專利名稱：一種抗腫瘤融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中一種抗腫瘤融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種抗腫瘤融合蛋白及其編碼基因與以該抗腫瘤融合蛋白為活性成分的藥物。
背景技術(shù)：
超抗原是指一類逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白和細菌外毒素，它們無需抗原遞呈細胞的加工，而能直接與抗原遞呈細胞的MHC及T細胞的TCR結(jié)合，并激活T細胞，由于這類抗原以微量存在時，即可激活大量的T細胞，因而稱之為超抗原(Superantigen，SAg)。將超抗原直接注射到機體會對抗原遞呈細胞產(chǎn)生超抗原依賴的細胞毒(SDCC)作用，而將超抗原加以靶向修飾，使其能特異地結(jié)合到腫瘤細胞則對腫瘤細胞產(chǎn)生SDCC作用，并分泌多種抑癌細胞因子，從而產(chǎn)生系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)，因此超抗原概念一經(jīng)提出，其在治療惡性腫瘤上的潛力便受到重視。
超抗原是一種很強的T細胞激活劑，它激活CD4+、CD8+T細胞，使之相應(yīng)分化成Th細胞和CTL，前者分泌大量的細胞因子如TNF-α、TNF-β、TNF-γ、IL-2、IL-6、IL-12等，對腫瘤產(chǎn)生間接抑制殺傷作用，而CTL則直接殺傷呈遞超抗原的細胞，因此，當運用各種方法將超抗原連接到腫瘤細胞上，使腫瘤扮演“抗原遞呈細胞”的角色時，CTL便會對腫瘤細胞產(chǎn)生直接的殺傷作用。
超抗原治療腫瘤的機理，其主要觀點有如下兩點1)超抗原能激活CD8+T細胞并對呈遞超抗原的腫瘤細胞產(chǎn)生超抗原依賴的細胞毒作用(SAg-dependent cell-mediatedcytotoxicity，SDCC)，穿孔素是該反應(yīng)的主要效應(yīng)分子；2)超抗原能激活CD4+T細胞，分泌大量的細胞因子，如IL-2、TNF-α、IFN-γ等，細胞因子激活NK細胞成為LAK細胞，兩者協(xié)同作用，對腫瘤細胞產(chǎn)生直接和間接的殺傷作用，其中IFN-γ的作用是主要的，而TNF-α可能起協(xié)同作用。
金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcus enterotoxins，SEs)是由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一組具有超抗原活性的細菌毒素，包括SEA、SEB、SEC1-3以及毒性休克綜合癥毒素-1(Toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1)等11種血清型。突變研究表明SEA有兩個MHC-II結(jié)合位點，除了在N端有一個結(jié)合位點外，SEA在C端還有一個Zn2+參與的強結(jié)合位點，分別涉及SEA分子的His187、His225、Asp227等殘基，將其中的227位進行點突變(D→A)，能使SEA與MHC-II的結(jié)合力下降1000倍。
以超抗原為候選抗腫瘤分子的研究已有較多嘗試，這些研究主要有三種策略1)利用腫瘤特異性相關(guān)抗原的單抗與超抗原融合表達來進行靶向治療，如Dohlsten小組將針對結(jié)腸癌腫瘤相關(guān)抗原的單抗與SEA分子進行融合(FabC242-SEA)，融合分子能有效地將T細胞吸引至腫瘤組織，產(chǎn)生SDCC作用，并分泌多種細胞因子，產(chǎn)生系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)，現(xiàn)已完成I期臨床研究；2)以腫瘤高表達受體為靶標，以其配體為導(dǎo)向進行腫瘤的靶向治療。張國池等用化學方法將人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)與SEB偶聯(lián)，偶聯(lián)物注入小鼠肝癌模型后，能將大量的CD8、CD4陽性T細胞導(dǎo)向癌組織，使腫瘤的生長受到顯著抑制，小鼠腫瘤發(fā)生率和死亡率明顯下降；3)將超抗原基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞或利用跨膜肽被動吸附腫瘤細胞，然后進行過繼治療。如Pulaski等利用該策略將SEB與MHC-II、CD80(B7-1)共轉(zhuǎn)染4T1乳腺瘤，過繼治療后使小鼠乳腺癌的術(shù)后轉(zhuǎn)移降低了100倍，生存時間明顯延長。
超抗原靶向治療腫瘤的研究盡管已取得一定的成果，但目前仍存在一些問題。首先是導(dǎo)向分子的選擇(1)就單抗分子導(dǎo)向而言，關(guān)鍵問題在于單抗的人源化；(2)對于配體介導(dǎo)的導(dǎo)向治療，雖省去了制備單抗的繁瑣，但配體和超抗原的融合使融合分子的分子量偏大，不利于對實體瘤的治療，此外配體和受體的結(jié)合通常會介導(dǎo)配體的內(nèi)吞，這可能使超抗原的作用時間縮短，因此直接以配體為靶向分子并不適合超抗原的靶向治療。基于上述問題，需要發(fā)展新的靶向分子。
表皮生長因子受體(EGFR)在許多腫瘤細胞表面存在過度表達，如腦瘤、黑色素瘤和乳癌等。EGF、TGF-α均是其天然配體，這些受體的配體均可作為導(dǎo)向分子。EGFR家族是研究最早的受體酪氨酸激酶，目前已發(fā)現(xiàn)EGFR/ErbB-1，HER2/ErbB-2，HER3/ErbB-3以及HER4/ErbB等4個不同的受體，其中EGFR和ErbB4具有配體激活酪氨酸激酶活性，ErbB2是一個孤兒受體，而ErbB3則是激酶缺陷受體。EGFR家族包含EGF、TGF-α及Heregulin等多種天然配體；其中，EGF能與EGFR結(jié)合，而Heregulin能與ErbB3和ErbB4結(jié)合。EGF刺激EGFR能引發(fā)受體的同源或異源二聚化，并對細胞轉(zhuǎn)化具有非常重要的影響如將ErbB3、Neu共轉(zhuǎn)染使NIH3T3發(fā)生轉(zhuǎn)化，而單獨轉(zhuǎn)化則沒有轉(zhuǎn)化效應(yīng)。EGFR在非小細胞肺癌、乳腺癌、頭頸癌等多種腫瘤細胞上高表達，這種高水平表達與腫瘤進行到晚期密切相關(guān)。因此以EGFR作為靶標的生物制藥一直頗受重視，并且已有藥物上市如抗ErbB-2的單抗Herceptin已經(jīng)得到美國FDA的批準應(yīng)用于臨床，并在2002年的抗癌藥物銷售收入排行榜中名列第五。由于以EGFR為靶標可對一類腫瘤產(chǎn)生治療效果，因此目前很多國外大公司仍然斥巨資于EGFR靶向藥物的研究。傳統(tǒng)的EGFR靶向抗癌藥物可分為3類一是酪氨酸激酶抑制劑，如ZD-1839(Iressa)、OSI-774(Tarceva)等；二類是單克隆抗體類如IMC-C225、MDX-210和Herceptin等；第三類是針對EGFR配體的分子，如針對EGF、TGF-α的反義核酸、融合毒素及細胞因子疫苗等。目前還未見以EGFR為靶向的超抗原抗癌藥物的研究。
TGFα第三環(huán)區(qū)(簡稱TGFα3)編碼堿基長51bp，Nestor等的研究表明TGFα的第三環(huán)區(qū)是TGFα與EGFR的結(jié)合位點，它沒有促細胞分裂活性但能同EGF競爭結(jié)合EGF受體。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抗腫瘤融合蛋白，它包括超抗原和可以與腫瘤細胞上受體結(jié)合的細胞因子。
所述超抗原為金黃色葡萄球菌腸毒素、鏈球菌熱源外毒素(Streptococcal pyrogenicexotoxins，Spes)A1-A4、鏈球菌分裂原性外毒素(Streptococcal mitogenic exotoxins，SME-Z，SME-Z2)以及鏈球菌超抗原(Streptococcal superantigen，SSA)等。
所述金黃色葡萄球菌腸毒素可為金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)、金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)、金黃色葡萄球菌腸毒素C1、金黃色葡萄球菌腸毒素C2、金黃色葡萄球菌腸毒素C3或毒性休克綜合癥毒素-1。
為了降低SEA與MHC-II分子的結(jié)合，所述金黃色葡萄球菌腸毒素A的自N端的227位氨基酸殘基由天冬氨酸突變?yōu)楸彼?，命名為mSEA，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示，其編碼基因具有序列表中序列8的核苷酸序列。
序列表中的序列1由242個氨基酸殘基組成，序列表中的序列8由729個堿基組成。
所述細胞因子可為轉(zhuǎn)化生長因子α、表皮生長因子及Heregulin等，優(yōu)選為轉(zhuǎn)化生長因子α的第三環(huán)區(qū)，它是具有序列表中序列3的自氮端第2位-18位的氨基酸殘基序列的17肽。
為了保證融合蛋白分子各部分構(gòu)象的相對獨立，所述融合蛋白還包括具有5-8個氨基酸殘基的連接肽(linker)。
所述轉(zhuǎn)化生長因子α的第三環(huán)區(qū)(TGFα3)可連接在所述金黃色葡萄球菌腸毒素的N端或C端。
本發(fā)明的抗腫瘤融合蛋白具體可選自下述蛋白質(zhì)家族中的任意一種1)具有序列表中SEQ ID No3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(mTSA)，或者將SEQ ID No3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No3的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No3衍生的蛋白質(zhì)；2)具有序列表中SEQ ID No5氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(mTSB)，或者將SEQ ID No5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No5的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No5衍生的蛋白質(zhì)；3)具有序列表中SEQ ID No7氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(mST)，或者將SEQ ID No7的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No7的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No7衍生的蛋白質(zhì)。
其中，本發(fā)明的抑制腫瘤生長的融合蛋白優(yōu)選為具有序列表中SEQ ID No3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(mTSA)、具有序列表中SEQ ID No5氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(mTSB)或具有序列表中SEQ ID No7氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(mST)；尤其優(yōu)選為具有序列表中SEQ ID No3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(mTSA)。
序列表中SEQ ID No3由267個氨基酸殘基組成，自氮端第2位-第18位氨基酸殘基為TGFα第三環(huán)區(qū)，自第19位-26位氨基酸殘基為連接肽序列，自氮端第27位-267位氨基酸殘基來自于mSEA。序列表中SEQ ID No5由264個氨基酸殘基組成，自氮端第2位-第18位氨基酸殘基為TGFα第三環(huán)區(qū)，自氮端第19位-23位氨基酸殘基為連接肽序列，自氮端第24位-264位氨基酸殘基來自于mSEA。序列表中SEQ ID No7由267個氨基酸殘基組成，自氮端第1位-第234位氨基酸殘基來自于mSEA，自氮端第235位-242位氨基酸殘基為連接肽序列，自氮端第243位-259位氨基酸殘基為TGFα第三環(huán)區(qū)。在上述序列表中SEQ ID No3，SEQ ID No5和SEQ ID No7中的C末端的LEHHHHHH為內(nèi)切限制酶Nde I識別序列編碼的氨基酸(LE)和六個組氨酸的純化標簽序列。
本發(fā)明的第二個目的是提供上述抗腫瘤融合蛋白的編碼基因。本發(fā)明所提供的抗腫瘤融合蛋白的編碼基因具有下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID No2或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(2)序列表中的SEQ ID No4或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(3)序列表中的SEQ ID No6或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的SEQ ID No2由804個堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5’端第1位到第804位堿基，編碼序列表中的SEQ ID No3；序列表中的SEQ ID No4由795個堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5’端第1位到第795位堿基，編碼序列表中的SEQID No5；序列表中的SEQ ID No6由804個堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5’端第1位到第801位堿基，編碼序列表中的SEQ ID No7。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種抗腫瘤疫苗藥物，它的活性成分為上述抗腫瘤融合蛋白。
需要的時候，在上述疫苗藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的疫苗藥物可通過注射、或滴注，可以制成注射劑、或靜脈滴注液等多種藥物形式。上述各種劑型的疫苗藥物均可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明中，SEA是指自然的SEA，rSEA是經(jīng)基因重組技術(shù)制備的SEA，后者的C端比前者多了氨基酸Leu、Glu及6個His(His可在純化過程通過酶切加以去除)。
為了降低融合分子的分子量，提高其在實體瘤治療中的穿透性，更重要的是避免融合蛋白被內(nèi)化，延長融合蛋白在體內(nèi)作用時間，本發(fā)明創(chuàng)造性地利用TGF-α與EGFR重要結(jié)合片段TGF-α第3環(huán)區(qū)與SEA融合。同時，為降低SEA對正常MHC-II+細胞的損傷，對其227位氨基酸進行了突變(D→A)。試驗表明該融合蛋白能有效地與EGFR結(jié)合，并能激活T細胞產(chǎn)生針對EGFR高表達腫瘤細胞的超抗原依賴的細胞毒作用。
本發(fā)明將能與EGF競爭結(jié)合EGFR的TGF-α第三環(huán)區(qū)與SEA融合，使其能夠靶向至EGFR高表達的腫瘤細胞，實現(xiàn)超抗原的靶向治療。為避免TGF-α3與SEA融合時對各自空間構(gòu)象的干擾，利用Insight II對其空間結(jié)構(gòu)進行模建，結(jié)果表明8肽的連接肽(linker)能夠保證兩者空間構(gòu)象相互獨立，而5肽則對兩者都有影響。將含8個氨基酸的連接肽(linker)的蛋白命名為mTSA(其構(gòu)象如圖1a)，而含5個氨基酸的連接肽(linker)的融合蛋白命名為mTSB(其構(gòu)象如圖1b)。
本發(fā)明克隆表達了融合蛋白mTSA、mTSB及mST(前兩者代表含8和5個氨基酸連接肽的TGFα3-mSEA分子，后者指TGFα3與mSEA的C端進行融合的分子)。將融合蛋白與脾細胞共培養(yǎng)，mTSA比mTSB更能顯著促進脾細胞的增殖，兩者差異顯著；而mST活性則相對較低，通過空間結(jié)構(gòu)的分析，初步表明SEA分子的C端融合會干擾SEA與T細胞TCR分子的結(jié)合。受體特異性結(jié)合試驗及激光共聚焦分析表明，融合蛋白mTSA能特異性地結(jié)合到A431的EGF受體，并呈劑量依賴效應(yīng)。將融合蛋白mTSA與激活的脾細胞及腫瘤細胞共培養(yǎng)，能對A431及B16腫瘤細胞產(chǎn)生明顯的抑瘤效果。用融合蛋白mTSA注射荷瘤小鼠，60pmol的mTSA對腫瘤生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，其抑瘤率為66.50％，而rSEA對照組抑瘤率僅有11.20％。組化分析表明，融合蛋白能將大量的CD4+、CD8+陽性T細胞靶向至腫瘤組織。融合蛋白治療荷瘤小鼠能明顯提高荷瘤小鼠的存活率，高、中、低劑量的融合蛋白的24天存活率分別為100％、60％、60％，而rSEA及環(huán)磷酰氨則均為40％，PBS對照組則僅有30％。將融合蛋白免疫小鼠，結(jié)果可使62.5％的小鼠能夠抵御腫瘤細胞的侵襲，而PBS對照組則均出現(xiàn)腫瘤細胞的肺轉(zhuǎn)移。進一步的抗體體外試驗表明，融合蛋白免疫小鼠能產(chǎn)生針對TGF-α3肽抗體，由于TGF-α3肽是TGF-α與EGFR結(jié)合的部位，因此該抗體與TGF-α的結(jié)合能夠干擾TGF-α與EGFR的結(jié)合，破壞腫瘤生長所必需的自分泌循環(huán)過程，抑制腫瘤的生長。上述研究表明，本發(fā)明的抗腫瘤融合蛋白具有超抗原靶向藥物和TGFα疫苗的雙重功效。
融合蛋白mTSA具有有以下抗癌效應(yīng)1)將融合蛋白注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，其直接產(chǎn)生超抗原依賴的細胞毒作用(SAg-dependent cell-mediated T-cell-derivedcytotoxicity，SDCC)，其特點是作用迅速；2)隨著融合蛋白多個療程的使用，基于SEA的佐劑效應(yīng)，機體將逐漸產(chǎn)生針對TGFα17肽的抗體，此時融合蛋白將逐漸失去靶向SDCC作用。由于TGFα17肽是TGFα分子與EGFR結(jié)合的主要片斷，針對TGFα17肽的抗體將通過與TGFα分子的結(jié)合阻斷與EGFR的結(jié)合，削弱腫瘤細胞的自分泌循環(huán)，從而發(fā)揮抑制相應(yīng)腫瘤復(fù)發(fā)的功能，其特點是作用時間相對較長。
本發(fā)明將在腫瘤的預(yù)防和治療中發(fā)揮重要的作用，并為根本解決融合毒素靶向治療中因免疫中和而失效的問題，提供了一種新模式。


圖1a為mTSA的構(gòu)象圖1b為mTSB的構(gòu)象圖2為pmTSA的構(gòu)建流程3為mSEA基因擴增產(chǎn)物的電泳圖譜圖4為pmTSA重組質(zhì)粒鑒定的電泳圖譜圖5為pmTSB重組質(zhì)粒鑒定的電泳圖譜圖6為pmST重組質(zhì)粒鑒定的電泳圖譜圖7為不同誘導(dǎo)時間對mTSA表達影響的電泳圖譜圖8為mTSA可溶表達檢測電泳圖譜圖9a為mTSA的電泳純度檢測圖譜圖9b為mTSA的金屬螯合親合層析的洗脫曲線圖10為mTSA的N端測序結(jié)果圖11為不同蛋白刺激脾細胞增殖活性的柱狀12為mTSA與A431結(jié)合的劑量曲線圖13為mTSA與A431結(jié)合的特異性試驗結(jié)果照片圖14為mTSA與A431結(jié)合的激光共聚焦分析照片圖15A為在不同的效應(yīng)細胞/靶細胞比條件下mTSA介導(dǎo)的細胞毒曲線圖15B為不同濃度的mTSA對A431細胞系生長的影響曲線圖16為mTSA抑制B16細胞生長曲線圖17為mTSA體內(nèi)抑制腫瘤生長曲線圖18a為mTSA治療對CD8+T細胞富集影響照片圖18b為mTSA治療對CD4+T細胞富集影響照片圖18c為rSEA治療對CD8+T細胞富集影響照片圖18d為rSEA治療對CD4+T細胞富集影響照片圖19為mTSA治療提高荷瘤小鼠的生存率曲線圖20a-20c為死亡小鼠中B16黑色素瘤的轉(zhuǎn)移情況照片圖21a為HE染色的腫瘤組織照片圖21b為HE染色的正常肺組織照片圖22a為rSEA免疫小鼠對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的影響照片圖22b為mTSA免疫小鼠對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的影響照片圖22c為PBS免疫小鼠對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的影響照片圖22d為rSEA免疫組、mTSA免疫組、PBS免疫組小鼠中腫瘤細胞轉(zhuǎn)移比率的柱狀23a為mTSA的抗體效價測定曲線圖23b為rSEA的抗體效價測定曲線圖24a為mTSA免疫血清對腫瘤細胞生長的抑制作用曲線圖24b為mTSA的抗原性分析(W＝5)曲線具體實施方式
以下實施例中的rSEA按照文獻(胥全彬，劉傳暄，馬清鈞等，金黃色葡萄球菌腸毒素A的基因克隆、表達及活性試驗，生物工程學報，2003，17(3)402-405)方法制備。
實施例1、融合基因的構(gòu)建1、表達mTSA的載體pmTSA的構(gòu)建表達mTSA的載體pmTSA的構(gòu)建過程如圖2所示，具體過程如下
(1)設(shè)計引物為了降低融合分子對MHC-II+組織的毒副作用，通過PCR引物設(shè)計在SEA的第227位引入定點突變D227A，將該SEA突變體命名為mSEA，其氨基酸序列如序列表中序列1所示，所用引物為P4，引物中黑色斜體部分即為突變位點。為了便于TGFα17肽與mSEA的N端融合，設(shè)計引物P3，使SEA基因的5′端的酶切位點變?yōu)锽amHI，引物中黑體部分為酶切位點，這樣TGFα17肽基因便可克隆至XholI與BamHI之間。
P35′-AA AGC GAG AAA AGC-3′，P45′-ATG AAT TCA CTC GAG ACT TGT ATA TAA ATA TAT AGC AAT ATG CAT-3′P55′-AA CAT ATG GTA TGC CAC TCT GGT TAC GTT GGC GCA CGT TGT GAA CAC-3′P65′-TT GAG CAG GTC AGC GTG TTC ACA ACG TGC GCC-3′合成末端互補的引物P5、P6，為了使TGFα3與SEA的構(gòu)象都不受影響，在兩者之間加了一段含8個氨基酸的連接肽，其編碼序列來自于引物P3和引物P6，連接肽編碼序列見相應(yīng)引物的方框內(nèi)堿基(P3方框內(nèi)堿基和P6所示堿基的反向互補序列共同組成8個氨基酸連接肽的編碼序列，其中GGATCC為P3和P6所共有)。
(2)載體pmTSA的構(gòu)建為定點突變所設(shè)計的引物P4長45nt，配對堿基42個，而其上游引物P3長26nt，配對堿基僅有12個，兩者的Tm值相差甚大，因此按照常規(guī)的PCR擴增程序進行擴增并不合適；與此同時SEA基因是一個富含AT的基因，增加P3引物配對堿基數(shù)，將使P3的3端出現(xiàn)AT富集區(qū)，從而使PCR擴增的特異性降低。為此，采用遞減PCR(Touch-Down PCR)擴增，以pET-SEA(胥全彬，劉傳暄，馬清鈞，金黃色葡萄球菌腸毒素A的基因克隆、表達及活性試驗，生物工程學報，2003，17(3)402-405)為模板，按照如下程序進行遞減PCR(Touch-Down PCR)擴增。其中，PCR反應(yīng)的體系如下10×擴增緩沖液5μl2.5mmol/l dNTP1μl25μmol/l引物P3 1μl25μmol/l引物P4 1μlPfuDNA聚合酶 1μlpET-SEA質(zhì)粒(5μg/ml) 1μlH2O 40μl總體積50μl擴增程序如下在95℃變性解鏈5min，再進行循環(huán)擴增94℃ 60秒，64℃ 60秒；2個循環(huán)72℃ 90秒；↓
94℃ 60秒，62℃ 60秒；2個循環(huán)72℃ 90秒；↓94℃ 60秒，60℃ 60秒；2個循環(huán)72℃ 90秒；↓94℃ 60秒，58℃ 60秒；2個循環(huán)72℃ 90秒；↓94℃ 60秒，56℃ 60秒；2個循環(huán)72℃ 90秒；然后94℃ 60秒，54℃ 60秒；72℃ 90秒；運行22個循環(huán)最后72℃延伸10min。4℃保存。
PCR擴增結(jié)果如圖3所示，表明mSEA基因擴增產(chǎn)物具有很高的特異性。圖3中，泳道1為DNA分子量標準，泳道2為mSEA基因擴增產(chǎn)物。用XholI與BamHI分別酶切pET-22b(+)和該mSEA基因擴增產(chǎn)物，連接得到pET-mSEA。
將具有互補序列的單鏈寡核苷酸P5、P6退火，經(jīng)BamHI和NdeI酶切后，與pET-mSEA的BamHI和NdeI酶切片段連接得到重組質(zhì)粒pmTSA，將pmTSA通過CaCl2法轉(zhuǎn)化DH5α，克隆再經(jīng)PCR和NdeI和XhoI酶切鑒定(圖4)，將鑒定為陽性的克隆進行測序，測序結(jié)果表明所得克隆與設(shè)計的pmTSA中的編碼序列(mTSA基因)完全一致，mTSA基因具有如序列表中的序列2所示的核苷酸序列，其編碼如序列表中的序列3所示的蛋白mTSA。圖4中，泳道1為PCR鑒定結(jié)果，泳道2為NdeI和XhoI酶切鑒定結(jié)果，泳道3為DNA分子量標準。
2、表達mTSB的載體pmTSB和表達mST的載體構(gòu)建設(shè)計引物P7，用P7代替P6，重復(fù)步驟1中的(2)的過程得到表達mTSB的載體pmTSB。將pmTSB通過CaCl2法轉(zhuǎn)化DH5α，克隆再經(jīng)PCR和NdeI和XhoI酶切鑒定(圖5)，將鑒定為陽性的克隆進行測序，測序結(jié)果表明所得克隆與設(shè)計的pmTSB中的編碼序列(mTSB基因)完全一致，mTSB基因具有如序列表中的序列4所示的核苷酸序列，其編碼如序列表中的序列5所示的蛋白mTSB。圖5中，泳道1為DNA分子量標準，泳道2為PCR鑒定結(jié)果，泳道3為NdeI和XhoI酶切鑒定結(jié)果。
為了得到TGFα3在mSEA的C端的融合分子，首先設(shè)計合成引物P8，利用該引物在SEA成熟肽基因的3’端引入新的限制酶切位點SacI，以pET-SEA(胥全彬，劉傳暄，馬清鈞，金黃色葡萄球菌腸毒素A的基因克隆、表達及活性試驗，生物工程學報，2003，17(3))為模板，在P3和P8引導(dǎo)下，按照與pmTSA相同的程序進行遞減PCR(Touch-DownPCR)擴增，利用BamHI和SacI將該擴增產(chǎn)物克隆至pET-22b(+)，得到載體pET-mST。設(shè)計合成引物P9、P10，使合成的TGFα3帶有8個氨基酸TGFα3(方框內(nèi)堿基為連接肽編碼序列)，將具有互補序列的P9、P10退火，進行常規(guī)PCR擴增，將該擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHI和NdeI酶切后，插入到pET-mST載體中得到重組載體pmST。將pmST通過CaCl2法轉(zhuǎn)化DH5α，克隆再經(jīng)PCR和NdeI和XhoI酶切鑒定(圖6)，將鑒定為陽性的克隆進行測序，測序結(jié)果表明所得克隆與設(shè)計的pmST中的編碼序列(mST基因)完全一致，mST基因具有如序列表中的序列6所示的核苷酸序列，其編碼如序列表中的序列7所示的蛋白mST。圖6中，泳道1為DNA分子量標準，泳道2為PCR鑒定結(jié)果，泳道3為NdeI和XhoI酶切鑒定結(jié)果。
P75′-TT GAG CAG GTC AGC GTG TTC ACA ACG TGC GCC-3′，P85′-AA GTG GTG GAG CTC GAC ACT TGT A-3′，P95′-AA GAG CTC GTA TGC CAC TCT GGT TAC GTT GGC-3′P105′-AA CTC GAG GAG CAG GTC AGC GTG TTC GCA ACG TGC GCC AAC GTA ACC AGA GTG GCA-3′實施例2、融合蛋白的表達及純化將重組質(zhì)粒pmTSA按照CaCl2法轉(zhuǎn)入E.coli BL-21(DE3)，37℃1mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)1、3、5小時，結(jié)果如圖7所示，表明融合蛋白的最大表達量占全菌總蛋白的10％，延長誘導(dǎo)時間對其表達沒有明顯的提高。與rSEA的表達相比(胥全彬，劉傳暄，馬清鈞等，金黃色葡萄球菌腸毒素A的基因克隆、表達及活性試驗，生物工程學報，2003，17(3)402-405)，TGFα3在N端的融合使mTSA的表達水平降低了2倍以上。圖7中，泳道1為蛋白質(zhì)分子量標準，泳道2-4為分別誘導(dǎo)5、3、1小時的mTSA的表達，泳道5為未誘導(dǎo)的mTSA的表達。此外，TGFα3在mSEA N端的融合并沒有增加mTSA的可溶表達量，所表達蛋白仍幾乎全是包含體(圖8)。圖8中，泳道1為轉(zhuǎn)化子的裂解上清液，泳道2為轉(zhuǎn)化子裂解液中的不溶部分；泳道3為蛋白質(zhì)分子量標準。降低誘導(dǎo)溫度至20℃，mTSA獲得了部分可溶表達。將mTSA可溶表達產(chǎn)物進行13000rpm離心10分鐘進行分離，再經(jīng)過金屬螯合親合層析進行純化，純化方法如下1)金屬螯合親合層析柱的準備按常規(guī)方法裝好層析柱，先用5倍體積水洗，再用1個體積的0.2mmol/lNi2+Cl2結(jié)合膠，先用5倍體積水冼柱，再用3倍體積的平衡緩沖液(0.5mol/L NaCl，0.1mol/LTris.Cl，pH8.0)平衡層析柱。
2)樣品制備22℃誘導(dǎo)24小時后，離心收集菌體。用平衡緩沖液溶解，加入10％的Triton-X100，至終濃度0.1％，冰浴30min。用超聲波破碎儀破碎細胞后(輸出功率4，超聲3分鐘)，離心分離上清。用0.45μm的濾膜過濾上清。
3)將已制備好的樣品以0.1ml/min的流速上樣，上樣結(jié)束后，用2倍體積的平衡緩沖液將峰線平衡至基線，然后用2倍體積的洗脫緩沖液(0.5mol/LNaCl，0.1mol/LTris.Cl，pH8.0，50mmol/L咪唑，pH8.0)洗去非特異結(jié)合蛋白質(zhì)，用含250mmol/L咪唑的洗脫緩沖液(0.5mol/L NaCl，0.1mol/LTris.Cl，pH8.0，250mmol/L咪唑，pH8.0)洗脫，收集樣品。先用平衡緩沖液透析洗脫樣品，然后用PBS緩沖液透析，再進行超濾濃縮。
純化結(jié)果如圖9a和圖9b所示，表明所得mTSA的純度在98％以上。圖9a中，泳道1為蛋白質(zhì)分子量標準，泳道2為純化的mTSA。
由軍事醫(yī)學科學院儀器測試分析中心采用Edman降解法對融合蛋白mTSA進行N端測序，結(jié)果如圖10所示，表明所表達蛋白中起始密碼子所編碼的甲硫氨酸被切割；在VCHSGY6個氨基酸中，除第2位氨基酸C因干擾需判讀外，其余5個氨基酸均可準確讀出。mTSB及mST的表達純化過程均與mTSA同，結(jié)果均達到95％以上。
實施例3、融合蛋白刺激脾細胞增殖試驗為比較linker長度及靶向分子的融合位置對SEA活性的影響，對各融合蛋白刺激脾細胞增殖的活性進行分析。取密度梯度離心分離所得的外周血單個核細胞(PBMCs)，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞濃度，以1×106個細胞/孔加到96孔板中，將50ng SEA(購自北京經(jīng)科生物技術(shù)公司)、rSEA、mTSA、mTSB或mST加到各孔中，分別以50μg BSA、PHA為陰性、陽性對照，每樣復(fù)3孔。按常規(guī)條件培養(yǎng)72小時后，加入20μl MTT液。繼續(xù)培養(yǎng)4小時，2000rpm離心10min收集細胞，加入DMSO 120μl，溶解15min后，在酶聯(lián)儀上以570nm測定各孔的吸光值。結(jié)果如圖11所示，表明mTSA的活性顯著高于mTSB的活性(P＜0.05)，這與融合蛋白的同源結(jié)構(gòu)模建結(jié)果一致。而mST的活性顯著低于mTSA的活性(P＜0.05)。
實施例4、mTSA融合蛋白與EGF受體特異性結(jié)合試驗A431細胞株表面有大量的EGF受體，適合利用細胞ELISA來檢測配體與受體的結(jié)合。Coligan等(1995)研究表明細胞ELISA對于相同類型細胞表面的抗原的檢測，其靈敏度可與流式細胞分析相媲美。試驗參照Coligan等(1995)(奧斯伯F，布倫特R，金斯頓RE等精編分子生物學實驗指南，北京科學出版社，1999)方法進行消化對數(shù)生長期的A431細胞，將細胞濃度調(diào)整至1×105個細胞/mL后，加入到96孔細胞板，每孔1×104個細胞培養(yǎng)過夜后，用PBS洗滌2次后，加入2％的中性福爾馬林固定10min，用PBS洗滌3次后，5％的BSA封閉60min，加入不同量的rSEA、BSA、mTSA(具體量如圖12)，37℃溫育60min。PBST洗滌3次后，加入抗6×His的一抗(小鼠IgG2a)(購自美國eBioscience公司)，37℃溫育60min，PBST洗滌3次后，加入HRP標記的羊抗鼠二抗(購自武漢博士德公司)，37℃溫育60min，加入顯色底物顯色5min，用2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，OD495測定光吸收。結(jié)果如圖12所示，表明以104個A431細胞包被細胞板能夠檢測出20ng的融合蛋白mTSA，mTSA與細胞的結(jié)合呈劑量依賴效應(yīng)。
為了更直觀反應(yīng)融合蛋白與EGFR的特異性結(jié)合，利用A431細胞進行細胞免疫化學實驗進一步驗證。消化傳代對數(shù)生長期的A431細胞，每一平皿放入1枚蓋玻片培養(yǎng)，待細胞密度適中后，取出蓋玻片，PBS沖洗，用2％中性福爾馬林固定10min。將切片置過氧化物酶滅活液中，滅活10min，傾去溶液；加入100μl正常羊血清封閉10min后，傾去溶液；加入100μl500ng/mL mTSA，37℃孵育1小時；用PBST洗3次，每次2min，加入抗6×His的一抗(小鼠IgG2a)，(購自美國eBioscience公司)，室溫孵育60min；用PBST洗3次，每次2min，加入HRP標記的兔抗鼠二抗100μl(購自武漢博士德公司)，室溫孵育10min后，用PBST洗3次，每次2min；加入過氧化物酶標記的鏈霉卵白素100μl，孵育10min，用PBST洗3次，每次2min；加入過氧化物酶的底物-色素混合液100μl，顯色5-10min后，用PBST清洗3次，每次2min。蘇木素復(fù)染細胞核后，脫水封片照相。結(jié)果如圖13所示，表明mTSA能夠與A431細胞結(jié)合(B)，這種結(jié)合能夠被EGF阻斷(C)。圖13中，A為陽性對照EGF與A431細胞結(jié)合結(jié)果，B為mTSA與A431細胞結(jié)合結(jié)果，C為mTSA與A431細胞的結(jié)合被EGF阻斷的結(jié)果，D為空白對照PBS與A431細胞的結(jié)合結(jié)果。用FITC-標記二抗代替HRP標記二抗，在激光共聚焦顯微鏡上進一步觀察mTSA與細胞的結(jié)合，結(jié)果如圖14所示，表明融合蛋白與細胞的結(jié)合主要發(fā)生在細胞膜上，但同時也發(fā)現(xiàn)mTSA還與細胞核膜結(jié)合，這是因為EGFR不僅在細胞膜，而且在細胞核膜也存在。以PBS代替一抗的陰性對照細胞沒有熒光的產(chǎn)生。
實施例5、mTSA融合蛋白的體外抑瘤試驗已有研究表明超抗原介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)包含了CTLs、NK以及細胞因子等的共同作用。為了反應(yīng)這種整體的抑瘤效應(yīng)，本試驗采用體內(nèi)激活的方式，具體方法如下將50μg SEA腹腔注射C57B1/6小鼠，24小時后按常規(guī)方法無菌取脾，制備單細胞懸液。將該細胞懸液置塑料培養(yǎng)皿培養(yǎng)過夜，除去黏附細胞。調(diào)整細胞濃度以7.5×105個細胞/孔濃度，加入到96孔板，每孔100μl，將100μl B16細胞以2.5×104個細胞/孔加入到96孔板，用RPMI1640培養(yǎng)基將rSEA、mTSA稀釋后，以不同量加入各孔。同時設(shè)置空白對照(僅加DMEM)、腫瘤對照(含與處理樣品等數(shù)量的B16細胞)及BSA陰性對照。37℃過夜培養(yǎng)后，用培養(yǎng)基洗細胞3次，加入20μl 5mg/ml的MTT液。繼續(xù)培養(yǎng)4小時，移去上清，加入DMSO120μl，溶解15min后，在酶聯(lián)儀上用空白對照調(diào)零，以570nm測定各孔的吸光值。腫瘤細胞生長抑制率的計算公式如下腫瘤細胞生長抑制率(％)＝100-(T/C)×100C腫瘤細胞對照組光吸收值T處理組光吸收值結(jié)果如圖15A所示，表明在效應(yīng)細胞/靶細胞比試驗中，當效/靶比在10-100范圍內(nèi)，mTSA與rSEA介導(dǎo)的細胞毒隨著比值的增大而增大，且兩者差異顯著，這種差異表明融合蛋白直接參與的CTL活性發(fā)揮了作用；但當效/靶比超過100時，兩者的差異逐漸下降，這可能是rSEA介導(dǎo)的NK細胞活性已與mTSA的細胞毒活性相當。
將效/靶比設(shè)為30，對融合蛋白的抑瘤活性進行測定，結(jié)果如圖15B和圖16所示，表明mTSA能夠有效地抑制A431及B16腫瘤細胞的生長，這種抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)。
A431腫瘤細胞是EGFR表達最高的腫瘤細胞系之一，然而融合蛋白對其抑制效率卻不及EGFR表達相對較低的B16黑色素瘤。這提示超抗原對腫瘤的抑制效率的高低不僅僅與EGFR表達程度的高低有關(guān)。有資料表明(Blankson JN，Moerse SS.The CD28/B7pathwaycostimulates the response of primary murine T cells to superantigens as well asto conventional antigens.Cellular immunology，1994，157306-312)超抗原激活T細胞的程度，與抗原遞呈細胞的共刺激分子是否參與相關(guān)。因此，mTSA與B16的結(jié)合可能有共刺激分子的參與，有利于T細胞的激活，從而表現(xiàn)出更好的抑瘤效應(yīng)。
實施例6、mTSA融合蛋白的體內(nèi)抑瘤試驗將傳代培養(yǎng)的B16細胞經(jīng)胰酶消化后，用含10％同種小鼠血清的1640稀釋至為1×107個細胞/mL，取C57BL/6小鼠50只，以0.2ml/只注射至小鼠腋窩皮下。接種次日，將小鼠隨機分為5個組1)6pmol mTSA，2)60pmol mTSA，3)600pmol mTSA，4)60pmolrSEA，5)生理鹽水陰性對照，每組10只；待腫瘤細胞長徑約0.5cm后，經(jīng)腹腔注射相應(yīng)量的pmTSA、rSEA及等體積的PBS，連續(xù)注射4天。10天后測量皮下腫瘤的大小，分別計算瘤重及抑瘤率，公式如下瘤重＝(A2×B)/2A腫瘤短徑(mm)；B腫瘤長徑(mm)腫瘤抑制率＝(C-T/C)×100C對照組平均瘤重；T給藥組平均瘤重結(jié)果如圖17所示，從停止治療后20天的結(jié)果來看，各劑量mTSA超抗原融合蛋白均能有效抑制腫瘤的生長，其中60pmol(1.6μg，中mTSA)的抑瘤效果最佳，其抑瘤率為66.50％；6pmol(低mTSA)、600pmol(高mTSA)的抑瘤效果次之，其抑瘤率分別58.50％和44.20％；而rSEA對照組抑瘤率僅有11.20％。這提示將TGFα3與SEA融合能有效地將后者靶向至EGFR高表達的腫瘤組織，并有效地抑制了腫瘤組織的生長。rSEA治療組治療停止后第10天的抑瘤率為53.5％，到第15天，其抑瘤率已降至4.7％。這表明rSEA對腫瘤生長的抑制作用較為短暫，分析原因可能rSEA治療時，rSEA分子由于缺乏靶向性，使免疫系統(tǒng)出現(xiàn)系統(tǒng)激活，大量激活的T細胞分化成CTLs，對抗原遞呈細胞產(chǎn)生殺傷作用。與此同時產(chǎn)生的細胞因子，如IFN-γ、IL-2等，IFN-γ能夠有效激活NK細胞活性，從而在NK細胞及細胞因子的作用下產(chǎn)生有效的抑瘤效果。但隨著T細胞、抗原遞呈細胞的凋亡，腫瘤細胞在缺乏有效免疫監(jiān)視的壓力下，又開始迅速生長。融合蛋白在治療停止后，其抑瘤率也有下降，中劑量mTSA組第10、15天的抑瘤率分別為84.1％及71％，但下降幅度比rSEA治療組明顯小。mTSA之所以能較長時期抑制腫瘤的生長首先在于它對免疫系統(tǒng)的激活主要局限在腫瘤組織，激活的CTLs直接殺傷遞呈融合蛋白的腫瘤細胞，所產(chǎn)生的各種抑瘤細胞因子也主要在腫瘤組織，因而避免了對正常細胞的副作用，并能不斷調(diào)動免疫系統(tǒng)長時期發(fā)揮作用；其次，融合蛋白激活CTL裂解腫瘤細胞，可能會增強機體針對腫瘤細胞的體液免疫。該結(jié)果表明超抗原的靶向修飾對于超抗原應(yīng)用于腫瘤的免疫治療非常重要。
融合蛋白治療在6-60pmol范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴的抑瘤效應(yīng)，但600pmol融合蛋白的抑瘤效果反而下降，該現(xiàn)象在預(yù)試驗中同樣也有所體現(xiàn)，這表明該劑量可能已超過融合蛋白應(yīng)用的治療窗口。
實施例7、腫瘤浸潤淋巴細胞的檢測抗原特異性的腫瘤浸潤淋巴細胞TIL在腫瘤組織的富集是惡性腫瘤治療療效判定的重要指標。已有研究資料表明CD4+、CD8+T細胞是發(fā)揮抑瘤效應(yīng)的主要細胞。為深入了解超抗原融合蛋白抑瘤機理，對mTSA能否將T細胞吸引到腫瘤組織進行了確證。將mTSA及rSEA分別注射C57BL/6荷瘤小鼠，24小時后引頸處死小鼠，取腫瘤組織制片，然后分別用大鼠抗小鼠的CD4、CD8抗體(購自eBioscience公司)進行免疫染色，所用方法基本同實施例4、mTSA融合蛋白與EGF受體特異性結(jié)合試驗中的免疫組織化學法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)mTSA治療組小鼠的腫瘤組織有大量的CD4、CD8陽性T細胞浸潤，而rSEA對照組則相對較少，尤其是CD4陽性T細胞(圖18a-圖18d)。這表明TGFα3能夠有效將融合蛋白靶向至腫瘤組織，激活淋巴細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，進而吸引更多的CD4+、CD8+T細胞，有效殺傷腫瘤細胞；rSEA則沒有該功能。
該結(jié)果同時也表明，抑瘤效應(yīng)不僅僅是CD8+T細胞的作用，CD4+T細胞的作用也非常重要。這一發(fā)現(xiàn)提示，在腫瘤的免疫治療中CD4+、CD8+T細胞的同時激活非常必要，而這正是超抗原應(yīng)用于腫瘤免疫治療的優(yōu)勢。
實施例8、mTSA融合蛋白治療對荷瘤小鼠生存率影響試驗治療劑量及步驟基本同mTSA體內(nèi)激活T細胞抑瘤實驗，當腫瘤長徑約1cm時，將高劑量16μg、中劑量1.6μg、低劑量0.16μg的mTSA及1.6μg rSEA、及100ng的環(huán)磷酰氨(CPA)和PBS分別注射C57BL/6荷瘤小鼠(帶有16黑色素瘤)，24天后處死所有小鼠，并對死亡小鼠進行統(tǒng)計分析，觀察其延長荷瘤小鼠的生存時間的效果。結(jié)果如圖19所示，表明融合蛋白mTSA能顯著延長荷瘤小鼠的生存時間，其中高劑量組(mTSA H)小鼠的24天存活率高達100％，中、低劑量(mTSA M、mTSA L)mTSA治療小鼠的24天存活率均為60％，對照組rSEA和環(huán)磷酰氨小鼠的存活率為40％，而PBS對照組小鼠的存活率僅有30％。這表明融合蛋白能顯著提高荷瘤小鼠的生存率。通過對各組死亡及存活小鼠的進行解剖，對融合蛋白延長荷瘤小鼠生存周期的原因進行初步分析。解剖結(jié)果表明，死亡小鼠除了在皮下有明顯實體腫瘤組織(圖20A)，腹腔均有明顯的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移(圖20B)，胸腔及肺均未見有腫瘤轉(zhuǎn)移(圖20C)，而存活小鼠則未見轉(zhuǎn)移的發(fā)生。傳統(tǒng)抗癌藥環(huán)磷酰氨是一種免疫抑制劑，盡管它能有效抑制腫瘤的生長，在瀕臨死亡小鼠其腫瘤體積最小，但這種抑瘤效應(yīng)并沒有提高小鼠的生存率；rSEA盡管能非特異性提高荷瘤小鼠的免疫力，但仍沒能提高小鼠生存時間。結(jié)合小鼠死亡原因，可以認為mTSA的治療之所以能提高小鼠的生存率，主要在于它能識別并結(jié)合已轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞，然后通過激活T細胞將腫瘤有效殺滅，抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移從而延長荷瘤小鼠的生存時間。這同時也提示融合蛋白在腫瘤微轉(zhuǎn)移的清除可能更具價值。
實施例9、mTSA免疫對腫瘤生長的影響1、小鼠的免疫及其對腫瘤侵襲的影響首先利用融合蛋白免疫小鼠以研究其對腫瘤侵襲的反應(yīng)。將待免疫蛋白rSEA、mTSA、EGF(購自eBioscience公司)分別與氫氧化鋁佐劑充分混勻，首次免疫14μg，2周后28μg加強免疫一次，第4周后28μg再加強一次。同時設(shè)PBS免疫的空白對照。第5周，采小鼠尾血，分離血清后凍存。在最后一次加強免疫10天后，將小鼠黑色素瘤經(jīng)小鼠尾靜脈注射，一月后引頸處死小鼠，取出肺。拍照后，用10％的中性福爾馬林固定，常規(guī)切片HE染色，對肺上的黑色組織類型進行確認。切片結(jié)果如圖21a和21b所示，表明上述黑色組織結(jié)構(gòu)致密且有明顯的黑色素沉淀的存在，而正常的肺組織則是疏松的肺泡組織，沒有黑色素的存在，這表明小鼠肺上的黑色組織應(yīng)是由從尾靜脈注射的黑色素瘤細胞而引起的。對小鼠肺腫瘤細胞轉(zhuǎn)移情況進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PBS對照組中，100％小鼠的肺有黑色素瘤的存在，而在rSEA免疫小鼠中，9個標本中6個有黑色素瘤，占66.7％；而在mTSA中，8個標本中3個有黑色素瘤，占37.5％(圖22a-22d)。統(tǒng)計結(jié)果表明，mTSA比rSEA能顯著提高免疫小鼠對腫瘤侵襲的抵抗力(P＜0.05，)，由于mTSA較rSEA多了一個TGFα3，因此這種保護作用與TGFα3密切相關(guān)。
2、mTSA免疫小鼠血清抗體的檢測為了分析mTSA的免疫原性，對免疫小鼠血清抗體進行檢測。分別以16μg rSEA及mTSA包被酶標板，結(jié)果如圖23a和圖23b所示，表明rSEA及mTSA免疫小鼠均產(chǎn)生了針對相應(yīng)蛋白的高效價抗體，其效價在2萬以上。
3、mTSA抗體對腫瘤體外生長的影響抗體效價測定結(jié)果表明融合蛋白mTSA具有較好的免疫原性，免疫小鼠確實能產(chǎn)生特異性的高效價抗體。基于mTSA免疫比rSEA免疫能顯著提高小鼠對腫瘤侵襲的抵抗力，進一步探討融合蛋白免疫血清對腫瘤體外生長的影響。將mTSA抗血清、rSEA抗血清、EGF抗血清、PBS免疫陰性血清分別與A431細胞共培養(yǎng)48小時后，利用MTT法對腫瘤細胞的生長情況進行檢測。結(jié)果如圖24a所示EGF抗體和mTSA抗體均對腫瘤細胞生長產(chǎn)生了抑制效應(yīng)；融合蛋白mTSA抗血清與PBS對照在1∶40便有顯著性差異(P＜0.05)，EGF抗血清在1∶80有顯著性差異(P＜0.05)；而rSEA對腫瘤細胞生長的抑制效應(yīng)不明顯(P＞0.05)。由于抗rSEA血清對腫瘤生長沒有顯著抑制作用，這說明融合蛋白抗血清中含有針對TGFα3的抗體，該抗體能直接抑制腫瘤生長。
本實施例的動物實驗結(jié)果顯示，33.3％的rSEA免疫小鼠能夠抵抗腫瘤細胞的侵襲，這表明將rSEA免疫動物仍能引起對免疫系統(tǒng)的激活。但這種非特異性激活可能并非是融合蛋白發(fā)揮抑瘤效應(yīng)的全部因素，因為同樣具有超抗原活性，但mTSA卻能使62.5％的免疫小鼠能夠抵抗腫瘤細胞的侵襲，這表明將TGFα3與rSEA融合后免疫能夠顯著提高小鼠對腫瘤侵襲的保護效果。隨后的抗體效價測定表明mTSA免疫小鼠產(chǎn)生了高效價的抗體，將該抗體與腫瘤細胞共培養(yǎng)能抑制腫瘤生長，而抗rSEA的抗體則沒有該效應(yīng)。這表明將融合蛋白免疫小鼠產(chǎn)生了針對TGFα3的抗體，該抗體能抑制腫瘤生長。
利用DNAssist(1.0)軟件對mTSA的抗原性進行分析，結(jié)果如圖24b所示，表明TGFα3(mTSA中2-18位氨基酸)線性結(jié)構(gòu)具有較強抗原性，尤其是12-18位氨基酸，而且由于該小肽的高級結(jié)構(gòu)是一環(huán)肽，其構(gòu)象相對復(fù)雜，因而抗原性可能會更強。將SEA與TGFα3融合完全能夠突破免疫耐受，產(chǎn)生抗TGFα3抗體。由于TGFα3是TGFα與EGFR結(jié)合的結(jié)合位點，那針對TGFα3抗體就能阻斷TGFα與EGFR的結(jié)合，進而干擾EGFR高表達腫瘤細胞生長所需的自分泌循環(huán)過程，抑制腫瘤生長。這就很好地解釋了融合蛋白免疫為什么能增強小鼠對腫瘤侵襲的抵抗力。表明本發(fā)明的融合蛋白是一個較好的疫苗藥物。
序列表<160>8<210>1<211>242<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys1 5 10 15Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr20 25 30Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe35 40 45Leu Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp50 55 60Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys65 70 75 80Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln85 90 95Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val100 105 110Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile115 120 125Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val130 135 140Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala145 150 155 160Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe165 170 175Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu180 185 190Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn195 200 205
Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn210 215 220Met His Ile Asp lle Tyr Leu Tyr Thr Ser Leu Glu His His His His225 230 235 240His His<210>2<211>804<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>2atggtatgcc actctggtta cgttggcgca cgttgtgaac acgctgacct gctcggtggt 60tctggatccg gtggtggtag cgagaaaagc gaagaaataa atgaaaaaga tttgcgaaaa120aagtctgaat tgcagggaac agctttaggc aatcttaaac aaatctatta ttacaatgaa180aaagctaaaa ctgaaaataa agagagtcac gatcaatttt tacagcatac tatattgttt240aaaggctttt ttacagatca ttcgtggtat aacgatttat tagtagattt tgattcaaag300gatattgttg ataaatataa agggaaaaaa gtagacttgt atggtgctta ttatggttat360caatgtgcgg gtggtacacc aaacaaaaca gcttgtatgt atggtggtgt aacgttacat420gataataatc gattgaccga agagaaaaaa gtgccgatca atttatggct agacggtaaa480caaaatacag tacctttgga aacggttaaa acgaataaga aaaatgtaac tgttcaggag540ttggatcttc aagcaagacg ttatttacag gaaaaatata atttatataa ctctgatgtt600tttgatggga aggttcagag gggattaatc gtgtttcata cttctacaga accttcggtt660aattacgatt tatttggtgc tcaaggacag tattcaaata cactattaag aatatataga720gataataaaa cgattaactc tgaaaacatg catattgata tatatttata tacaagtctc780gagcaccacc accaccacca ctga 804<210>3<211>267<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
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Met Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp1 5 10 15Leu Leu Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Lys Ser Glu Glu20 25 30Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala35 40 45Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr50 55 60Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile Leu Phe65 70 75 80Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp85 90 95Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp100 105 110Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn115 120 125Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg130 135 140Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys145 150 155 160Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val165 170 175Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys180 185 190Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly195 200 205Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tvr Asp Leu210 215 220Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg225 230 235 240Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp Ile Tyr Leu245 250 255Tyr Thr Ser Leu Glu His His His His His His260 265<210>4<211>795<212>DNA
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65 70 75 80Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser85 90 95Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly100 105 110Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala115 120 125Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu130 135 140Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr145 150 155 160Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln165 170 175Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu180 185 190Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val195 200 205Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala210 215 220Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys225 230 235 240Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser245 250 255Leu Glu His His His His His His260<210>6<211>804<212>DNA<213>人工序列<220>
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acaccaaaca aaacagcttg tatgtatggt ggtgtaacgt tacatgataa taatcgattg360accgaagaga aaaaagtgcc gatcaattta tggctagacg gtaaacaaaa tacagtacct420ttggaaacgg ttaaaacgaa taagaaaaat gtaactgttc aggagttgga tcttcaagca480agacgttatt tacaggaaaa atataattta tataactctg atgtttttga tgggaaggtt540cagaggggat taatcgtgtt tcatacttct acagaacctt cggttaatta cgatttattt600ggtgctcaag gacagtattc aaatacacta ttaagaatat atagagataa taaaacgatt660aactctgaaa acatgcatat tgatatatat ttatatacaa gtggtggttc tggatccggt720ggtggtgtat gccactctgg ttacgttggc gcacgttgtg aacacgctga cctgctcctc780gagcaccacc accaccacca ctga 804<210>7<211>267<212>PRT<213>人工序列<220>
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<400>7Met Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys1 5 10 15Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr20 25 30Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe35 40 45Leu Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp50 55 60Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys65 70 75 80Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln85 90 95Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val100 105 110Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile115 120 125Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val130 135 140Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala145 150 155 160
Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe165 170 175Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu180 185 190Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn195 200 205Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn210 215 220Met His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly225 230 235 240Gly Gly Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala245 250 255Asp Leu Leu Leu Glu His His His His His His260 265<210>8<211>729<212>DNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤融合蛋白，它包括超抗原和可以與腫瘤細胞上受體結(jié)合的細胞因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述超抗原為金黃色葡萄球菌腸毒素、鏈球菌熱源外毒素A1-A4、鏈球菌分裂原性外毒素以及鏈球菌超抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述金黃色葡萄球菌腸毒素為金黃色葡萄球菌腸毒素A、金黃色葡萄球菌腸毒素B、金黃色葡萄球菌腸毒素C1、金黃色葡萄球菌腸毒素C2、金黃色葡萄球菌腸毒素C3或毒性休克綜合癥毒素-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于所述金黃色葡萄球菌腸毒素A的自N端的227位氨基酸殘基由天冬氨酸突變?yōu)楸彼帷?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述細胞因子為轉(zhuǎn)化生長因子α、表皮生長因子及Heregulin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述細胞因子為轉(zhuǎn)化生長因子α的第三環(huán)區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白還包括具有5-8個氨基酸殘基的連接肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述抗腫瘤融合蛋白選自下述蛋白質(zhì)家族中的任意一種1)具有序列表中SEQ ID №3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者將SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №3的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №3衍生的蛋白質(zhì)；2)具有序列表中SEQ ID №5氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者將SEQ ID №5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №5的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №5衍生的蛋白質(zhì)；3)具有序列表中SEQ ID №7氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者將SEQ ID №7的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №7的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №7衍生的蛋白質(zhì)。
9.一種抗腫瘤融合蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID №2或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(2)序列表中的SEQ ID №4或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(3)序列表中的SEQ ID №6或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
10.以權(quán)利要求1所述抗腫瘤融合蛋白為活性成分的抗腫瘤疫苗藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，其目的是提供一種抗腫瘤融合蛋白及其編碼基因與以該抗腫瘤融合蛋白為活性成分的藥物。本發(fā)明所提供的抗腫瘤融合蛋白包括超抗原和可以與腫瘤細胞上受體結(jié)合的細胞因子。本發(fā)明的抗腫瘤融合蛋白具有超抗原靶向藥物和TGFα疫苗的雙重功效，將在腫瘤的預(yù)防和治療中發(fā)揮重要的作用，并為根本解決融合毒素靶向治療中因免疫中和而失效的問題，提供了一種新模式。
文檔編號A61K39/395GK1718730SQ20041006273
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月8日
發(fā)明者胥全彬, 劉傳暄, 馬清鈞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所