專利名稱：刺桐及其異黃酮類化合物用于抗骨質(zhì)疏松藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種民間草藥刺桐(Erythrina variegata L.)和從中分離得到的異黃酮類化合物作為抗骨質(zhì)疏松藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松是各種原因引起的代謝性骨病，其發(fā)病機理比較復(fù)雜，且受到體內(nèi)多種水平的調(diào)控。其病變特點是骨質(zhì)丟失增多，骨礦物質(zhì)密度減低，骨量減少，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁變細(xì)，髓腔增寬，骨的脆性變大，容易發(fā)生自發(fā)性骨折，或輕微的外傷即可引起骨折。近二十年來骨質(zhì)疏松被公認(rèn)為是很嚴(yán)重的危害公眾健康問題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在美國，每年治療骨質(zhì)疏松引起的髖骨骨折就要花費100億美元，與治療心血管疾病和哮喘的費用相當(dāng)[1]。而國際骨質(zhì)疏松基金會(international osteoporosis foundation)的統(tǒng)計，在歐盟，每30秒就會發(fā)生一例因骨質(zhì)疏松引起的骨折[2]。而且隨著社會老齡化，預(yù)計到2050年全球骨質(zhì)疏松引發(fā)髖骨骨折患者會將從1990年的180萬上升到630萬，而高發(fā)地區(qū)也將從現(xiàn)在的歐洲、美洲轉(zhuǎn)移到發(fā)展中國家[2，3]。中國是世界人口大國，結(jié)合2000年我國第5次人口普查結(jié)果，預(yù)測我國原發(fā)性骨質(zhì)疏松人數(shù)約為9千萬[5]。如何有效的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松已成為全世界共同關(guān)注的問題。
骨骼是一種不斷重生的器官，它由功能不同的細(xì)胞、礦化和未礦化的連接組織基質(zhì)、以及骨髓空穴、血管、微管、空隙組成。骨骼生長成熟后，骨形成與骨吸收形成動態(tài)平衡，稱為骨重建。在骨內(nèi)有一個虛擬的單位，被稱為BMU(basic multicellular unit)，前部是破骨細(xì)胞(osteoclast)，后部是成骨細(xì)胞(osteoblast)，中部則是血管、神經(jīng)和連接組織。BMU在特定的時間和部位形成之后，即向著骨內(nèi)需要代謝的部位移動。破骨細(xì)胞即可附著在骨上，通過酸化和蛋白質(zhì)消化作用將舊骨吸收。隨著BMU向前推進，成骨細(xì)胞將代替破骨細(xì)胞附著在這個部位上，分泌骨基質(zhì)，最終鈣化形成新骨[4]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病機理比較復(fù)雜，且受到體內(nèi)多種水平的調(diào)控。在正常的情況下，骨骼維持在健康的水平。一旦骨重建動態(tài)平衡被打破，骨吸收超過了骨形成，即形成了骨質(zhì)疏松。
中醫(yī)對骨質(zhì)疏松癥的現(xiàn)代認(rèn)識是近十年來開始的，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，與祖國醫(yī)學(xué)中“骨瘺”、“骨枯”、“骨痹”、“腰腿疼”等病的描述有相似之處。近年來多種無創(chuàng)性骨密度監(jiān)測技術(shù)的發(fā)展對骨質(zhì)疏松的早期診斷和臨床治療觀察起到了重要作用，隨之，中醫(yī)對于本病病因病機的認(rèn)識得以深入。中意對本病病因病機的認(rèn)識多責(zé)于腎肝脾等臟腑的功能失調(diào)，治療時多在整體論治的基礎(chǔ)上針對病機而有所側(cè)重。
現(xiàn)代藥理實驗也從多角度證實了中藥對骨質(zhì)疏松癥的防治作用，中藥提高骨量、改善骨質(zhì)量的作用不僅僅是因為補鈣提高了礦鹽含量，更主要是因為其可能通過多種途徑對機體多系統(tǒng)、多器官、多組織的影響，對骨代謝多環(huán)節(jié)、多因素、多層次的調(diào)節(jié)而增加了骨密度，改善了骨的顯微結(jié)構(gòu)，提高了骨的力學(xué)強度，從而降低了骨折發(fā)生率。目前用于防治骨質(zhì)疏松癥的治療主要有對老年人補充鈣劑和維生素D、絕經(jīng)期女性雌激素替代治療、已發(fā)生骨質(zhì)疏松的患者使用二磷酸鹽、降鈣素等，這些藥物或只是抑制骨吸收，或只是促進骨形成，或僅補充鈣源，這種單點局部治療對于骨質(zhì)疏松癥這一復(fù)雜的病變而言顯然難奏長期之效，并且這些化學(xué)合成藥常由于其種種副作用而使治療半途而廢。因此，目前還未找到理想的防治骨質(zhì)疏松癥的藥物。中醫(yī)中藥治療骨質(zhì)疏松癥療效確切，其作用途徑是多方面的，并可調(diào)節(jié)患者的整體狀況，具有西藥所無法替代的綜合治療功效，越來越受到人們的關(guān)注。從中藥中研制開發(fā)高效無毒副作用的防治骨質(zhì)疏松癥的新藥已成為熱點。中醫(yī)中藥治療骨質(zhì)疏松癥具有廣泛的研究前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中草藥刺桐提取物，用科學(xué)的工藝做成制劑，使之可以有效治療骨質(zhì)疏松。通過檢測中藥提取物對各種生化指標(biāo)、骨組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)、骨力學(xué)指標(biāo)以及調(diào)控骨代謝和礦物質(zhì)代謝的基因表達(dá)的影響，初步確定這種中藥提取物治療骨質(zhì)疏松的機理和作用靶點。同時采用現(xiàn)代化學(xué)分離手段分離這種中藥提取物，以體外成骨樣UMR106細(xì)胞檢測化合物的抗骨質(zhì)疏松活性，確定這種中藥提取物治療骨質(zhì)疏松的物質(zhì)基礎(chǔ)。為預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松提供了新的途徑。
刺桐為豆科刺桐屬植物，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布于廣東、廣西、云南、貴州、浙江、湖南、湖北、福建等地。野生或栽植為行道樹。其干皮為常用中藥海桐皮。功用主治為祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，殺蟲。治風(fēng)濕痹痛，痢疾，牙痛，疥癬[5]。文獻報道，刺桐藥用主要作為抗菌劑、抗炎劑、退熱劑及防腐劑，在中國還用作洗眼劑。有關(guān)刺桐抗骨質(zhì)疏松活性少見報道，無專利申請。
這一目的是這樣實現(xiàn)的刺桐(Erythrina variegata L.)莖皮適當(dāng)粉碎，用乙醇回流提取2次，減壓蒸去溶劑，所得浸膏可以制成口服劑、片劑、膠囊劑等劑型。乙醇浸膏混懸于水中，用乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得到乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。其中乙酸甲酯、乙酸丁酯可以代替乙酸乙酯，異丙醇可以代替正丁醇。乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析、分子篩層析、反相柱層析和高效液相制備后，得到15個為異黃酮類化合物。并且化合物5、化合物10、化合物13和化合物15是這次發(fā)明中得到的新化合物，用于抗骨質(zhì)疏松的用途。本發(fā)明對骨質(zhì)疏松有很好的治療效果，是副作用較小的天然藥物。
四

附圖是本次發(fā)明從刺桐乙醇浸膏中分離得到的化合物的結(jié)構(gòu)式。其中化合物5、化合物10、化合物13和化合物15是本次發(fā)明得到的新化合物。
五具體實施例方式
實施例1刺桐(Erythrina variegata L.)的莖皮12公斤，經(jīng)粉碎后用10倍量和8倍量65％乙醇依次加熱回流提取1次，時間各為2小時和1小時。合并提取液，減壓蒸去溶劑，得乙醇浸膏670克。
乙醇浸膏350克用于實施例2。乙醇浸膏320克混懸于4500毫升水中分別以等體積乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，減壓蒸去溶劑，得乙酸乙酯提取物44克，正丁醇提取物54克，水提取物220克。乙酸甲酯、乙酸丁酯可以代替乙酸乙酯，異丙醇可以代替正丁醇。
也可以用氯仿萃取乙醇浸膏水混懸液之后，再乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。
乙酸乙酯提取物經(jīng)進一步化學(xué)分離，鑒定了其中主要的化學(xué)成分。這些化合物的結(jié)構(gòu)和抗骨質(zhì)疏松活性將在下面的實施例中闡述。
實施例2說明從實施例1得到的刺桐乙醇浸膏的體內(nèi)生物活性實驗結(jié)果。
將3月齡的雌性SD大鼠隨機分為6組，4組卵巢摘除組，1組假手術(shù)組和1組正常對照組。卵巢摘除組(OVX)的大鼠乙醚麻醉后摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組(Sham)的大鼠同樣用乙醚麻醉，但不摘除卵巢，只剪去少許卵巢外側(cè)的脂肪。手術(shù)后一個月，將刺桐乙醇浸膏溶解于蒸餾水中配成600mg/ml和300mg/ml兩個濃度，將陽性對照藥17β-雌二醇混懸于蒸餾水中，分別灌胃給藥。正常對照，假手術(shù)和模型對照組按1ml/100g給予蒸餾水。持續(xù)給藥3個月，每周測定大鼠體重。在處死之前，將大鼠放入代謝籠中，收集24小時內(nèi)的尿液，測定尿中鈣、磷、肌酐以及脫氧吡啶酚(DPD)的含量。腹主動脈取血后，摘除大鼠子宮，迅速稱重并計算子宮臟器系數(shù)比。測定血清Ca含量，堿性磷酸酶活性(ALP)。取出大鼠的左側(cè)脛骨和股骨，剔除肌肉和軟骨，采用周圍骨定量CT(pQCT)技術(shù)測定脛骨骨密度，同時用三點彎曲試驗考察股骨的強度。
以下是實施例2的實驗結(jié)果1)



結(jié)果表明去卵巢后模型組大鼠體重顯著增加，子宮明顯萎縮，給予雌二醇的大鼠體重增加被抑制，子宮重量顯著增大，而灌胃給予刺桐乙醇浸膏3個月，并未引起子宮重量的增加，說明刺桐乙醇浸膏對子宮生長無刺激作用。
2)



結(jié)果表明去卵巢后，模型組大鼠血鈣濃度降低，同時尿鈣、尿磷含量升高，顯示體內(nèi)鈣、磷等無機質(zhì)代謝平衡失常，血鈣濃度下降將會刺激甲狀旁腺激素的分泌，動員骨鈣入血，不利于骨鈣的沉積；同時尿鈣、尿磷升高意味著排出鈣、磷量增加，同樣不利于骨鈣的保持。給予刺桐乙醇浸膏3個月，大鼠血鈣濃度升高，且鈣、磷排出量降低，與陽性藥雌二醇的作用類似。
3)


結(jié)果表明去卵巢后，模型組大鼠血清堿性磷酸酶活性增加，尿中DPD/尿肌酐比值增加。而血清堿性磷酸酶和尿中DPD分別為骨形成和骨吸收的標(biāo)志。去卵巢引起體內(nèi)雌激素缺乏，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)化率增加，與絕經(jīng)后婦女的高轉(zhuǎn)化型骨質(zhì)疏松癥一致。分別灌胃給予刺桐乙醇浸膏3個月后，堿性磷酸酶活性降低，尿中DPD/尿肌酐比值降低，可見刺桐乙醇浸膏能夠顯著抑制去卵巢造成的大鼠骨轉(zhuǎn)化的增加，與陽性藥雌二醇的作用類似。
4)


結(jié)果表明去卵巢后模型組大鼠近端脛骨骨密度、股骨吸收能量以及股骨剛度明顯降低，雌激素缺乏導(dǎo)致大鼠骨量減少，骨強度降低，灌胃給予高低劑量刺桐乙醇浸膏3個月后，骨密度增加，骨吸收能量和骨剛度均明顯增加，說明刺桐乙醇浸膏能夠抑制去卵巢造成的骨量減少，并增強骨強度。
小結(jié)以上實驗結(jié)果表明刺桐乙醇浸膏能夠抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化增強，從而保護骨量丟失，增加骨強度，對由于雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松具有治療作用，其作用與陽性藥雌二醇相當(dāng)，卻無雌激素樣副作用。
實施例3說明從實施例1得到的刺桐乙酸乙酯提取物經(jīng)過硅膠柱層析、分子篩層析、ODS柱層析和高效液相的制備，得到并鑒定了15個異黃酮類化合物用于治療骨質(zhì)疏松新用途。5，4′-dihydroxy-8-(3，3-dimethylally)-2″，2″-dimethylpyrano[5，66，7]isoflavone(化合物1)；3-hydroxy-2′，2′-dimethylpyrano[5，69，10]pterocarpan(化合物2)；5，4′-dihydroxy-2″，2″-dimethyl-pyrano[5，66，7]isoflavone(化合物3)；5，7，4′-tri-hydroxy-6，8-di(3，3-dimethylally)isoflavone(化合物4)；5，4′-dihydroxy-2′-methoxy-8-(3，3-dimethylally)-2″，2″-dimethylpyrano[5，66，7]isoflavanone(化合物5)；5，2′，4′-trihydroxy-8-(3，3-dimethylally)-2″，2″-dimethylpyrano[5，66，7]isoflavone(化合物6)；5，4′-dihydroxy-6-(3，3-dimethylally)-2″，2″-dimethylpyrano[5，67，8]isoflavone(化合物7)；5，7，4′-trihydroxy-8-(3，3-dimethylally)-6-(2-hydroxy-3-methylbut-3-enyl)isoflavone(化合物8)；5，7，4′-trihydroxy-6-(3，3-dimethylally)isoflavone(化合物9)；5，4′-dihydroxy-8-(3，3-dimethylally)-2″-methoxyiso-propyl-furano[4，56，7]isoflavone(化合物10)；5，7，4′-trihydroxy-6-(2-hydroxy-3-methyl-but-3-enyl)isoflavone(化合物11)；5，7，4′-trihydroxy-8-(3，3-dimethyl-ally)isoflavone(化合物12)；5，7，4′-trihydroxy-6-(3，3-di-methyl-oxiranylmethyl)isoflavone(化合物13)；5，4′-dihydroxy-8-(3，3-dimethylally)-5-hydroxyisopropyl-dihydrofurano[4，56，7]isoflavone(化合物14)；5，4′-dihydroxy-8-(3，3-dimethylally)-2″-hydroxymethyl-2″-methylpyrano[5，66，7]isoflavone(化合物15)。以上化合物均包括相應(yīng)的不同立體構(gòu)型者。結(jié)構(gòu)見附圖。
其中化合物5、化合物10、化合物13和化合物15是這次發(fā)明中分離到的新化合物，用于治療骨質(zhì)疏松新用途。
新化合物的性狀化合物5黃色油狀，紫外燈(254nm)下顯黃色熒光。H2SO4顯黃色，F(xiàn)eCl3反應(yīng)顯陽性。鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陰性。正離子ESI-MS給出m/z459[M+Na]+，負(fù)離子ESI-MS給出m/z435[M-H]-。經(jīng)HR-EI-MS(m/z)測定給出分子式為C26H28O6(測量值436.1878，理論值436.1886)。UV圖譜[(CH3OH)λmax]顯示在269、275、312和360nm處有吸收(logε分別為4.48、4.49、3.90和3.20)。[α]D207.6°(MeOH，c 0.1)。1H NMR(400MHz，in CDCl3)和13C NMR(100MHz，in CDCl3)見表。

化合物10淡黃色無定形粉末，mp 101-102℃。紫外燈(254nm)下顯黃色熒光。H2SO4顯黃色，F(xiàn)eCl3反應(yīng)顯陽性。鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陰性。正離子ESI-MS給出m/z457[M+Na]+，435[M+H]+，負(fù)離子ESI-MS給出m/z433[M-H]-。經(jīng)HR-EI-MS(m/z)測定給出分子式為C26H26O6(測量值434.1724，理論值434.1729)。UV圖譜[(CH3OH)λmax]顯示在268和353nm處有吸收(logε分別為4.75和3.49)。IR光譜(vmaxKBr壓片)在3356、2982、2932、1655、1628、1562、1512、1423、1365、1335、1223、1107、1069、988、837cm-1處有強吸收，提示分子中含有羥基，苯環(huán)，共軛酮羰基和甲基。1H NMR(400MHz，acetone-d6)和13C NMR(100MHz，acetone-d6)見表。

化合物13淡黃色無定形粉末，mp 252-254℃。紫外燈(254nm)下顯黃色熒光。H2SO4顯黃色，F(xiàn)eCl3反應(yīng)顯陽性。鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陰性。正離子ESI-MS給出m/z355[M+H]+及m/z377[M+Na]+，負(fù)離子ESI-MS給出m/z353[M-H]-。經(jīng)HR-EI-MS(m/z)測定給出分子式為C20H18O6(測量值354.1109，理論值354.1103)。UV圖譜[(CH3OH)λmax]顯示在212、265、300和339nm處有吸收(logε分別為4.64、4.75、4.14和3.71)。[α]D2010.8°(MeOH；c 0.1)。IR光譜(vmaxKBr壓片)在3441、2932、1655、1616、1578、1516、1462、1369、895、837、818cm-1處有強吸收，提示分子中含有羥基，苯環(huán)，共軛酮羰基和甲基。1H NMR(400MHz，acetone-d6和13C NMR(100MHz，acetone-d6)見表。


化合物15淡黃色無定形粉末，mp 205-207℃。紫外燈(254nm)下顯黃色熒光。H2SO4顯黃色，F(xiàn)eCl3反應(yīng)顯陽性。鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陰性。正離子ESI-MS給出m/z443[M+Na]+，負(fù)離子ESI-MS給出m/z419[M-H]-。經(jīng)HR-EI-MS(m/z)測定給出分子式為C25H24O6(測量值420.1576，理論值420.1573)。UV圖譜[(CH3OH)λmax]顯示在289和226nm處有吸收(logε分別為4.71和4.44)。[α]D20-7.8°(MeOH，c 0.1)。IR光譜(vmaxKBr壓片)在3456、3283、2909、1659、1616、1570、1516、1435、1230、887、837、818cm-1處有強吸收，提示分子中含有羥基，苯環(huán)，共軛酮羰基和甲基。1H NMR(400MHz，acetone-d6)和13C NMR(100MHz，acetone-d6)見表。


實施例4從大鼠成骨樣UMR106細(xì)胞的增殖評價從實施例3中得到的化合物的體外抗骨質(zhì)疏松活性。
大鼠成骨樣UMR106細(xì)胞的增殖UMR106細(xì)胞以5,000細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板。在5％FBS(胎牛血清)-DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)1天后，培養(yǎng)液去血清再培養(yǎng)一天。將實施例3中所述的化合物以甲醇稀釋成不同濃度，加入到96孔板中，每個濃度4個復(fù)孔。IGF-I(胰島素樣生長因子，10ng/ml)為陽性對照組，無樣品加入的細(xì)胞為正常組。作用兩天后，加入MTT(3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium)培養(yǎng)4小時。以100μl DMSO溶解形成的甲鐕，于570nm處測定吸光度值，以吸光度值來評價細(xì)胞的增殖情況。
以下為實施例4的實驗結(jié)果


*means p＜0.05**means p＜0.01\means nonstimulating effectProl.Rat＝(OD570，treatment/OD570，control-1)×100％結(jié)果清楚表明，實施例3中所述的化合物對成骨樣UMR106細(xì)胞的增殖有較強的促進作用。
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權(quán)利要求
1.一種民間用藥刺桐及其異黃酮類化合物在制備用于防治骨質(zhì)疏松癥的制劑中的應(yīng)用。其特征在于將一種民間用藥刺桐的莖皮經(jīng)適當(dāng)粉碎后用65％乙醇回流提取，除去溶劑后經(jīng)水混懸，分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析、分子篩層析、反相柱層析和高效液相制備后，得到15個異黃酮類化合物。其中4個是這次發(fā)明中得到的新化合物，用于抗骨質(zhì)疏松的用途。
2.權(quán)力要求1所述的刺桐，其特征在于刺桐的莖皮適當(dāng)粉碎后用65％乙醇10倍量及8倍量依次回流提取，每次2小時，減壓濃縮除去溶劑得刺桐乙醇浸膏。提取溶劑還可以用純乙醇或純甲醇代替60％乙醇。
3.權(quán)力要求1所述的刺桐異黃酮類化合物，其特征在于刺桐浸膏經(jīng)水混懸，分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。
4.權(quán)力要求3所述的刺桐異黃酮類化合物，其特征在于刺桐浸膏經(jīng)水混懸后，可分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取，在兩者萃取之前可加入氯仿萃取的步驟。酯類溶劑還包括乙酸甲酯、乙酸丁酯。異丙醇可以代替正丁醇。
5.權(quán)力要求3所述的異黃酮類化合物，其特征在于乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析、分子篩層析、反相柱層析和高效液相制備后，得到16個異黃酮類化合物。其中4個是這次發(fā)明中得到的新化合物，用于抗骨質(zhì)疏松的用途。
6.權(quán)力要求5所述的異黃酮類化合物，其特征在于在異黃酮母體結(jié)構(gòu)上均連有一個或多個異戊烯基取代基。異戊烯基可以以直鏈、羥基化、甲基化、環(huán)氧化以及駢合成吡喃環(huán)或呋喃環(huán)的形式取代于異黃酮母體骨架上。不同的連接方式可以形成平面結(jié)構(gòu)相同，立體構(gòu)型不同的異構(gòu)體。
全文摘要
本發(fā)明涉及四種新的化合物，這些化合物是從中藥刺桐中提取分離得到的四個新物質(zhì)。本發(fā)明還涉及刺桐總提取物、刺桐總提取物各分離部分及分離得到的一些單體在制備藥物方面的用途，特別是在制備抗骨質(zhì)疏松藥物方面的用途。
文檔編號A61P19/10GK1754553SQ20041005161
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者姚新生, 王乃利, 李曉莉 申請人:深圳中藥及天然藥物研究中心