專利名稱：天然脫落酸用于制備腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物的新用途的制作方法
一.所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種天然物質(zhì)的新用途，具體涉及天然脫落酸的新用途。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來，人們同威脅人民健康的主要疾病之一的腫瘤進(jìn)行了不懈的斗爭(zhēng)，手術(shù)、放療、化療成為腫瘤治療的三大手段。但這三種手段毒副作用大，選擇性差。近年來，腫瘤分化誘導(dǎo)和分化治療在世界各地廣泛開展，國(guó)際上先后召開了4次專題討論會(huì)，并且已把腫瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo)治療從基礎(chǔ)推向臨床，從而為腫瘤的治療開辟了新途徑。
大量的研究證實(shí)，應(yīng)用一些化學(xué)物質(zhì)可以使惡性腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)，向正常細(xì)胞分化；這些能使惡性細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的物質(zhì)，被稱為“分化誘導(dǎo)劑”。在“分化誘導(dǎo)劑”作用下，去分化的腫瘤細(xì)胞可被誘導(dǎo)向正常細(xì)胞方向分化，從而表現(xiàn)出正常細(xì)胞的生物學(xué)特征，甚至可完全轉(zhuǎn)變成為正常細(xì)胞。這種“分化誘導(dǎo)治療”與傳統(tǒng)的治療措施最大的不同在于，不是通過殺傷瘤細(xì)胞，而是通過引導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化來達(dá)到治療腫瘤的目的。
腫瘤細(xì)胞自發(fā)分化及在某些化學(xué)物質(zhì)的作用下被誘導(dǎo)分化的發(fā)現(xiàn)，使人們努力尋找腫瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。自1971年發(fā)現(xiàn)二甲亞砜(DMSO)能使Frind紅白血病細(xì)胞分化以來，先后發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞能被某些化合物誘導(dǎo)分化。如r-干擾素100-1000μ/ml濃度下抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)分化；神經(jīng)節(jié)苷脂GM3可以誘導(dǎo)早幼粒白血病HL-60細(xì)胞向單核細(xì)胞分化；丁酸在1400μM濃度下誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅細(xì)胞方向分化；六甲撐二乙酰胺(HMBA)在5×10-3M濃度下可誘導(dǎo)90％以上的Frind紅白血病細(xì)胞分化；人參皂甙Rh2具有明顯誘導(dǎo)小鼠B16細(xì)胞分化的功能，細(xì)胞被阻斷在G1期而不能增殖；維甲類化合物主要由環(huán)己乙烯側(cè)鏈及極性基團(tuán)組成，能誘導(dǎo)早幼粒白血病HL-60細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化，使U937細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，最近的臨床研究證明，維甲酸對(duì)急性早幼粒白血病有明顯療效。
天然脫落酸[(+)-cis，trans-Abscisic Acid，ABA]是一種植物內(nèi)源抗逆物質(zhì)，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育中起著非常重要的作用，其微量天然存在于各種植物體內(nèi)，包括各種糧食作物，蔬菜、瓜果、堅(jiān)果等，目前主要由真菌規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)獲得。ABA的分子式為C15H20O4，分子量264.33，其化學(xué)名稱為5-(1’-羥基-2’，6”，6”-三甲基-4’-氧代-2’-環(huán)己烯-1’-甲基)-3-甲基-2-順-4-反-戊二烯酸，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 ABA是一種以異戊二烯為基本單位的倍半萜羧酸，與維甲酸化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似，都是由環(huán)己烯、側(cè)鏈和一個(gè)極性基團(tuán)構(gòu)成；ABA是類胡蘿卜素的一種衍生物，類胡蘿卜素在人體內(nèi)可代謝為維甲酸。眾所周知，維甲類化合物是人類發(fā)現(xiàn)的最為有效的、作用機(jī)理研究最為深刻的一類分化誘導(dǎo)劑，但由于明顯的毒副作用而限制了其開發(fā)應(yīng)用。ABA在結(jié)構(gòu)和功能上與維甲酸有極高的相似性，而且經(jīng)嚴(yán)格的毒理學(xué)試驗(yàn)證明，在極大劑量(SD大鼠LD50＞5000mg/Kg)時(shí)，對(duì)生物和環(huán)境無任何毒副作用，因而有望成為治療人類惡性腫瘤的有效分化誘導(dǎo)劑。

發(fā)明內(nèi)容
我們?cè)谘芯窟^程中發(fā)現(xiàn)，天然脫落酸對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有分化誘導(dǎo)劑的功能，即可以誘導(dǎo)惡性細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化，于是完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的在于公開一種天然脫落酸用于制備腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物的新用途。
天然脫落酸用于制備腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物的有效使用濃度，一般在5g/L-1×10-6g/L，較好為2g/L-1×10-3g/L，最佳為1g/L-5×10-2g/L，可通過在低于50℃的溫度下，常規(guī)制劑方法制備；其制備的藥物可為口服劑型、外用劑型和滴注劑型，作用方式可以為活體注射或內(nèi)服，在體內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)分化；也可以外敷外涂等或用于腫瘤細(xì)胞組織培養(yǎng)，進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化。
研究表明，ABA可使癌細(xì)胞向正常細(xì)胞方向轉(zhuǎn)變，其作用機(jī)理為ABA使大量增殖期細(xì)胞停滯在S期，使其無法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分裂而有效地抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；ABA可以作用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，改變癌細(xì)胞的惡性增殖能力，誘導(dǎo)其向正常細(xì)胞方向發(fā)展，起到抑制癌細(xì)胞增殖的作用；應(yīng)用動(dòng)物模型研究，發(fā)現(xiàn)ABA能較好地抑制腫瘤癌周血管的生成，從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ABA能降低腫瘤細(xì)胞Ki67的表達(dá)，使其增殖活性減低，因此證實(shí)ABA具有體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化和抑制其增殖的作用。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、分化誘導(dǎo)效果好，能很好的抑制癌細(xì)胞和腫瘤的生長(zhǎng)；2、天然脫落酸屬天然藥物，對(duì)正常細(xì)胞損傷小，毒副作用很??；3、使用方便，操作簡(jiǎn)單。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1天然脫落酸對(duì)前列腺癌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)研究將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌DU-145細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組兩組，實(shí)驗(yàn)組加入20ul2×10-2g/L ABA(溶于無水乙醇)，使培養(yǎng)液中ABA終濃度為I0-2g/L，對(duì)照組加入20ul無水乙醇，培養(yǎng)液中小牛血清濃度為130mI/L，常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞。加藥48h后常規(guī)更換培養(yǎng)液，維持相同的藥物濃度(ABA濃度為I0-2g/L)。培養(yǎng)過程中，倒置光學(xué)顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察DU-145細(xì)胞形態(tài)上的改變。
結(jié)果細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的觀察離心收集培養(yǎng)及ABA作用36h的DU-145細(xì)胞，0.01mol·L-1PH7.4PBS洗滌兩次，用3％戊二醛固定，鋨酸固定后，脫水，包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，核固縮現(xiàn)象增多，細(xì)胞器數(shù)量減少，張力原纖維消失，細(xì)胞間隔變大，并出現(xiàn)小片狀無細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)等現(xiàn)象。對(duì)照組細(xì)胞分布均勻，大小一致，未見明顯異常。
流式細(xì)胞儀檢測(cè)及分析ABA作用前列腺癌DU-145細(xì)胞72h后，收集腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，以0.01mol·L-1PH7.4PBS洗滌兩次，用70％冰乙醇固定，置于4℃冰箱，檢測(cè)前再次離心，棄上清液，PBS洗滌兩次，4℃下溴化丙錠染色30min，用流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量的變化，分析細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期紊亂情況。
ABA作用后腫瘤細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組ABA作用DU-145細(xì)胞72h后，DU-145細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)出現(xiàn)典型的亞二倍體“凋亡小峰”，腫瘤細(xì)胞凋亡率高達(dá)32％，大量增殖期細(xì)胞停滯在S期，使其無法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分裂，阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)行，從而抑制DU-145細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。對(duì)照組流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果無明顯異常發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例2天然脫落酸對(duì)早幼粒白血病HL-60細(xì)胞的分化誘導(dǎo)研究將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的早幼粒白血病HL-60細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組兩組，實(shí)驗(yàn)組加入10ul 5×10-1g/L ABA(溶于無水乙醇)，使培養(yǎng)液中ABA終濃度為1×10-1g/L，對(duì)照組加入10ul無水乙醇，培養(yǎng)液中小牛血清濃度為130mI/L，常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞。加藥48h后常規(guī)更換培養(yǎng)液，維持相同的藥物濃度(ABA濃度為1×10-1g/L)。培養(yǎng)過程中，透射電子顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察HL-60細(xì)胞形態(tài)上的改變。
細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的觀察 離心收集培養(yǎng)及ABA作用24h的HL-60細(xì)胞，用0.01mol·L-1PH7.4PBS洗滌兩次，用3％戊二醛固定，鋨酸固定后，脫水，包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)的改變。
ABA作用HL-60細(xì)胞24h后，透射電子顯微鏡觀察顯示腫瘤細(xì)胞核膜的微絨毛消失，細(xì)胞器數(shù)量減少，張力原纖維消失，可能與腫瘤細(xì)胞惡性表型減輕有關(guān)；而部分腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡超微結(jié)構(gòu)特征。而電鏡觀察顯示相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁存在，未見明顯異常。
流式細(xì)胞儀檢測(cè)及分析 收集ABA作用12h和24h的HL-60實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組腫瘤細(xì)胞，以0.01mol·L-1PH7.4PBS洗滌兩次，用70％冰乙醇固定，置于4℃冰箱，檢測(cè)前再次離心，棄上清液，PBS洗滌兩次，4℃下溴化丙錠染色30min，用流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量的變化，分析細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期紊亂情況。
檢測(cè)結(jié)果表明ABA作用HL-60細(xì)胞后，能夠通過影響腫瘤細(xì)胞的DNA合成，使大量增殖期細(xì)胞停滯在S期，使其無法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分裂，阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)行，從而抑制細(xì)胞的增殖；同時(shí)，通過上調(diào)cAMP/PKA途徑，誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化，進(jìn)入細(xì)胞程序化死亡，有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。對(duì)照組流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果均無明顯異常發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例3.
3.天然脫落酸對(duì)裸鼠移植瘤成瘤能力的影響1).材料(1)3周齡Balb/c.nu裸小鼠，平均體重約20g左右，均為雄性。
(2)裸鼠SPF飼養(yǎng)用屏障系統(tǒng)。
(3)人口腔癌Tca8113細(xì)胞株2.
2)方法2.1)接種細(xì)胞制備按照試驗(yàn)一方法培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將貼壁生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞用消化液使之脫壁、分散，用無血清培養(yǎng)液離心洗滌2次，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，用PBS液調(diào)整為2×107/ml細(xì)胞懸液。用帶6號(hào)針頭的注射器抽取適量的瘤細(xì)胞懸液接種裸鼠，每只動(dòng)物接種1個(gè)部位(接種于裸鼠的腋下)，每個(gè)部位注射0.2ml瘤細(xì)胞懸液，含活細(xì)胞4×106。
2.2)藥物處理待腫瘤增殖至可清楚摸到瘤結(jié)(瘤結(jié)Φ2-4mm)時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，對(duì)照組3只，治療組4只。分組給藥ABA治療組，經(jīng)腹腔注射給藥，2次/周、20mg/kg/次；對(duì)照組，PBS液代替ABA，給藥方法與實(shí)驗(yàn)組相同。連續(xù)給藥4周，共8次，脫頸處死裸鼠，終止試驗(yàn)。切取瘤塊稱重后，將腫瘤組織分為數(shù)塊，用福爾馬林固定者，用于HE染色組織學(xué)觀察、診斷及免疫組化檢測(cè)；用3％戊二醛固定者，用于透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變。
2.3)計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率(％)處死動(dòng)物進(jìn)行瘤體解剖，電子天平(精度0.0001g)稱取并記錄瘤重，計(jì)算抑瘤率，公式如下腫瘤生長(zhǎng)抑制率(％)＝對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重×100％2.4)組織學(xué)觀察觀察瘤組織組織學(xué)特點(diǎn)及癌周血管變化情況3)結(jié)果(1).組織學(xué)觀察結(jié)果裸鼠瘤組織塊中，細(xì)胞特點(diǎn)與原細(xì)胞株完全一致，可明確診斷為人口腔癌Tca8113細(xì)胞株所致的移植瘤。對(duì)照組瘤周組織中，有大量新生血管形成，而實(shí)驗(yàn)組則比對(duì)照組明顯減少。
(2).實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)ABA實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的轉(zhuǎn)移瘤瘤塊明顯小于PBS對(duì)照組動(dòng)物的瘤塊(圖4-1、圖4-2)。實(shí)驗(yàn)組4只裸鼠移植瘤瘤重分別為1.9890g、2.3515g、2.4053g、2.6804g，平均瘤重為2.3565g；PBS對(duì)照組3只裸鼠瘤重分別為4.5420g、4.6053g、4.8734g，平均瘤重為4.6736g。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的平均瘤重明顯大于對(duì)照組動(dòng)物的平均瘤重，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者間的差異有明顯著性(P＜0.05)；計(jì)算ABA對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)抑制率為49.6％。
(3).對(duì)照組大量細(xì)胞的細(xì)胞核中布滿棕褐色陽(yáng)性顆粒，顆粒分布不均，細(xì)胞核深淺不一，每個(gè)高倍視野中約有多于2/3的細(xì)胞呈Ki67陽(yáng)性表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)高倍視野中，僅有約1/4的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性顆粒分布較一致。
權(quán)利要求
1.天然脫落酸用于制備腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物的新用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸用于制備腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物的新用途，其特征為制備的腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物中天然脫落酸的有效使用濃度一般在5g/L-1×10-6g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的天然脫落酸用于制備腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物的新用途，其特征為制備的腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物中天然脫落酸的有效使用濃度較好為2g/L-1×10-3g/L，最佳為1g/L-5×10-2g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸用于制備腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物的新用途，其特征為其制備的藥物可為口服劑型、外用劑型和滴注劑型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸用于制備腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物的新用途，其特征為在低于50℃的溫度下，常規(guī)制劑方法制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種天然物質(zhì)的新用途，具體涉及天然脫落酸的新用途。針對(duì)目前腫瘤發(fā)生率高，本發(fā)明公開了一種天然脫落酸用于制備腫瘤細(xì)胞“分化誘導(dǎo)劑”藥物的新用途，即采用5g/L－1×10
文檔編號(hào)A61P35/00GK1748674SQ20041004068
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者譚紅, 雷寶良, 李志東, 周金燕, 楊杰, 鐘娟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所