)，例如鹽酸或氫化鈉。經腸制劑可以裝入安瓿、一次性注射器或者多劑量瓶中，這些容器可以是玻璃或塑料材質。
適合注射的藥物包括無菌水溶液(若可溶于水)或分散液和可臨時配制成無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。對于靜脈注射給藥，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF；Parsippany，N.J.)或者磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，藥物都必須是無菌的并且應當具有容易注射的流動性。藥物在制造和存儲條件下必須穩(wěn)定并且必須具有防止受到微生物例如細菌和真菌污染的保護措施。載體可以是溶劑或分散介質，其可以包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)以及這些物質的適當混合物?？梢酝ㄟ^使用糖衣(例如卵磷脂)、通過維持所需的粒度(對于分散液而言)以及使用表面活性劑的方式，維持適當?shù)牧鲃有浴７乐刮⑸锏淖饔每梢酝ㄟ^使用各種抗菌和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸維生素C、乙基汞硫代水楊酸鈉等等)來實現(xiàn)。在許多情況下，藥物中最好也包括等滲劑，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇和氯化鈉。可以在藥物中包括一種延緩吸收的藥劑(例如一硬脂酸鋁和凝膠)來延長吸收。
可以將溶于適當溶劑中的所需數(shù)量的活性藥劑(例如前saposin相關多肽和內小葉成分)與必要的上述一種成分或者多種成分的組合合成，然后過濾殺菌，配制成無菌可注射溶液。一般來說，分散劑的配制方法是將活性藥劑融合到無菌介質中，無菌介質包含基本分散介質和必要的上述其它成分。對于用來配制無菌可注射溶液的無菌粉末，配制粉末的較佳方法是真空干燥法和冷凍干燥法，這些方法可以從先前經殺菌過濾的溶液中制造出活性成分粉末以及任何其它想要得到的成分。
口服藥物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可以封裝在凝膠膠囊中或者壓縮成藥片。對于口服療法用藥，活性藥劑可以與賦形劑融合，并以藥片、片劑或膠囊的形式使用?？诜幬镞€可以使用液體載體配制成漱口液，液體載體中的藥劑經口給藥并沖漱口部，然后吐出或咽下。制藥學相容粘合劑和/或輔助材料可以作為藥物的一部分。藥片、藥丸、膠囊、片劑等可以包含以下任何成分或類似性質的藥劑粘合劑例如微晶纖維素、黃蓍膠或者凝膠；賦形劑例如淀粉或乳糖、分解劑例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或Sterotes；助滑劑例如二氧化硅膠體；甜味劑例如蔗糖或糖精；或者調味劑例如薄荷、水楊酸甲酯或者橙味劑。對于吸入給藥，藥劑以裝在壓縮容器或配給器中的氣霧噴劑的形式給藥，該容器包含一種適當?shù)耐七M物，例如二氧化碳氣體或霧化器。
在一個具體藥物中，活性藥劑與可以防止藥劑被身體快速排出的載體一起配制而成，例如控制釋放配方，包括植入和微膠囊封裝給藥機制?？梢允褂每缮锝到狻⑸锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原磷酯以及聚乳酸。這種配方的配制方法對于本技術領域的有經驗者而言是顯而易見的?？捎貌牧弦部上駻lzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.公司購買。脂質體懸浮液(包括以具有抗病毒抗原的單克隆抗體的感染細胞為目標的脂質體)也可以用作制藥學上可接受的載體。這些物質可以根據(jù)本技術領域已知的方法進行配制，例如使用美國專利No.4,522,811所描述的方法。
將口服或不經腸的藥物配制成劑量單位形態(tài)尤其有利，因為可以方便用藥并保證劑量的一致性。在此，“劑量單位形態(tài)”是指物理上離散的單位，適合治療實驗對象的單位劑量，每單位包含預定數(shù)量的活性藥劑，預定數(shù)量是根據(jù)活性藥劑與所需的制藥學載體聯(lián)合可產生所要的療效計算而得。根據(jù)疾病的類型和嚴重程度，給病人選用的本發(fā)明藥劑的初始劑量大約在1微克/公斤至大約15毫克/公斤(例如0.1至20毫克/公斤)之間，不管是采用一次或多次單獨給藥或者連續(xù)輸注的方法。典型的每日劑量可以在大約1微克/公斤至100毫克/公斤之間或者更高劑量，具體劑量要根據(jù)上述因素而定。對于多日或更長時間內重復給藥，根據(jù)具體情況，治療可繼續(xù)，直到疾病癥狀得到適當?shù)囊种茷橹?。然而，其它劑量體系也可能有效。這種療法的進展情況可以通過傳統(tǒng)的技術和化驗得到監(jiān)控。一個典型的劑量體系已在WO 94/04188中公開。本發(fā)明的劑量單位形態(tài)取決于并直接依賴于活性藥劑的獨特性質和所要取得的特定療效以及復合該活性藥劑用以治療個體患者的技術所固有的局限性。
系統(tǒng)用藥還可以采用經黏膜或經皮的方法。對于經黏膜或經皮給藥，應在配方中使用適合所要滲透的屏障的滲透劑。這種滲透劑在本技術領域已為人所普遍知曉，例如用于經黏膜給藥的滲透劑有清潔劑、膽汁鹽以及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜給藥可以使用鼻用噴劑或栓劑的方法。對于經皮給藥，活性藥劑被配制成油膏、軟膏、膠體或霜劑，這些在本技術領域已眾所周知。藥劑還可以配制成栓劑(例如傳統(tǒng)栓劑可可油及其它甘油酯)形式或者保留灌腸劑實現(xiàn)直腸送藥。
本文所述的抗腫瘤或抗癌藥劑可以經皮給藥。經皮給藥一般包括使藥劑通過經皮通道進入實驗對象或患者的系統(tǒng)循環(huán)。皮膚部位包括經皮給藥的解剖學區(qū)域，包括前臂、腹部、胸部、背部、屁股、乳頭部等等。
經皮送藥通過使患者的皮膚長時間暴露于藥劑或藥物源達到送藥目的。經皮藥貼還具有有控制地向身體提供藥劑的優(yōu)點(參見Hadgraftand Guy(eds)所著的Transdermal Drug DeliveryDevelopmentalissues and Research InitiativesMarcel Dekker，Inc.；Robinson &Lee(eds)所著的(1987)Controlled Drug DeliveryFundamentalsand Applications，Marcel Dekker，Inc；以及Kydonieas & Bemer(eds)所著的(1987)Transderrnal Delivery of Drugsvols 1-3，CRC Press，在此通過引用納入)。這種劑量形態(tài)可以通過溶解、分散或者其它方式將saposin C相關多肽和二油基磷脂酰絲氨酸(dioleoylphosphatidylserine，簡稱DOPS)的結合物融合到適當?shù)慕橘|(例如彈性體骨架材料)中制作而成。吸收增強劑還可以用來提高藥劑通過皮膚的流量。此流量的速度可以通過提供速度控制膜或者將藥劑分散在聚合物骨架或凝膠中而得到控制。
許多類型的經皮藥貼在此處所述的方法中得到應用。例如，簡單膠布藥貼可以使用背襯材料和丙烯酸鹽膠布制作而成。藥劑和任何增強劑可以配制成膠性澆鑄溶液并可充分混合。該溶液可以直接澆鑄在背襯材料上，而澆鑄溶劑則在爐中蒸發(fā)掉，留下膠膜。附上釋放內襯，即成完整的藥貼。
也可以使用聚氨酯骨架藥貼進行送藥。此藥貼的各層包括背襯層、聚氨酯藥/增強劑骨架層、膜層、膠粘層以及釋放內襯層。聚氨酯骨架使用室溫固化聚氨酯預聚物配制而成。在該預聚物中加入水、酒精和藥劑配制成堅實的粘性彈性體后，可以直接澆鑄在背襯材料上。
本發(fā)明的一個更進一步的具體藥物可以使用水凝膠骨架藥貼。水凝膠骨架一般包括酒精、水、藥和幾種親水聚合物。該水凝膠骨架可以夾在背襯和膠粘層之間，融合到經皮藥貼上。
對于被動送藥系統(tǒng)，釋放速度一般通過夾在儲藥器和皮膚之間的膜、通過從單片裝置中進行擴散或者通過將皮膚本身作為送藥系統(tǒng)中的速度控制屏障得到控制。(參見美國專利，專利號4,816,258；4,927,408；4,904,475；4,588,580；4,788,062，在此通過引用納入)。送藥速度將部分取決于膜的性質。例如藥物在體內穿過膜的速度一般比穿過皮膚屏障的速度高。藥劑從裝置送往膜的速度的最便利控制方法是在儲藥器和皮膚之間放置一個速度限制膜。當皮膚對于藥物具有充分的滲透性(即通過皮膚的吸收高過通過膜的速度)時，膜將具有控制患者接受劑量速度的功效。
具有適當滲透性的膜材料可以根據(jù)所需的滲透性、藥劑的性質以及與構建裝置有關的機械因素來選擇。典型的滲透性膜材料包括廣泛的自然和合成聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(硅樹脂橡膠)、乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚氨酯、聚氨酯-聚醚共聚物、聚乙烯、聚酰胺、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、纖維素材料，例如三乙酸纖維素和硝酸纖維素/醋酸纖維素和水凝膠，例如2-羥乙酯甲基丙烯酸(HEMA)。
裝置可以含有其它東西，例如其它制藥學上可接受載體，具體要看所要的裝置特性而定。例如，根據(jù)本發(fā)明的配制藥物還可以包括一種或多種防腐劑或細菌抑制劑，例如羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、氯化甲酚、殺藻胺等等。這些藥物還可以包含其它活性成分，例如抗微生物劑，尤其是抗生素、麻醉劑和止癢劑。
本發(fā)明的另一方面還對本發(fā)明藥劑的外用送藥進行了規(guī)定。本治療體系適合抗腫瘤藥劑的系統(tǒng)用藥，也適合局部療法，即直接送至病理性或有病的組織。
一般來說，外用藥物配方包括將藥劑直接送至感染部位、包含藥物的制劑，藥物的濃度范圍一般在大約0.001％至10％之間；較理想的范圍為大約0.01至大約10％之間；進一步理想的范圍在大約0.1至大約5％之間；而最理想的范圍為大約1至大約5％之間，這一濃度包括非毒性、制藥學上可接受的外用載體(Barry(eds).Dermatological FormulationsPercutaneous Absorption(1983)Marcel Dekker，Inc；有關傳統(tǒng)藥劑的標準劑量，可參見例如，Physicians Desk Reference(1992版)；以及美國醫(yī)學協(xié)會的(1992)Drug Evaluations Subscriptions)。
外用制劑可以通過將藥劑與傳統(tǒng)藥物稀釋劑和外用干質、液體、霜質和浮質配方中常用的載體相結合配制而成。膏劑和霜劑可以(例如)使用水基或者油基加上適當?shù)臐饣瘎┖?或膠凝物質配制而成。這些基可以包括水和/或油，例如液體石蠟，或植物油，例如花生油或蓖麻油。根據(jù)基的性質而進行使用的濃化劑可以包括軟石蠟、硬脂酸鋁、十六十八混合醇、丙二醇、聚乙二醇、羊毛脂、氫化羊毛脂、蜂蠟等等。洗劑可以使用水基或油基配制而成，并且一般還包括下列之一種或多種穩(wěn)定化劑、乳化劑、分散劑、懸浮劑、濃化劑、著色劑、香精等等。粉末可以使用任何適宜的基(例如滑石、乳糖、淀粉等等)制作而成。滴劑可以使用水基或非水基配制而成，這些基還可以包括一種或多種分散劑、懸浮劑、增溶劑等等。
本發(fā)明藥劑的外用劑量形態(tài)包括粉末、噴劑、油膏、軟膏、霜劑、洗劑、膠體、溶液、藥貼和吸入劑?；钚运巹┛梢栽跓o菌條件與制藥學上可接受載體、任何防腐劑、緩沖劑或必要的推進物混合。
油膏、軟膏、霜劑和膠體還可包含賦性劑，例如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅樹脂、膨潤土、滑石以及氧化鋅或者以上物質的混合物。粉末和噴劑還可包含賦性劑，例如乳糖、滑石、氫氧化鋁、硅酸鈣以及聚酰胺粉末或者以上物質的混合物。噴劑還可包含慣用的推進物，例如含氯氟羥和揮發(fā)性未取代碳氫化合物，例如丁烷和丙烷。
本發(fā)明的方法還適用于通過粘膜送藥，例如胃腸、舌下、口腔、鼻、肺、陰道、角膜、眼膜(參見Mackay等人所著的(1991)Adv.Drug Del.Rev.7313-338)。
對于經口腔或舌下膜送藥，可以使用典型的口服配方例如口含片、藥片或膠囊。制造這些配方的方法已為本技術領域所知，包括，但不限于，在預制藥片中加入藥劑；冷壓縮惰性填料、粘合劑和膠囊封裝。
另外一種口服配方可以與粘合劑(例如纖維素衍生物、羥丙纖維素)一起敷在口腔黏膜上，如美國專利No.4,940,587所描述，在此通過引用納入。當敷在口腔黏膜上時，這種口腔粘合配方可以控制藥劑釋放到口中并穿過口腔黏膜。
對于送藥到鼻和/或肺膜，可以采用典型的氣霧劑配方?！皻忪F劑”這一術語包括本發(fā)明藥劑的任何氣載懸浮相，能夠被吸入到細支氣管或鼻道中。具體而言，氣霧劑包括當前發(fā)明藥劑微滴的氣導懸浮液，例如裝在計量劑量吸入器或噴霧器中。氣霧劑還可以包括懸浮在空氣或其它載體氣中的藥劑干粉藥物，可以通過從吸入器裝置中吸入的方法送藥。
本發(fā)明藥物具有治療此處所述的紊亂的功效。藥物按療效數(shù)量提供。這里的“療效數(shù)量”是指足以調節(jié)所要達到的反應的數(shù)量。根據(jù)這一定義，藥劑中的蛋白質或多肽的療效數(shù)量(即有效劑量)的范圍在大約0.001至30毫克/公斤體重之間，較理想的范圍在大約0.01至25毫克/公斤體重之間，進一步理想的范圍在大約0.1至20毫克/公斤體重之間，而更進一步理想的范圍在大約1至15毫克/公斤體重之間。本發(fā)明藥劑的內小葉成分療效數(shù)量(即有效劑量)的范圍在大約0.001至30毫克/公斤體重之間，較理想的范圍在大約0.01至大約30毫克/公斤體重之間，進一步理想的范圍在大約0.01至大約20毫克/公斤體重之間，更進一步理想的范圍在0.01至10毫克/公斤體重之間，再進一步理想的范圍在大約0.1至9毫克/公斤、0.1至8毫克/公斤、0.1至7毫克/公斤、0.1至6毫克/公斤、0.1至5毫克/公斤、0.1至4毫克/公斤或者0.1至3毫克/公斤體重之間。
本發(fā)明藥劑中多肽與內小葉成分的摩爾比率范圍在大約1∶1至大約1∶50之間，較理想的范圍在大約1∶1至大約1∶25之間，進一步理想的范圍在大約1∶1至1∶10之間，而再進一步理想的比率是大約1∶7或大約1∶3。適宜的比率寶庫，但不限于，1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15、1∶16、1∶17、1∶18、1∶19、1∶20、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45以及1∶50。本發(fā)明藥劑中的多肽與內小葉成分的質量比率范圍在大約15∶1至3∶10之間，較理想的范圍在大約15∶1至大約3∶5之間，進一步理想的范圍在大約15∶2至大約3∶0之間，而最理想的比率是大約15∶7或者大約5∶1。看得出本發(fā)明藥劑中的多肽與內小葉成分之間的優(yōu)先比率可能受到某些因素的影響，例如，但不限于，目標細胞類型。有經驗的技術人員看得出某些因素可能影響有效治療某一實驗對象所需的劑量，包括，但不限于，疾病或紊亂的嚴重程度、先前的治療、實驗對象的總體健康狀況和/或年齡以及是否存在其它疾病。而且，使用療效數(shù)量的蛋白質、多肽或者抗體治療某一實驗對象可包括單一治療或者更可取地包括一系列治療。在一個首選例子中，每周使用療效數(shù)量的藥劑治療某一實驗對象，用藥時間在大約一周至十周之間，較理想為二周至八周之間，進一步理想為大約三周至七周，更進一步理想為大約四周、五周或六周。另外也看得出治療所用的抗體、蛋白質或者多肽的有效劑量可能在具體治療過程中或增或減。劑量更改可能是因為并可能顯然是因為于此處所述的診斷檢定結果所致。當治療中的某一實驗對象有部分反應表現(xiàn)或者在癥狀長期消退之后復發(fā)時，可以使用本發(fā)明藥劑作為后續(xù)治療。因此，在第一個治療周期(可能包括單劑量體系或多劑量體系)之后間隔了一段時間之后，某一實驗對象可以接受一個或多個額外治療周期，額外治療周期可包括單劑量體系或多劑量體系。在此，兩個治療周期之間的間隔時間是指停藥時間?？吹贸?，停藥時間長度取決于任何先前使用本發(fā)明抗腫瘤藥劑的治療周期中達到的腫瘤反應程度。藥物可以使用容器、裝包或分配器包裝，并隨附用藥說明。一種癌癥的治療結果可以采用本技術領域已知的任何方法進行檢定，包括，但不限于，體檢、實驗、原子和X光照相術(即計算機X光體層照相術和/或磁共振成像技術)、超聲波以及其它方法。在此，“細胞死亡”是指通過任何機制包括凋亡、壞死和溶解等使細胞失去生命。在此，“凋亡”或者“計劃內細胞死亡”是指需要垂死細胞的調制代謝活動的正常生理過程，其通常特征是細胞收縮、染色質濃縮和/或核子分裂、膜的缺失、DNA分裂和/或質膜損害或起泡。以下例子僅為說明用途，并非對本發(fā)明進行限制。
實驗例一重組saposinC的提純采用異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷誘導pET系統(tǒng)時，重組saposin C在E.coli細胞中被過度表達(參見Qi等人所著的(1994)J.Biol Chem.26916746-16753，在此通過引用將它們作為整體納入)。被表達的多肽與His-tag一起從鎳柱上洗提。透析之后，多肽通過以下HPLC高效液相色譜法得到進一步提純。一個C4反相柱與0.1％三氟乙酸(TFA)保持平衡達10分鐘。蛋白質在乙腈中按0.1％TFA的線性(0-100％)梯度洗提60分鐘以上。主要的蛋白質峰均被收集并凍干。蛋白質濃度按上述方法測定(參見Qi等人所著的(1994)J.Biol.Chem.26916746-16753)。
例二saposin C和二油基磷脂酰絲氨酸的聲波降解浴二油基磷脂酰絲氨酸(DOPS)可向Avanti Polar Lipids(Alabaster AL)公司購買。氯仿中有二十至三十微摩爾的DOPS在N2下被干燥并抽真空成脂膜。五至十微摩爾saposin C多肽被添加到干燥膜上并加到50微升Mcllvanine緩沖劑(pH4.7)中制成懸浮液。然后加入細胞培養(yǎng)介質或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)使懸浮液容積達到1毫升(參見Ausubel等人所著的(2002)Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley & Sons，New York，New York，在此通過引用納入)。以上混合物在浴法聲波降解器中經聲波降解大約20分鐘。如需要，加入適量的冰，防止樣品過熱。
例三組織培養(yǎng)條件鱗片細胞癌(SCC)細胞和L5178Y細胞在加有10％FBA的DEME介質(Gibco)中培養(yǎng)。正常永生化角質形成細胞(NIK)在50％Cascade介質154(Cascade Biologics)和50％角質形成細胞-SFM介質(Gibco)中生長。
例四體外分析saposin C-DOPS抑制SCC細胞的效果鱗片細胞癌(SCC)細胞和對照細胞(NIK細胞)均在介質中生長，該介質在本文別處進行介紹。把NIK作為對照細胞，是因為已表明SCC在人類皮膚角質形成細胞中是通過一個多步過程而發(fā)育的(參見Kubo等人所著的(2002)J.Med.Invest.49111-117)。從已建立的NIK和SCC細胞平皿中除去培養(yǎng)介質。培養(yǎng)介質不做任何處理，向已建立的NIK和SCC細胞平皿中加入saposin C、DOPS或者8μM saposin C+26μM DOPS。這些細胞在治療之后48-72小時進行檢查。圖1顯示一個上述實驗的結果。鱗片細胞癌(SCC)細胞所生長的介質在本文他處進行介紹。培養(yǎng)介質從已建立的SCC細胞平皿中除去。培養(yǎng)介質不做任何處理或者向已建立的SCC細胞平皿中加入含有10μM saposin C+30μM DOPS的藥劑。讓細胞孵化24小時后，通過TUNEL著色、染色體組DNA的膠體電泳或者使用抗凝結劑蛋白即膜聯(lián)蛋白V進行雜交測定，分析這些細胞，分析數(shù)據(jù)未顯示。
例五體外分析saposin C-DOPS對鼠淋巴瘤細胞的療效組織培養(yǎng)平皿種有鼠L5178Y-R淋巴瘤細胞。培養(yǎng)物建立之后，除去培養(yǎng)介質并清洗細胞。這些細胞上覆蓋DEME+10％FBA之外，或者無附加藥物或者附加60μM DOPS、20μM saposin C或者10μMsaposin C和30μM DOPS。培養(yǎng)物孵化24-48小時。孵化期之后檢查培養(yǎng)物。圖2顯示一個上述實驗的結果。
例六體內分析saposin C-DOPS對腫瘤大小的影響裸鼠按(美國)辛辛那提兒童研究基金會(CincinnatiChildren′s Research Foundation)有關實驗鼠照料的規(guī)定進行喂養(yǎng)。分別對兩組各五只裸鼠進行2×106SCC上背部皮下注射，使之發(fā)生腫瘤生長。每只鼠分別長出兩個腫瘤。讓腫瘤生長21天。在第21天，這些動物的腫瘤部位接受純PBS稀釋劑或者包含saposin C(10毫克/公斤體重)和DOPS(2毫克/公斤體重)的藥劑皮下注射。在第27天，這些動物的腫瘤部位接受第二次純PBS稀釋劑或者包含saposinC(10毫克/公斤體重)和DOPS(2毫克/公斤體重)的藥劑皮下注射。每隔一天用卡尺測量腫瘤大小，腫瘤體積按公式V＝(π/4)LW2進行估算。圖3的A片區(qū)顯示一個上述實驗的結果。在單獨的一組實驗中，裸鼠按(美國)辛辛那提兒童研究基金會(Cincinnati Children′s Research Foundation)有關實驗鼠照料的規(guī)定進行喂養(yǎng)。分別對兩組各五只裸鼠進行2×106SCC上背部皮下注射，使之發(fā)生腫瘤生長。每只鼠分別長出兩個腫瘤。讓腫瘤生長6天。在第6天，這些動物的腫瘤部位接受純PBS稀釋劑或者包含saposin C(10毫克/公斤體重)和DOPS(2毫克/公斤體重)的藥劑皮下注射。
每隔一天用卡尺測量腫瘤大小，腫瘤體積按公式V＝(π/4)LW2進行估算。圖3的B片區(qū)顯示一個上述實驗的結果。
例七saposin C-DOPS對人類鱗片細胞癌腫瘤組織的療效使用SCC腫瘤按本技術領域已知的方法制備鼠異種移植物。將熒光標志硝基苯并二唑(NBD)與磷脂酰絲氨酸相連結并制備NBD-PS與DOPS的混合物。使用NBD-DOPS制備熒光標志NBD-PS/DOPS/saposin C藥劑。在腫瘤部位按0.1毫克NBD-PS/公斤體重和2毫克DOPS/公斤體重的劑量注射NBD-PS/DOPS。在腫瘤部位按0.1毫克NBD-PS/公斤體重、2毫克DOPS/公斤體重和10毫克saposin C/公斤體重的劑量注射NBD-PS/DOPS/saposin C。腫瘤于用藥后24小時被殺死。檢查腫瘤的顯微切片是否有熒光。圖4顯示一個上述實驗的結果。
例八體外分析saposin C-DOPS對人類細胞的療效取自人類癌組織和健康組織的細胞均在適合該細胞系的介質中生長。對取自以下癌組織和健康組織細胞系的細胞進行分析乳癌MCF-7、轉染顯性負caspase 9的MCF-7、轉染病媒控制的MCF-7、BT-549；頭和頸SCC-25、FaDu；黑素瘤MeWo、Sk-Mel-28；白血病K-562、HL60；子宮頸癌Hela；卵巢癌PA1、轉染顯性負caspase 9的PA1、PA1-E6；SK-OV3；前列腺癌DU145、PC3；成神經細胞瘤SK-N-SH、SK-SY-5Y、CHLA-79；Ewing肉瘤5838；T細胞淋巴瘤；RoduT；GCT；肺癌A549、H441；肝癌HepG2；健康乳房MCF-10A；以及健康角質形成細胞NIK。96井平底組織培養(yǎng)皿(Falcon，Becton-Dickson Labware，F(xiàn)ranklin Lakes NJ)按每井10000個細胞的密度進行種植。細胞皿分別放入含有或不含有本發(fā)明藥劑的完全培養(yǎng)基中。使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-y1)-2，5-二苯四唑溴化物(可向Sigma購買)轉甲產品(18992)來評價可存活細胞密度。細胞培養(yǎng)之后72小時，向每個井中添加3-(4，5-二甲基噻唑-2-y1)-2，5-二苯四唑溴化物(MTT)，達到最終濃度為0.25毫克/毫升為止。細胞皿在黑暗中于37℃溫度下孵化3個小時。所起的反應通過加入含有0.04N HCI的異丙醇予以終止。將細胞皿徹底混合，并在微ELISA平皿讀取器(由SpectraMax Plus，Molecular Devices，Sunnyvale CA制造)上做570納米分析。使用PharmTools Pro計算機軟件(The McCaryGroup，Elkins Park，PA產品)進行生長曲線和回歸分析。
例九評估saposin C/DOPS IC50制備saposin C和DOPS摩爾比率分別為1∶7、1∶3和1∶10的混合物。按上述方法制備由多段saposin C蛋白質組成的多肽(參見Wang等人所著的(2003)Arch.Biochem.&Biophys.41545-53，在此通過引用將它們作為整體納入)。突變saposinC多肽如下所示HNSC由氨基酸殘留物1-40組成；H1由殘留物4-20組成；H-2則由氨基酸殘留物24-40組成。人類SK-Mel-28黑素瘤細胞在96井平底組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。細胞上覆蓋介質，該介質含有各種濃度的saposin C、DOPS、HNSC∶DOPS(1∶3)、H-1∶DOPS 1∶3；H-2∶DOPS 1∶3；或者全長saposin C與DOPS按1∶7、1∶3或1∶10比例混合的混合物。分別對四個SK-Mel-28細胞皿使用每一種治療。使用MTT轉換測定法(在本文他處進行介紹)分析對細胞的抑制效果。使用PharmTools Pro計算機軟件(The McCary Group，Elkins Park，PA公司產品)對數(shù)據(jù)進行基本線性回歸分析。分析結果顯示在表2中。
例十體內分析saposin C-DOPS對腫瘤細胞的療效裸鼠按(美國)辛辛那提兒童研究基金會(CincinnatiChildren′s Research Foundation)有關實驗鼠照料的規(guī)定進行喂養(yǎng)。分別對實驗鼠進行2×106SCC上背部皮下注射，使之發(fā)生腫瘤生長。讓腫瘤生長。這些動物分別使用DOPS(2毫克/體重)或含有saposinC(10毫克/公斤)和DOPS(2毫克/公斤體重)的藥劑進行治療。治療之后四十八小時，腫瘤被殺死。制備腫瘤組織切片并使用各種方法進行檢查。使用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸鹽缺口端標志(TUNEL)對組織切片檢查，評估凋亡情況。(一個上述實驗的結果在圖5的A和B片區(qū)顯示。)組織切片使用蘇木精和曙紅進行著色。(一個上述實驗的結果在圖5的C和D片區(qū)顯示。)說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請表明那些對本發(fā)明領域有經驗者的水平。所有出版物、專利和專利申請在此通過引用納入，如同具體地引用每個出版物或專利申請，將它們分別納入一般。盡管為理解清楚起見，通過圖解和舉例的方法對前述發(fā)明作了一定程度的具體說明，但是很顯然，在隨附的申請專利范圍內可作某些變化和修改。
序列表<110>Children′s Hospital Medical Center<120>Saposin C-DOPS一種抗癌新藥<130>CHM08/GN003<150>60/466,166<151>2003-04-28<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>524<212>PRT<213>人<400>1Met Tyr Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala1 5 10 15Gly Pro Val Leu Gly Leu Lys Glu Cys Thr Arg Gly Ser Ala Val Trp20 25 30Cys Gln Asn Val Lys Thr Ala Ser Asp Cys Gly Ala Val Lys His Cys35 40 45Leu Gln Thr Val Trp Asn Lys Pro Thr Val Lys Ser Leu Pro Cys Asp50 55 60Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp Met Leu Lys Asp Asn65 70 75 80Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Tyr Leu Glu Lys Thr Cys Asp Trp85 90 95Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys Glu Ile Val Asp Ser100 105 110Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly Glu Met Ser Arg Pro115 120 125Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu Ser Leu Gln Lys His130 135 140Leu Ala Glu Leu Asn His Gln Lys Gln Leu Glu Ser Asn Lys Ile Pro145 150 155 160Glu Leu Asp Met Thr Glu Val Val Ala Pro Phe Met Ala Asn Ile Pro165 170 175Leu Leu Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Pro Arg Ser Lys Pro Gln Pro Lys180 185 190Asp Asn Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile195 200 205Gln Thr Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu210 215 20His Val Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile225 230 235 240Cys Lys Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met245 250 255Met His Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Ala Leu Val Gly Phe Cys Asp260 265 270Glu Val Lys Glu Met Pro Met Gln Thr Leu Val Pro Ala Lys Val Ala275 280 285Ser Lys Asn Val Ile Pro Ala Leu Glu Leu Val Glu Pro Ile Lys Lys290 295 300
His Glu Val Pro Ala Lys Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe305 310 315 320Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys325 330 335Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser340 345 350Leu Ser Glu Glu Cys Gln Glu Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile355 360 365Leu Ser Ile Leu Leu Glu Glu Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met370 375 380Leu His Leu Cys Ser Gly Thr Arg Leu Pro Ala Leu Thr Val His Val385 390 395 400Thr Gln Pro Lys Asp Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val405 410 415Gly Tyr Leu Asp Arg Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Gln Glu Ile420 425 430Leu Ala Ala Leu Glu Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln435 440 445Lys Gln Cys Asp Gln Phe Val Ala Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu450 455 460Ile Leu Val Glu Val Met Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly465 470 475 480Ala Cys Pro Ser Ala His Lys Pro Leu Leu Gly Thr Glu Lys Cys Ile485 490 495Trp Gly Pro Ser Tyr Trp Cys Gln Asn Thr Glu Thr Ala Ala Gln Cys500 505 510Asn Ala Val Glu His Cys Lys Arg His Val Trp Asn515 520<210>2<211>80<212>PRT<213>人<400>2Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe Leu Val Lys Glu Val Thr1 5 10 15Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu Ile Leu Asp Ala Phe20 25 30Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser Leu Ser Glu Glu Cys Gln35 40 45Glu Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile Leu Ser Ile Leu Leu Glu50 55 60Glu Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met Leu His Leu Cys Ser Gly65 70 75 80
權利要求
1.包含內小葉成分和前saposin相關多肽的藥劑，其中的多肽具有一個氨基酸序列，系選自由下列氨基酸序列組成的群組(a)SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列；(b)有80％與SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留質膜親和力；(c)SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列；以及(d)有80％與SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留質膜親和力。
2.在本發(fā)明藥劑的權利要求1中，內小葉成分是指磷脂酰絲氨酸或其結構類似物。
3.在本專利藥劑的權利要求2中，磷脂酰絲氨酸或其結構類似物是指二油基磷脂酰絲氨酸。
4.在本發(fā)明藥劑的權利要求1中，多肽與內小葉成分的摩爾比率的范圍在大約1∶1至大約1∶50之間。
5.在本發(fā)明藥劑的權利要求5中，多肽與內小葉成分的摩爾比率的范圍在大約1∶1至大約1∶10之間。
6.本發(fā)明藥劑的權利要求1可進一步包含一種制藥學上可接受的載體。
7.在本發(fā)明藥劑的權利要求1中，該藥劑可促進超擴散性細胞的死亡。
8.在本發(fā)明藥劑的權利要求7中，該超擴散性細胞選自由腫瘤細胞和癌細胞組成的群組。
9.調節(jié)某一實驗對象的細胞質膜中的內小葉成分分布的方法包括給該實驗對象用藥，所用的藥劑包括內小葉成分和前saposin相關多肽，其中的多肽具有一個氨基酸序列，系選自由以下氨基酸序列組成的群組(a)SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列；(b)有80％與sEQ ID NO1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留質膜親和力；(c)SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列；以及(d)有80％與SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留質膜親和力。
10.在本發(fā)明方法的權利要求9中，內小葉成分是指磷脂酰絲氨酸或其結構類似物。
11.在本發(fā)明方法的權利要求10中，磷脂酰絲氨酸或其結構類似物是指二油基磷脂酰絲氨酸。
12.在本發(fā)明方法的權利要求9中，質膜的外小葉中的內小葉成分的分布情況發(fā)生了改變。
13.在本發(fā)明方法的權利要求12中，外小葉中的內小葉成分濃度得到了提高。
14.在本發(fā)明方法的權利要求9中，對內小葉成分分布情況的調節(jié)系發(fā)生于超擴散性細胞上。
15.在本發(fā)明方法的權利要求14中，超擴散性細胞選自由腫瘤細胞和癌細胞組成的群組。
16.在本發(fā)明方法的權利要求9中，該方法可促進細胞死亡。
17.一種調節(jié)某一實驗對象的腫瘤大小的方法，該方法包括使用一種包含內小葉成分和前saposin相關多肽的藥劑，其中的多肽具有一個氨基酸序列，系選自由下列氨基酸序列組成的群組(a)SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列；(b)有80％與SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留質膜親和力；(c)SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列；以及(d)有80％與SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留質膜親和力。
18.在本發(fā)明方法的權利要求17中，該藥劑可促進超擴散性細胞的死亡。
19.在本發(fā)明方法的權利要求18中，超擴散性細胞選自由腫瘤細胞和癌細胞組成的群組。
20.在本發(fā)明方法的權利要求19中，該癌細胞選自由肉瘤、成神經細胞瘤、乳癌和鱗片細胞癌細胞組成的群組。
21.在本發(fā)明方法的權利要求17中，內小葉成分是指磷脂酰絲氨酸或其結構類似物。
22.在本發(fā)明方法的權利要求21中，磷脂酰絲氨酸或其結構類似物是指二油基磷脂酰絲氨酸。
23.在本發(fā)明方法的權利要求17中，該實驗對象是哺乳動物。
24.在本發(fā)明方法的權利要求23中，該哺乳動物是人類。
25.在本發(fā)明方法的權利要求17中，該腫瘤體積減小。
26.在本發(fā)明方法的權利要求17中，多肽與內小葉成分的摩爾比率的范圍在大約1∶1至大約1∶50之間。
27.在本發(fā)明方法的權利要求26中，多肽與內小葉成分的摩爾比率的范圍在大約1∶1至大約1∶10之間。
28.在本發(fā)明方法的權利要求17中，該藥劑可進一步包含一種制藥學上可接受的載體。
29.一種治療某一實驗對象的癌癥的方法，該方法包括使用一種包含內小葉成分和前saposin相關多肽的藥劑，其中的多肽具有一個氨基酸序列，系選自由下列氨基酸序列組成的組(a)SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列1；(b)有80％與SEQ ID NO1中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留質膜親和力；(c)SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列；以及(d)有80％與SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中的多肽保留質膜親和力。
30.在本發(fā)明方法的權利要求29中，內小葉成分是指磷脂酰絲氨酸或其結構類似物。
31.在本發(fā)明方法的權利要求30中，磷脂酰絲氨酸或其結構類似物是指二油基磷脂酰絲氨酸。
32.在本發(fā)明方法的權利要求29中，多肽與內小葉成分的摩爾比率的范圍在大約1∶1至大約1∶50之間。
33.在本發(fā)明藥劑的權利要求32中，多肽與內小葉成分的摩爾比率的范圍在大約1∶1至大約1∶10之間。
34.在本發(fā)明方法的權利要求29中，該藥劑可進一步包含一種制藥學上可接受的載體。
35.在本發(fā)明方法的權利要求29中，該藥劑可促進超擴散性細胞的死亡。
36.在本發(fā)明方法的權利要求35中，細胞死亡通過凋亡而發(fā)生。
37.在本發(fā)明方法的權利要求35中，超擴散性細胞選自由幾種癌細胞組成的群組。
38.在本發(fā)明方法的權利要求37中，該癌細胞選自由肉瘤、成神經細胞瘤、乳癌和鱗片細胞癌細胞組成的群組。
39.在本發(fā)明方法的權利要求29中，該實驗對象是哺乳動物。
40.在本發(fā)明方法的權利要求39中，該哺乳動物是人類。
41.在本發(fā)明方法的權利要求29中，藥劑的用藥方法有經腸道、非腸道、經皮下、經靜脈、經腹膜或外用。
42.在本發(fā)明方法的權利要求29中，給該實驗對象使用多劑量的該藥劑。
43.在本發(fā)明方法的權利要求29中，給該實驗對象使用單劑量的該藥劑。
44.抗腫瘤藥劑包含具有SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列的多肽以及二油基磷脂酰絲氨酸。
45.在權利要求44中所述的抗腫瘤藥劑中，多肽與二油基磷脂酰絲氨酸的質量比率大約為5∶1。
46.在權利要求44中所述的抗腫瘤藥劑中，多肽與二油基磷脂酰絲氨酸的質量比率大約為15∶7。
47.在權利要求44中所述的抗腫瘤藥劑中，多肽與二油基磷脂酰絲氨酸的質量比率范圍在大約15∶1至大約3∶10之間。
48.權利要求44中所述的抗腫瘤藥劑包含大約10μM的多肽和大約30μM的二油基磷脂酰絲氨酸。
49.權利要求44中所述的抗腫瘤藥劑包含大約10μM的多肽和大約70μM的二油基磷脂酰絲氨酸。
全文摘要
提供治療患有以超擴散性細胞如腫瘤和癌為特征的紊亂的患者的藥物和方法。藥物包含的藥劑為saposin C (即前saposin相關多肽)與二油基磷脂酰絲氨酸的結合物(即內小葉成分)。這種抗腫瘤藥劑按本發(fā)明方法并根據(jù)一種劑量體系進行用藥。使用本發(fā)明藥劑將在腫瘤患者體內發(fā)生積極的治療反應。
文檔編號A61K38/00GK1735424SQ200480001127
公開日2006年2月15日 申請日期2004年3月17日 優(yōu)先權日2003年4月28日
發(fā)明者X·齊 申請人:兒童醫(yī)院醫(yī)療中心