專利名稱：干擾素含片在制備治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍藥物中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有藥用抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能的作用的干擾素，尤其涉及重組人干擾素α2b含片在制備治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
干擾素是一類有抑制病毒復(fù)制，抗細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，目前干擾素主要包括α、β、γ三大類型，最近又發(fā)現(xiàn)了ω和Γ兩類干擾素。α干擾素可分為許多亞型，分別命名為α1、α2、α3……，其中α2又有α2a和α2b兩種亞型。目前，α、β、γ三型基因工程干擾素均已研制成功，產(chǎn)品已投放市場治療二十余種疾病。
現(xiàn)有的α干擾素研究均采用天然干擾素，如中國專利申請98105384.x公開了一種復(fù)方干擾素口含片及其制備方法，但采用的是天然α干擾素與白細(xì)胞介素2的混合物。中國專利申請95111433.6公開了一種人白細(xì)胞干擾素口含片及其制法，但采用的人白細(xì)胞干擾素，系由健康人白細(xì)胞通過仙臺病毒誘導(dǎo)、提純，并經(jīng)特殊滅活病毒處理制成。中國專利申請98105383.1公開了一種β干擾素口含片及其制備方法，但采用的是β干擾素。這些天然α干擾素口含片具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能的作用，如抗流感病毒、抗冠狀病毒(如SARS冠狀病毒)、乙肝病毒、丙肝病毒、使用的劑量為小劑量，在10000IU以下，以100IU～500IU較多。
復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(recurrent aphthous ulcer，RAU，或recurrent oralulcer，ROU)是最常見的口腔粘膜疾病，發(fā)病率高，一般人群的患病率可達(dá)25％，且極易復(fù)發(fā)，病因復(fù)雜，被認(rèn)為與病毒感染、內(nèi)分泌失調(diào)、精神狀態(tài)、遺傳因素、消化系統(tǒng)疾病及功能紊亂等有關(guān)(劉瑞剛、王鵬，“復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病及分型”，《山東醫(yī)藥》，57～58，2001年第17期。孫黎飛、劉海軍、于廣遠(yuǎn)、田野草、曹雪濤，“復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者的細(xì)胞免疫功能研究”，《中國免疫學(xué)雜志》，332～333，2001年第6期)。也有人認(rèn)為與幽門螺旋桿菌有關(guān)(陳東、黃英，“復(fù)發(fā)性口腔潰瘍和幽門螺旋桿菌的相關(guān)性分析”，《實用醫(yī)學(xué)雜志》，615～616，2003年第6期)。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的分類目前尚未統(tǒng)一，目前常見的分類是分為三種類型，即輕型口腔潰瘍、重型口腔潰瘍、皰疹樣潰瘍。其臨床特征為(劉瑞剛、王鵬，“復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病及分型”，《山東醫(yī)藥》，57～58，2001年第17期)(1)輕型口腔潰瘍約占ROU的80％，潰瘍不大，直徑2～4mm，呈圓形或橢圓形，數(shù)目每次1～5個，好發(fā)于非角化區(qū)如唇、頰等粘膜，角化程度高的齦、硬腭部較少發(fā)生，潰瘍中央凹陷，基底不硬，周邊有約1mm的充血紅潤帶，表面覆有淺黃色假膜，灼痛感明顯，發(fā)作期持續(xù)1～2周，具有不治自愈的自限性，潰瘍愈合不留瘢痕，間歇期長短不一，因人而宜。
(2)重型口腔潰瘍又稱復(fù)發(fā)性壞死性粘膜腺周圍炎，其發(fā)病情況與輕型口腔潰瘍相似，特點是潰瘍較大而深，直徑達(dá)10～30mm，深及粘膜下層至肌層，周邊紅腫隆起，捫之基底較硬，潰瘍好發(fā)于口腔后部，頰、咽旁、硬腭或軟腭交界處，潰瘍持續(xù)時間月余，數(shù)月甚至更長，愈合可留瘢痕，舌尖或懸壅垂?jié)冇虾罂赡苡薪M織缺損。
(3)皰疹樣潰瘍臨床特征是潰瘍小而多，直徑小于2mm，散在分布于粘膜任何部位，可達(dá)數(shù)十個，似有“滿天星”之感，以舌腹、口底多見，潰瘍疼痛較重，可伴頭痛，低熱，全身不適，愈合不留瘢痕。
對于復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病機(jī)理，迄今為止仍不清楚。目前對該病的治療也無特效藥物，其局部治療常選用抗菌藥物、抗病毒藥物、止痛藥、腎上腺皮質(zhì)激素類藥物等。由于病毒感染及細(xì)菌感染會消耗體內(nèi)大量維生素C，同時可降低體內(nèi)免役系統(tǒng)的功能，造成機(jī)體抗病能力下降，因而使用抗病毒藥物和免役調(diào)節(jié)劑、維生素C等也是臨床上的一種選擇。近幾年口腔潰瘍常選用的藥物有(1)消炎藥物為抗細(xì)菌藥物如甲硝唑、替硝唑、慶大霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、新霉素、金霉素、潔霉素等，抗霉菌藥物如克霉素、制霉菌素、酮康唑等，抗病毒藥物如阿昔洛韋等。(2)皮質(zhì)激素類藥物強(qiáng)的松、地塞米松、氫化可的松等，該類藥物可能是大部分藥膜的主要有效成分。(3)消毒防腐藥洗必泰或醋酸洗必泰。(4)免疫抑制劑和免疫調(diào)節(jié)劑如左旋咪唑，但該類藥物的應(yīng)用和研究還較少。(5)局部止痛藥如達(dá)克羅寧、丁卡因、冰片、可卡因等。(6)促進(jìn)潰瘍愈合的藥物具有促進(jìn)粘膜上皮細(xì)胞的再生，如維甲酸、魚肝油、維生素E、核黃素、維生素C等(李志民、公柏娟，“口腔潰瘍治療方法的研究進(jìn)展”，《中國社區(qū)醫(yī)師》，19，2004年第2期)。
單純皰疹病毒(HSV)對人體的感染是常見的。它是一種脫氧核糖核酸病毒。形成小痘皰的病毒，稱為I型單純皰疹病毒；形成較大的痘皰的病毒，稱為II型單純皰疹病毒。這種病毒，可以在唾液或皮膚上生存。
重組人干擾素α2b目前有注射劑、滴眼劑、栓劑、凝膠劑、軟膏劑等。常用的注射劑具有增加病人痛苦、副作用大、價格昂貴的不足。尚無重組人干擾素含片在制備治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍藥物中的新用途的研究報道。因此，研究和開發(fā)含片劑型，充分發(fā)揮該劑型用藥方便、病人耐受性好、價格低廉等優(yōu)點，在治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的新用途成為人們期盼。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種安全有效劑量、療效好、副作用小、使用方便的重組人干擾素α2b含片制備治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍藥物中的新用途。
本發(fā)明的目的之一在于證明I型單純性皰疹病毒是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的原因之一。
本發(fā)明的另一個目的提供了重組干擾素α-2b含片在治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍中的新用途。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用重組人干擾素α2b含片在治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍藥物的藥理試驗及結(jié)果來說明其在制備治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍藥物中的新用途。
重組人干擾素α2b含片的制備采用中國專利申請(申請?zhí)?00410036739.4，名稱“重組人干擾素α2b含片及其制備方法”)公開的方法。
為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明先制備了一種重組人干擾素α2b含片，其中包含作為有效成份的重組人干擾素α2b，以及藥學(xué)上認(rèn)可的輔料，包括乳糖、糖粉、淀粉、羥丙甲纖維素、微粉硅膠等。
上述小劑量含片的重組人干擾素α2b含量為每片80IU～2000IU，優(yōu)選400IU～750IU，上述大劑量含片的重組人干擾素α2b含量為每片10000IU～250000IU，優(yōu)選40000IU～75000IU。上述輔料的重量配比是乳糖40％～75％，糖粉10％～40％，羥丙甲纖維素2％～15％，淀粉2％～12％，微粉硅膠2％～10％。
本發(fā)明的制備工藝是，先將乳糖、糖粉、淀粉、羥基甲纖維素、微粉硅膠充分混合，過篩、將淀粉制成淀粉漿加入上述混合輔料中，干擾素加入淀粉漿中一起加入或配成溶液單獨加入，然后制成濕顆粒，干燥，壓片。
本發(fā)明實施例1是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍與I型單純皰疹病毒的相關(guān)性的試驗。從實驗結(jié)果可以看出，I型單純性皰疹病毒能引起家兔的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍。
本發(fā)明實施例2是重組人干擾素α2b含片體外抗單純皰疹病毒體外藥效試驗。從試驗結(jié)果可見，將重組人干擾素α2b含片在400IU/ml以上濃度對單純皰疹病毒HSV-I有較強(qiáng)的抑制作用。
本發(fā)明實施例3是重組人干擾素α2b含片動物急性毒性試驗。試驗證明，給藥量1500000IU/只，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，若大鼠體重按0.27kg計算，即5600000IU/kg相當(dāng)于臨床劑量的335329倍，所以臨床用藥非常安全。
本發(fā)明實施例4是重組人干擾素α2b含片小鼠體內(nèi)藥效學(xué)試驗。試驗證明，干擾素α2b含片500IU/只，干擾素α2b含片5000IU/只，干擾素α2b含片50000IU/只，對由HSV-I引起的口腔潰瘍均有治療作用，500IU/片、5000IU/片、50000IU/片療效相似。
本發(fā)明實施例5是皰疹病毒引起的口腔潰瘍20例系統(tǒng)臨床觀察分析。觀察結(jié)果表明，對照組平均痊愈時間為7.7天，干擾素含片組平均為3.6天，兩組比較有顯著差異(p＜0.01)。說明干擾素含片對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍有明顯的治療作用。
下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。
具體實施例方式
實施例1 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍與I型單純皰疹病毒的相關(guān)性1、材料實驗家兔，體重1.5～2kg，共20只，分成二組，每組10只，其中一組用于I型單純皰疹病毒感染實驗，對照組10只。
2、I型單純皰疹病毒采用美國American type culturecollection(ATCC)保藏公開的皰疹病毒(ATCC NoVR-1383)。I型單純皰疹病毒(HSV-I)配置成100TCID(即病毒半數(shù)感染劑量的100倍)。
3、生理鹽水。
實驗方法取配置好的I型皰疹病毒溶液，涂抹于實驗組家兔的口腔粘膜，涂抹時間持續(xù)2～3分鐘，對照組家兔以生理鹽水進(jìn)行同樣操作。
實驗結(jié)果試驗組家兔分別于涂抹后第3天出現(xiàn)口腔潰瘍，潰瘍呈圓形或橢圓型，邊緣較整齊，表面有一層黃色假膜覆蓋，直徑1～5mm。繼續(xù)觀察2周，潰瘍在1～2周內(nèi)可自行愈合，后又復(fù)發(fā)。半年內(nèi)家兔潰瘍次數(shù)見下表1表1 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍與I型單純皰疹病毒的相關(guān)性試驗

HSV-I組和對照組比較，p＜0.01。
從實驗結(jié)果可以看出，I型單純性皰疹病毒能引起家兔的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍。
實施例2 重組人干擾素α2b含片體外抗單純皰疹病毒體外藥效試驗一、材料1.病毒采用美國American type culture collection(ATCC)保藏公開的皰疹病毒(ATCC NoVR-1383)。-60℃凍存，取出溶化后稀釋，TCID50均為4.0。
2.細(xì)胞Hela細(xì)胞，采用美國American type culture collection(ATCC)保藏公開的Hela細(xì)胞(ATCC NoCCL-2)3.細(xì)胞培養(yǎng)板96孔coster細(xì)胞培養(yǎng)板。
4.細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640培養(yǎng)液，美國GIBCO公司市售產(chǎn)品，產(chǎn)品編號GNM31800.25，250ml裝。
5.重組人干擾素α2b含片深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司提供，生產(chǎn)批號20020401，試驗時每片以生理鹽水溶解，制成不同濃度的重組人干擾素α2b溶液。
二、方法在96孔板中，將生長成單層的Hela細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液傾出后，第一行加入IFN標(biāo)準(zhǔn)，第二行作為陰性對照加入細(xì)胞培養(yǎng)液，第三行以后依次加入待測樣品，每孔加入100μl，將分別制作的重組人干擾素α2b含片(參見實施例6、7、8、9、10、11)，即25萬IU/片、5萬IU/片、1萬IU/片、2000IU/片、400IU/片、80IU/片六個規(guī)格的產(chǎn)品，各取一片以1ml生理鹽水溶解分別制成25萬IU/ml、5萬IU/ml、1萬IU/ml、2000IU/ml、400IU/ml、80IU/ml溶液，每個濃度3個復(fù)孔。于37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時，將培養(yǎng)基上清吸出，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋HSV-I，每孔加入100μl的病毒HSV，37℃，5％CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)后每天顯微鏡下觀察，在第一行完成的單層活細(xì)胞應(yīng)被觀察到，在第二行應(yīng)看到單層細(xì)胞被完全破壞以第二行病毒對照行病毒病變?yōu)?00％，分為-(0)+(病變≤25％)++(病變≤50％)+++(病變≤75％)++++(病變≥75％)，觀察5天，記錄結(jié)果，試驗重復(fù)3次。
三、試驗結(jié)果表2 將重組人干擾素α2b含片抗HSV-I病毒試驗

四、結(jié)論從上述試驗結(jié)果可見，將重組人干擾素α2b含片在400IU/ml以上濃度對單純皰疹病毒HSV-I有較強(qiáng)的抑制作用。
實施例3 重組人干擾素α2b含片急性毒性試驗一、試驗?zāi)康挠^察重組人干擾素α2b含片一次性于口腔粘膜給藥后，由于粘膜吸收所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況。
二、試驗材料1、藥品重組人干擾素α2b含片，1500000萬IU/片，生產(chǎn)批號20020402，由深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司提供。
2、動物Wistar大鼠20只雌雄各半，體重250-300g，由吉林省藥品檢驗所動物室提供，合格證編號10--1009。
三、試驗方法1、劑量選擇重組人干擾素α2b含片臨床每日擬用劑量為1000IU/人，在預(yù)試的基礎(chǔ)上，選高于臨床劑量1500倍量。
2、分組、給藥及觀察上述大鼠均分為賦形劑組和重組人干擾素α2b含片組。用紗布條將藥片包好縫緊，吊系在口腔中，1片/只，1次給藥，即刻觀察動物狀態(tài)、毛發(fā)、食欲、四肢活動、精神狀態(tài)、死亡情況及體重變化，連續(xù)14日。
四、試驗結(jié)果1、給藥7日之內(nèi)，賦形劑組及重組人干擾素α2b含片組動物毛發(fā)、食欲、四肢活動、精神狀態(tài)均無異常，無一死亡，體重亦無明顯差別，見下表。表3 重組人干擾素α2b含片及賦形劑組急毒試驗體重變化(x±s，n＝10)

2、重組人干擾素α2b含片臨床擬用量為每日1000IU/人，若人體重按60kg計算，即2500IU/kg；而急毒試驗證明，給藥量1500000IU/只，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，若大鼠體重按0.27kg計算，即5600000IU/kg相當(dāng)于臨床劑量的335329倍，所以臨床用藥非常安全。
實施例4 重組人干擾素α2b含片小鼠體內(nèi)藥效學(xué)試驗一、試驗材料1、病毒I型單純皰疹病毒，采用美國American type culturecollection(ATCC)保藏公開的皰疹病毒(ATCC NoVR-1383)。-60℃凍存，取出溶化后稀釋，TCID50均為4.0。
2、藥品重組人干擾素α2b含片，500IU/片，生產(chǎn)批號20020501，由深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司提供。
3、動物Wistar大鼠20只雌雄各半，體重250-300g，由吉林省藥品檢驗所動物室提供，合格證編號10--1009。
二、試驗方法動物分組Wistar大鼠60只，分為6個組，每組10只，分別為均干擾素α2b含片500IU/只組，干擾素α2b含片5000IU/只組，干擾素α2b含片50000IU/只組，陽性藥對照組(病毒唑0.04mg/只)，模型組(空白基質(zhì)片)，正常動物對照組。
病理模型建立除正常動物組外，其余五組動物均在口腔粘膜處涂上HSV-1病毒液，2日后動物傷口處均出現(xiàn)口腔潰瘍。
給藥及觀察用紗布條將藥片或基質(zhì)片或?qū)φ账幇每p緊，吊系在口腔中，1片/次，連續(xù)給藥7天，每天觀察潰瘍進(jìn)展情況。統(tǒng)計動物痊愈數(shù)、進(jìn)步數(shù)(潰瘍好轉(zhuǎn))、無效數(shù)(潰瘍無好轉(zhuǎn)或惡化)。表4結(jié)果表4 重組人干擾素α2b含片小鼠體內(nèi)藥效學(xué)試驗組別 動物數(shù)痊愈數(shù) 進(jìn)步數(shù) 無效數(shù)含片500IU/只組* 10 8 2 0含片5000IU/只組* 10 8 2 0含片50000IU/只組* 10 9 1 0病毒唑組* 10 7 2 1基質(zhì)片組 10 0 3 8*與模型組比較，p＜0.01結(jié)論干擾素α2b含片500IU/只，干擾素α2b含片5000IU/只，干擾素α2b含片50000IU/只，對由HSV-I引起的口腔潰瘍均有治療作用，500IU/片、5000IU/片、50000IU/片療效相似。
實施例5 皰疹病毒引起的口腔潰瘍20例系統(tǒng)臨床觀察分析20例口腔潰瘍患者，隨機(jī)分成兩組，一組服用干擾素α2b含片，500IU/片，生產(chǎn)批號20020501，每天2次，另一組服用空白對照片，每天2次，連續(xù)服用二周，觀察潰瘍發(fā)展情況。結(jié)果如下表5
表5皰疹病毒引起的口腔潰瘍20例系統(tǒng)臨床觀察分析病例號 性別年齡組別 癥狀 潰瘍部大小(mm) 痊愈時間位 (天)11 女 42含片組 反復(fù)口 口底及5×3×4 4腔潰瘍 頰側(cè)13 男 32含片組 反復(fù)口 全口 6×4×4 5腔潰瘍2 女 22含片組 反復(fù)口 舌緣 3×3×5 3腔潰瘍5 女 45含片組 反復(fù)口 頰側(cè) 5×5×5 4腔潰瘍17 男 36含片組 反復(fù)口 下唇 4×4×4 4腔潰瘍4 男 41含片組 反復(fù)口 下唇 4×3×4 3腔潰瘍16 女 26含片組 反復(fù)口 口底 5×5×2 4腔潰瘍8 女 28含片組 反復(fù)口 頰側(cè) 3×3×2 3腔潰瘍9 男 51含片組 反復(fù)口 舌緣 2×3×2 3腔潰瘍12 女 29含片組 反復(fù)口 下唇 4×3×4 3腔潰瘍14 女 36對照組 反復(fù)口 頰側(cè) 4×3×2 8腔潰瘍10 男 24對照組 反復(fù)口 口底 3×3×2 6
腔潰瘍1 女 38 對照組 反復(fù)口口底3×2×27腔潰瘍7 男 47 對照組 反復(fù)口頰側(cè)3×3×47腔潰瘍19 女 40 對照組 反復(fù)口下唇4×3×58腔潰瘍18 女 56 對照組 反復(fù)口全口5×5×49腔潰瘍6 男 51 對照組 反復(fù)口頰側(cè)5×3×48腔潰瘍20 男 28 對照組 反復(fù)口口底5×4×49腔潰瘍15 女 34 對照組 反復(fù)口下唇3×5×58腔潰瘍3 女 46 對照組 反復(fù)口下唇2×3×27腔潰瘍對照組平均痊愈時間為7.7天，干擾素含片組平均為3.6天，兩組比較有顯著差異(p＜0.01〉。說明干擾素含片對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍有明顯的治療作用。
實施例6 重組人干擾素α2b含片(0.25g/片、重量百分比)重組人干擾素α2b 25萬IU乳糖 65％糖粉 25％羥丙甲纖維素 6％淀粉 4％
實施例7 重組人干擾素α2b含片(0.25g/片、重量百分比)重組人干擾素α2b5萬IU乳糖60％糖粉30％羥丙甲纖維素4％微粉硅膠2％淀粉4％實施例8 重組人干擾素α2b含片(0.25g/片、重量百分比)重組人干擾素α2b10000IU乳糖65％糖粉20％羥丙甲纖維素10％淀粉5％實施例9 重組人干擾素α2b含片(0.25g/片、重量百分比)重組人干擾素α2b2000IU乳糖65％糖粉20％羥丙甲纖維素6％微粉硅膠5％淀粉4％實施例10 重組人干擾素α2b含片(0.25g/片、重量百分比)重組人干擾素α2b 400IU乳糖 65％糖粉 20％羥丙甲纖維素 10％淀粉 5％
實施例11 重組人干擾素α2b含片(0.25g/片、重量百分比)重組人干擾素α2b 80IU乳糖 65％糖粉 20％羥丙甲纖維素 6％微粉硅膠 5％淀粉 4％。
權(quán)利要求
1.重組人干擾素α2b含片在制備治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍藥物中的新用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新用途，其特征是其中所述的含片中重組人干擾素α2b含量為每片400IU～250000IU。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有藥用抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能的作用的干擾素，尤其涉及重組人干擾素α2b含片在制備治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍藥物中的新用途。其中藥用重組人干擾素α2b含量在400－250000IU/片，賦形劑包括乳糖、糖粉、羥丙甲纖維素、淀粉、微粉硅膠等，該含片具有更有效的治療和預(yù)防復(fù)發(fā)性口腔潰瘍等疾病的作用。
文檔編號A61P1/00GK1660413SQ20041007778
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者蔣為民, 柴向東, 王妍, 潘韻, 張水華 申請人:深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司