專利名稱：：一種利用智能化水凝膠對物質進行包裹的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于藥物輔料
技術領域：
，具體涉及一種利用智能化水凝膠對物質進行包裹的方法。
背景技術：
：近年來，由于多肽、基因藥物的出現，人們對具有良好生物相容性的水凝膠的制備及其應用的研究越來越感興趣。20多年來，人們對水凝膠進行了深入研究，成功將其應用于生物醫(yī)學和藥學領域，目前已廣泛用于緩釋系統(tǒng)和組織工程領或[HoffmanAS，2002；JanuszM，1999；PeppasNA，2000]。水凝膠聚合物具有良好的生物相容性，大量吸收的水分充斥于聚合物網絡中，使整個材料具備了一種流體的性質，這與充盈有大量水性液體的機體組織極其相似，柔軟、潤濕的表面以及與組織的親和大大減少了刺激性[GuptaPandGargS，2002]。而且水凝膠作為大分子藥物的控釋材料更為適宜，因為水凝膠所含有的大量水性環(huán)境適合極性蛋白質分子的擴散。與疏水聚合物相比，同蛋白質藥物、被固定化的酶或組織有弱得多的相互作用[YsuhikoT，2000]，固定在水凝膠中的生物分子活性能夠保持較長的時間。但親水性凝膠藥物釋放系統(tǒng)的缺點在于藥物釋放速度一般都較快。雖然用凝膠包埋生物大分子藥物有很多優(yōu)點，但是將蛋白質藥物包埋進凝膠中，卻并不是一件很容易的事[BrombergLE，1998]。將蛋白質藥物原位聚合包埋的方法易使蛋白質失活，而將凝膠制備好后，再浸入藥物溶液中吸附的方法具有明顯的優(yōu)越性，因為經水溶脹的凝膠具有多孔、大孔網絡可以使之在吸附藥物之前充分去除聚合過程中造成生物不相容和大分子類藥物失活的殘留單體，引發(fā)劑及副產物?？墒沁@種方法也有其限制因素，就是載藥量太低，通常小于0.1wt％[AntonsenKPandHoffmanAS，1993]。根據對外界刺激的應答情況，水凝膠分普通凝膠和智能凝膠，即水凝膠自身能感知響應外界環(huán)境細微的變化或刺激，如外界pH，離子強度，溫度，電場以及光和特異化學物質刺激時，高分子水凝膠的體積發(fā)生溶脹或者收縮，從而控制藥物的釋放或包埋藥物。如ParkTG(1999)制備了同時具有pH和溫度敏感的水凝膠，并研究了胰島素在不同條件下的釋放行為。可是利用凝膠的智能性進行包埋蛋白質藥物并控制藥物釋放的研究卻并不多見。JeongB(1997)合成了PEO-PLLA-PEO三嵌段的溫敏性可降解的聚合物，該聚合物在高溫(45℃)下呈流動的液體，通過與蛋白質藥物簡單的混合，注入人體之后，變成凝膠，形成藥物的儲庫，對藥物進行釋放。但該凝膠是物理凝膠，且不適用用于對高溫敏感的蛋白質。本發(fā)明提出了一種利用凝膠的智能性對生物活性物質進行包埋的方法。本發(fā)明所利用的材料的智能性為反向溫度敏感性，低溫舒張而高溫收縮。理想的相轉變溫度在冰箱溫度到體溫之間。這樣，在低溫(低于水凝膠的相轉變溫度但高于0℃或4℃)下，將生物活性物質吸收進凝膠中，然后通過在低溫下干燥或升高溫度(不高于人或動物體溫)使凝膠網絡孔徑縮小，被包埋的生物活性物質的大小介于低溫和高溫的凝膠網絡孔徑之間，那么升高溫度后生物活性物質就被包裹在凝膠中而不會滲漏，在人或動物的體溫下，生物活性物質就會通過凝膠的降解而釋放。參考文獻1.AntonsenKP，BohmertJLNabeshimaY，SheuMS，SuXS，HoffmanAS，Controlledreleaseofproteinfrom2-hydroxyethylmethacrylatecopolymergels，Biomater.Artif.CellsImmoilizationBiotechnol.，1993，211-222.BrombergLE，RonES，Temperature-responsivegelsandthermogellingpolymericmatricesforproteinandpeptidedelivery，AdvancedDrugDeliveryReviews.，1998，31197-2213.GuptaP，VermaniK，GargS，HydrogelsfromcontrolledreleasetopH-responsivedrugdelivery，Drugdiscoverytoday.，2002，7(10)569-5794.HoffmanAS，Hydrogelsforbiomedicalapplications，Adv.Drug.Deliv.Rev.，2002，433-125.JanuszM.Rosiak，FumioYoshii，Hydrogelsandtheirmedicalapplication，NuclearInstrumentsandMethodsinPhysicsResearchB.，1999，15156-646.JeongB，BaeYH，LeeDS，KimSW，Biodegradableblockcopolymersasinjectabledrug-deliverysystems，Nature.，1997，388860-8627.ParkTGTemperaturemodulatedproteinreleasefrompH/temperature-sensitivehydrogels，Biomaterials，1999，20517-5218.PeppasNA，BuresP，LeobandungW，IchikawaH，Hydrogelsinpharmaceuticalformulations，J.Pharm.Buiogarn.，2000，5027-469.YasuhikoT.，Theimportanceofdrugdeliverysystemsintissueengineering，PharmaceuticalScience&TechnologyToday.，2000，3(3)80-89
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提出一種利用智能化水凝膠對物質進行包埋的方法。所謂智能化水凝膠是指該水凝膠具有反向溫度敏感性，亦稱為智能性。本發(fā)明提出的利用智能化水凝膠對生物活性物質進行包裹的方法，所采用的水凝膠具有如下結構或式中，表示任意形式的化學交聯，F(C)2和F(DC)2表示交聯點之間的嵌段共聚物鏈段，其中F代表具有反向溫敏性的大分子或寡聚物，C為聚合交聯部分，D為可降解部分。該凝膠由大單體通過聚合反應化學交聯而成，大分子單體的結構為F(C*)2或F(DC*)2，其中，C*為可聚合部分。包裹步驟如下在低溫下，將水凝膠在被包埋的物質的溶液中溶脹，使被包埋物質吸收進入凝膠的網絡中；然后直接在低溫下干燥，或者升高溫度使凝膠收縮，或者先升高溫度再干燥，使該物質包埋進凝膠的網絡孔徑中。這里所謂升高的溫度是指高于水凝膠的相轉變點溫度，但低于人或動物的體溫。所謂低溫是指低于水凝膠的相轉變溫度，但高于0℃。上述方法中，被包埋進水凝膠中的物質在高于水凝膠的相轉變溫度以上的溶液中釋放。上述方法中，相轉變溫度為低于人或哺乳動物的體溫。上述方法中，水凝膠要在被包埋物質的溶液中溶脹時間一般可為3天到1周。水凝膠在被包裹的物質的溶液中溶脹之后可以將吸附在表面的物質洗去再進行下一步驟的處理。上述方法中，將被包埋的物質吸收進入凝膠網絡中以后，升高溫度，所升高的溫度必須要高于凝膠的相轉變點溫度，使凝膠收縮并進一步凝膠化，從而防止被包埋進凝膠網絡本體中的物質泄露。上述方法中，將被包埋的物質吸收進入凝膠網絡中以后，在低溫下干燥，干燥的溫度低于凝膠的相轉變溫度。上述方法中，水凝膠可以為凝膠薄膜，或其它類型的大塊凝膠，但鑒于微凝膠的可注射性，最好為微凝膠。上述方法中，被包埋的物質可以是具有生物活性的。被包裹時，一般處于溶液狀態(tài)，溶劑為水、水溶液或生理緩沖溶液；濃度為0.5mg/ml-500mg/ml。具有生物活性物質是蛋白質或多肽等生物大分子及其衍生物，尤其是蛋白質藥物和其它生物技術藥物。圖1包裹血紅蛋白的凝膠薄膜釋放行為。圖2包裹BSA的凝膠薄膜的釋放行為。圖3包裹SOD的凝膠薄膜的釋放行為。圖4包裹BSA的微凝膠的釋放行為。圖5包裹溶菌酶的微凝膠的釋放行為。圖6包裹BSA的凝膠薄膜的釋放行為。圖7包裹FITC-dextran的凝膠薄膜的釋放行為。具體實施例方式下面通過實施例進一步描述本發(fā)明，但不限于這些實施例。實施例120g的PEO100-PPO65-PEO100，3.68g丙交酯和1.3ml的10mg/ml的異辛酸亞錫的苯溶液裝在50ml預先真空干燥的安瓿管內，將安瓿管于60℃油浴中抽真空6hr，以除去易揮發(fā)物，期間用氬氣置換數次，之后在真空下熱封安瓿管，再在150℃油浴中反應24hr，冷卻后用二氯甲烷溶解，然后用過量的無水乙醚沉淀并去除多余的辛酸亞錫，抽濾得到F127/寡聚酯共聚物，室溫下真空干燥2-3天。共聚產物的二氯甲烷溶液與丙烯酰氯(摩爾比為1∶20)反應，反應后過濾，濾液在無水乙醚(-10～0℃)中沉淀，收集沉淀，真空干燥，得大分子單體(PEO100-PPO65-PEO100)-LA16-DA。20％濃度的該大單體水溶液(有含有6％大分子單體的過硫酸胺和5％的抗壞血酸)在20℃的條件下制成凝膠薄膜。薄膜真空干燥后，室溫下用三氯甲烷萃取出凝膠中殘余的大單體，再干燥，然后再用4℃去離子水浸泡出殘余的三氯甲烷。該凝膠可以干燥備用，也可以直接使用。取干燥凝膠薄膜，在4℃的濃度為25mg/ml的血紅蛋白的磷酸緩沖溶液(PBS)中吸收5天，用4℃的PBS溶液洗去表面吸附的血紅蛋白后(這時切去凝膠的六面，肉眼即可看到凝膠呈深紅色)，然后在30℃條件下收縮。該凝膠在37℃的PBS溶液中釋放，一定時間內取0.5ml釋放液，并加入0.5ml新鮮的PBS溶液，蛋白質的濃度用Bradford法測定。釋放曲線見圖1，血紅蛋白的載藥量為170.5mg/gdrygel。實施例2與實施例1操作相同，20％濃度的該大單體((PEO100-PPO65-PEO100)-LA8-DA)水溶液(有含有6％大分子單體的過硫酸胺和5％的抗壞血酸)在20℃的條件下制成凝膠薄膜。薄膜真空干燥后，室溫下用三氯甲烷萃取出凝膠中殘余的大單體，再干燥，然后再用4℃去離子水浸泡出殘余的三氯甲烷。真空干燥后的凝膠薄膜，在4℃的濃度為25mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中吸收7天，然后用4℃的PBS溶液洗去表面吸附的BSA，然后在4℃的條件下干燥。干燥后的凝膠在37℃的PBS溶液中釋放，一定時間內取0.5ml釋放液，并加入0.5ml新鮮的PBS溶液，蛋白質的濃度用Bradford法測定。釋放曲線見圖2，BSA的載藥量為189.6mg/gdrygel。實施例3與實施例1操作相同，20％濃度的該大單體((PEO100-PPO65-PEO100)-LA2-DA)水溶液(有含有6％大分子單體的過硫酸胺和20μl的四甲基乙二胺)在60℃的條件下制成凝膠薄膜。薄膜真空干燥后，室溫下用三氯甲烷萃取出凝膠中殘余的大單體，再干燥，然后再用4℃去離子水浸泡出殘余的三氯甲烷。真空干燥后的凝膠薄膜，在1℃的濃度為20mg/ml的超氧化物歧化酶(SOD)的PBS溶液中吸收3天，然后用1℃的PBS溶液洗去表面吸附的SOD，然后在1℃的條件下干燥。干燥后的凝膠在37℃的PBS溶液中釋放，一定時間內取0.5ml釋放液，并加入0.5ml新鮮的PBS溶液，蛋白質的濃度用Bradford法測定。釋放曲線見圖3，SOD的載藥量為64.6mg/gdrygel。實施例4與實施例1操作相同，在有氮氣保護的四口燒瓶中先后加入司班80和正庚烷(司班80與正庚烷重量比為8％)，在冰浴中攪拌，攪拌速度為350轉/分鐘，滴加16.7％濃度的大單體((PEO100-PPO65-PEO100)-LA8-DA)水溶液(含有大單體重量3％的過硫酸胺和2.3％的抗壞血酸)，每秒1-2滴，正庚烷與大單體水溶液的重量比為12∶1。15分鐘后，將體系升溫至70℃，2小時后停止攪拌，趁熱用篩網過濾，丙酮和去離子水洗滌后，真空干燥。干燥后的微凝膠在濃度為25mg/ml的BSA的PBS溶液中在8℃條件下吸收5天，用8℃的PBS溶液洗去表面吸附的BSA，然后在8℃的條件下干燥。干燥后的微凝膠在37℃的PBS溶液中釋放，一定時間內取0.5ml釋放液，并加入0.5ml新鮮的PBS溶液，蛋白質的濃度用Bradford法測定。釋放曲線見圖4，BSA的載藥量為100.9mg/gdrygel。實施例5與實施例1操作相同，在有氮氣保護的四口燒瓶中先后加入司班60和正庚烷(司班60與正庚烷重量比為10％)，攪拌速度為450轉/分鐘，加熱至60℃，30分鐘后，滴加16.7％濃度的大單體((PEO100-PPO65-PEO100)-CL16-DA)水溶液(含有大單體重量3％的過硫酸胺和15μl的四甲基乙二胺)，每秒1-2滴，正庚烷與大單體水溶液的重量比為12∶1。1小時后停止攪拌，趁熱用篩網過濾，丙酮和去離子水洗滌后，真空干燥。干燥后的微凝膠在濃度為35mg/ml的溶菌酶的PBS溶液中吸收6天后用4℃的PBS溶液洗去表面吸附的溶菌酶，然后在4℃的條件下干燥。干燥后的微凝膠在37℃的PBS溶液中釋放，一定時間內取0.5ml釋放液，并加入0.5ml新鮮的PBS溶液，蛋白質的濃度用Bradford法測定。釋放曲線見圖5，溶菌酶的載藥量為60.9mg/gdrygel。實施例6稱取20gPEO100-PPO65-PEO100，溶于二氯甲烷中，PEO100-PPO65-PEO100的二氯甲烷溶液與丙烯酰氯(摩爾比為1∶15)反應，反應后過濾，濾液在無水乙醚(-10～0℃)中沉淀，收集沉淀，真空干燥，得大分子單體(PEO100-PPO65-PEO100)-DA。20％濃度的該大單體水溶液(有含有6％大分子單體的過硫酸胺和5％的抗壞血酸)在20℃的條件下制成凝膠薄膜。薄膜真空干燥后，室溫下用三氯甲烷萃取出凝膠中殘余的大單體，再干燥，然后再用4℃去離子水浸泡出殘余的三氯甲烷。真空干燥后的凝膠薄膜，在4℃的濃度為25mg/ml的BSA的PBS溶液中吸收5天，然后用4℃的PBS溶液洗去表面吸附的BSA，然后在4℃的條件下干燥。干燥后的凝膠在37℃的PBS溶液中釋放，一定時間內取0.5ml釋放液，并加入0.5ml新鮮的PBS溶液，蛋白質的濃度用Bradford法測定。釋放曲線見圖6，BSA的載藥量為96.3mg/gdrygel。實施例7與實施例1操作相同，16.7％濃度的該大單體((PEO100-PPO65-PEO100)-LA16-DA)水溶液(有含有5％大分子單體的過硫酸胺和20μl的四甲基乙二胺)在40℃的條件下制成凝膠薄膜。薄膜真空干燥后，室溫下用三氯甲烷萃取出凝膠中殘余的大單體，再干燥，然后再用4℃去離子水浸泡出殘余的三氯甲烷。真空干燥后的凝膠薄膜，在4℃的濃度為20mg/ml的FITC-dextran(4400)的水溶液中吸收6天，然后用4℃的水溶液洗去表面吸附的FITC-dextran，然后在30℃的條件下干燥。干燥后的凝膠在37℃的PBS溶液中釋放，一定時間內取0.5ml釋放液，并加入0.5ml新鮮的PBS溶液，FITC-dextran濃度用熒光法測定。釋放曲線見圖7，載藥量為47.1mg/gdrygel。權利要求1.一種利用智能化水凝膠對物質進行包裹的方法，其特征在于使用的水凝膠的結構為或式中，表示任意形式的化學交聯，F(C)2和F(DC)2表示交聯點之間的嵌段共聚物鏈段，其中F代表具有反向溫敏性的大分子或寡聚物，C為聚合交聯部分，D為可降解部分；包裹步驟如下低溫度下，將水凝膠在被包埋的物質的溶液中溶脹；然后直接在低溫下干燥，或者升高溫度使凝膠收縮，或者先升高溫度再干燥，使該物質包埋進凝膠的孔徑中；這里的低溫是指低于水凝膠的相轉變溫度，但高于0℃，高溫是指高于水凝膠的相轉變溫度，但低于人或動物的體溫。2.根據權利要求1所述的包裹方法，其特征在于水凝膠要在被包埋物質的溶液中溶脹時間為3天到1周。3.根據權利要求1所述的包裹方法，其特征在于在所升高的溫度高于凝膠的相轉變點溫度，使凝膠收縮凝膠網絡進一步凝膠化，防止被包埋進凝膠網絡本體中的物質泄露。4.根據權利要求1所述的包裹方法，其特征在于所用水凝膠為凝膠薄膜，或其它類型的大塊凝膠，或微凝膠。5.根據權利要求1所述的包裹方法，其特征在于被包埋物質具有生物活性，溶液的溶劑是水、水溶液或生理緩沖溶液。6.根據權利要求5所述的包裹方法，其特征在于被包埋的生物活性物質的濃度為0.5mg/ml-500mg/ml。7.根據權利要求1所述的包裹方法，其特征在于所述物質是生物大分子或其衍生物。8.根據權利要求5所述的包裹方法，其特征在于所述生物活性物質是蛋白質或多肽。全文摘要本發(fā)明屬于藥劑輔料
技術領域：
，具體為一種利用智能化水凝膠對生物活性物質進行包裹的方法。尤其指利用反向溫敏性水凝膠的溫敏性對具有生物活性的大分子物質進行后包裹。具體步驟是先在低于水凝膠相轉變溫度下溶解，使被包埋物質進入凝膠網絡中；然后低溫干燥，或在高于水凝膠相轉變溫度下干燥，使該物質包埋進凝膠網絡孔徑中。本發(fā)明方法包裹物質的量大，適應面廣。尤其適合于蛋白質和肽等藥物的包埋。文檔編號A61K47/30GK1562372SQ200410017389公開日2005年1月12日申請日期2004年4月1日優(yōu)先權日2004年4月1日發(fā)明者丁建東,張穎,王標兵,朱文申請人:復旦大學