專(zhuān)利名稱(chēng)：一種苦參總黃酮提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物提取物，尤其是涉及一種具有TNFα和IL-1β抑制作用的苦參總黃酮提取物、其制備方法和含有該提取物的藥物組合物以及該提取物的制藥用途。
背景技術(shù)：
炎癥是機(jī)體對(duì)各種致炎癥因子引起的損傷所發(fā)生的以防御為主的反應(yīng)，炎癥的局部表現(xiàn)為紅，腫，熱，痛及功能障礙。這些表現(xiàn)在急性體表炎癥時(shí)較為明顯，而內(nèi)臟的炎癥和慢性炎癥則多不明顯。炎癥不僅表現(xiàn)在局部，而且也常引起全身反應(yīng)。常見(jiàn)的全身反應(yīng)有發(fā)熱，血液中的白細(xì)胞數(shù)目增多以及心，肝，腎等實(shí)質(zhì)性器官可出現(xiàn)不同程度的變性，壞死等病變。
按病理分類(lèi)，炎癥可分為變質(zhì)性炎、漿液性炎、纖維素性炎、化膿性炎、出血性炎、卡他性炎、增生性炎和慢性肉芽腫性炎。
TNFα是一種前體炎癥細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與許多炎癥反應(yīng)的過(guò)程。內(nèi)毒素(LPS)是TNFα的誘導(dǎo)劑。研究發(fā)現(xiàn)，TNFα具有多種生物學(xué)活性1)殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞；2)提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，增加過(guò)氧化物陰離子產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)；3)抗感染等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TNFα抑制劑可用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、炎性腸病、心力衰竭、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、銀屑病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、急性髓型白血病、帕金森氏癥、艾滋病癡呆綜合征、早老性癡呆、抑郁癥、膿毒癥、壞疽性膿皮病、敗血癥、感染性休克、白塞氏病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、Wegener′s肉芽腫、休格連氏干燥癥、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、牙周病、惡病質(zhì)、癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、呼吸道病毒感染、肥胖等多種病癥的治療(1-25)(1.Ogata H，Hibi T.et al Curr Pharm Des.2003；9(14)1107-13.2.Moller DR.et alJ Intern Med.2003 Jan；253(1)31-40.3.Taylor PC.Et al Curr Pharm Des.2003；9(14)1095-106.4.Wilkinson N et al Arch Dis Child.2003 Mar；88(3)186-91.5.Nishimura F et al J Periodontol.2003 Jan；74(1)97-102.6.Weinberg J M et alCutis.2003 Jan；71(1)41-5.7.Burnham E et al Crit Care Med.2001 Mar；29(3)690-1.8.Sack M.et al Pharmacol Ther.2002 Apr-May；94(1-2)123-35.9.BarnesPJ.Et al Annu Rev Pharmacol Toxicol.2002；4281-98.10.Mageed RA et al Lupus.2002；11(12)850-5.11.Tsimberidou AM et al Expert Rev Anticancer Ther.2002Jun；2(3)277-86.12.Muller T.et al Curr Opin Investig Drugs.2002 Dec；3(12)1763-7.13.Calandra T et al Curr Clin Top Infect Dis.2002；221-23.14.Girolomoni G et al Curr Opin Investig Drugs.2002 Nov；3(11)1590-5.15.Tutuncu Z et al Clin Exp Rheumatol.2002 Nov-Dec；20(6 Suppl 28)S146-51.16.Braun J et al Best Pract Res Clin Rheumatol.2002 Sep；16(4)631-51.17.BarnesPJ.Et al Novartis Found Symp.2001；234255-67；discussion 267-72.18.Brady M，et al Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol.1999 Jul；13(2)265-89.19.Goldring MB.et al Expert Opin Biol Ther.2001 Sep；1(5)817-29.20.Mariette X.Rev Prat.2003 Mar 1；53(5)507-11.21.Sharma R et al Int J Cardiol.2002 Sep；85(1)161-71.22.Wang CX et al Prog Neurobiol.2002 Jun；67(2)161-72.23.VanReeth K et al Vet Immunol Immunopathol.2002 Sep 10；87(3-4)161-8.24.Leonard BE et al Int J Dev Neurosci.2001 Jun；19(3)305-12.25.Hays SJ et alCurr Pharm Des.1998 Aug；4(4)335-48.)。Marc Feldmann等報(bào)道TNFα已被用作篩選類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及其他自身免疫性疾病治療藥物的藥靶(26)(26.MarcFeldmann et al.Nature Medicine.2003 Oct；9(10)1245-50)。
IL-1β是由單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子。它能刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖和分化、刺激造血以及參與炎癥反應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IL-1β抑制劑可用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥、牙周病、心力衰竭、皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺病、早老性癡呆、骨性關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌感染、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、葡萄膜炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、呼吸道病毒感染、哮喘、抑郁癥、硬皮病等多種病癥的治療(27-46)(27.Taylor PC.et al Curr Pharm Des.2003；9(14)1095-106.28.Dellinger RP et al Clin Infect Dis.2003 May 15；36(10)1259-65.29.Takashiba S et al J Periodontol.2003 Jan；74(1)103-10.30.Diwan A，et al Curr Mol Med.2003 Mar；3(2)161-82.31.Lundberg IE，et al Rheum Dis Clin North Am.2002 Nov；28(4)799-822.32.Makhija R，et al JHepatobiliary Pancreat Surg.2002；9(4)401-10.33.Chung KF.Et al Eur Respir JSuppl.2001 Dec；3450s-59s.34.Hallegua DS，et al Ann Rheum Dis.2002 Nov；61(11)960-7.35.Goldring MB.Et al Expert Opin Biol Ther.2001 Sep；1(5)817-29.36.Mrak RE，Griffin WS.Et al Neurobiol Aging.2001 Nov-Dec；22(6)903-8.37.Brady M，et al Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol.1999 Jul；13(2)265-89.38.Van der Meer JW，et al Ann N Y Acad Sci.1998 Sep 29；856243-51.39.Rameshwar P et al Acta Haematol.2003；109(1)1-10.40.deKozak Y et al Int Rev Immunol.2002 Mar-Jun；21(2-3)231-53.41.Wang CX et alProg Neurobiol.2002 Jun；67(2)161-72.42.Van Reeth K et al Vet ImmunolImmunopathol.2002 S ep 10；87(3-4)161-8.43.Stirling R G et al Br M ed B ull.2000；56(4)1037-53.44.Leonard BE et al Int J Dev Neurosci.2001 Jun；19(3)305-12.45.Allan SM et al Ann N Y Acad Sci.2000；91784-93.46.Cafagna D et alMinerva Med.1998 May；89(5)153-61.)。
傳統(tǒng)中藥苦參(Sophora flavescens Ait)為豆科槐屬植物，其性寒味苦，有清熱解毒、明目止淚、祛風(fēng)殺蟲(chóng)、安五臟、轉(zhuǎn)身定志的作用。從中分離出的主要化學(xué)成分可分為兩大類(lèi)，即苦參生物堿和苦參黃酮。有人已從苦參根、莖、葉和花中分離出了23種生物堿及32種黃酮與異黃酮類(lèi)化合物(47)(47.苗抗立，張建中等，天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2000，13(2)69～73)。
苦參酮(Kurarinone)的主要植物來(lái)源為豆科的苦參(Sophora flavescensAit)和龍膽科的秦艽(Gentiana macrophylla Pall)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 分子式C26H30O6，分子量438.52，熔點(diǎn)121～123℃2’-甲氧基-苦參酮(2’-methoxy-Kurarinone)又名異苦參酮(Isokurarinone)，為黃色晶體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 分子式C27H32O6，分子量438，熔點(diǎn)102-104℃槐黃烷酮G(Sophoraflavanone G)又名降苦參酮(Norkurarinone)，為無(wú)色針晶(苯)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
分子式C25H28O6，分子量424.49，熔點(diǎn)173-175℃未見(jiàn)現(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于苦參酮、2-甲氧基-苦參酮和槐黃烷酮可抑制TNFα和IL-1β表達(dá)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種具有TNFα和IL-1β抑制作用的苦參總黃酮提取物。該提取物包含如下重量比成分苦參酮20～40％、2-甲氧基-苦參酮1～5％和槐黃烷酮1～10％。特別是，該提取物可含有30％苦參酮、2％2’-甲氧基-苦參酮和5％槐黃烷酮。
本發(fā)明還涉及一種包含上述苦參總黃酮提取物的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及上述苦參總黃酮提取物的制備方法。
本發(fā)明還涉及上述苦參總黃酮提取物在制備TNFα抑制劑和IL-1β抑制劑中的用途。
所述“TNFα抑制劑”可用于治療下列病癥，包括但不限于脊柱關(guān)節(jié)病、炎性腸病、心力衰竭、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、銀屑病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、急性髓型白血病、帕金森氏癥、早老性癡呆、抑郁癥、艾滋病癡呆綜合征、膿毒癥、壞疽性膿皮病、敗血癥、感染性休克、白塞氏病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、Wegener′s肉芽腫、休格連氏干燥癥、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、牙周病、惡病質(zhì)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或肥胖。
所述“IL-1β抑制劑”可用于治療下列病癥，包括但不限于敗血癥、牙周病、心力衰竭、皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺病、早老性癡呆、骨性關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌感染、骨髓增生異常綜合征、葡萄膜炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、哮喘、抑郁癥或硬皮病。
本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過(guò)下文以及權(quán)利要求的描述，本發(fā)明的其他特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢(shì)將會(huì)更為明顯。
本發(fā)明的問(wèn)世部分是基于這樣一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮和槐黃烷酮G以特定的比例存在于具有TNFα和IL-1β抑制活性的苦參總黃酮提取物中。因此，該苦參總黃酮提取物可用于制備TNFα抑制劑和IL-1β抑制劑。
所述“TNF-α抑制劑”可用于治療下列病癥，包括但不限于脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathies)、炎性腸病(inflammatory bowel disease)、心力衰竭(heart failure)、糖尿病(diabetes mellitus)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupuservthematosus)、硬皮病(scleroderma)、結(jié)節(jié)病(sarcoidosis)、皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)、銀屑病(psoriasis)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome)、急性髓型白血病(acute myelogenous leukemia)、帕金森氏癥(Parkinson′s disease)、艾滋病癡呆綜合征(AIDS dementia complex)、早老性癡呆(Alzheimer′s disease)、抑郁癥(depression)、膿毒癥(sepsis)、壞疽性膿皮病(pyoderma gangrenosum)、敗血癥(hematosepsis)、感染性休克(septic shock)、白塞氏病(Behcet′s syndrome)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)、葡萄膜炎(uveitis)、Wegener′s肉芽腫(Wegener′sgranulomatosis)、休格連氏干燥癥(Sjogren′s syndrome)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)、哮喘(asthma)、急性胰腺炎(acutepancreatitis)、牙周病(Periodontal disease)、惡病質(zhì)(cachexia)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(central nervous system injury)、肥胖(obesity)等。
所述“IL-1β抑制劑”可用于治療下列病癥，包括但不限于敗血癥(hematosepsis)、牙周病(Periodontal disease)、心力衰竭(heart failure)、皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)、急性胰腺炎(acute pancreatitis)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)、早老性癡呆(Alzheimer′sdisease)、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis)、細(xì)菌感染(Bacterial infections)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome)葡萄膜炎(uveitis)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(central nervous system injury)、哮喘(asthma)、抑郁癥(depression)、硬皮病(scleroderma)等。
術(shù)語(yǔ)“脊柱性關(guān)節(jié)病”(spondyloarthropathies)是指一組具有內(nèi)在聯(lián)系的多系統(tǒng)炎癥性疾病。因此類(lèi)疾病患者其血中的類(lèi)風(fēng)濕因子(rheumatoid factor)為陰性，所以又稱(chēng)為“血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病(seronegative spondyloarthropathies)。本病可累及脊柱、外周關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)周?chē)Y(jié)構(gòu)或三者均累及，并伴有各種特征性的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，如急慢性胃腸或泌尿生殖系統(tǒng)炎癥(有時(shí)可為感染)、眼前部炎癥、銀屑病性皮膚、指甲損害等。本組疾病主要包括強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis)、瑞特氏綜合癥(Reiter′s syndrome)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎(Psoriatic arthropathy)、炎性腸病性關(guān)節(jié)炎(Inflammatory bowel diseasearthritis)、未分化型脊柱關(guān)節(jié)病(Undifferentiated spondyloarthropathy)等。
術(shù)語(yǔ)“炎性腸病”(inflammatory bowel disease)是克隆病(Crohn’s disease)、和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)兩種非特異性腸炎的統(tǒng)稱(chēng)。
術(shù)語(yǔ)“慢性阻塞性肺病”(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是指具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和/或肺氣腫(美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(ATS)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸系統(tǒng)學(xué)會(huì)定義)。某些支氣管哮喘，在疾病進(jìn)程中發(fā)展為不可逆性氣流阻塞，當(dāng)支氣管哮喘與慢性支氣管炎和/或肺氣腫重疊存在或難以鑒別時(shí)，也可列入COPD范圍。COPD的主要特征是慢性進(jìn)行性氣流阻塞。
本發(fā)明的苦參總黃酮提取物中包含如下重量比成分苦參酮20～60％、2’-甲氧基-苦參酮1～5％和槐黃烷酮G1～12％；優(yōu)選的，該提取物含有苦參酮35～45％、2’-甲氧基-苦參酮2～4％和槐黃烷酮G5～8％；特別是，該提取物可含有苦參酮45％、2-甲氧基-苦參酮2％和槐黃烷酮6％。該提取物可按本發(fā)明的方法制備，即苦參經(jīng)乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑提取、濃縮，所得粗提物溶解于5％～50％C1～C4醇水溶液，再用有機(jī)溶劑萃取，合并有機(jī)相，濃縮得產(chǎn)物。所述C1～C4醇水溶液可以是甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或丁醇水溶液；所述C1～C4醇水溶液的濃度為5％～50％，優(yōu)選20～40％，最優(yōu)選30％；所述有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙醚或其混合物。
本發(fā)明的苦參總黃酮提取物里可加入可藥用載體以促進(jìn)其給藥。較佳的，本發(fā)明的藥物組合物含有0.1-99.9％重量比的提取物或其活性成份?！翱伤幱幂d體”不會(huì)破壞本發(fā)明的苦參總黃酮提取物或其活性成份的藥學(xué)活性，同時(shí)其有效用量，即能夠起到藥物載體作用時(shí)的用量對(duì)人體無(wú)毒。
“可藥用載體”包括但不限于離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)(SEDDS)如d-alpha-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫(Tweens)或其他類(lèi)似聚合介質(zhì)等藥物制劑用的表面活化劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合物、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二納、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質(zhì)、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙稀酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛酯、環(huán)糊精如α-、β-及γ-環(huán)糊精或其經(jīng)化學(xué)修飾的衍生物如2-和3-羥丙基-β-環(huán)糊精等羥烷基環(huán)糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進(jìn)本發(fā)明的苦參總黃酮提取物或其活性成份的藥物傳遞。
其他可藥用輔料如填充劑(如無(wú)水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合劑(如微晶纖維素)、崩解劑(如交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素和交聯(lián)PVP)、潤(rùn)滑劑(如硬酯酸鎂)、吸收促進(jìn)劑、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤(rùn)濕劑、溶劑、增溶劑和著色劑等也可加入本發(fā)明的藥物組合物中。
上述苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物可通過(guò)腸道或者非腸道途徑給藥。腸道給藥制劑包括丸劑、顆粒劑、膠囊劑、懸浮液或溶液。非腸道給藥制劑包括注射劑、霜?jiǎng)⒏鄤?、貼劑或噴霧劑。非腸道給藥途徑包括皮下、皮內(nèi)、動(dòng)脈、靜脈、肌肉、關(guān)節(jié)、滑液、胸骨、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)注射或滴注。其它給藥途徑可包括局部、直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、陰道、舌下、粘膜、氣管或尿道?？鄥⒖傸S酮提取物、其活性成份以及藥物組合物還可以通過(guò)氣霧吸入或植入蓄積或針刺等方式給藥。
本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物的口服制劑包括但不限于膠囊、片劑、乳劑、水懸浮劑、膠體液、溶液、微膠囊、丸劑、錠劑、顆粒劑、粉劑。常用于片劑的可藥用載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還會(huì)加入硬脂酸鎂等潤(rùn)滑劑。常用于膠囊劑的可藥用載體包括乳糖和干玉米淀粉。當(dāng)制成口服水懸浮劑和/或乳劑時(shí)，本發(fā)明的苦參總黃酮提取物或其活性成份可懸浮或溶解于油相里并與乳化劑或懸浮劑相結(jié)合。如果需要，也可以加入一些甜味劑和/或香味劑和/或增色劑。
本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份和藥物組合物可被制成無(wú)菌注射劑，如無(wú)菌水相或油相懸浮液。該懸浮液可按本領(lǐng)域的常規(guī)方法即使用適宜的分散劑或濕潤(rùn)劑(如Tween 80)及懸浮劑等制得。其還可以是在可腸道外給藥的無(wú)毒稀釋劑或溶劑中的水溶液或懸浮液，如在1，3-丁二醇中的溶液。相關(guān)的可用載體或溶劑包括甘露醇、水、林格氏液、等滲氯化鈉等。另外，無(wú)菌的固定油常被作為溶劑或懸浮劑的媒介，因而包括合成甘油單酯或甘油二酯在內(nèi)的多種柔和的固定油(bland fixed oil)均適用。脂肪酸，如十八烯酸及其甘油酯衍生物(如橄欖油或蓖麻油，特別是其聚氧乙烯基衍生物)等可用于制備所述注射劑。所述油溶液或懸浮液還可包含一種長(zhǎng)鏈的乙醇稀釋劑或分散劑或羧甲基纖維素或類(lèi)似的其他分散劑，此類(lèi)物質(zhì)常用于制備可藥用乳劑和/或懸浮劑。其它一些制劑常用的表面活性劑如Tweens或Spans和/或其他類(lèi)似的乳化劑或生物利用度促進(jìn)劑等也同樣可用于制備本制劑。
本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物可制成栓劑通過(guò)直腸給藥，方法是將苦參總黃酮提取物或其活性成份與適宜的非刺激性賦形劑混合，后者在室溫下為固體而在直腸溫度下為液體，因而該栓劑可融解于直腸中并釋放出活性成份。此類(lèi)賦形劑包括但不限于可可油、蜂蠟和聚乙烯。本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物的局部給藥制劑(如油膏)可直接用于患處。此類(lèi)局部制劑含有活性成份及可藥用載體，后者包括但不限于礦物油、液體石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯或聚氧丙稀化合物、乳化臘或水。另外，本發(fā)明的藥物組合物還可制成洗劑或油劑。適用的載體包括但不限于礦物油、三梨醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鯨臘酯、十六烷醇、2-十八烷醇、苯甲基乙醇或水。本發(fā)明的苦參總黃酮提取物或其活性成份還可制成灌腸劑等用于直腸局部給藥。局部透皮貼劑亦在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物亦可經(jīng)鼻噴霧或者吸入給藥，即按本領(lǐng)域的常規(guī)方法，使用苯甲基乙醇或其他防腐劑、吸收促進(jìn)劑、碳氟化合物和/或其他增溶劑或分散劑制得鹽溶液。
本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物還可通過(guò)植入給藥。采用植入給藥方式可達(dá)到在給藥對(duì)象體內(nèi)持續(xù)，定時(shí)釋放本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物的效果。另外，植入給藥還能在局部組織和器官定位給藥(Negrin et al.，Biomaterials 22(6)563，2001)定時(shí)釋放技術(shù)亦可用于本發(fā)明苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物的給藥中，如基于聚合體技術(shù)的定時(shí)釋藥膠囊、緩釋技術(shù)和制劑包裹技術(shù)(如聚合體和脂質(zhì)體)等。
貼劑同樣包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。其包括基層(如聚合體、布、紗和繃帶)和本發(fā)明的藥物組合物?；鶎拥囊贿吙稍O(shè)有一保護(hù)層以防止活性成份的流出。所述貼劑還可含有一用于固定的粘合劑，后者可以是一種自然的或者合成的物質(zhì)，當(dāng)其與給藥對(duì)象的皮膚接觸時(shí)可暫時(shí)粘附于皮膚上。粘合劑可以是防水的。
當(dāng)本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份、藥物組合物和制劑可與一種或多種附加的治療藥物或預(yù)防藥物混合。附加藥劑可作為獨(dú)立的劑型與本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物分別給藥。附加藥劑也可和本發(fā)明的苦參總黃酮提取物、其活性成份以及藥物組合物一起以單一劑型給藥。
為了便于理解本發(fā)明，特列舉以下實(shí)施例。其作用應(yīng)被理解為是對(duì)本發(fā)明的詮釋而非對(duì)本發(fā)明的任何方式的限制。以上所列的各參考文獻(xiàn)均以全篇引入本文作為參考。


圖1苦參酮(0912)、苦參總黃酮提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNFa表達(dá)的抑制作用；圖2苦參酮(0912)、苦參總黃酮提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-1β表達(dá)的抑制作用；圖3苦參總黃酮提取物HPLC色譜圖；具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。但并不意味著本發(fā)明僅限于此。
實(shí)施例1用酸水和乙酸乙酯制備苦參總黃酮提取物500克的苦參干藥材用9000毫升95％的乙醇室溫浸提3次，提取液合并，經(jīng)真空濃縮蒸干，得粗提物195克。提取物經(jīng)30％乙醇水和乙酸乙酯(1∶1)分配三次，合并乙酸乙酯溶液，濃縮蒸干得88.7克苦參總黃酮(收率45.5％)。
實(shí)施例2苦參黃酮三種成分的分離與鑒定苦參酮的分離和鑒定分離500克的苦參干藥材用3000毫升95％的乙醇室溫浸提3次，提取液合并，經(jīng)真空濃縮蒸干，得粗提物65克。提取物經(jīng)6％甲醇水和氯仿分配三次，合并氯仿溶液，濃縮蒸干得30克浸膏。浸膏經(jīng)LH-20柱層析，以甲醇為洗脫劑，得10克的粗品。粗品依次用硅膠柱層析，洗脫劑丙酮/石油醚＝1∶2，及反相材料(RP-18)柱層析，以甲醇/水＝65∶35洗脫得2克苦參酮(得率0.4％)。
鑒定1H NMR(DMSO-d6，400MHz)10.2(2’-OH)，9.4(4’-OH)，9.2(7-OH)，7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.32(1H，d，J＝2.28Hz，H-3’)，6.25(1H，dd，J＝8.2，2.4Hz，H-5’)，6.12(1H，s，H-6)，5.4(1H，dd，J＝2.6，13.1Hz，H-2)，4.9(1H，t，J＝1.4Hz，H-4”)，4.55(1H，brs，H-9”a)，4.47(1H，brs，H-9”b)，3.7(3H，s)，2.8(1H，dd，J＝13.1，16.3Hz，H-3a)，2.4(3H，m)，1.9(2H，m)，1.6(3H，s)，1.57(3H，s)，1.42(3H，s).
13C NMR(DMSO-d6，75MHz)188.5，162.1，161.7，159.2，157.7，154.9，147.6，130.3，127.0，123.1，116.1，110.5，106.7，106.0，104.1，102.1，92.3，73.4，55.2，46.3，44.3，30.7，26.9，25.5，18.6，17.6。
ESIMS(m/z)439。
2’-甲氧基苦參酮的分離和鑒定分離500克的苦參干藥材用3000毫升95％的乙醇室溫浸提3次，提取液合并，經(jīng)真空濃縮蒸干，得粗提物65克。提取物經(jīng)40％丙醇水和乙醚分配三次，合并乙醚溶液，濃縮蒸干得30克浸膏。12克浸膏經(jīng)LH-20柱層析，以甲醇為洗脫劑，得50毫克的粗品。粗品依次用硅膠柱層析，洗脫劑丙酮/石油醚＝1∶3，及反相材料(RP-18)柱層析，以甲醇/水＝75∶25洗脫得20mg 2’-甲氧基苦參酮(得率0.01％)，為黃色晶體，mp 102-104℃。
鑒定1H NMR(CDCl3，400MHz)7.4(1H，d，J＝8.2Hz，H-6’)，6.48(1H，dd，J＝8.21，2.34Hz，H-5’)，6.44(1H，d，J＝2.35Hz，H-3’)，6.08(1H，s，H-6)，5.62(1H，m，H-2)，5.0(1H，m)，4.72(1H，brs)，4.66(1H，brs)，3.8(3H，s)，3.76(3H，s)，2.84(1H，m，H-3a)，2.4(3H，m)，1.67(3H，s)，1.63(3H，s)，1.6(2H，m)，1.52(3H，s)。
ESIMS(m/z)451(M-1)。
UV(MeOH)λmax(logε)286(4.3)nm，IR(KBr)vmax3291，2955，2920，1650，1590，1500，1465，1410，1280cm-1。
槐黃烷酮G的分離和鑒定分離500克的苦參干藥材用3000毫升95％的乙醇室溫浸提3次，提取液合并，經(jīng)真空濃縮蒸干，得粗提物65克。提取物經(jīng)25％異丙醇水和乙酸乙酯分配三次，合并乙酸乙酯溶液，濃縮蒸干得30克浸膏。浸膏經(jīng)LH-20柱層析，以甲醇為洗脫劑，得15克的總黃酮。粗品用依次用硅膠柱層析，洗脫劑丙酮/石油醚＝1∶3，得到Norkurarinone粗品500mg，接著反相材料(RP-18)柱層析，以甲醇/水＝70∶30洗脫得300mg的槐黃烷酮G(得率0.06％)。
鑒定1H NMR(DMSO-d6，400MHz)12.1(s，5-OH)，9.6(4’-OH)，9.4(7-OH)，7.22(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.33(1H，d，J＝2.3Hz，H-3’)，6.26(1H，dd，J＝8.4，2.5Hz，H-5’)，5.92(1H，s，H-6)，5.50(1H，dd，J＝2.8，13.3Hz，H-2)，4.89(1H，t，J＝6.8Hz，H-4”)，4.55(1H，brs)，4.47(1H，brs)，3.1(1H，dd，J＝13.3，17.2Hz，H-3a)，2.62(1H，dd，J＝2.9，17.2Hz，H-3b)，2.4(3H，m)，1.9(2H，m)，1.56(3H，s)，1.52(3H，s)，1.43(3H，s)。
ESIMS(m/z)423。
實(shí)施例3苦參總黃酮提取物HPLC色譜圖及定量分析用HPLC系統(tǒng)對(duì)苦參總黃酮提取物(實(shí)施例1)進(jìn)行定量分析。儀器Agilent1100，設(shè)定波長(zhǎng)為280nm，分析柱為Zorbax SB-C18 4.6*150mm，流速為1ml/分鐘。流動(dòng)相為CH3CN和H2O溶液。梯度洗脫，梯度狀況為CH3CN在25分鐘內(nèi)從30％遞增到80％。在隨后的5分鐘內(nèi)，CH3CN遞增到100％。得附圖3所示HPLC圖譜。
苦參酮，2’-甲氧基苦參酮，槐黃烷酮G的對(duì)照品均在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離純化。經(jīng)HPLC分析，純度均在96％以上。
結(jié)果測(cè)得本發(fā)明的苦參總黃酮提取物(實(shí)施例1)中含苦參酮40.1％(保留時(shí)間16.87分鐘)，2’-甲氧基-1苦參酮1.8％(保留時(shí)間19.99分鐘)，槐黃烷酮G6.2％(保留時(shí)間20.65分鐘)。
實(shí)施例4在細(xì)胞水平上檢測(cè)苦參總黃酮提取物和苦參酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的PBMC細(xì)胞中TNFα及IL-1β表達(dá)的抑制作用。
實(shí)驗(yàn)材料
1.細(xì)胞外周血單核細(xì)胞2.受試藥物苦參總黃酮提取物(實(shí)施例1)和苦參酮(091-2)3.陽(yáng)性對(duì)照地塞米松(DEX)4.試劑Ficoll-Paque Plus(Amersham Bioscience)；內(nèi)毒素(LPS)和地塞米松(CalBiochem.)；TNFαELISA Kit及IL-1βELISA Kit(晶美生物工程公司)；DMSO(Sigma)。
5.方法與結(jié)果●新鮮血液以EDTA為抗凝劑，分離外周血單核細(xì)胞，懸浮在含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在96孔板中加入100μl密度為1×105細(xì)胞/ml新分離的細(xì)胞，每孔細(xì)胞總數(shù)為104個(gè)。每個(gè)樣品作3個(gè)孔。
●在細(xì)胞中加入指定濃度的測(cè)試樣品(終濃度分別為10，30，和100μg/ml，加樣量為10μl)和陽(yáng)性對(duì)照(地塞米松，10μM)。置于37℃，含5％ CO2的培養(yǎng)箱中保溫15分鐘。
●加入10μl濃度為100μg/ml的LPS，置于37℃，含5％ CO2的培養(yǎng)箱中保溫16小時(shí)。
●與1000rpm離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移入新的96孔板中，測(cè)定TNFα及IL-1β濃度，或凍藏于-20℃，避免反復(fù)凍融。
●根據(jù)生產(chǎn)者所述方法，利用試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中TNFα和IL-1β濃度。
6.結(jié)果計(jì)算根據(jù)TNFa和IL-1β檢測(cè)試劑盒測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算LPS刺激及藥物處理后細(xì)胞分泌至培養(yǎng)液中兩細(xì)胞炎癥因子的濃度，表達(dá)抑制率根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算
實(shí)驗(yàn)結(jié)果苦參總黃酮提取物及苦參酮對(duì)炎癥因子表達(dá)的抑制作用

權(quán)利要求
1.一種苦參總黃酮提取物，其特征在于，它包含如下重量比成分苦參酮20～60％、2’-甲氧基-苦參酮1～5％和槐黃烷酮G 1～12％。
2.權(quán)利要求1的苦參總黃酮提取物，其特征在于，它包含苦參酮35～45％、2’-甲氧基-苦參酮2～4％和槐黃烷酮G 5～8％。
3.權(quán)利要求2的苦參總黃酮提取物，其特征在于，它包含苦參酮45％、2’-甲氧基-苦參酮2％和槐黃烷酮G 6％。
4.權(quán)利要求1的苦參總黃酮提取物的制備方法，其特征在于，它包括如下步驟苦參經(jīng)有機(jī)溶劑提取、濃縮，所得粗提物溶解于5％～50％C1～C4醇水溶液，再用有機(jī)溶劑萃取，合并有機(jī)相，濃縮得產(chǎn)物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述C1～C4醇水溶液為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或丁醇水溶液。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述C1～C4醇水溶液的濃度為20～40％。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述C1～C4醇水溶液的濃度為30％。
8.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1的苦參總黃酮提取物。
9.權(quán)利要求1的苦參總黃酮提取物在制備TNFα抑制劑中的用途。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述TNFα抑制劑可用于治療下組病癥中的一種或多種類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、炎性腸病、心力衰竭、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、銀屑病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、急性髓型白血病、帕金森氏癥、早老性癡呆、抑郁癥、艾滋病癡呆綜合征、膿毒癥、壞疽性膿皮病、敗血癥、感染性休克、白塞氏病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、Wegener′s肉芽腫、休格連氏干燥癥、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、牙周病、惡病質(zhì)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或肥胖。
11.權(quán)利要求1的苦參總黃酮提取物在制備IL-1β抑制劑中的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述IL-1β抑制劑可用于治療下組病癥中的一種或多種類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥、牙周病、心力衰竭、皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺病、早老性癡呆、骨性關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌感染、骨髓增生異常綜合征、葡萄膜炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、哮喘、抑郁癥或硬皮病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有TNFα和IL－1β抑制作用的苦參總黃酮提取物、其制備方法和用途以及含有該提取物的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P1/18GK1676520SQ20041003093
公開(kāi)日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2004年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月1日
發(fā)明者嚴(yán)孝強(qiáng), 崔玉敏, 王滔, 馬志明, 潘柯, 張維權(quán), 黃偉暉, 洪建榮, 段繼峰, 蔡宇 申請(qǐng)人:和記黃埔醫(yī)藥企業(yè)有限公司