專利名稱：一種具有抗腫瘤活性的三螺旋香菇多糖及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性得三螺旋香菇多糖及其制備方法和用途。它屬于高分子物理領域，也屬于生物學領域。
背景技術：
60年代初，Chihara發(fā)現從香菇子實體中提取出的多糖具有抗腫瘤活性(Nature，1969，222，687；1970，225，943；Cancer Res.，1970，30，2776.)，此后多糖研究受到極大重視。80年代以來的研究表明，真菌多糖是一種免疫調節(jié)劑，它能夠增強巨噬細胞和白細胞的吞噬功能，誘導產生腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞素，從而提高人體的免疫機能，對多種危害人類健康的疾病，如免疫紊亂、癌癥、糖尿病、高血壓、肝炎、肺炎等都具有一定的療效，而且對正常細胞沒有毒副作用(Intern.J.Orient.Med.17，57，1992)。香菇屬于真菌，是我國的特產資源，長期用于中藥配方，在傳統(tǒng)醫(yī)學上被用作靈丹妙藥。但將香菇子實體直接用做中藥，療效受到制約。因為香菇中含有多種多糖，包括雜多糖、α-葡聚糖、β-葡聚糖，而且隨提取條件而變化，部分多糖是不能靠普通中藥的煎熬方法提取出來。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤活性的三螺旋香菇多糖及其制備方法和用途，所制得的三螺旋香菇多糖具有較高的抗腫瘤活性，且制備方法簡單易行、成本較低廉。
為實現上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案如下一種具有抗腫瘤活性的三螺旋香菇多糖，主鏈為β-(1→3)-D-葡聚糖，含20～30％(1→6)鍵接的葡萄糖側基，它在水溶液中呈三螺旋鏈構象，其持續(xù)長度q為80～120nm；單位圍長摩爾質量ML為2000～2300nm-1；螺距h為0.30～0.32nm；均方根旋轉半徑<s2>z1/2與重均分子量Mw之間的依賴關系<s2>z1/2＝KMwα方程中的指數α為0.8～1；重均分子量為20萬～200萬。
在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，上述三螺旋香菇多糖，還含有0～20％結合蛋白質。
本發(fā)明還提供了上述三螺旋香菇多糖的制備方法，將干燥的香菇子實體(Lentinusedodes)剪碎，依次用乙酸乙酯、丙酮進行索氏提取去除脂肪，然后浸泡在生理鹽水中，離心；殘渣在100～130℃下提取，離心，收集殘渣；殘渣用0.3～6wt％NaOH/0.01～0.05wt％NaBH4的水溶液在常溫下提取，離心得提取液；于提取液中加入醋酸中和至pH6～8，收集上清液；上清液用H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質；然后分別用清水和二次蒸餾水透析，濃縮，冷凍干燥得三螺旋香菇多糖。
本發(fā)明利用生物技術，從不同菌種培養(yǎng)得到的香菇子實體中提取分離出具有明顯抗腫瘤活性和免疫機能的香菇三螺旋多糖，同時弄清楚它的一級和二級結構及其與抗腫瘤等生物活性之間的關系。所用方法簡單易行、成本較低廉。本發(fā)明利用高分子物理理論和方法研究香菇三螺旋多糖在溶液中的鏈構象；所制得的三螺旋香菇多糖具有較高的抗腫瘤活性，可用于制備提高免疫機能和抗腫瘤的藥物或保健品。
由對植入Sarcoma 180腫瘤的小鼠進行體內腹腔注射實驗的生物活性結果表明，本發(fā)明香菇三螺旋多糖對腫瘤細胞有明顯的抑制作用，甚至超過化學藥物5-Fu的效果(50％)。當三螺旋鏈被破壞以后，它基本不顯示抗腫瘤活性，表明鏈剛性在抗腫瘤活性中起了很重要的作用。尤其，適量結合蛋白質存在三螺旋多糖中有利于抗腫瘤活性提高。體外胃癌細胞和宮頸癌細胞Hela的生長和增殖的試驗結果表明香菇多糖對腫瘤細胞有選擇性，即對胃癌細胞有顯著抑制作用，而對Hela細胞基本無抑制作用。同時對香菇三螺旋多進行人體急性白血病毒細胞(HL-60)和人體乳腺癌細胞(MCF-7)的抗增殖實驗結果表明其對增殖有顯著的抑制效果，而不會破壞正常猴腎細胞的增殖。
具體實施例方式
以下結合具體的實例對本發(fā)明的技術方案作進一步說明實施例1購買市售的湖北隨州產香菇子實體，將香菇子實體碎片依次用乙酸乙酯、丙酮進行索氏提取各8小時。然后用0.9％NaCl水溶液在室溫下提取三次浸泡在0.9％NaCl水溶液中過夜，離心，收集殘渣。殘渣用熱水(100℃)提取三次，每次半小時，離心，收集殘渣；殘渣依次用0.4％NaOH/0.02％NaBH4，0.8％NaOH/0.02％NaBH4和5％NaOH/0.05％NaBH4水溶液于室溫下提取一次，離心，收集上清液。用1M HOAc水溶液于室溫下中和至pH＝7，離心，收集上清液。上清液濃縮后，均用30％H2O2脫色至淺黃色，用Sevag法除去游離的蛋白質，反復進行9次以上。然后，分別用清水和二次蒸餾水經再生纖維素膜透析5天和3天，濃縮，最后冷凍干燥得三螺旋多糖純品(L-FV-IB)。用粘度計、光散射及其與尺寸排除色譜聯用儀檢測各多糖試樣的特性粘數、重均分子量和均方旋轉半徑，按照高分子溶液理論和方法及計算機模擬，計算出表征高分子在溶液中鏈的分子參數。由此得出香菇多糖在水溶液中呈現三螺旋鏈構象，而在DMSO中呈單股線團鏈。另外將香菇多糖溶于DMSO中，使其三螺旋鏈破壞成單鏈，再加入沉淀劑丙酮使產物沉淀分離出，然后用丙酮充分洗滌除去DMSO、真空干燥得到單鏈香菇多糖。將多糖L-FV-IB溶解于水中，經超聲波降解成不同分<p>3.實驗方法1)將熏香放置在房間中間，以其為圓心，分別在50cm、100cm、150cm半徑上分別選擇3點(A、B、C)，在選定的各點處分別放置盛有細菌和霉菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿各2個。
2)在點燃熏香之前，將培養(yǎng)皿蓋打開，放置30分鐘，然后將培養(yǎng)皿蓋蓋好，移開。作為對照。
3)點燃熏香3支，直至其燃盡，為第一次處理。而后，在上述選定的各點處分別放置盛有細菌培養(yǎng)基和霉菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿各2個，打開培養(yǎng)皿蓋，放置30分鐘，然后，將培養(yǎng)皿蓋蓋好，移開。
4)再點燃1次熏香(3支)，重復4的步驟，為第二次處理，直至試驗完成。
5)將上述盛有細菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿置于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時，計數每個培養(yǎng)皿中的菌落總數。將上述盛有霉菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿置于25～28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后開始觀察，共培養(yǎng)觀察5天。計數每個培養(yǎng)皿中的菌落總數。
4.實驗結果計算方法殺菌率(％)＝(對照菌落數-處理后菌落數)×100/對照菌落數結果見表4、表5，表4熏香對空氣中細菌的抑制效果
(注第一次處理熏香的使用量為3根，第二次處理熏香的使用量為6根。)表5熏香對空氣中霉菌的抑制效果
附表2.市售湖北遂州產香菇子實體三螺旋多糖抗BALB/c小鼠體內Sarcoma 180腫瘤的活性試驗結果。
注具有三螺旋鏈的香菇β-葡聚糖當分子量相對低時如L-FVIB31，它顯示明顯抗S-180腫瘤活性。但當三螺旋破壞成單股鏈后其抗腫瘤活性基本消失，如L-FV-IB21D和L-FV-IB31D。
顯然，該多糖對植入BALB/c小鼠體內的Sarcoma 180腫瘤抑制率具有分子量和劑量依賴性。高劑量時顯示較高抗腫瘤活性，分子量為14.9×105的級分L-FV-IB31對S-180腫瘤細胞顯示出高達49.5％的抑制率，接近5-Fu的值(50％)，且與對照組差別非常顯著。而三螺旋被破壞成單股鏈后，其抗腫瘤活性基本消失，如試樣L-FV-IB21D和L-FV-IB31D。體外活性實驗也表明，香菇子實體多糖對Sarcoma 180腫瘤細胞的增殖有顯著的抑制效果，而且具有劑量和分子量依賴性(附表3)。分子量相對小的湖北遂州產香菇多糖試樣對S-180腫瘤細胞和胃癌細胞的抑制作用相對較高，而分子量為5.71×1050的級分L-FV-IB52表現出對S-180腫瘤細胞和胃癌細胞最強的抑制作用，其抑制率分別高達45.3％和56.2％。同時該多糖對抗腫瘤細胞還具有選擇性，如它對宮頸癌細胞Hela的生長和增殖無明顯的抑制作用。
附表3.不同分子量的湖北遂州產香菇子實體三螺旋多糖F-LV-IB的體外抗S-180腫瘤活性。
實施例2所用香菇子實體由華中農業(yè)大學真菌研究室用其研制的4種編碼為No.2，No.36，No.39和No.50的雜交菌種培養(yǎng)得到并公開對外出售(公眾能買到)。分別將4種香菇子實體碎片依次用乙酸乙酯、丙酮進行索氏提取各8小時。然后用0.9％NaCl水溶液在室溫下提取三次浸泡在0.9％NaCl水溶液中過夜，離心，收集殘渣。殘渣用在高壓鍋中熱水(120℃)提取三次，每次半小時，離心，收集殘渣；殘渣用5％NaOH/0.05％NaBH4水溶液于室溫下提取一次，離心，收集上清液。用36％HOAc水溶液于室溫下中和至pH6-8，離心，收集上清液。上清液濃縮后，用30％H2O2脫色至淺黃色，用Sevag法除去游離的蛋白質，反復進行9次以上。然后，分別用清水和二次蒸餾水透析5天和3天，濃縮，最后冷凍干燥得三螺旋多糖純品，依次命名為L-I1，L-I2，L-I3，L-L4.其中含結合蛋白質分別為5.8％，5.5％，5.2％，15.2％。將其中的結合蛋白脫去以后的多糖分別標記為LNP-I1，LNP-I2，LNP-I3，LNP-I4。
多糖構象表征方法同實施例1。4種三螺旋香菇多糖在水溶液中的特性粘數和重均分子量詳見附表4。不同菌種的香菇子實體中的三螺旋香菇多糖的分子量不同，但其在水溶液和DMSO中的比值為3，<s2>z1/2＝K Mwα方程中的指數α為0.8-0.91；而且由高分子溶液理論計算得到其構象參數為持續(xù)長度q＝85nm；單位圍長摩爾質量ML＝2300nm-1；螺距h＝0.315nm。表明4種不同菌種的香菇子實體多糖在水溶液中均呈現三螺旋鏈構象，而在DMSO中均呈現單股無規(guī)線團構象。與實施例1相比，由雜交菌種培養(yǎng)的香菇子實體中提取分離出的三螺旋多糖的分子量更高。
4種雜交菌多糖試樣對植入BALB/c小鼠體內的Sarcoma 180腫瘤抑制率的結果見附表4。顯然，本發(fā)明得到的三螺旋多糖表現出較高的抗腫瘤活性，尤其是L-I1，L-I2和L-I3表現出更高的抗腫瘤活性，抑制率甚至高達70％，遠遠超過5-Fu的抑制率(50％)，而且具有劑量依賴性。除去結合蛋白后的三螺旋香菇多糖LNP-I1，LNP-I2，LNP-I3，LNP-I4的活性明顯降低；當其三螺旋鏈受到破壞后，抗腫瘤活性基本消失(未示出)，表明適量蛋白質和三螺旋結構對其抗腫瘤活性有重要影響。4種多糖L-I1，L-I2，L-I3，L-I4對人體急性白血病毒細胞(HL-60)和人體乳腺癌細胞(MCF-7)的增殖也有顯著的抑制效果，而不會破壞正常猴腎細胞的增殖，表明其不具有毒性。比較附表2和5可知，由雜交菌種培養(yǎng)得到的香菇子實體螺旋多糖比市售的湖北隨州產香菇子實體三螺旋香菇多糖顯示更高的生物活性。因此，三螺旋香菇多糖可用于制備抗腫瘤藥物和提高機體免疫功能的保健品，具有極大的推廣和應用前景。
附表4.雜交菌種香菇子實體三螺旋多糖在0.9％NaCl水溶液中25℃時的特性粘數、重均分子量，及其抗BALB/c小鼠體內抗S-180腫瘤活性。
試樣特性粘數重均分子分子鏈劑量 抑制率， 體重增長率，(毫升/克) 量×10-5股數 (毫克/千克×天)(％) (％)L-I1105014.42.920×7 12.1 55.060×7 47.8 29.1L-I2112316.43.120×7 25.9 41.330×7 40.7 34.760×7 54.5 31.4L-I3116216.52.920×7 70.0 27.430×7 63.0 37.160×7 50.0 42.7L-I4125017.73.220×7 20.3 33.330×7 31.8 46.160×7 37.1 45.05-氟脲 20×7 48.6 39.1嘧啶空白對 44.2照組
權利要求
1.一種具有抗腫瘤活性的三螺旋香菇多糖，主鏈為β-(1→3)-D-葡聚糖，含20～30％(1→6)鍵接的葡萄糖側基，它在水溶液中呈三螺旋鏈構象，其持續(xù)長度q為80～120nm；單位圍長摩爾質量ML為2000～2300nm-1；螺距h為0.30±0.32nm；重均分子量為20萬～200萬。
2.根據權利要求1所述的三螺旋香菇多糖，其特征在于含有0～20％的結合蛋白質。
3.權利要求1所述三螺旋香菇多糖的制備方法，其特征在于將干燥的香菇子實體剪碎，依次用乙酸乙酯、丙酮進行索氏提取去除脂肪，然后浸泡在生理鹽水中，離心；殘渣在100～130℃下提取，離心，收集殘渣；殘渣用0.3～6wt％NaOH/0.01～0.05wt％NaBH4的水溶液在室溫下提取，離心得提取液；于提取液中加入醋酸中和至pH6～8，收集上清液；上清液用H2O2脫色，Sevag法除去游離的蛋白質后，分別用清水和二次蒸餾水透析，濃縮，冷凍干燥得到三螺旋香菇多糖。
4.權利要求1所述的三螺旋香菇多糖在制備抗腫瘤或提高免疫機能的藥物或保健品中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種三螺旋香菇多糖，主鏈為β－(1→3)－D－葡聚糖，含20－30％(1→6)鍵接的葡萄糖側基，它在水中呈三螺旋鏈，重均分子量為20－200萬。其制法是，將干燥的香菇子實體剪碎，依次用索氏提取去除脂肪，然后浸泡在生理鹽水中，離心；殘渣在100－130℃下提取，離心；殘渣用NaOH/NaBH
文檔編號A61K31/716GK1613876SQ200410060850
公開日2005年5月11日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權日2004年9月14日
發(fā)明者張俐娜, 許小娟, 俄尼爾, 李雪蓮 申請人:武漢大學