專利名稱：用乙肝病毒核心蛋白增強基因槍接種HBs DNA疫苗誘生免疫應(yīng)答的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及乙肝病毒核心蛋白增強基因槍接種HBs DNA疫苗誘生的Th1型免疫應(yīng)答的方法，及其用途。
背景技術(shù)：
DNA疫苗(DNA vaccine)因可克服傳統(tǒng)疫苗的缺陷、同時誘發(fā)機體產(chǎn)生細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，并具有制備簡單、穩(wěn)定等優(yōu)點，被認(rèn)為是未來疫苗發(fā)展的一個新方向，而近幾年興起的基因槍接種DNA疫苗因具有只需微量的質(zhì)粒DNA就能誘發(fā)很強免疫反應(yīng)等特點在人體免疫中具有極大的應(yīng)用前景(Kaiserlian D etal.Eur J Dermatol 1999，9169-76；Stringl G et al.Immunol ser 1989，463-72；Chen D et al.Expert Rev Vaccines 2002，1265-76；Fynan EF et al.Proc Natl Acad Sci USA 1993，9011478-82)。然而研究顯示，與注射器肌注或皮內(nèi)注射主要誘生Th1型免疫應(yīng)答相比，基因槍接種DNA疫苗所誘生的免疫應(yīng)答以Th2型為主，迄今，其機制的差異尚不清楚(Pertmer TM et al.J Virol 1996，706119-25；Feltquate DM et al.J Immunol 1997，1582278-84；Cardoso AIet al.J Virol 1998，722516-8；Schirmbeck R et al.Intervirology2001，44115-23；Reimann J et al.Dev Biol(Basel)2000，10415-24；Schirmbeck R et al.Biol Chem 2001，382543-52；Tanghe A et al.Infect Immun2000，683854-60)。鑒于Th1型免疫應(yīng)答在清除病毒持續(xù)性感染、抗胞內(nèi)菌感染和抗腫瘤免疫中的重要作用，了解基因槍和注射器接種DNA疫苗誘生不同類型免疫應(yīng)答的分子機制以及尋找增強基因槍接種DNA疫苗誘生Th1型免疫應(yīng)答的佐劑策略，已成為國內(nèi)外眾多學(xué)者關(guān)注的焦點。
袁正宏等(中國專利申請?zhí)?3142099.0)曾報道在基因槍接種質(zhì)粒HBsAg DNA疫苗的同時共導(dǎo)入一定比例的合成的寡核苷酸CpG DNA作為佐劑(質(zhì)粒DNA∶CpGDNA為10∶1)增強抗原特異的Th1型免疫應(yīng)答的策略。HBcAg是乙型肝炎病毒的衣殼蛋白，其組裝的顆粒大小為28nm。研究表明，HBcAg是迄今唯一能在小鼠模型中以基因槍接種DNA疫苗方式誘生Th1型免疫應(yīng)答的抗原，其它抗原以及與HBcAg擁有大部分相同氨基酸(＞70％)的HBeAg以及HBcAg截短體(1~144aa、1~149aa)都只能誘生Th2型免疫應(yīng)答(Riedl P et al.J Immunol2002，1684951-9；Milich DR et al.J Virol 1997，712192-201)。根據(jù)Riedl等(J Immunol 2002，1684951-9)的研究，HBcAg誘生針對本身的Th1型免疫應(yīng)答與它的C末端34個氨基酸結(jié)合RNA的性能有關(guān)，因不含RNA結(jié)合區(qū)的HBcAg的1～144或1～149aa截短體因失去了結(jié)合RNA的能力而不能誘生Th1型免疫反應(yīng)。由此推測，HBcAg結(jié)合的RNA可能起到了一種促進針對HBcAg本身Th1型免疫應(yīng)答的“內(nèi)在佐劑效應(yīng)”。目前尚不清楚具有結(jié)合RNA、誘生Th1型免疫應(yīng)答能力的HBcAg可否作為其他抗原的佐劑而廣泛使用。
近年已有大量研究證據(jù)提示RNA可作為病原體相關(guān)分子模式被機體免疫系統(tǒng)識別。雙鏈RNA(dsRNA)已知可以在細(xì)胞內(nèi)激活PKR、2’-5’OAS及RNase H等通路，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)也能被TLR3識別激活NF-κB(Alexopoulou L et al.Nature 2001，413732-8)。最近，單鏈RNA(ssRNA)被確認(rèn)為是一種新的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，其相應(yīng)的受體也已經(jīng)明確。Scheel等(Eur J Immunol 2004，34537-47)根據(jù)接種mRNA疫苗不需另加佐劑就能有效誘生免疫應(yīng)答的現(xiàn)象推測單鏈RNA本身是一種刺激免疫系統(tǒng)的危險信號。該作者使用了兩種方式保護RNA免受細(xì)胞外核酸酶的降解一種是將RNA和陽離子蛋白質(zhì)結(jié)合稱為反式保護(Trans-protection)，另一種是對RNA的磷酸二酯鍵骨架進行化學(xué)修飾(硫代RNA)稱為順式保護(Cis-protection)。這兩種方式均能使ssRNA以一種與序列無關(guān)的方式誘導(dǎo)小鼠DC的成熟。裸RNA則幾乎沒有作用，可能是因為它加入細(xì)胞培養(yǎng)液后即被降解。因此他們認(rèn)為順式和反式穩(wěn)定的ssRNA是一種新的PAMP。Heil等(Science 2004，3031526-9)、Diebold等(Science 2004，3031529-31)以及Lund等(Proc Natl Acad Sci U S A.2004，1015598-603)的研究不僅進一步證實了ssRNA可以作為一種PAMP，而且明確了其識別受體是TLR7(鼠)、TLR8(人)。他們還發(fā)現(xiàn)TLR7、TLR8對單鏈RNA的識別需要內(nèi)吞和內(nèi)體/溶酶體酸化的過程。保護ssRNA不被降解以及促進其進入相應(yīng)細(xì)胞的內(nèi)體/溶酶體是其發(fā)揮PAMP作用的先決條件。
根據(jù)目前對HBcAg的認(rèn)識，它是一種理想的RNA載體。HBcAg不僅具專門有結(jié)合RNA的區(qū)域(C末端34個氨基酸)，而且本身能組裝成顆粒，RNA進入顆粒內(nèi)部后能有效防止降解，故可作為RNA佐劑有力的載體。理論推測，表達HBVcore基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)表達HBcAg時可非特異性的結(jié)合部分宿主細(xì)胞的ssRNA。結(jié)合RNA的HBcAg從細(xì)胞釋放后可通過內(nèi)吞或胞飲作用重新進入抗原提呈細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過晚期內(nèi)吞體和早期溶酶體的作用--破壞顆粒和降解core蛋白，釋放出ssRNA而激活TLR7/TLR8的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，從而營造一個誘生Th1型免疫應(yīng)答的微環(huán)境。已有實驗表明，少量的RNA結(jié)合到HBcAg即足以發(fā)揮作用(Riedl P et al.J Immunol 2002，1684951-9)。
目前尚無應(yīng)用HBc增強基因槍接種HBs DNA疫苗誘生Th1免疫應(yīng)答的研究報道，也無與本策略相似的發(fā)明專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能增強基因槍接種DNA疫苗誘生的Th1免疫應(yīng)答的新型佐劑策略，即以共導(dǎo)入或共表達HBV Core基因作為佐劑增強基因槍接種HBsDNA疫苗誘生的Th1型免疫應(yīng)答，及其實際用途。
本發(fā)明根據(jù)對已有技術(shù)的分析，推測在基因槍接種HBs DNA疫苗的同時共導(dǎo)入或共表達HBV core基因，可通過營造誘生Th1型免疫應(yīng)答的微環(huán)境，誘生針對HBsAg的Th1免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的技術(shù)方案是基因槍接種HBsAg DNA疫苗的同時共導(dǎo)入/共表達HBVcore基因作為佐劑，利用HBcAg結(jié)合RNA的特性來促進基因槍接種所誘生的HBsAg特異性Th2型免疫應(yīng)答向Th1型轉(zhuǎn)化。將HBsAg與HBcAg基因構(gòu)建于同一個真核表達載體上包裹于金顆粒表面，或HBsAg DNA與HBcAg DNA共同包裹于金顆粒表面，利用高壓惰性氣體的轟擊，將其直接導(dǎo)入表皮層細(xì)胞內(nèi)。為評價該佐劑策略的效果，本發(fā)明在小鼠體內(nèi)免疫實驗評價了加用HBV core基因佐劑后的特異性的體液免疫(檢測血清中抗HBcAg、抗HBsAg的抗體)和細(xì)胞免疫(HBsAg特異性的IFN-γ分泌能力和CTL活性)。此外HBcAg本身也可以誘生特異性免疫，因此本發(fā)明也可作為針對HBV的一種多價DNA疫苗(HBsAg+HBcAg)免疫策略，可有助于清除HBV的持續(xù)性感染。
本發(fā)明方法包括如下步驟DNA疫苗載體的構(gòu)建首先構(gòu)建pIRES/S，由EcoR I從質(zhì)粒pYQF-2CpG/S酶切獲得HBV S基因。同時對載體pIRES用EcoR I進行酶切，然后進行1％瓊脂糖凝膠電泳。膠回收純化載體與片段。純化后的pIRES載體用小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化處理，酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提一次后乙醇洗滌、ddH20溶解。pIRES載體和HBV S基因片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接。轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞。LB平板(氨芐抗性篩選)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時。挑取單菌落接種到2mlLB培養(yǎng)液中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)(250rpm)16小時。堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA。重組子用XbalI酶切鑒定插入方向，在酶切鑒定的基礎(chǔ)上再進行測序確認(rèn)。進一步構(gòu)建pIRES/Core、pIRES/C149、pIRES/S/Core和pIRES/S/C149。以PCR方法從含adr亞型HBV基因組的質(zhì)粒p3.8中擴增HBV Core全長基因(1-183aa)與C149基因(1-149aa)。PCR引物序列為，擴增Core基因正引物(引入Sal I酶切位點5’-GCCCGTCGACATGGACATTGACCCTTATAA-3’；負(fù)引物(引入NotI切點)5-CTTAGACTGCGGCCGCGAATACTAACATTGAG-3’。
擴增C149基因正引物同core基因正引物。
負(fù)引物(引入Not I切點)5’-GACTGCGGCCGCTCAAACAACAGTAGTTTCCG-3’。
以ExTaq酶(Takara公司)進行擴增，PCR產(chǎn)物與載體pIRES或pIRES/S均用雙酶切，然后進行1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收純化載體與片段。PCR DNA片段和載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接。轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞。LB平板(氨芐抗性篩選)。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時，篩選轉(zhuǎn)化子。挑取單菌落接種到2ml LB培養(yǎng)液中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)(250rpm)16小時。堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA。重組子用SalI和NotI雙酶切鑒定。在酶切鑒定的基礎(chǔ)上再進行測序確認(rèn)。所構(gòu)建重組質(zhì)粒用Qiagen Plasmid Maxi Kit大量制備、純化，溶于三蒸水或生理鹽水，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> HBsAg重組質(zhì)粒的真核表達檢測HBsAg重組質(zhì)粒以常規(guī)磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，-20℃保存，一并用ELISA方法檢測上清中HBsAg的濃度。采用上海市傳染病醫(yī)院HBsAg檢測試劑盒測定HepG2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染上清中HBsAg的濃度。每孔加待測樣品50μl，并設(shè)陽性和陰性對照各2孔，空白對照1孔。然后加入酶結(jié)合物每孔50μl，空白對照孔不加，充分混勻，封板，置37℃孵育30min。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿每孔，靜置20s，甩干，反復(fù)5次，扣干。每孔加顯色劑A，顯色劑B各50μl，置37℃暗處10min。每孔加終止液50μl。酶標(biāo)儀上讀取各孔OD450值。
HBcAg重組質(zhì)粒的真核表達檢測HBcAg重組質(zhì)粒以Fugen 6(Roche公司)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按說明書進行。轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞后48小時作免疫熒光檢測。操作如下轉(zhuǎn)染后48小時棄培液，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞三次。將平皿置于冰上，用2％甲醛(PBS)固定30分鐘。用PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.2％Triton-X100滲透液(PBS，含1％FBS)，室溫處理5分鐘。用含1％小牛血清PBS洗滌三次，每次5分鐘。用鑷子將玻片轉(zhuǎn)移至一干燥的平皿，加入1∶1000稀釋抗HBcAg單抗，每片玻片約150μl，4℃濕盒過夜。用含1％小牛血清PBS洗滌三次，每次5分鐘。加入二抗(Rhodamin標(biāo)記的羊抗鼠IgG1∶200稀釋，1％FBS)，每片玻片約150μl，37℃孵育1小時。PBS洗滌后用鑷子將玻片輕覆于加有一滴50％甘油的載玻片上，用無色指甲油封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。
制備基因槍子彈用亞精胺-氯化鈣包裹法將DNA包裹在直徑為1.0μm的金粉(購自美國Bio-rad公司)上。簡述如次，10μg質(zhì)粒DNA或者20μg質(zhì)粒DNA溶于100μl ddH2O，加入到含5mg金顆粒的100μl 0.1M亞精胺中混勻，再加入200μl 2.5M CaCl2即可使DNA沉淀于金顆粒上。乙醇充分洗滌后，加入100μl無水乙醇混勻，每10μl為一顆子彈。將金顆粒-DNA乙醇溶液吸到基因槍專用塑料小管中，空氣干燥后即制成子彈。每顆子彈攜帶有0.5mg金顆粒+1μg DNA或2μg DNA。
動物免疫取6周齡BALB/c雌鼠(購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心)隨機分為八組，每組6只小鼠?；驑尳臃N將腹部皮膚的毛剃干凈，用基因槍(由新芝科技有限公司提供)以2.5MPa的壓力轟擊將金顆粒-DNA導(dǎo)入小鼠腹部皮膚，轟擊后局部可見有2cm2左右的轟擊范圍。肌注接種先用戊巴比妥鈉(75mg/kg)麻醉后，用100u胰島素注射器(購自BD公司)于雙側(cè)脛前肌進針，緩慢注入質(zhì)粒DNA生理鹽水溶液，每側(cè)25μg/50ul。初次免疫后第4周作第一次加強免疫，第8周作第二次加強免疫，方法同前。
免疫后抗HBsAg抗體及亞類檢測自免疫日開始每隔2周從小鼠眼眶后眥靜脈叢采血，分離血清ELISA法檢測其中抗體IgG及亞類IgG1、IgG2a。將每組內(nèi)各小鼠血清等量混勻，作梯度稀釋，以間接法ELISA檢測IgG總血清滴度。
免疫后細(xì)胞免疫功能檢測每組隨機挑取3只小鼠，引頸處死BABL/c小鼠，無菌取其脾臟，脾臟合并后制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整濃度為4×106/ml，備檢測細(xì)胞因子及CTL活性用。IFN-γ檢測為加HBsAg為10μg/ml刺激，培養(yǎng)48小時收集上清，用IFN-γELISA定量檢測試劑盒(購自美國R&D公司)檢測其中IFN-γ水平。Calcein熒光標(biāo)記CTL殺傷實驗以70Gy的γ射線滅活對數(shù)生長期P815-s細(xì)胞制備成刺激細(xì)胞。在脾細(xì)胞中以20∶1的比例加入刺激細(xì)胞共培養(yǎng)6天，加mIL-225u/ml維持。用Ficoll分離液純化刺激后效應(yīng)細(xì)胞，以無酚紅培養(yǎng)液重懸。以5~10uM calcein AM(購自美國Molecular Probe公司)37℃水浴標(biāo)記對數(shù)生長期P815-s，P815細(xì)胞，D-Hank’s液洗后以無酚紅培養(yǎng)液重懸制成標(biāo)記好的靶細(xì)胞。在96孔圓底培養(yǎng)板中按效/靶比例50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1加入梯度稀釋效應(yīng)細(xì)胞與標(biāo)記好的靶細(xì)胞。設(shè)完全釋放組(加細(xì)胞裂解液)與自發(fā)釋放組(加無酚紅培養(yǎng)液)。孵育4.5小時后離心將上清移入新板孔中，用熒光測量儀檢測上清的熒光值。殺傷率＝(試驗組的FI-自發(fā)釋放的FI)/(陽性對照的FI-自發(fā)釋放的FI)×100％。特異性殺傷率為P815-s的值減去P815的值。
統(tǒng)計處理多組數(shù)據(jù)的方差分析，兩樣本均數(shù)比較的t檢驗。
實驗結(jié)果表明，本發(fā)明在小鼠體內(nèi)證實當(dāng)用基因槍接種HBV表面抗原DNA疫苗的同時共導(dǎo)入或共表達HBV core基因，均能促使所誘生的針對HBV表面抗原的免疫應(yīng)答類型由Th2型向Th1型轉(zhuǎn)化(HBV core基因的共導(dǎo)入或共表達兩種方式之間沒有顯著的差異性)。實驗表明HBV core基因能使抗HBsAg IgG2a的水平升高、IgG2a/IgG1的比值反轉(zhuǎn)，HBsAg特異性CTL活性與HBsAg特異性的IFN-γ釋放的能力增強。這表明在基因槍接種DNA疫苗的情形中，HBcAg不僅能誘生針對本身的Th1型免疫應(yīng)答，而且可以作為佐劑增強針對HBsAg的Th1型免疫?？梢灶A(yù)測，HBcAg能作為一種更廣泛的Th1型佐劑對其他抗原或其他形式的疫苗起作用，對于誘生TH2型免疫應(yīng)答為主的蛋白質(zhì)疫苗和多肽類疫苗可能具有更大的應(yīng)用潛力。本研究的另外一個意義是可以作為HBV的多價疫苗(HBsAg+HBcAg)。盡管HBcAg一般不能在細(xì)胞表面以及病人血中檢測到，但HBeAg擁有HBcAg的絕大多數(shù)B細(xì)胞表位與CTL表位，也存在交叉反應(yīng)(Pumpens P etal.FEBS Lett.1999，4421-6；Baumeister MA et al.J Med Viro 2000，60256-63；Milich DR et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1991，884348-52；Kuhober A et al.J Immunol 1996，1563687-95；Kuhrober A et al.Int Immunol1997，91203-12)。因此HBcAg誘生的CTL可能清除表面有HBeAg表達的靶細(xì)胞?；驑尳臃N共表達HBsAg與HBcAg的質(zhì)粒或共導(dǎo)入分別表達HBsAg與HBcAg的質(zhì)?？梢酝瑫r誘生針對兩種抗原的Th1型免疫，可能有助于清除HBV的持續(xù)性感染。本發(fā)明有利于克服基因槍接種HBsAg DNA疫苗誘生Th1型免疫應(yīng)答水平低下的缺陷，還可能作為HBV的多價疫苗(HBsAg+HBcAg)使用。


圖1為本發(fā)明實施實例所用DNA疫苗質(zhì)粒載體構(gòu)建示意圖。
其中擴增Core基因正引物(引入SalI酶切位點)序列為5’-GCC CGT CGACAT GGA CAT TGA CCC TTA TAA-3’；負(fù)引物(引入Not I切點)序列為5’-CTTAGA CTG CGG CCG CGA ATA CTA ACA TTG AG-3’。擴增C149基因正引物序列同core基因正引物，負(fù)引物(引入Not I切點)序列為5’-GAC TGC GGC CGC TCAAAC AAC AGT AGT TTC CG-3’。
圖2為本發(fā)明實施實例所用DNA疫苗載體真核細(xì)胞表達的檢測結(jié)果。
其中圖A為HBsAg表達載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，ELISA法檢測細(xì)胞上清中HBsAg水平。1為轉(zhuǎn)染IRES/S組、2為轉(zhuǎn)染IRES/S/Core組、3為轉(zhuǎn)染IRES/S/C149組。柱形圖顯示的值為吸光度450nm值±SE。圖B為HBcAg或HBcAg1-149aa表達載體轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞，免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)HBcAg或HBcAg1-149aa表達情況。
圖3為本發(fā)明實施實例所用動物免疫實驗方案。
其中，每隔兩周采集血清備抗體檢測，第10W分離脾細(xì)胞備CTL實驗和IFN-γ檢測用，1組基因槍IRES/S1微克，2組基因槍IRES/Core1微克，3組基因槍IRES/S/Core1微克，4組基因槍IRES/S1微克+IRES/Core1微克，5組基因槍IRES/S/C1491微克，6組基因槍IRES/S1ug+IRES/C1491微克，7組肌肉注射接種IRES/S50微克，8組未處理對照，每組6只小鼠。
圖4為免疫接種后抗HBcAg抗體應(yīng)答反應(yīng)其中，ELISA檢測免疫后10周血清(1∶100)中抗HBcAg的IgG、IgG1和IgG2a(柱形圖顯示的值為A450±SE)。
圖5為免疫接種后抗HBsAg抗體應(yīng)答反應(yīng)a.免疫后小鼠IgG抗體滴度水平。b.ELISA檢測免疫后10周血清(1∶100)中IgG、IgG1和IgG2a。
圖6為免疫接種后HBsAg特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)a、加強免疫后四周HBsAg特異性CTL反應(yīng)，其中各組數(shù)據(jù)為每組中三只小鼠脾細(xì)胞合并，用Calcein熒光釋放實驗檢測其特異性殺傷率。b、免疫接種后小鼠脾細(xì)胞經(jīng)HBsAg體外刺激IFN-γ釋放水平(pg/ml)。柱形圖代表的數(shù)據(jù)為每組三只小鼠脾細(xì)胞合并ELISA定量法檢測的結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1DNA疫苗載體在哺乳細(xì)胞中的表達通過磷酸鈣法將質(zhì)粒pIRES/S、pIRES/S/Core和pIRES/S/C149瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，48小時后ELISA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中HBsAg表達。對照為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清。結(jié)果見圖2A，pIRES/S、pIRES/S/Core和pIRES/S/C149均能表達HBsAg，各組OD450nm為0.832±0.349，0.57±0.162和0.561±0.277，對照為0.052±0.024。
通過脂質(zhì)體法將質(zhì)粒IRES/Core、IRES/S/Core、IRES/C149、IRES/S/C149瞬時轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞，48小時后用抗HBV Core單抗及Rhodanmin標(biāo)記的羊抗鼠二抗作免疫熒光染色。激光共聚焦掃描結(jié)果顯示Core蛋白及其截短體C149蛋白經(jīng)Rhodanmin染色呈紅色熒光，提示IRES/Core、IRES/S/Core、IRES/C149、IRES/S/C149均有表達，蛋白分布于細(xì)胞漿中。對照為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。結(jié)果見圖2B。
實施例2免疫接種后HBcAg特異性體液免疫水平BALB/c小鼠隨機分為8組，每組6只。初次免疫后第4周作第一次加強，第8周作第二次加強。用ELISA法檢測基因槍接種pIRES/Core、pIRES/S/Core、pIRES/Core+pIRES/S、pIRES/S/C149和pIRES/C149+pIRES/S各組第二次加強后兩周(第10周)血清中HBcAg特異性的IgG水平及IgG亞類水平。對照為未處理小鼠血清。結(jié)果見圖3。接種表達全長HBcAg或HBcAg1~149截斷體的質(zhì)粒的各組均能誘生HBcAg特異性的IgG抗體，各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。進一步分析各組亞類情況，發(fā)現(xiàn)表達全長HBcAg的pIRES/Core、pIRES/S/Core和pIRES/Core+pIRES/S三組抗HBcAg亞類以IgG2a為主，其IgG2a/IgG1分別2.47、2.73和2.07，而表達HBcAg1~149截斷體的pIRES/C149+pIRES/S和pIRES/S/C149二組抗HBcAg亞類以IgG1為主，其IgG2a/IgG1分別0.38、0.48。
實施例3免疫接種后HBsAg特異性體液免疫水平為監(jiān)測抗HBsAg總IgG滴度變化情況，將基因槍接種pIRES/S、pIRES/S/Core、pIRES/Core+pIRES/S、pIRES/S/C149、pIRES/C149+pIRES/S、肌注接種pIRES/S及未處理對照各組每次采集的血清分別組內(nèi)等體積混合，ELISA法檢測滴度水平。結(jié)果見圖5A。第14周時，各組抗體滴度分別為1∶4800、1∶4800、1∶4800、1∶4800和1∶6400。檢測各組第二次加強后兩周(第10周)血清中HBsAg特異性的IgG水平，結(jié)果見圖5B。除pIRES/Core組及對照組外，基因槍接種pIRES/S、pIRES/S/Core、pIRES/Core+pIRES/S、pIRES/C149+pIRES/S、pIRES/S/C149和肌注接種pIRES/S組均能誘生HBsAg特異性的IgG抗體，各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。由上可知，基因槍接種共表達HBsAg與HBcAg的質(zhì)?；蚪臃NHBs DNA疫苗的同時共導(dǎo)入表達HBV Core基因或其截短體C149的質(zhì)粒對抗HBsAg總IgG的滴度無明顯影響。
分析各組的抗HBsAg IgG亞類，基因槍接種pIRES/S/Core組和pIRES/Core+pIRES/S組IgG2a的OD450nm值分別為2.322±0.388和1.816±0.277，均顯著高于(p＜0.01和p＜0.05)基因槍接種pIRES/S組的IgG2a的OD450nm值0.770±0.209。IgG2a/IgG1比值基因槍接種pIRES/S/Core組pIRES/Core+pIRES/S組和pIRES/S分別為1.48、1.34和0.44。以上數(shù)據(jù)表明，共導(dǎo)入或共表達HBV Core基因能顯著增強基因槍接種HBs DNA疫苗誘生HBsAg特異性抗體IgG2a水平，使其免疫應(yīng)答類型由Th2型免疫應(yīng)答向Th1型轉(zhuǎn)化?；驑尳臃NpIRES/S/C149組和pIRES/C149+pIRES/S組的IgG2a與基因槍接種pIRES/S組IgG2a相比無統(tǒng)計差異，IgG2a/IgG1比值分別為0.76和0.61。肌注pIRES/S組作為誘生Th1型免疫應(yīng)答的陽性對照，其IgG2a的OD450nm值為2.478±0.165，IgG2a/IgG1比值為4.63。
實施例4免疫接種后HBsAg特異性細(xì)胞免疫水平為驗證HBV Core基因?qū)驑尳臃NHBs DNA疫苗中的Th1型佐劑效應(yīng)，進一步分析了抗原特異性的細(xì)胞免疫功能。獲取第二次加強免疫后兩周(10W)小鼠脾細(xì)胞，各組內(nèi)三只小鼠脾細(xì)胞合并，分別檢測抗原特異性CTL活性和IFN-γ釋放能力。CTL結(jié)果見圖2-2-6A。由圖中曲線可知，作為誘生Th2型應(yīng)答對照的基因槍單獨接種1μg質(zhì)粒pIRES/S組僅誘生很低的CTL活性，而作為誘生Th1型應(yīng)答對照的肌注接種50μg質(zhì)粒pIRES/S組則誘發(fā)了較高水平的CTL應(yīng)答?；驑尳臃NpIRES/S/Core組與pIRES/Core+pIRES/S組CTL活性比基因槍接種pIRES/S對照組有明顯提高，但基因槍接種pIRES/S/C149組或pIRES/C149+pIRES/S組CTL應(yīng)答水平與基因槍接種pIRES/S對照組CTL活性無明顯差異。效靶比(E/T)比為50/1時，各組的特異性殺傷率為基因槍接種pIRES/S組8.76％，pIRES/S/Core組42.02％，pIRES/S+pIRES/Core組37.97％，pIRES/S/C149組14.46％，pIRES/S+pIRES/C149組9.63％，肌注接種pIRES/S組53.54％。
檢測抗原刺激IFN-γ釋放能力，基因槍接種1μg pIRES/S組只產(chǎn)生少量的IFN-γ(160.3pg/ml)，而肌注50μg pIRES/S組則能釋放大量的IFN-γ(1487.6pg/ml)?；驑尳臃NpIRES/S/Core組與pIRES/Core+pIRES/S組釋放IFN-γ能力明顯提高分別為960.2pg/ml和959.3pg/ml。而基因槍接種pIRES/S/C149組和pIRES/S+pIRES/C149組IFN-γ能力增高不明顯，分別為280.1pg/ml和222.4pg/ml。未處理小鼠組為92.3pg/ml。
權(quán)利要求
1.用乙肝病毒核心蛋白增強基因槍接種HBsDNA疫苗誘生免疫應(yīng)答的方法，其特征在于基因槍接種HBsDNA疫苗的同時共導(dǎo)入或共表達乙肝病毒核心蛋白基因作為佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用于基因槍接種HBsDNA疫苗時使用乙肝病毒核心蛋白基因作為佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于將表達HBsAg的質(zhì)粒DNA與表達HBcAg的質(zhì)粒DNA共同包裹于金顆粒表面，利用高壓惰性氣體的轟擊，將其直接導(dǎo)入表皮層細(xì)胞內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在將一種能同時表達HBsAg與HBcAg的質(zhì)粒包裹于金顆粒表面，利用高壓惰性氣體的轟擊，將其直接導(dǎo)入表皮層細(xì)胞內(nèi)。
5.權(quán)利要求書1所述的乙肝病毒核心蛋白基因在制備HBsDNA疫苗佐劑中的用途。
6.權(quán)利要求書1所述的乙肝病毒核心蛋白基因在制備HBV的多價疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了應(yīng)用HBVCore增強基因槍接種HBs DNA疫苗誘生Th1型免疫應(yīng)答的新方法，本發(fā)明是在基因槍接種質(zhì)粒HBs DNA疫苗的同時共導(dǎo)入/或共表達HBV Core基因作為佐劑。動物免疫實驗證實本發(fā)明能增強基因槍接種HBs DNA疫苗誘生的Th1型免疫應(yīng)答水平，包括總IgG，IgG2a，特異性CTL活性，抗原特異的IFN－γ產(chǎn)生能力。有利于克服基因槍接種HBs DNA疫苗誘生低水平Th1型免疫應(yīng)答的缺陷，并可以作為HBV的多價疫苗(HBsAg+HBcAg)，有助于清除HBV的持續(xù)性感染。
文檔編號A61K48/00GK1628858SQ20041005406
公開日2005年6月22日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者袁正宏, 周曉輝 申請人:復(fù)旦大學(xué), 上海復(fù)旦悅達生物技術(shù)有限公司