專利名稱：成骨生長五肽藥物組合物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制劑，具體涉及一種含成骨生長五肽(OGP10-14)的藥物組合物及制備方法。
背景技術(shù)：
如何促進(jìn)骨折愈合、縮短骨折愈合時間、有效治療骨折不愈合和骨缺損，這是多年來人們苦苦探索的課題。至于骨質(zhì)疏松癥，它是老年人常見病之一，全球約有10％的人患有此病，其發(fā)病機(jī)理是由于骨吸收增加或骨形成減少導(dǎo)致骨量低下、骨脆性增加，進(jìn)而發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折。有關(guān)促進(jìn)骨折愈合、治療骨質(zhì)疏松的藥物的研制和開發(fā)已成為醫(yī)藥界的熱門課題之一。
長期以來，人們發(fā)現(xiàn)骨髓損傷后在其修復(fù)期往往伴隨著骨骼的成骨反應(yīng)，并認(rèn)為此反應(yīng)是由骨髓組織釋放某種因子入血所介導(dǎo)。1992年，以色列希伯來大學(xué)的Bab等人率先報道從修復(fù)期的骨髓組織純化出一個由14個氨基酸組成的因子(H-Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH)，并將其命名為成骨生長肽(osteogenic growth peptide，OGP)，天然的OGP與人工合成的OGP均可在體外刺激成骨細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性的表達(dá)，當(dāng)注入大鼠體內(nèi)時，可明顯增加骨量和促進(jìn)骨基質(zhì)礦化。此外，OGP可促進(jìn)血細(xì)胞發(fā)生及移植后骨髓的生長(EMBO J，1992，111867-1873；Biochemistry.1997，36(48)14883-8；J Cell Biochem.1997，65(3)359-67；J Clin Endocrinol Metab，1995，802330-2335)。正常生理狀態(tài)下，血液中有一定水平的OGP存在(主要以O(shè)GP-OGP結(jié)合蛋白——α2巨球蛋白復(fù)合物的形式)；骨髓損傷后修復(fù)期，血中OGP水平明顯提高并伴有全身性成骨反應(yīng)。
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，OGP的氨基酸序列與組蛋白H4的C-末端序列一致(89-102)，它是組蛋白H4基因在AUG85開始翻譯的產(chǎn)物。在血液中，OGP水解產(chǎn)生的五肽——OGP10-14(H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH)是具有OGP的全部生物活性的最小片段，它激活細(xì)胞內(nèi)G1蛋白-MAP激酶信號途經(jīng)發(fā)揮其生物學(xué)作用。(J Biol Chem.1999，274(20)14474-81；J Cell Biochem.2001，81(4)594-603.)。
基于上述的研究成果，成骨生長五肽(OGP10-14)應(yīng)用于臨床，正引起藥學(xué)界的極大關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種含成骨生長五肽(OGP10-14)的藥物組合物及其藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種含成骨生長五肽(OGP10-14)的藥物組合物，是由OGP10-14(H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH)作為活性成份與輔劑甘露醇和低分子右旋糖酐制成的，其中OGP10-14含量為0.01～99.99％、輔劑含量為99.99％～0.01％，并按任意比例配制而成。
本發(fā)明藥物組合物的制備方法是取OGP10-14放入安培瓶內(nèi)并將OGP10-14溶解于超純水中，然后，加入甘露醇和低分子右旋糖酐，經(jīng)冷凍干燥得凍干品針劑。
上述OGP10-14可以通過常規(guī)的多肽合成技術(shù)，即固相多肽合成法制備本發(fā)明中的OGP10-14的藥物組合物中的主要成分OGP10-14。該方法按照已設(shè)計好的和給定的氨基酸序列，利用適當(dāng)活化劑和縮合劑將氨基已保護(hù)的肽鏈碳末端氨基酸殘基連接到固相載體上。其中所述的固相載體為二乙烯苯交聯(lián)的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺樹脂、可控孔度玻璃、TentaGel樹脂、磁性樹脂珠等。上述肽制備可選的樹脂有wang樹脂、HMPA-PEGA樹脂、2-氯三苯甲基氯樹脂、Merrifield樹脂、Oxime樹脂等。
當(dāng)使用9芴甲氧羰基(Fmoc)系統(tǒng)進(jìn)行固相合成時，可選用下列被保護(hù)的氨基酸殘基Fmoc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Tyr(But)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH。在Fmoc合成系統(tǒng)中，首先將C端第一個氨基酸(C端Fmoc-Gly-OH)裝在含羥基樹脂的反應(yīng)器中，按照給定的氨基酸序列由C端逐個向N端延伸。其中用Fmoc保護(hù)各種氨基酸的α-氨基。氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基為Tyr用叔丁基(But)保護(hù)。使用HOBt和HBTu活化各氨基酸的羧端，并完成氨基酸分子間的縮合。完成合成后，用含有或不含有還原劑(如巰基乙醇)的三氟乙酸水溶液將合成的OGP10-14從樹脂上切割下來并去除保護(hù)基。可用過濾法或乙醚沉淀法分離得到粗肽。將所得產(chǎn)物的溶液凍干后，用凝膠過濾或反相高壓液相層析法純化所需的肽。
當(dāng)使用Boc系統(tǒng)進(jìn)行固相合成時，可選用下列被保護(hù)的氨基酸殘基Boc-Gly-OH，Boc-Tyr(Brz)-OH，Boc-Phe-OH。在Boc保護(hù)系統(tǒng)的固相合成中，典型的是使用Merrifield樹脂。不同的是用Boc保護(hù)各種氨基酸α-氨基。氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是Tyr用BrZ保護(hù)。在去保護(hù)、中和、偶聯(lián)的循環(huán)中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保護(hù)基團(tuán)(Boc)并用二異丙基乙胺(DIEA)/二氯甲烷中和。肽鏈縮合完成后，用無水氟化氫(HF)，在0℃下處理1～2小時，將肽鏈從樹脂上切下，同時除去所有保護(hù)基團(tuán)。以10％～30％乙酸抽提肽。凍干后進(jìn)一步用分子篩Sephadex G10或Tsk-40f分離純化，然后再經(jīng)高壓液相色譜C18柱純化，得到HPLC純的OGP10-14。
本發(fā)明還可以通過以下措施來實現(xiàn)可使用肽化學(xué)合成領(lǐng)域內(nèi)已知的各種偶聯(lián)劑和偶聯(lián)方法偶聯(lián)各氨基酸殘基，例如可使用二異丙基碳二亞胺(DIC)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)進(jìn)行直接偶聯(lián)，或通過活性酯例如五氟苯酯，或使用Fmoc-氨基酸-羧酸酐?？梢允褂昧u基苯駢三氮唑(HOBt)或7-氮雜羥基苯駢三唑(HOAt)或用2-(1H-苯駢三唑-1-基)，PyBOP、PyBroP、1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1H-苯駢三唑-1-基)，1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟磷酸酯(TBTU)、HATU活化氨基酸。
本發(fā)明也可以用手工方法或合成儀完成上述多肽的合成，肽自動合成儀，例如由Applied Biosystems公司生產(chǎn)的ABI 430A型或ABI 431A型肽合成儀也可以完成多肽的合成。
本發(fā)明的優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果是通過大量的生物活性實驗表明，本發(fā)明所制備的OGP10-14藥物組合物在促進(jìn)NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨方向分化、促進(jìn)形成成熟的骨樣小結(jié)，抑制其向成脂方向分化，促進(jìn)新生乳鼠跖骨生長有明顯的作用。其對于促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，通過成骨的增加來提高骨量、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、促進(jìn)骨拆愈合、提高造血能力等方面產(chǎn)生良好的效果，為加速臨床應(yīng)用和商業(yè)開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。
另外，本發(fā)明所制備的OGP10-14藥物組合物中發(fā)揮藥效作用的主要成分具有天然存在的OGP10-14結(jié)構(gòu)完全相同的結(jié)構(gòu)，從而顯著避免了長期使用后可能造成的免疫原性。本發(fā)明與OGP相比，具有結(jié)構(gòu)簡單、合成成本低、藥效相當(dāng)，更有利于臨床應(yīng)用及規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點。
下面通過生物活性實驗進(jìn)一步的說明本發(fā)明在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、促進(jìn)骨折愈合、提高造血能力等方面所產(chǎn)生的效果。
OGP(10-14)對NIH3T3細(xì)胞增殖的影響實驗步驟
1.消化NIH3T3細(xì)胞，以2×104/ml的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200ul，培養(yǎng)液為含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基。
2.46小時后吸出培養(yǎng)液，加入37℃預(yù)熱的無血清DMEM200ul/孔，置培養(yǎng)箱孵育2小時。
3.吸出培養(yǎng)液，加入含0.2％BSA及10-13-10-5M的OGP(10-14)無血清DMEM培養(yǎng)基(加入前37℃預(yù)熱30min)200ul/孔，各組3孔細(xì)胞。對照組培養(yǎng)液中無OGP(10-14)。
4、培養(yǎng)48小時(圖1)。
5.每孔加入MTT(5mg/ml)20ul，37℃孵育4小時，棄上清，每孔加入二甲基亞砜150ul，振蕩10分鐘，于490nm測吸光度值。
6.OD值用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異。
結(jié)果MTT法測定結(jié)果見附表1，OGP(10-14)促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖最適濃度為10-10。
附表1 不同濃度OGP(10-14)對NIH3T3增殖的影響(OD值)

OGP(10-14)對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響實驗方法1.原代培養(yǎng) 將Wistar大鼠頸椎脫位法處死，75％的酒精中浸泡5分鐘后取出，無菌條下取出雙側(cè)的股骨，經(jīng)無菌生理鹽水漂洗干凈后剪除股骨干的兩端，暴露骨髓腔，注射器針頭插入髓腔，用5ml DMEM培養(yǎng)液沖洗髓腔，沖出的骨髓細(xì)胞放于離心管中，1000rpm離心10min，棄上清，用含10％FBS，青、鏈霉素各100u/ml的DMEM培養(yǎng)液5ml制成骨髓細(xì)胞懸液，以次用8號和4號針頭抽吸細(xì)胞懸液兩次，將細(xì)胞過濾為單細(xì)胞懸液，計數(shù)有核細(xì)胞后以2×105/cm2種植于3個75ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，CO2濃度5％，濕度95％。3天后首次換液，以后每隔3-5天換液一次。
2.傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)14天細(xì)胞生長融合，吸出培養(yǎng)液，用37℃1×PBS洗細(xì)胞2次，用0.25％的胰蛋白酶消化細(xì)胞5-10min，鏡下觀察大部分細(xì)胞變?yōu)閳A形后立即加入含有10％的FBS的DMEM終止細(xì)胞的消化過程。吸管吹打貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶壁，吹打成細(xì)胞懸液，吸出置于離心管中，1500rpm離心10min，棄上清，重新加入DMEM培養(yǎng)液，吹打重懸細(xì)胞，依次用8號和4號針頭過濾成單細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞后以5×103/cm2種植于2個100ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，CO2濃度5％，濕度95％。3天后首次換液，以后每隔3-5天換液一次，待長滿瓶底形成單細(xì)胞層繼續(xù)傳代。
3.誘導(dǎo)成骨1)細(xì)胞分組傳3代骨髓基質(zhì)細(xì)胞(圖2)分A、B、C三組，A組培養(yǎng)液為原代培養(yǎng)液+50ug/ml維生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+10-8mol/L地塞米松；B組培養(yǎng)液為原代培養(yǎng)液+50ug/ml維生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+10-10mol/L的OGP10-14；C組培養(yǎng)液為原代培養(yǎng)液+50ug/ml維生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+10-8mol/L地塞米松+10-10mol/L的OGP10-14。
2)將傳3代的細(xì)胞以1×104/孔種于24孔培養(yǎng)板中并進(jìn)行爬片，誘導(dǎo)12天后各組取3孔細(xì)胞行ALP的改良Gomori氏鈣鈷法染色，光鏡觀察，隨機(jī)數(shù)取10個非重疊視野(×100)，計數(shù)堿性磷酸酶陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。
3)于誘導(dǎo)后12天終止培養(yǎng)，各組取3孔，吸出培養(yǎng)液，每孔加入無血清DMEM培養(yǎng)液1ml，用細(xì)胞刮器收集細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，3000rpm離心10min，取上清夜，用ALP試劑盒在全自動生化分析儀上測定細(xì)胞內(nèi)ALP活性。
4)于誘導(dǎo)后第35天各組取3孔細(xì)胞做Von Kossa染色，鏡下計數(shù)各孔鈣化結(jié)節(jié)數(shù)。
4.統(tǒng)計分析測得數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。
結(jié)果1.于誘導(dǎo)后第12天做ALP染色(圖3)，每張玻片隨機(jī)數(shù)取10個視野計算結(jié)果見附表2。結(jié)果顯示，與10-8mol/L地塞米松比較，10-10mol/L的OGP10 -14對BMSC向成骨方向分化有促進(jìn)作用。地塞米松(10-8mol/L)與OGP10-14(10-10mol/L)聯(lián)合作用時，其效應(yīng)大于單一因素的作用，呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。
2.于誘導(dǎo)后12天測定細(xì)胞內(nèi)ALP活性，結(jié)果見附表3。結(jié)果顯示，與10-8mol/L地塞米松比較，l0-10mol/L的OGP10-14對BMSC的ALP活性表達(dá)有促進(jìn)作用。地塞米松(10-8mol/L)與OGP10-14(10-10mol/L)聯(lián)合作用時，其效應(yīng)大于單一因素的作用，呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。
3.于誘導(dǎo)后35天做鈣染色(圖4)，鏡下及大體觀察細(xì)胞的染色情況，各組中均有非常多的黑色銀染顆粒沉積，細(xì)胞結(jié)構(gòu)已不清晰。其中C組的強(qiáng)度明顯強(qiáng)于A、B兩組，鏡下見該組中大片的黑色無結(jié)構(gòu)銀染區(qū)，大小、形態(tài)各異；而A、B組中這種區(qū)域相對較少。鏡下計數(shù)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)結(jié)果見附表4。A與C比較P＝0.009，B與C比較P＝0.034，A與B比較P＝0.315。以上結(jié)果說明10-8mol/L地塞米松與10-10mol/L的OGP10-14均可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)形成成熟的骨樣小結(jié)。10-8mol/L地塞米松與10-10mol/L的OGP10-14聯(lián)合作用時，其效應(yīng)大于單一因素的作用，呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。
附表2 OGP10-14對BMSC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

x±S各組間比較P＜0.05附表3 OGP10-14對骨髓基質(zhì)細(xì)胞ALP活性的影響

附表4 OGP10-14對BMSC鈣化的影響

±xS各組間比較P＜0.05OGP(10-14)對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂分化的影響實驗方法1.實驗分組傳3代骨髓基質(zhì)細(xì)胞分對照組和實驗組，對照組培養(yǎng)液為原代培養(yǎng)液+0.5mmol/L IBMX+10ug/ml胰島素+100ug/ml吲哚美辛+10- 6mol/L地塞米松；實驗組培養(yǎng)液為對照組培養(yǎng)液+10-10mol/L的OGP10-14。
2.各組細(xì)胞以1×104/孔種于24孔培養(yǎng)板中并進(jìn)行爬片，每組3孔細(xì)胞。誘導(dǎo)21天后行脂肪細(xì)胞油紅O染色，染色完成后光鏡觀察，照相留取資料。各濃度組每張玻片隨機(jī)數(shù)取10個非重疊視野(×100)，計算脂肪細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。
3.成脂誘導(dǎo)21天終止培養(yǎng)，吸出培養(yǎng)液，每組3孔細(xì)胞，每孔加入無血清DMEM培養(yǎng)液1ml，用細(xì)胞刮器收集細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，然后用氯仿∶甲醇(2∶1v/v)混合液抽提5分鐘。將有機(jī)相37℃水浴，使甲醇、氯仿?lián)]發(fā)后，用甘油三酯試劑盒在全自動生化分析儀上測定甘油三酯含量。
4.測得數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。
結(jié)果光鏡下觀察脂肪細(xì)胞油紅O染色(圖5)，每張玻片隨機(jī)數(shù)取10個視野計算結(jié)果見附表5。統(tǒng)計結(jié)果顯示，OGP10-14具有抑制BMSC向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用(P＜0.01)。甘油三酯含量測定結(jié)果見附表6(組間比較P＜0.05)。
附表5 OGP10-14對BMSC向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

附表6 OGP10-14對骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂分化的影響

OGP(10-14)對新生Wistar大鼠跖骨生長的影響實驗方法1.新生Wistar大鼠處死，75％酒精浸泡2分鐘。無菌條件下完整取出跖骨48塊，分別培養(yǎng)在兩塊24孔培養(yǎng)板中，每孔加入含0.2％BSA，0.3mg/mlL-glutamine，0.05mg/ml ascorbic acid，1mM sodiumglycerophosphate，100U/ml penicillin及100μg/ml streptomycin的DMEM培養(yǎng)液0.45ml。
2.48塊跖骨分8組，每組6塊，各組分別加入用PBS液配制的濃度為10-4-10-10M的OGP(10-14)溶液0.05ml，使其在培養(yǎng)液中的終濃度為10-5-10- 11M。對照組加入無菌PBS液0.05ml。
3.和濕度、5％CO2、37℃的條件下培養(yǎng)，每天換液1次。
4.養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6和7天，在倒置相差顯微鏡下(40倍)測量骨的長度(圖6)。
實驗結(jié)果見附表7，OGP(10-14)促進(jìn)跖骨生長的最佳有效濃度為10-9。
附表7 OGP(10-14)對新生Wistar大鼠跖骨生長的影響

x±S與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.0

圖1 OGP(10-14)誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞增殖(相差鏡，×100)圖2 第3代骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)1周后融合(相差鏡×100)圖3 骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)12天(ALP鈣鈷法染色×40)圖4 骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)35天(Von Kossa染色×40)圖5 骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)3周(油紅O染色×40)圖6 OGP(10-14)促進(jìn)新生大鼠跖骨生長(相差鏡×40)具體實施方式
實施例1
(1)用Boc系統(tǒng)合成OGP10-14H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH采用Merrifield樹脂(1g，氯取代值為1.06mmol/g)，使用Loffit法連接第一個Boc保護(hù)的氨基酸

取代值采用改進(jìn)的Gisin法測定，將接好第一個氨基酸的Merrifield樹脂裝于多肽合成反應(yīng)器中，然后按下表所示步驟由C端向N端逐個縮合各個被保護(hù)的氨基酸，每步反應(yīng)完成后，經(jīng)負(fù)壓作用過濾去除各試劑。步驟如下


重復(fù)1～22步進(jìn)行C端氨基酸逐個向N端的延伸反應(yīng)。
每進(jìn)入下一個氨基酸縮合循環(huán)用Kaiser試劑檢驗游離氨已確定縮合和脫保護(hù)是否完全。按上述反應(yīng)步驟由C端氨基酸逐個向N端延伸肽鏈后得到目的肽鏈樹脂，將樹脂從反應(yīng)器中移出后進(jìn)行真空干燥。
(2)肽鏈樹脂的氟化氫(HF)切割反應(yīng)將干燥的肽樹脂置于反應(yīng)器中，加入苯甲醚(1ml/g樹脂)，反應(yīng)器外使用液氮/冰水冷浴，通入無水HF液體(5m1/0.1mmol肽)，冰浴下反應(yīng)2小時。移去冰浴，真空泵除去HF，將反應(yīng)物用無水乙醚洗滌3次(1ml/g樹脂)，使用10％、20％、30％的乙酸梯度抽提粗肽3次(10ml/g樹脂)，去離子水稀釋后冷凍干燥。
(3)OGP10-14粗肽的純化稱取上述粗產(chǎn)物50mg，溶于1ml1N乙酸中，將溶液過SephadexG10柱(2.0×25cm)，1N乙酸洗脫以脫鹽。收集全排峰后進(jìn)行冷凍干燥。進(jìn)一步將所得脫鹽品過高壓液相反向?qū)游鯟18柱(Waters7.8mm×3cm)。收集主峰，真空除去乙酸，冷凍干燥，純化后的樣品純度達(dá)95％以上，核磁分析及質(zhì)譜分析結(jié)果均符合理論值。
(4)OGP10-14凍干品針劑的制備取50μg OGP10-14放入安培瓶內(nèi)，并將OGP10-14溶解于0.5ml超純水中，然后，加入1ml20％甘露醇和0.5ml 6％低分子右旋糖酐，經(jīng)冷凍干燥得凍干品針劑。使用時用1ml生理鹽水稀釋。
實施例2(1)用Fmoc系統(tǒng)合成OGP10-14接第一個Fmoc保護(hù)的氨基酸。
將起始Wang樹脂(1g，1.57mmolOH/g resin)裝于圓底燒瓶中，加入15mLDCM/DMF(9∶1)。將1.5eqAa溶于少量DMF，再加入1.5eqHOBt，溶解后加入燒瓶，再加入1eqDIC。0.1eqDMAP溶于DMF再加入燒瓶中。室溫磁力攪拌2～3h。加入2eq醋酐和2eq吡啶室溫再攪拌30min。過濾，洗滌，干燥。將接好第一個氨基酸的Wang樹脂裝于多肽合成反應(yīng)器中。然后按下表所示步驟由C端向N端逐個縮合各個被保護(hù)的氨基酸，每步反應(yīng)完成后，經(jīng)負(fù)壓作用過濾去除各試劑。步驟如下

重復(fù)1-5完成C端氨基酸逐個向N端的延伸。
每個氨基酸脫保護(hù)和縮合后用茚三酮法測定游離氨基進(jìn)行檢驗。按上述反應(yīng)步驟由C端氨基酸逐個向N端延伸肽鏈后得到目的肽鏈樹脂，將樹脂從反應(yīng)器中移出后進(jìn)行真空干燥。
(2)肽鏈樹脂的切割反應(yīng)將干燥的肽鏈樹脂(1g)置于反應(yīng)器中，加入Regent K(TFA∶水∶苯酚∶苯甲硫醚∶1，2乙二硫醇＝82.5∶5∶5∶5∶2.5)25ml，室溫反應(yīng)3h，間歇攪拌。過濾清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用冷的乙醚沉淀，低溫離心，沉淀用水溶解，冷凍干燥。
(3)純化方法同上述實施例1中(3)方法。
(4)OGP10-14凍干品針劑制備取50μg OGP10-14放入安培瓶內(nèi)，并將OGP10-14溶解于0.5ml超純水中，然后，加入1ml20％甘露醇和0.5ml 6％低分子右旋糖酐，經(jīng)冷凍干燥得凍干品針劑。使用時用1ml生理鹽水稀釋。
權(quán)利要求
1.一種含成骨生長五肽(OGP10-14)的藥物組合物，其特征在于藥物組合物是由OGP10-14作為活性成份與輔劑甘露醇和低分子右旋糖酐制成的，其中OGP10-14含量為0.01～99.99％、輔劑含量為99.99％～0.01％，并按任意比例配制而成。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一種含成骨生長五肽藥物組合物的制備方法，其特征在于取OGP10-14放入安培瓶內(nèi)并將OGP10-14溶解于超純水中，然后，加入甘露醇和低分子右旋糖酐，經(jīng)冷凍干燥得凍干品針劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含成骨生長五肽的藥物組合物的制備方法，其特征在于成骨生長五肽OGP10-14是采用常規(guī)的固相多肽合成技術(shù)制備的。
4.如權(quán)利要求5所述的一種含成骨生長五肽藥物組合物的制備方法，其特征在于1)在Fmoc保護(hù)系統(tǒng)的固相合成中，首先將C端第一個氨基酸(C端Fmoc-Gly)裝在含羥基樹脂的反應(yīng)器中，按照給定的氨基酸序列由C端逐個向N端延伸，其中用Fmoc保護(hù)各種氨基酸的α-氨基，氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基為Tyr用叔丁基(But)保護(hù)，使用HOBt和HBTu活化各氨基酸的羧端，并完成氨基酸分子間的縮合，完成合成后，用含有或不含有還原劑(如巰基乙醇)的三氟乙酸水溶液將合成的OGP(10-14)從樹脂上切割下來并去除保護(hù)基，可用過濾法或乙醚沉淀法分離得到粗肽，將所得產(chǎn)物的溶液凍干后，用凝膠過濾或反相高壓液相層析法純化所需的肽；2)在Boc保護(hù)系統(tǒng)的固相合成中，典型的是使用Merrifield樹脂，不同的是用Boc保護(hù)各種氨基酸α-氨基，氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是Tyr用BrZ保護(hù)。在去保護(hù)、中和、偶聯(lián)的循環(huán)中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保護(hù)基團(tuán)(Boc)并用二異丙基乙胺(DIEA)/二氯甲烷中和，肽鏈縮合完成后，用無水氟化氫(HF)，在0℃下處理1-2小時，將肽鏈從樹脂上切下，同時除去所有保護(hù)基團(tuán)，以10％-30％乙酸抽提肽，凍干后進(jìn)一步用分子篩SephadexG10或Tsk-40f分離純化，然后再經(jīng)高壓液相色譜C18柱純化，得到HPLC純的OGP(10-14)。
5.如權(quán)利要求3所述的一種含成骨生長五肽藥物組合物的制備方法，其特征在于當(dāng)采用Fmoc系統(tǒng)進(jìn)行固相合成時，可選用下列被保護(hù)的氨基酸殘基Fmoc-Gly，F(xiàn)moc-Tyr(But)，F(xiàn)moc-Phe；當(dāng)使用Boc系統(tǒng)進(jìn)行固相合成時，可選用下列被保護(hù)的氨基酸殘基Boc-Gly，Boc-Tyr(Brz)，Boc-Phe。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種含成骨生長五肽的藥物組合物的制備方法，其特征在于所述的固相多肽合成載體為二乙烯苯交聯(lián)的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺樹脂、可控孔度玻璃、TentaGel樹脂、磁性樹脂珠；上述肽制備可選的樹脂有wang樹脂、HMPA-PEGA樹脂、2-氯三苯甲基氯樹脂、Merrifield樹脂、Oxime樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種骨生長五肽的藥物組合物的制備方法，其特征在于可使用肽化學(xué)合成領(lǐng)域內(nèi)已知的各種偶聯(lián)劑和偶聯(lián)方法偶聯(lián)各氨基酸殘基，偶聯(lián)劑可使用二異丙基碳二亞胺(DIC)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)進(jìn)行直接偶聯(lián)，或通過活性酯例如五氟苯酯，或使用Fmoc-氨基酸-羧酸酐；或使用羥基苯駢三氮唑(HOBt)或7-氮雜羥基苯駢三唑(HOAt)或用2-(1H-苯駢三唑-1-基)，PyBOP、PyBroP、1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1H-苯駢三唑-1-基)，1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟磷酸酯(TBTU)、HATU活化氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制劑，具體涉及一種含成骨生長五肽(OGP
文檔編號A61P19/10GK1785424SQ20041007337
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月9日
發(fā)明者王銳, 陳志信, 常民, 彭雅麗 申請人:蘭州大學(xué)