專利名稱：用于多型人乳頭瘤病毒感染防治的多肽和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及用于多型人乳頭瘤病毒(HPV)感染防治的多肽和疫苗，所述的多肽衍生自HPV外殼蛋白1。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一類具有嚴(yán)格宿主范圍和組織特異性的DNA的病毒，已發(fā)現(xiàn)有100多個(gè)型。其中HPV16、18、31、33、45、58型是引起消化道、生殖道癌的一個(gè)主要因素，特別是宮頸惡性腫瘤；HPV6、11是引起尖銳濕疣等性傳播性疾病的重要致病因素[1-5]。為了有效預(yù)防這類病毒的感染和傳播，世界各國(guó)都在積極開(kāi)展HPV疫苗的研制。
HPV疫苗大致可分為治療性疫苗和預(yù)防性疫苗兩大類，由于HPV至今不能經(jīng)組織培養(yǎng)，且含有潛在致癌性DNA，故疫苗不能采用HPV減毒活疫苗或死疫苗。腫瘤細(xì)胞內(nèi)病毒癌蛋白E6和E7屬于組成型表達(dá)，因而可以將它們視作免疫治療的基本靶抗原，故治療性的疫苗主要是以HPV早期蛋白E6、E7作為目的蛋白，主要是針對(duì)HPV感染后的治療，尤其對(duì)已經(jīng)發(fā)生上皮內(nèi)變異，或上皮內(nèi)原位癌的治療，如CIN，此類疫苗基本不具有HPV感染的預(yù)防作用[6，7]。外殼蛋白L1、L2位于病毒的表面，機(jī)體針對(duì)L1、L2的免疫，可以有效的保護(hù)宿主不受感染，因而預(yù)防性疫苗主要是以HPV晚期蛋白L1、L2為目的蛋白，此類疫苗同時(shí)對(duì)某些型HPV感染所致的疾病具有治療作用[8-13]。L1疫苗的表現(xiàn)形式又有L1全蛋白，融合蛋白，嵌合蛋白及短肽等不同形式。HPV L1具備在單獨(dú)表達(dá)體系中自行組裝，形成不含病毒DNA病毒樣顆粒(VLP)的能力，在一定程度上，能夠替代天然病毒，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)天然病毒的保護(hù)性抗體，防止病毒的感染或再感染[11]。
VLP疫苗大致可以分為3類。
最常見(jiàn)的是僅由L1單獨(dú)構(gòu)成的疫苗，其通過(guò)誘導(dǎo)中和性抗體來(lái)預(yù)防生殖道HPV感染。許多型別的VLP在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已取得良好的結(jié)果。目前，HPV16及其它一些型別的VLP疫苗的臨床試驗(yàn)已經(jīng)開(kāi)始，初步的全身性的免疫結(jié)果顯示，能誘導(dǎo)高滴度的中和性抗體，而沒(méi)有明顯的副作用[10，12]。但不足之處是以HPV16 L1 VLP作疫苗，生產(chǎn)成本較高，且其對(duì)其它型別的HPV無(wú)預(yù)防或治療作用。Zhang LF等用HPV6 L1 VLP免疫生殖器疣患者也得到了類似的結(jié)果，以HPV6 L1VLP免疫對(duì)高危型HPV無(wú)交叉反應(yīng)[14]。劉躍華等報(bào)道，其表達(dá)的HPV6b L1 VLP誘導(dǎo)的抗血清，除能與HPV6b發(fā)生反應(yīng)外，還能與HPV11發(fā)生反應(yīng)。但且其結(jié)果未有其他研究者的實(shí)驗(yàn)證實(shí)及后繼的相關(guān)報(bào)道，且其反應(yīng)僅限于兩個(gè)低危HPV型間，未能與高危型HPV反應(yīng)[15]。
第二類是由L1和L2共同構(gòu)成的疫苗，盡管其預(yù)防性效果好于L1單獨(dú)構(gòu)成的VLP，但其在制備和成本方面具有明顯的劣勢(shì)。
第三類是將其它乳頭瘤病毒蛋白的多肽整合入VLP，成為CVLP，L1或L2為融合蛋白。設(shè)計(jì)這類嵌合VLP目的想通過(guò)誘導(dǎo)對(duì)病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白，如E7的細(xì)胞免疫反應(yīng)，以增強(qiáng)HPV疫苗的治療作用。小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，這類疫苗在保持誘導(dǎo)高滴度中和抗體的能力的同時(shí)，還產(chǎn)生了抗腫瘤的CTL反應(yīng)[16-21]。Thompson HS等及Lacey CJ等用E.coli表達(dá)的HPV6L2/E7融合蛋白對(duì)一些由HPV6和11所致的、反復(fù)發(fā)作的生殖器疣進(jìn)行了治療，取得了一定的效果。但他們的研究具有的不足仍是對(duì)高危型HPV無(wú)交叉反應(yīng)[22，23]。
既往的許多研究均證實(shí)，相近型別的共同表位較之病毒外殼主要型特異性B-細(xì)胞決定簇的免疫原性低，且抗原性也有顯著的不同。Giroglou T等用ELISA和交叉中和實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù)種高危HPV16，18，31，33和45型病毒及VLP多克隆免疫血清進(jìn)行了檢測(cè)[8]。進(jìn)一步證實(shí)，盡管家族性L1基因序列變化的程度不同，每一受檢型別VLP所誘導(dǎo)的高滴度抗血清多克隆抗體完全是型特異性的。體外感染活性檢測(cè)，VLP抗血清的中和作用只能發(fā)生在同型的HPV病毒之間。僅HPV31和HPV45 VLP免疫血清顯示具有低水平的分別對(duì)HPV18和HPV33病毒的中和作用。表位阻塞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，主要型特異性外殼蛋白抗原位點(diǎn)與病毒的中和之間具有密切的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果支持乳頭瘤病毒基因型決定著病毒的獨(dú)特血清型的觀點(diǎn)[24-26]。
由于病毒的變異性，制作全價(jià)的通用疫苗，困難較多，以表位為基礎(chǔ)的多肽疫苗開(kāi)始受到人們的重視。為尋找HPV L1的共同表位，以期達(dá)到一種疫苗針對(duì)多型HPV的目的，許多研究者采用短肽篩選的辦法進(jìn)行確定。然而，至今未能取得理想的結(jié)果。
以HPV16為例，以短肽篩選法前后共有27個(gè)不同的氨基酸序列被鑒定為B-細(xì)胞表位，覆蓋L1氨基酸殘基序列總長(zhǎng)度的63.2％。它們可以誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠與HPV16病毒顆?；蚺cL1發(fā)生反應(yīng)的抗體，或能夠與HPV16病毒顆?；騆1誘導(dǎo)的抗體發(fā)生反應(yīng)[27，28]。但時(shí)至今日，真正在HPV16 L1氨基酸序列上得到公認(rèn)的B-細(xì)胞表位是位于aa233-253之間的一段序列。對(duì)于這樣的結(jié)果，研究者普遍的觀點(diǎn)是L1相對(duì)保守的氨基酸序列多為埋于蛋白內(nèi)的區(qū)段，而代表型特異性的變異較大的區(qū)段多為為于蛋白表面的區(qū)段；能夠發(fā)生型間交叉反應(yīng)的氨基酸序列多為位于蛋白內(nèi)部的線性表位，而代表型特異性的氨基酸序列多為位于蛋白表面的結(jié)構(gòu)性表位；L1(aa233-253)位于蛋白的表面，但其具有極為明顯的型特異性。
基于多肽的疫苗較之于其它種類的疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，沒(méi)有減毒活疫苗的危險(xiǎn)；其次，保護(hù)性的免疫反應(yīng)可以通過(guò)表位進(jìn)行選擇，或制成各種多價(jià)疫苗；第三，潛在性的有害表位，如促進(jìn)HIV感染的、與宿主蛋白同源的，可以被選擇性的剔除，從而大大降低副反應(yīng)；第四，肽苗具有安全性好、可大規(guī)?；蚬こ躺a(chǎn)和化學(xué)合成，易干純化等優(yōu)點(diǎn)。如van Driel WJ等以HPV16 E7短肽為疫苗，對(duì)經(jīng)一般治療無(wú)效的HPV16陽(yáng)性子宮頸癌患者進(jìn)行了I、II期臨床試驗(yàn)，顯示具有一定的效果，但其對(duì)HPV16感染無(wú)預(yù)防作用[29]。
現(xiàn)有的HPV疫苗的研究成果，最大的不足就是所設(shè)計(jì)的疫苗不能同時(shí)針對(duì)多種型別的HPV，尤其是不能同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)高危型和低危型HPV的免疫反應(yīng)，或不能同時(shí)針對(duì)多種型別的HPV感染產(chǎn)生預(yù)防或治療作用。迄今為止，由于HPV型特異性強(qiáng)，型間交叉反應(yīng)少，還沒(méi)有一種針對(duì)多型的HPV疫苗應(yīng)用于臨床。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)針對(duì)多型HPV的預(yù)防性和/或治療性的疫苗，以便有效控制與HPV相關(guān)疾病的傳播與發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種能同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)多種型別，尤其是同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)高危型和低危型均能產(chǎn)生免疫反應(yīng)的多肽和疫苗，以便用一種疫苗來(lái)預(yù)防多種型別HPV感染和/或治療部分型別HPV感染性疾病。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種多肽，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽；
(b)將SEQ ID NO1氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-3個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有引發(fā)針對(duì)至少3種HPV型別的免疫應(yīng)答的由(a)衍生的多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的短肽的氨基酸序列為SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、或9。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗體，所述的抗體特異性地與本發(fā)明上述的的多肽結(jié)合。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是單克隆抗體。
在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明所述多肽的用途，它被用于制備抗至少3種(較佳地至少4種)HPV型別的抗體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明所述多肽的用途，它被用于制備預(yù)防或治療至少3種(較佳地至少4種)HPV型別的藥物組合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是疫苗組合物。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有本發(fā)明所述的多肽(如0.01wt％-99.9wt％)以及藥學(xué)上可接受的載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有免疫有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及任選的藥學(xué)上可接受的佐劑。


圖1顯示了兔抗血清(RSs-P30)及鼠抗血清(Msa-P30)對(duì)重組HPV6b L1(6b-L1)、HPV16(Caski)及HPV18(Hela)的反應(yīng)無(wú)明顯差異。
圖2顯示了Western印跡結(jié)果。1，2道為重組HPV16 L1；3道為Caski培養(yǎng)細(xì)胞裂解液，4道為Hela培養(yǎng)細(xì)胞裂解液；5，6道為重組HPV6b L1。
圖3顯示了Caski培養(yǎng)細(xì)胞，Kawana HPV16 L1單克隆抗體HRP免疫組織化學(xué)染色?？梢?jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)染色深，胞核區(qū)無(wú)反應(yīng)，呈負(fù)染狀態(tài)。
圖4顯示了Caski培養(yǎng)細(xì)胞，兔抗短肽抗血清HRP免疫組織化學(xué)染色。可見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)染色深，呈現(xiàn)出與Kawana HPV16 L1單克隆抗體反應(yīng)一致的染色特性。
圖5顯示了Hela培養(yǎng)細(xì)胞，Kawana HPV16 L1單克隆抗體HRP免疫組織化學(xué)染色?？梢?jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)染色深，胞核區(qū)無(wú)反應(yīng)，呈負(fù)染狀態(tài)。
圖6顯示了Hela培養(yǎng)細(xì)胞，兔抗短肽抗血清HRP免疫組織化學(xué)染色?？梢?jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)染色深，呈現(xiàn)出與Kawana HPV16 L1單克隆抗體反應(yīng)一致的染色特性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)多年廣泛而深入的研究，對(duì)多種HPV病毒潛在抗原蛋白的序列分析，在一段可誘導(dǎo)針對(duì)多型HPV抗體的多肽基礎(chǔ)上，找到了兼具很強(qiáng)抗原性和廣譜性的氨基酸序列。通過(guò)多肽合成，制得該抗原遞呈細(xì)胞靶向性的HPV廣譜性多肽，并對(duì)多肽進(jìn)行的免疫研究表明該多肽可同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)多種型別HPV，尤其是同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)高危型HPV和低危型HPV均能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。因此可用于制備有效的抗多型別HPV的疫苗，實(shí)現(xiàn)用一種疫苗預(yù)防多種型別HPV感染和/或治療部分型別HPV所致感染性疾病。
如本文所用，“本發(fā)明多肽”、“本發(fā)明短肽”、“HPV多特異性多肽”、“抗多型別HPV的免疫原性短肽”等可互換使用，指序列如SEQ ID NO1所示的多肽或其保守性衍生多肽，該多肽可引發(fā)針對(duì)至少3種(較佳地至少4種)HPV型別的免疫應(yīng)答。優(yōu)選的本發(fā)明多肽是氨基酸序列如表1所示的多肽(SEQ IDNO1-9)。
在一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明多肽以HPV16 L1 448-477aa區(qū)段的蛋白序列為基礎(chǔ)，并且為了針對(duì)多種型別的HPV，在465位引入G→A突變，形成SEQ ID NO1所示的多肽。
在本發(fā)明中，“保守性衍生多肽”指與SEQ ID NO1的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸差異的多肽。較佳地，所示的差異是用性質(zhì)相似或相近的氨基酸進(jìn)行替換。在一優(yōu)選例中，這些保守性變異多肽最好根據(jù)表A進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表A


本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產(chǎn)。因此本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的核酸序列、含所述核酸序列的表達(dá)載體、以及含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
例如，SEQ ID NO1序列可作為基本結(jié)構(gòu)單元，借連接段肽鏈連接，形成具有多個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白(或長(zhǎng)肽)。
無(wú)論是單體還是多體形式的本發(fā)明多肽，都可用于制備預(yù)防性和/或治療性疫苗，用于各型HPV的感染預(yù)防和/或多種低危型HPV感染性疾病的治療。
此外，本發(fā)明多肽還與其它具有佐劑效應(yīng)的蛋白相聯(lián)接，形成融合蛋白。該融合蛋白也可用于制備預(yù)防性和/或治療性疫苗，用于各型HPV的感染預(yù)防和/或多種低危型HPV感染性疾病的治療。
此外，本發(fā)明多肽還可與化學(xué)合成佐劑或生物佐劑混合后使用，用于各型HPV的感染預(yù)防和/或多種低危型HPV感染性疾病的治療。
此外，本發(fā)明多肽還可與BSA等分子量的蛋白偶聯(lián)，從而形成多肽偶聯(lián)物。通常，所述的偶聯(lián)物由多肽、交聯(lián)劑、和BSA構(gòu)成，其中所述的交聯(lián)劑優(yōu)選戊二醛(當(dāng)與本發(fā)明多肽的N-端偶聯(lián)時(shí))、EDAC(當(dāng)與本發(fā)明多肽的C-端偶聯(lián)時(shí))。
本發(fā)明多肽或其偶聯(lián)物可用于免疫兔、鼠等動(dòng)物，從而獲得抗本發(fā)明多肽的抗體(“本發(fā)明抗體”)。本發(fā)明抗體包括特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于HPV病毒、基因產(chǎn)物或片段。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段(如Fab′或(Fab)2片段)、抗體重鏈、抗體輕鏈、嵌合抗體、人源化抗體等。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。對(duì)于單克隆抗體，可利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本發(fā)明的抗體可用檢測(cè)樣品中是否存在HPV病毒。
本發(fā)明的多肽和偶聯(lián)物還可用于制備治療性的藥物組合物或預(yù)防性的疫苗組合物。因此，另一方面，本發(fā)明還提供了一種組合物(包括藥物組合物如疫苗組合物)，它含有(a)安全有效量的本發(fā)明多肽、偶聯(lián)物或其組合物；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。本發(fā)明的組合物可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。此外，載體和配制方法的例子可以參見(jiàn)《Remington藥物科學(xué)》(Remington’s Phamaceutical Science)。
以本發(fā)明多肽計(jì)，其用量例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與佐劑或其他治療劑一起使用。
在優(yōu)選例中，本發(fā)明的組合物是疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性的(即預(yù)防感染)或治療性的(即在感染后治療疾病)。
本發(fā)明的疫苗組合物包含本發(fā)明的針對(duì)多型別HPV的免疫性短肽(如SEQID NO1-9，較佳地SEQ ID NO1)和“藥學(xué)上可接受的載體”。這些載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)以及無(wú)活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(“佐劑”)作用。另外，抗原或免疫原可以和細(xì)菌類毒素(如白喉、破傷風(fēng)、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯(lián)。
增強(qiáng)組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方(有或沒(méi)有其它特異性的免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見(jiàn)下文)或細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，例如，(a)MF59(PCT出版物No.WO 90/14837)，其含有5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％Span 85(任選地含有不同量的MTP-PE(見(jiàn)下文)，雖然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亞微米級(jí)顆粒；(b)SAF，其含有10％鯊烯、0.4％吐溫80、5％普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L(fēng)121以及thr-MDP(見(jiàn)下文)，微量流化成亞微米級(jí)乳劑或渦流振蕩產(chǎn)生粒徑較大的乳劑，和(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％鯊烯、0.2％吐溫80以及取自單磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂素佐劑，例如可采用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或從其產(chǎn)生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激性復(fù)合物)；(4)Freund完全佐劑(CFA)和Freund不完全佐劑(IFA)；(5)細(xì)胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如γ干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素(如霍亂毒素CT，百日咳毒素PT或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素LT)的脫毒變異體，尤其是LT-K63、LT-R72，CT-S109、PT-K9/G129；參見(jiàn)例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作為免疫刺激劑來(lái)增強(qiáng)組合物效果的其它物質(zhì)。
包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗組合物(如可包括抗原，藥學(xué)上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這類運(yùn)載體中。
本發(fā)明的疫苗組合物包含免疫學(xué)有效量的本發(fā)明免疫原性多肽以及上述其它所需的組分?！懊庖邔W(xué)有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個(gè)體的量對(duì)治療或預(yù)防是有效的。該用量根據(jù)所治療個(gè)體的健康狀況和生理狀況、所治療個(gè)體的類別(如非人靈長(zhǎng)類等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對(duì)醫(yī)療狀況的評(píng)估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計(jì)該用量將在相對(duì)較寬的范圍內(nèi)，可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中，在上述藥學(xué)上可接受的載體下增強(qiáng)佐劑效果。
常規(guī)方法是從腸胃外(皮下或肌內(nèi))途徑通過(guò)注射給予免疫原性組合物。適合其它給藥方式的其它配方包括口服、或透皮給藥。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)本發(fā)明多肽可同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)多種型別HPV，尤其是同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)高危型HPV和低危型HPV均能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。所誘導(dǎo)的高滴度的抗短肽抗血清能分別與重組HPV6b L1，重組HPV16 L1，HPV16及HPV18病毒發(fā)生反應(yīng)。
(b)本發(fā)明多肽不含潛在性的有害表位，從而大大降低副反應(yīng)，安全性好。
(c)本發(fā)明的多肽易于大規(guī)模基因工程生產(chǎn)和化學(xué)合成，并且純化簡(jiǎn)便。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1特異性肽段抗血清的制備(a)HPV L1短肽的合成在本實(shí)施例中，以HPV16 L1 448-477aa區(qū)段的蛋白序列為基礎(chǔ)，為了針對(duì)多種型別的HPV，在465位引入G→A突變。
設(shè)計(jì)后的HPV L1短肽長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸，序列如下N端-EVNLKEKFSADLDQFPLARKFLLQAGLKAK-C端(SEQ ID NO1)。
委托北京賽百盛基因技術(shù)有限公司在美國(guó)Genemed Synthesis Inc.公司用常規(guī)方法合成該HPV L1短肽。
(b)抗血清的制備將如上合成短肽以PBS溶解后，1∶1加Furend.s完全佐劑，乳化后分別以25ug及10ug的劑量免疫日本長(zhǎng)耳大白兔及Balb/c小鼠，共3次。于最后一次免疫的第14天，處死動(dòng)物，取抗短肽的兔抗血清及鼠抗血清。
實(shí)施例2短肽免疫抗血清免疫特異性的ELISA檢測(cè)HPV16病毒顆粒、重組HPV16 L1 VLP、HPV6b L1 VLP、HPV16病毒顆粒小鼠抗血清、重組HPV16 L1 VLP及HPV6b L1 VLP的兔和小鼠抗血清均獲自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；HPV16 L1單克隆抗體獲自日本國(guó)立傳染病研究所。HRP標(biāo)記及熒光標(biāo)記二抗購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司(Sigma產(chǎn)品)。Caski細(xì)胞及Hela細(xì)胞均購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。
分別將HPV16病毒、重組HPV16 L1 VLP、HPV6b L1 VLP、含HPV16病毒的Caski培養(yǎng)細(xì)胞及含HPV18的Hela培養(yǎng)細(xì)胞裂解液或它們的培養(yǎng)液包被塑料板，以免或小鼠的抗短肽抗血清與之進(jìn)行反應(yīng)。
結(jié)果如圖1所示。小鼠及兔的短肽免疫抗血清，能使HPV16病毒、重組HPV16L1 VLP及HPV6b L1 VLP包被的塑料板呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；能使含HPV16病毒的Caski培養(yǎng)細(xì)胞及含HPV18的Hela培養(yǎng)細(xì)胞裂解液或它們的培養(yǎng)液所包被的塑料板呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。
實(shí)施例3短肽免疫抗血清免疫特異性的Western印跡檢測(cè)分別將Caski細(xì)胞、Hela細(xì)胞和HPV6b及16 L1重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72小時(shí)的昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行裂解，裂解液作SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后以兔抗短肽抗血清作一抗。
結(jié)果如圖2所示。在蛋白分子量約為56K的區(qū)間，均可見(jiàn)有一條陽(yáng)性反應(yīng)帶。
實(shí)施例4短肽免疫抗血清免疫特異性的培養(yǎng)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)檢測(cè)將Caski細(xì)胞、Hela細(xì)胞以24孔板培養(yǎng)于蓋玻片之上，分別以Kawana HPV16單克隆抗體、HPV16病毒顆粒小鼠抗血清或重組HPV16 L1 VLP小鼠抗血清作為陽(yáng)性一抗對(duì)照，檢測(cè)兔抗短肽抗血清對(duì)Caski細(xì)胞內(nèi)HPV16及Hela細(xì)胞內(nèi)HPV18的反應(yīng)性。
結(jié)果如圖3-6所示?？苟屉目寡蹇墒古囵B(yǎng)Caski細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，可見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)僅出現(xiàn)于胞漿之內(nèi)，胞質(zhì)被染成棕黃色，胞核透亮，呈負(fù)染狀態(tài)。反應(yīng)特征與Kawana HPV16單克隆抗體、HPV16病毒顆粒小鼠抗血清或重組HPV16 L1 VLP小鼠抗血清對(duì)此細(xì)胞的反應(yīng)完全一致。Hela細(xì)胞的反應(yīng)與Caski細(xì)胞相同。
實(shí)施例5類似于HPV L1短肽的其他免疫原性多肽按照實(shí)施例1的類似方式，合成表1所示的類似于HPV L1短肽的其他免疫原性多肽表1HPV多特異性短肽

按照實(shí)施例1相同的方式制備小鼠的抗血清，按實(shí)施例2相同方式測(cè)試抗血清與HPV6b L1、HPV16 L1、HPV16、HPV18的免疫特異性，結(jié)果如下表2所示
表2免疫特異性測(cè)試結(jié)果

實(shí)施例6疫苗組合物按以下配方，通過(guò)常規(guī)的混合法制備一疫苗組合物10微克短肽(SEQ ID NO1)+1毫克磷酸鋁(AlPO4)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
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序列表<110>三峽大學(xué)<120>用于多型人乳頭瘤病毒感染防治的多肽和疫苗<130>048875<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>抗多型別HPV的免疫原性短肽<400>1Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro1 5 10 15Leu Ala Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys20 25 30<210>2<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>抗多型別HPV的免疫原性短肽<400>2Glu Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro1 5 10 15Leu Ala Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys20 25 30<210>3<211>30<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>抗多型別HPV的免疫原性短肽<400>3Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro1 5 10 15Leu Ala Lys Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys20 25 30<210>4<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>抗多型別HPV的免疫原性短肽<400>4Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro1 5 10 15Leu Ala Arg Arg Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys20 25 30<210>5<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>抗多型別HPV的免疫原性短肽<400>5Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Tyr Pro1 5 10 15Leu Ala Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys20 25 30<210>6<211>32<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>抗多型別HPV的免疫原性短肽<400>6Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln1 5 10 15Phe Pro Leu Ala Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys20 25 30<210>7<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>抗多型別HPV的免疫原性短肽<400>7Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe1 5 10 15Pro Leu Ala Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys20 25 30<210>8<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>抗多型別HPV的免疫原性短肽<400>8Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro1 5 10 15Leu Ala Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Arg Ala Lys20 25 30<210>9<211>30
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權(quán)利要求
1.一種多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽(b)將SEQ ID NO1氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-3個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有引發(fā)針對(duì)至少3種HPV型別的免疫應(yīng)答的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的短肽，其特征在于，其氨基酸序列為SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、或9。
3.一種抗體，其特征在于，所述的抗體特異性地與權(quán)利要求1所述的多肽結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的抗體，其特征在于，所述的抗體是單克隆抗體。
5.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備抗至少3種HPV型別的抗體。
6.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療至少3種HPV型別的藥物組合物。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物是疫苗組合物。
8.一種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
9.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，它含有免疫有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的佐劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)多種型別，尤其是同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)高危型和低危型均能產(chǎn)生免疫反應(yīng)的多肽，以及含有該多肽的疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗組合物可預(yù)防多種型別HPV感染和/或治療部分型別HPV感染性疾病。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1796403SQ20041009337
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日
發(fā)明者肖長(zhǎng)義, 萬(wàn)濤, 黃利鳴, 袁太寧 申請(qǐng)人:三峽大學(xué)