專利名稱：一種夏枯草提取物及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中草藥提取物，特別是一種夏枯草提取物；本發(fā)明還涉及該提取物的制備方法與用途。
背景技術(shù)：
夏枯草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是最常用的中藥材之一，現(xiàn)載于2000版《中國(guó)藥典》一部，為唇形科植物夏枯草(Prunella.vulgaris L.)的干燥果穗。具有清火，明目，散結(jié)，消腫之功效。夏枯草中降糖素是降血糖作用的有效成分之一，其降糖機(jī)理在于修復(fù)胰島細(xì)胞，使胰島素分泌正常，從而達(dá)治療目的。醇提物對(duì)小鼠血糖的影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該提取物可對(duì)抗腎上腺素升高血糖作用，具有改善糖耐量、增加肝糖元合成的作用，機(jī)制可能與促進(jìn)胰島素分泌或增加組織對(duì)糖轉(zhuǎn)化利用有關(guān)。熊果酸及衍生物對(duì)細(xì)胞P388、L1210和人體肺腫瘤細(xì)胞A-549均具有顯著的細(xì)胞毒作用。在研究植物對(duì)SGC-7901細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)抗增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是其抗腫瘤作用機(jī)制之一。夏枯草皂苷具有明顯抗艾滋病毒作用。夏枯草總苷對(duì)麻醉大鼠急性心肌梗死的保護(hù)作用及降血壓作用研究中表明本植物的降血壓作用與其總皂苷有關(guān)。此外，在現(xiàn)有技術(shù)中，還沒有提出其它新的提取物及其新用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種新的夏枯草提取物。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提出了該新的夏枯草提取物的制備方法。
本發(fā)明還提出了該種新的夏枯草提取物的醫(yī)藥用途。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
一種夏枯草提取物，其特點(diǎn)是，所述提取物的活性成份總酚酸的含量為60-70％，迷迭香酸的含量為14％-21％。
本發(fā)明還公開了一種夏枯草提取物的制備方法，其特點(diǎn)是，取夏枯草藥材，分別以藥材4～12倍量的40～85％乙醇回流提取2～4次，每次1～2.5小時(shí)，濾過，合并醇提液，回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮至相對(duì)密度至1.0～1.15，靜置冷藏12～36小時(shí)，傾出上清液，加醇至含醇量達(dá)60～75％，加入濃氨水使PH等于7～8，回收乙醇，濃縮液加5-15％的HCL調(diào)PH為3～4，用乙酸乙酯萃取5-7次，每次用量為濃縮液的2～4倍，回收乙酸乙酯至密度為1.30～1.40的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
本發(fā)明還公開了另一種夏枯草提取物的制備方法，其特點(diǎn)是，取夏枯草藥材，分別以藥材4～12倍量的40～85％乙醇回流提取2-4次，每次1～2.5小時(shí)，濾過，水煎液濃縮至密度為1.0～1.15，上大孔樹脂柱，用8-10倍柱體積水洗脫，水洗液棄去，再用12～14倍柱體積的50％～70％的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇至密度為1.3-1.4的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
本發(fā)明還公開了另一種夏枯草提取物的制備方法，其特點(diǎn)是，取夏枯草藥材，分別以藥材4～12倍量的40～85％乙酸乙酯回流提取2-4次，每次1～2.5小時(shí)，濾過，回收乙酸乙酯液并濃縮至密度為1.3-1.4的稠膏，加藥材0.5～1.0倍量的0.1～0.5％的NaOH溶解，再用10～20％的HCL調(diào)PH至3-4，加乙酸乙酯萃取5-7次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯并濃縮至密度達(dá)1.3-1.4的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
以上所述的夏枯草提取物的制備方法，其特點(diǎn)是，所述提取物的干膏得率為1.5％-3.5％。
本發(fā)明還公開了一種夏枯草提取物制劑，其特點(diǎn)是，以所述的夏枯草提取物為活性成份，加入醫(yī)用輔料，制成任何一種劑型的藥劑。
本發(fā)明還公開了以上述的夏枯草提取物作為活性成份在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)腫脹、晨間僵直。該病在美國(guó)被視為影響人類健康的五大疾病之一，它使數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的病人喪失生活和工作能力，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致死亡。據(jù)WHO提供的數(shù)字，全球有1％的人患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，僅中國(guó)就有1000多萬(wàn)。治療RA的藥物分為兩類一類藥是非甾體類抗炎藥(NSAIDs)，具有鎮(zhèn)痛和消炎作用；另一類藥物為緩解疾病的抗風(fēng)濕藥物，包括金制劑、青霉胺、抗瘧藥、柳氮、磺吡啶、皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提出了一種新的夏枯草提取物及其制備方法與醫(yī)藥用途。經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明夏枯草提取物的酚酸部位具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有確切的治療作用，且其酚酸部位具有增強(qiáng)免疫抑制作用，與目前中藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制、趨勢(shì)相符，酚酸部位所選活性與雷公藤多甙片有異曲同工的作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1。一種夏枯草提取物，所述提取物的活性成份總酚酸的含量為70％，迷迭香酸的含量為21％。
實(shí)施例2。一種夏枯草提取物的制備方法，取夏枯草藥材，分別以藥材6、8、10倍量的60％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過，合并醇提液，回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮至相對(duì)密度至1.10，靜置冷藏24小時(shí)，傾出上清液，加醇至含醇量達(dá)65％，加入濃氨水使PH等于8，回收乙醇，濃縮液加10％的HCL調(diào)PH為3，用乙酸乙酯萃取6次，每次用量為濃縮液的3倍，回收乙酸乙酯至密度為1.35的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
實(shí)施例3。一種夏枯草提取物，所述提取物的活性成份總酚酸的含量為65％，迷迭香酸的含量為18％。其制備方法是，取夏枯草藥材，分別以藥材4、5、6、7倍量的40％乙醇回流提取4次，每次1小時(shí)，濾過，合并醇提液，回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮至相對(duì)密度至1.0，靜置冷藏12小時(shí)，傾出上清液，加醇至含醇量達(dá)60％，加入濃氨水使PH等于8，回收乙醇，濃縮液加5％的HCL調(diào)PH為4，用乙酸乙酯萃取5次，每次用量為濃縮液的4倍，回收乙酸乙酯至密度為1.30的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
實(shí)施例4。一種夏枯草提取物，所述提取物的活性成份總酚酸的含量為60％，迷迭香酸的含量為14％。其制備方法是，取夏枯草藥材，分別以藥材10、12倍量的85％乙醇回流提取2次，每次2.5小時(shí)，濾過，合并醇提液，回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮至相對(duì)密度至1.15，靜置冷藏36小時(shí)，傾出上清液，加醇至含醇量達(dá)75％，加入濃氨水使PH等于7.5，回收乙醇，濃縮液加5-15％的HCL調(diào)PH為3.5，用乙酸乙酯萃取7次，每次用量為濃縮液的2倍，回收乙酸乙酯至密度為1.40的稠膏，真空干燥，粉碎即得。所述提取物的干膏得率為1.5％。
實(shí)施例5。一種夏枯草提取物的制備方法，取夏枯草藥材，分別以藥材7、9、11倍量的60％乙醇回流提取3次，每次1.5小時(shí)，濾過，水煎液濃縮至密度為1.0，上大孔樹脂柱，用9倍柱體積水洗脫，水洗液棄去，再用13倍柱體積的60％的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇至密度為1.35的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
實(shí)施例6。一種夏枯草提取物，所述提取物的活性成份總酚酸的含量為68％，迷迭香酸的含量為20％。其制備方法是，取夏枯草藥材，分別以藥材4、5、6、7倍量的50％乙醇回流提取4次，每次1小時(shí)，濾過，水煎液濃縮至密度為1.10，上大孔樹脂柱，用8倍柱體積水洗脫，水洗液棄去，再用12倍柱體積的50％的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇至密度為1.3的稠膏，真空干燥，粉碎即得。所述提取物的干膏得率為2.5％。
實(shí)施例7。一種夏枯草提取物，所述提取物的活性成份總酚酸的含量為62％，迷迭香酸的含量為16％。其制備方法是，取夏枯草藥材，分別以藥材12、12倍量的85％乙醇回流提取2次，每次2.5小時(shí)，濾過，水煎液濃縮至密度為1.15，上大孔樹脂柱，用10倍柱體積水洗脫，水洗液棄去，再用14柱體積的70％的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇至密度為1.4的稠膏，真空干燥，粉碎即得。所述提取物的干膏得率為3.5％。
實(shí)施例8。一種夏枯草提取物的制備方法，其特征在于，取夏枯草藥材，分別以藥材5、6、7、8倍量的70％乙酸乙酯回流提取4次，每次1小時(shí)，濾過，回收乙酸乙酯液并濃縮至密度為1.3的稠膏，加藥材0.7倍量的0.25％的NaOH溶解，再用15％的HCL調(diào)PH至3.5，加乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯并濃縮至密度達(dá)1.35的稠膏，真空干燥，粉碎即得。所述提取物的干膏得率為2％。
實(shí)施例9。一種夏枯草提取物，所述提取物的活性成份總酚酸的含量為69％，迷迭香酸的含量為19％。其制備方法是，取夏枯草藥材，分別以藥材10、12倍量的65％乙酸乙酯回流提取2次，每次2.5小時(shí)，濾過，回收乙酸乙酯液并濃縮至密度為1.4的稠膏，加藥材1.0倍量的0.5％的NaOH溶解，再用20％的HCL調(diào)PH至4，加乙酸乙酯萃取7次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯并濃縮至密度這1.4的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
實(shí)施例10。一種夏枯草提取物，所述提取物的活性成份總酚酸的含量為70％，迷迭香酸的含量為20％。其制備方法是，取夏枯草藥材，分別以藥材8、10、12倍量的85％乙酸乙酯回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過，回收乙酸乙酯液并濃縮至密度為1.35的稠膏，加藥材0.5倍量的0.1％的NaOH溶解，再用10％的HCL調(diào)PH至3，加乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯并濃縮至密度達(dá)1.3的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
實(shí)施例11。一種夏枯草提取物制劑，取實(shí)施例1所述的夏枯草提取物150克，取糊精60克，按常規(guī)藥劑學(xué)工藝制成片劑1000片。用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
實(shí)施例12。一種夏枯草提取物制劑，取實(shí)施例2所述的夏枯草提取物150克，取淀粉75克，按常規(guī)藥劑學(xué)工藝制成顆粒劑1000袋。用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
實(shí)施例13。一種夏枯草提取物制劑，取實(shí)施例9所述的夏枯草總酚酸提取物150克，加入PEG4000 300克，按常規(guī)藥劑學(xué)工藝制成軟膠囊1000粒。用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
實(shí)施例14。夏枯草提取物藥效實(shí)驗(yàn)。
1、夏枯草藥材分別以藥材10倍、12倍、8倍量的65％乙醇回流提取3次，每次2.5小時(shí)，濾過，合并醇提液，回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮至相對(duì)密度至1.15，靜置冷藏24小時(shí)，傾出上清液，加醇至含醇量達(dá)70％，加入濃氨水使PH＝8，回收乙醇，濃縮液加10％的HCL調(diào)PH＝3，用乙酸乙酯萃取6次，每次用量為濃縮液的3倍，回收乙酸乙酯至稠膏(ρ＝1.30)，真空干燥，粉碎，加輔料，按常規(guī)藥劑學(xué)工藝制成膠囊劑。該膠囊劑以下簡(jiǎn)稱為XKC-AB1。
2、夏枯草藥材分別以藥材8倍、10倍、12倍量的85％乙醇回流提取3次，每次1.5小時(shí)，濾過，水煎液濃縮至ρ＝1.0，上大孔樹脂柱(D101型，樣品量與樹脂量為1∶2)，先用水洗脫(水量10BV，流速2BV/h)，水洗液棄去，再用12柱體積的60％的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇至稠膏(ρ＝1.4)，真空干燥，粉碎，加輔料，按常規(guī)藥劑學(xué)工藝制成片劑。該片劑以下簡(jiǎn)稱為XKC-AB2。
3、夏枯草藥材分別以藥材8倍、10倍、12倍量的70％乙醇回流提取3次，每次2.5小時(shí)，濾過，回收乙酸乙酯液并濃縮至稠膏(ρ＝1.35)，加藥材1.0倍量的0.5％的NaOH溶解，再用20％的HCL調(diào)PH＝4，加乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏(ρ＝1.4)，真空干燥，粉碎，加輔料，按常規(guī)藥劑學(xué)工藝制成顆粒劑。該顆粒劑以下簡(jiǎn)稱為XKC-AB3。
下面分別以上述的3種方法制成的制劑做藥效實(shí)驗(yàn)。
(一)、XKC-AB1的藥效實(shí)驗(yàn)。
1、實(shí)驗(yàn)材料1-1藥品與試劑藥品XKC-AB1，口服，每粒含生藥5-7g，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，臨用前用蒸餾水配成所需濃度。批號(hào)030509痹沖劑，遼寧省本溪第三制藥廠與泰國(guó)合資，批號(hào)020303。
試劑卡介苗，衛(wèi)生部上海生物制品研究所提供，批號(hào)020701，制備成弗氏(Freund’s)完全佐劑。
角叉菜膠，遼寧省藥物研究所產(chǎn)品。
伊文思藍(lán)(Evan’s，blue)，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站，批號(hào)030118。
冰醋酸，江蘇省啟東市精細(xì)化工二廠，批號(hào)020128，臨用前配成0.6％醋酸溶液。
1-2動(dòng)物SD大鼠、ICR小鼠，均出南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證蘇動(dòng)(質(zhì))02004。
1-3儀器722型分光關(guān)度計(jì)，上海分析儀器廠。
2000CA型液閃分析儀，Packard公司。
奧林巴斯顯微鏡，日本。
1-4統(tǒng)計(jì)方法表1、2、3、6、7、8、11、12，13、14、15采用t檢驗(yàn)，表4采用u檢驗(yàn)。
2、實(shí)驗(yàn)方法2-1 XKC-AB1對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響2-1-1對(duì)原發(fā)病變的影響取雄性大鼠40只，160g±20g，隨機(jī)分為五組，即(1)生理鹽水組生理鹽水10ml/kg；(2)痹組6.0g/Kg；(3)XKC-AB1小劑量組5.0g/Kg；(4)XKC-AB1中劑量組10.0g/Kg；(5)XKC-AB1大劑量組20.0g/Kg。各組按10ml/kg灌胃給藥，共給5日、于第3日給藥30min后，在大鼠右后肢足跖皮內(nèi)注射弗氏(Freund’s)完全佐劑0.05ml/只(其中含卡介苗7.5mg/ml)，然后繼續(xù)給藥2天。用容積法測(cè)定致炎前與致炎后12、18、24、48h大鼠足跖容積，以致炎前后足跖容積之差值為腫脹程度。結(jié)果見表1。
表1 XKC-AB1對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠原發(fā)病變的足腫脹的影響(X±S，n＝8)致炎前劑量 致炎后足腫脹度(ml)(h)(足腫脹抑制百分率％)組別 足容積(g/kg)(ml)12 182448生理鹽水組1.340.520.74 0.78 0.80±0.12 ±0.15 ±0.17±0.16±0.11痹組 6.01.330.44(15.4) 0.52*(29.7) 0.54*(30.8) 0.59*(26.3)±0.11 ±0.21 ±0.18±0.26±0.24XKC-AB1小劑量組 5.01.320.49(5.8) 0.67(9.5) 0.71(9.0) 0.70(12.5)±0.15 ±0.12 ±0.16±0.23±0.18XKC-AB1中劑量組 10.0 1.330.45(13.5) 0.58*(21.6) 0.61*(21.8) 0.65*(18.8)±0.16 ±0.16 ±0.11±0.13±0.15XKC-AB1大劑量組 20.0 1.350.44(21.2) 0.46**(37.8) 0.49**(37.3) 0.52**(35.0)±0.13 ±0.11 ±0.20±0.19±0.10*p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XKC-AB1中、大二個(gè)劑量組均能降低弗氏完全佐劑所致大鼠原發(fā)病變的足腫脹度，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01)。
2-1-2對(duì)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎(繼發(fā)性病變)的影響取雄性大鼠60只，170g±20g，用費(fèi)氏(Freund’S)完全佐劑0.05ml/只(其中含卡介苗7.5mg/ml)注射于右后足跖皮內(nèi)，致炎一周后將大鼠隨機(jī)分為五組，即(1)生理鹽水組生理鹽水10ml/kg；(2)痹組6.0g/Kg；(3)XKC-AB1小劑量組5.0g/Kg；(4)XKC-AB1中劑量組10.0g/Kg；(5)XKC-AB1大劑量組20.0g/Kg。各組每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥21日。同期另設(shè)一組正常組。并于注射佐劑前及注射佐劑后用容積法測(cè)定大鼠左右足跖容積。同側(cè)足跖于給佐劑前后容積之差為腫脹度(ml)，同時(shí)觀察大鼠前肢、耳部、尾部等部位的病變。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠頸動(dòng)脈放血，以2％EDTA-Na2抗凝，分離血漿，按說明書方法用FMJ-182放射免疫γ計(jì)數(shù)器測(cè)定前列腺素E2(PGE2)。同時(shí)取血清，測(cè)定大鼠白細(xì)胞介素I(IL-1)(其方法為①IL-1誘生給SD大鼠腹腔內(nèi)注入冷的含10％小牛血清的1640 20ml，輕揉腹部后取腹腔液，離心洗滌用24孔培養(yǎng)板制備細(xì)胞單層(巨噬細(xì)胞單層)，每孔再加1ml培養(yǎng)液，繼續(xù)置5％CO2、37℃中培養(yǎng)24小時(shí)，-30℃保存待測(cè)。②IL-1活性測(cè)定用小鼠胸腺細(xì)胞增殖法，取C57BL/6小鼠胸腺制備單個(gè)細(xì)胞懸液，用含10％小牛血清的1MDM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，加入3μg/ml的ConA，迅速混勻，盡快加入96孔細(xì)板中，每孔0.1ml，含細(xì)胞2*106個(gè)。在加入ConA-胸腺細(xì)胞前，先將待測(cè)樣品每孔加0.1ml，置5％CO2、37℃中培養(yǎng)60小時(shí)，每孔加0.2uci3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，收集細(xì)胞，測(cè)定3H-TdR摻入cpm值)。然后處死各組大鼠，立即取腎上腺、胸腺、脾臟稱重，并對(duì)大鼠左右后肢踝關(guān)節(jié)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，結(jié)果見表2、3、4、5、6、7、8、9、10。
表2 XKC-AB1對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎(繼發(fā)性病變)足腫脹(右足)的影響(X±S，n＝12)致炎前致炎后不同時(shí)間的足腫脹值(ml)(足腫脹抑制百分率％)劑量組別 足容積(g/kg)(ml) 8d 10d 14d 18d 22d 28d生理鹽水組1.36 0.920.99 1.61 2.22 1.92 1.84±0.15±0.11 ±0.46±0.46±0.51±0.22±0.31痹組 6.0 1.34 0.95(-3.3) 110**(31.7) 110**(31.7) 1.36**(38.7) 1.15**(40.1) 0.97**(47.3)±0.12±0.25 ±0.35±0.35±0.33±0.37±0.28XKC-AB1小5.0 1.37 0.89(3.3) 1.42(11.8)1.42(11.8)1.78*(19.8) 1.59*(17.2) 1.51*(17.9)劑量組±0.11±0.23 ±0.42±0.42±0.41±0.33±0.36XKC-AB1中10.01.38 0.94(-2.2) 1.07**(33.5) 1.07**(33.5) 1.08**(51.4) 1.01**(47.4) 0.91**(50.5)劑量組±0.13±0.17 ±0.30±0.30±0.43±0.31±0.22XKC-AB1大 20.01.35 0.93(-1.1) 0.86**(46.6) 0.86**(46.6) 0.89**(59.9) 0.81**(57.8) 0.69**(62.5)
劑量組 ±0.17±0.21±0.62±0.62±0.60±0.34±0.36*p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較表3 XKC-AB1對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎(繼發(fā)性病變)足腫脹(左足)的影響(X±S，n＝12)致炎前 致炎后不同時(shí)間的足腫脹值(ml)(足腫脹抑制百分率％)劑量組別 足容積(g/kg)(ml)10d 14d 18d 22d 28d生理鹽水組 1.350.21 0.68 0.93 0.89 0.75±0.16 ±0.14 ±0.19±0.50±0.42±0.31痹組 6.0 1.360.22(-4.8) 0.36**(47.1) 0.37**(60.2) 0.40*(55.1) 0.31**(58.7)±0.18 ±0.10 ±0.16±0.19±0.25±0.28XKC-AB1小5.0 1.350.23(-9.5) 0.52(23.5)0.75(19.4)0.53*(40.4) 0.44*(41.3)劑量組 ±0.14 ±0.15 ±0.21±0.39±0.38±0.32XKC-AB1中10.0 1.370.19(9.5)0.41**(39.7) 0.54**(41.9) 0.39*(56.2) 0.27**(64.0)劑量組 ±0.17 ±0.10 ±0.30±0.26±0.25±0.30XKC-AB1大20.0 1.380.24(-14.3) 0.30**(55.9) 0.44**(52.7) 0.36**(59.6) 0.23**(69.3)劑量組 ±0.16 ±0.17 ±0.18±0.31±0.34±0.27*p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較表4 XKC-AB1對(duì)弗氏完全佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠結(jié)節(jié)的影響劑量 動(dòng)物數(shù) 結(jié)節(jié)出現(xiàn)動(dòng)物數(shù)(n) 結(jié)節(jié)出現(xiàn)結(jié)節(jié)發(fā)組別動(dòng)物總數(shù)生率(g/kg)(n)耳部前肢尾部(n) (％)生理鹽水組 - 12 1 6 11 11 91.7痹組 6.0 12 0 1 2 2 16.6**XKC-AB1小劑量組 5.0 12 0 3 5 6 50.0*XKC-AB1中劑量組 10.0 12 0 2 3 4 33.3**XKC-AB1大劑量組 20.0 12 0 1 3 3 25.0***p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較表5 XKC-AB1對(duì)弗氏完全佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠各部位結(jié)節(jié)的影響(X±S)劑量 結(jié)節(jié)出現(xiàn)動(dòng)物數(shù)(n)組別(g/kg) 耳部 前肢 尾部生理鹽水組- 5.0±0.0(1)5.7±1.9(6)12.7±2.8(11)痹組 6.00.0±0.0(0)3.0±0.0(1)9.5±2.1(2)
XKC-AB1小劑量組 5.0 0.0±0.0(0)4.0±1.0(3)9.8±1.9(5)XKC-AB1中劑量組 10.00.0±0.0(0)3.5±0.7(2)8.3±1.5(3)XKC-AB1大劑量組 20.00.0±0.0(0)2.0±0.0(1)5.3±1.5(3)注表內(nèi)括號(hào)中的數(shù)據(jù)為出現(xiàn)結(jié)節(jié)的動(dòng)物數(shù)表6 XKC-AB1對(duì)弗氏完全佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血漿前列腺素E2(PGE2)(X±S)組別 劑量(g/kg) 動(dòng)物數(shù)(n) PGE2(cpm)正常組 - 12 415±72生理鹽水組 - 12 645±97△△痹組 6.012 495±90**XKC-AB1小劑量組 5.012 556±105*XKC-AB1中劑量組 10.0 12 517±132*XKC-AB1大劑量組 20.0 12 458±73**△△ P＜0.01 與正常組比較*p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較表7 XKC-AB1對(duì)弗氏完全佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清白細(xì)胞介素I(IL-1)的影響(X±S)組別 劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)(n) IL-1(cpm)正常組 - 12 653±87生理鹽水組 - 12 2298±416△△痹組 6.0 12 1195±215**XKC-AB1小劑量組 5.0 12 1951±309*XKC-AB1中劑量組 10.0 12 1287±268**XKC-AB1大劑量組 20.0 12 941±394**△△ P＜0.01 與正常組比較*p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較表8 XKC-AB1對(duì)弗氏完全佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠胸腺、脾臟、腎上腺重量的影響(X±S)劑量 動(dòng)物數(shù)胸腺 脾臟 腎上腺組別(g/kg)(只) (g/100g) (g/100g) (g/100g)正常- 120.18±0.050.35±0.080.02±0.01組 - 120.19±0.040.37±0.060.03±0.01生理鹽水6.0 120.20±0.060.35±0.070.03±0.01組 5.0 120.21±0.030.38±0.060.02±0.01痹 10.0 120.17±0.040.36±0.080.03±0.01組 20.0 120.18±0.050.37±0.090.03±0.01
XKC-AB1小劑量組XKC-AB1中劑量組XKC-AB1大劑量組表9 XKC-AB1對(duì)大鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)的影響(右足)關(guān)節(jié) 關(guān)節(jié)腔內(nèi)分泌 關(guān)節(jié)軟骨破 滑膜炎關(guān)節(jié)外軟組織炎組別數(shù)物壞 癥癥正常組 3 0/3 0/3 0/3 0/3生理鹽水組 6 4/6 5/6 6/6 6/6痹組 6 1/6 0/6 3/6 1/6XKC-AB1小劑量組 6 1/6 3/6 5/6 4/6XKC-AB1大劑量組 6 0/6 1/6 3/6 2/6表10 XKC-AB1對(duì)大鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)的影響(左足)關(guān)節(jié) 關(guān)節(jié)腔內(nèi)分泌 關(guān)節(jié)軟骨破 滑膜炎關(guān)節(jié)外軟組織炎組別數(shù)物壞 癥癥正常組 3 0/3 0/3 0/3 0/3生理鹽水組 6 1/6 2/6 6/6 1/6痹組 6 0/6 0/6 2/6 1/6XKC-AB1小劑量組 6 0/6 0/6 2/6 0/6XKC-AB1大劑量組 6 1/6 0/6 1/6 0/62-3、結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1.XKC-AB1三個(gè)劑量組能明顯抑制因弗氏完全佐劑引起的大鼠致炎側(cè)和對(duì)側(cè)后肢因遲發(fā)型超敏反應(yīng)引起的足腫脹，與生理鹽水組比較具有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01)(見表2、3)。
2.生理鹽水組大鼠于12天后前肢關(guān)節(jié)部位紅腫，有點(diǎn)狀結(jié)節(jié)；耳部出現(xiàn)結(jié)節(jié)，直徑約3mm左右；尾部關(guān)節(jié)有結(jié)節(jié)狀突起，呈串珠狀。XKC-AB1三個(gè)劑量組能明顯降低上述的結(jié)節(jié)發(fā)生率，與生理鹽水組比較具有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01)(見表4、5)。
3.XKC-AB1三個(gè)劑量組能明顯降低佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血漿前列腺素E2、血清白細(xì)胞介素I，與生理鹽水組比較具有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01)(見表6、7)。
4.XKC-AB1小、中、大三個(gè)劑量組對(duì)弗氏完全佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的胸腺、脾臟和腎上腺重量無(wú)明顯影響，與生理鹽水組比較無(wú)顯著性差異(P＜0.05>(見表8)。
5.組織學(xué)檢查(1)正常組雙側(cè)踝關(guān)節(jié)組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常。
(2)生理鹽水組右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見分泌物，成分為漿液、纖維素及炎細(xì)胞，關(guān)節(jié)軟骨部分破壞，滑膜出現(xiàn)血管輕度擴(kuò)張充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)外軟組織也見程度不等的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。左側(cè)踝關(guān)節(jié)主要表現(xiàn)為滑膜輕度充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
(3)痹組右側(cè)踝關(guān)節(jié)有1例外關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)分泌物，未見關(guān)節(jié)軟骨的破壞、脫落，3例出現(xiàn)滑膜炎癥，關(guān)節(jié)外軟組織僅1例出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。左側(cè)關(guān)節(jié)有2例主要表現(xiàn)為滑膜輕度炎癥，1例關(guān)節(jié)外軟組織少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，余末見異常。
(4)XKC-AB1小劑量組右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)僅1例出現(xiàn)分泌物，3例出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的破壞，5例出現(xiàn)滑膜炎癥反應(yīng)，4例出現(xiàn)關(guān)節(jié)外軟組織炎癥。左側(cè)關(guān)節(jié)僅1例出現(xiàn)滑膜炎癥，余末見異常。
(5)XKC-AB1大劑量組右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)均未見分泌物，1例出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨破壞，3例出現(xiàn)滑膜炎癥反應(yīng)，2例出現(xiàn)關(guān)節(jié)外軟組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)。左側(cè)關(guān)節(jié)有1例關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)少量分泌物，1例出現(xiàn)滑膜輕度炎癥，余末見異常。(見表9、10)。
2-2、XKC-AB1對(duì)其它炎癥反應(yīng)的影響2-2-1對(duì)角叉菜膠誘發(fā)足腫脹的影響取雄性大鼠40只，170g±20g，隨機(jī)分為五組，即(1)生理鹽水組生理鹽水10ml/kg；(2)痹組6.0g/Kg；(3)XKC-AB1小劑量5.0g/kg；(4)XKC-AB1中劑量組10.0g/Kg；(5)XKC-AB1大劑量組20.0g/Kg。各組按10ml/kg灌胃給藥，共給3日。末次給藥30分鐘后，在大鼠右后肢足跖皮下注射1％角叉菜膠0.05ml/只，用容積法測(cè)定致炎前與致炎后1、2、4、6h大鼠足跖容積。以致炎前后足跖容積之差值為腫脹程度。結(jié)果見表11。
表11 XKC-AB1對(duì)角叉菜膠致大鼠足肝臟的影響(X±S，n＝8)劑量 致炎前致炎后足腫脹度(ml)(h)(足抑制百分率％)組別 (g/kg)足容積(ml) 1 2 4 6生理鹽水組 1.33 0.52 0.73 1.07 0.90±0.15±0.15±0.28±0.18 ±0.11痹組 6.0 1.36 0.19**((51.3)0.27**(63.0) 0.59**(44.9) 0.54**(40.0)±0.17±0.11±0.18±0.26 ±0.24XKC-AB1小劑量組 5.0 1.32 0.34(12.8)0.52(28.8)0.8*5(25.9) 0.66**(26.7)±0.21±0.09±0.17±0.15 ±0.09XKC-AB1中劑量組 10.0 1.35 0.26*(50.0) 0.44*(39.7) 0.67**(37.4) 0.57**(36.7)±0.22±0.13±0.18±0.09 ±0.16XKC-AB1大劑量組20.0 1.38 0.21**(16.2) 0.32**(56.2) 0.49**(54.2) 0.41**(51.4)±0.16±0.12±0.10±0.1 ±0.09*p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XKC-AB1三個(gè)劑量組均能降低角叉菜膠致大鼠足腫脹度，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01>。
2-2-2對(duì)大鼠棉球肉芽腫形成的影響[3]取雄性大鼠40只，體重150±20g，將兩個(gè)10mg滅菌消毒棉球分別植人大鼠左右腋下，縫合皮膚、消毒。次日將大鼠分為五組，即(1)生理鹽水組生理鹽水10ml/Kg；(2)痹組6.0g/Kg；(3)XKC-AB1小劑量組5.0g/Kg；(4)XKC-AB1中劑量組10.0g/Kg；(5)XKC-AB1大劑量組20.0g/Kg。各組按10ml/kg灌胃給藥，共給8日，停藥后次日脫椎處死大鼠；取出棉球，剔除脂肪組織。稱取棉球濕重和干重(60℃烘干)，計(jì)算肉芽組織濕重和干重及其抑制率，結(jié)果見表12。
表12 XKC-AB1對(duì)大鼠棉球肉芽腫形成的影響(X±S，n＝8)濕重抑制 干重抑制劑量 肉芽組織濕重 肉芽組織干重組別 率 率(g/kg)(mg) (mg)(％) (％)生理鹽水 45.6±7.8組- 60.5±8.8 --痹 23.8±6.3**6.0 39.7±6.1**34.4 47.8組 38.0±5.2*5.0 52.4±7.2 13.4 16.7XKC-AB1小劑量組10.0 47.3±6.0**21.8 28.3XKC-AB1中劑量組 32.7±4.6**20.0 36.6±5.9**39.5 50.7XKC-AB1大劑量組22.5±6.1***p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XKC-AB1三個(gè)劑量組均能減少肉芽組織重量，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01>。
2-2-3對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響取19-22gICR小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)均分為五組，即叫生理鹽水組生理鹽水20ml/kg；(2)痹組12.0g/Kg；(3)XKC-AB1小劑量組10.0g/kg；(4)XKC-AB1中劑量組20.0g/kg；(5)XKC-AB1大劑量組40.0g/kg。各組按20ml/Kg每日灌胃給藥，共給3日。末次給藥后1h，尾靜脈注射0.05％伊文思蘭0.05ml/10g，并同時(shí)腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，20分鐘后脫頸椎處死，剪開腹腔，用5ml生理鹽水沖洗腹腔三次，取出腹腔液約4.5ml，離心5分鐘，在722型分光光度計(jì)590nm處測(cè)定OD值及其抑制率，見表13。
表13 XKC-AB1對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響動(dòng)物數(shù) 劑量 OD值 抑制率組別(只)(g/kg)(X±S)(％)生理鹽水組 10 - 0.661±0.162痹組 10 12.0 0.363±0.177**45.1XKC-AB1小劑量組 10 10.0 0.548±0.138 17.1XKC-AB1中劑量組 10 20.0 0.481±0.165*27.2XKC-AB1大劑量組 10 40.0 0.445±0.121**32.7*p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XKC-AB1中、大劑量組均能顯著地對(duì)抗醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性的增加，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。
3、XKC-AB1的鎮(zhèn)痛作用3-1對(duì)熱刺激的影響(熱板法)取18-21gICR雌性小鼠，恒溫(55±0.5℃)熱刺激致痛，預(yù)先測(cè)定痛閾值(以小鼠舔后足為疼痛反應(yīng)信息，以痛反應(yīng)的潛伏期為痛閾指標(biāo)，若不超過30s為合格小鼠)。挑選合格小鼠50只，隨機(jī)分為五組，即(1)生理鹽水組生理鹽水20ml/kg；(2)痹組12.0g/Kg；(3)XKC-AB1小劑量組；10.0g/Kg；(4)XKC-AB1中劑量組20.0g/Kg；(5)XKC-AB140.0g/Kg。各組均按20ml/kg灌胃給藥，并于給藥后30、60、90、120分鐘各測(cè)其痛閾值。結(jié)果見表14。
表14 XKC-AB1對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用(熱板法)(X±S，n＝10)痛閾值(s)劑量組別給藥前給藥后(min)(痛閾提高百分率％)(g/kg)306090120生理鹽水組- 20.323.1(13.8)21.2(-4.4)19.1(-5.9)19.6(-3.4)±5.8 ±7.5 ±11.7±8.4 ±8.0痹組 12.0 19.828.6*(14.4) 32.6**(64.6) 38.0**(91.9) 31.5*(59.1)
±4.4±8.7±10.5±14.1±12.1XKC-AB1小劑量組 10.0 19.4 24.5(26.3) 27.8(43.3)28.5*5(46.9) 26.6**(37.1)±5.1±6.1±12.4±12.6±11.5XKC-AB1中劑量組 20.0 20.7 27.2(31.4) 33.9**(63.8) 35.6**(72.0) 30.4*(46.9)±5.6±8.1±9.8 ±12.2±10.8XKC-AB1大劑量組 40.0 21.1 30.1*(12.7) 36.5**(73.0) 40.3**(91.0) 37.8**(79.1)±4.2±10.6 ±12.7±14.5±13.9*p＜0.05 **P＜0.01與給藥前比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XKC-AB1三個(gè)劑量組能提高小鼠的痛閾值，與給藥前組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01>。
3-2對(duì)化學(xué)刺激的影響(扭體法)取18-21gICR小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為五組，即(1)生理鹽水組生理鹽水20ml/kg；(2)痹組12.0g/Kg；(3)XKC-AB1小劑量組10.0g/Kg；(4)XKC-AB1中劑量組20.0g/Kg；(5)XKC-AB1大劑量組40.0g/Kg。各組均按20ml/kg灌胃給藥，給藥后30分鐘后腹腔注射0.5％醋酸0.2ml/只，觀察10分鐘內(nèi)各組小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)。結(jié)果見15。
表15 XKC-AB1對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用(扭體法)(X±S，n＝10)劑量 扭體反應(yīng)的次數(shù)(次/min)組別(g/kg)生理鹽水組 -32.8±12.9痹組 12.0 17.5±9.6**XKC-AB1小劑量組 10.0 24.7±8.5XKC-AB1中劑量組 20.0 21.3±6.1*XKC-AB1大劑量組 40.0 16.4±10.3***p＜0.05 **P＜0.01與生理鹽水組比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XKC-AB1中、高劑量組能顯著降低小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01>。
3、結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1①XKC-AB110.0g/Kg、20.0g/Kg二個(gè)劑量組均能降低弗氏完全佐劑致大鼠原發(fā)病變的足腫脹度，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01>。②XKC-AB15.0g/Kg、10.0g/Kg、20.0g/Kg三個(gè)劑量組能明顯抑制因弗氏完全佐劑引起的大鼠致炎側(cè)和對(duì)側(cè)后肢因遲發(fā)型超敏反應(yīng)引起的足腫脹，降低大鼠前肢、耳部、尾部結(jié)節(jié)的發(fā)生率；降低大鼠血漿前列腺素E2、血清白細(xì)胞介素I，與生理鹽水比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01>；但對(duì)弗氏完全佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的胸腺、脾臟和腎上腺重量無(wú)明顯影響；組織學(xué)檢查結(jié)果也表明XKC-AB15.0g/Kg、20.0g/Kg二個(gè)劑量組能夠減少大鼠踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分泌物、關(guān)節(jié)軟骨破壞、滑膜炎癥和關(guān)節(jié)外軟組織炎癥的關(guān)節(jié)數(shù)。提示XKC-AB1對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎有對(duì)抗作用。
2.XKC-AB15.0g/Kg、10.0g/Kg、20.0g/Kg三個(gè)劑量組能明顯降低角叉菜膠所致大鼠足腫脹度，減少棉球所致大鼠肉芽組織重量；而且XKC-AB110.0g/kg、20.0g/Kg、40.0g/Kg三個(gè)劑量組能顯著地對(duì)抗醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增加。各指標(biāo)與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01>。提示XKC-AB1具有抗炎作用。
3.XKC-AB110.0g/Kg、20.0g/Kg、40.0g/Kg三個(gè)劑量組均能提高熱刺激(熱板法)所致小鼠的痛閾值，與給藥前組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01>；也能顯著降低醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01>。提示XKC-AB1具有鎮(zhèn)痛作用。
綜上所述，XKC-AB1對(duì)弗氏完全佐劑所致大鼠的原發(fā)性和繼發(fā)性損害具有顯著的對(duì)抗作用，同時(shí)又能明顯減輕角叉菜膠性大鼠足腫脹，抑制大鼠肉芽組織的形成，降低小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性，減輕熱刺激、化學(xué)刺激所致的小鼠的疼痛性反應(yīng)，表明XKC-AB1具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用。
(二)、XKC-AB2的藥效實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料1-1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供室提供。
1-2.藥品與試劑XKC-AB2，口服，每粒含生藥5-7g，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，臨用前用蒸餾水配成所需濃度。
雷公藤多甙片上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)030105氟氏完全佐劑北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司主產(chǎn)，批號(hào)0301172、實(shí)驗(yàn)方法2-1.動(dòng)物分組選雄性健康Wistar大鼠60只，體重180±20克，實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)一周，隨機(jī)分為6組，每組各10只大鼠。
2-2.造模方法除空白對(duì)照組外各組大鼠在乙醚麻醉下于右后足趾皮內(nèi)注射氟氏完全佐劑0.1ml，先向下注射一半，再掉轉(zhuǎn)針頭向上注射完畢。
2-3.足趾容積的測(cè)量用玻璃容器法測(cè)量大鼠足趾容積取一20毫升量筒，內(nèi)徑2厘米，用記號(hào)筆在每只大鼠的左后及右后踝關(guān)節(jié)周圍作一標(biāo)記，大鼠乙醚麻醉后，將其待測(cè)足趾慢慢浸入量筒內(nèi)，使標(biāo)記與液面重疊，多余的液體自缺口處流出。取出大鼠足趾，可見量筒內(nèi)液面下降，其下降容積即為足趾容積。用1毫升移液管慢慢將液體注入到量筒內(nèi)，直到液面與缺口處相平而液體不流出，移液管的讀數(shù)即為大鼠的足趾容積，重復(fù)二次取均值。
2-4.給藥及觀測(cè)方法各組給藥劑量按人體-大鼠體表面積比值換算如下雷公藤多甙片組6.3mg/kg.d，XKC-AB2小劑量組5.0g生藥/kg.dXKC-AB2中劑量組10.0g生藥/kg.d；XKC-AB2大劑量組20g生藥/kg.d；正常組及模型組等容量生理鹽水。以上各組給藥容量相等。于注射佐劑前1小時(shí)，各組大鼠灌胃一次，并測(cè)量不同時(shí)間間隔大鼠右后足跖容積，計(jì)算其足跖腫脹度(足跖腫脹度＝致炎前足跖容積-致炎后足跖容積)；于致炎后第8d開始，各組大鼠繼續(xù)灌胃，每天1次，連續(xù)16天，并測(cè)量不同時(shí)間間隔大鼠左后足跖容積，計(jì)算其足跖腫脹度，同時(shí)觀察大鼠腳爪、耳及尾部出現(xiàn)紅斑、結(jié)節(jié)惰況，第24天采集標(biāo)本后處死全部大鼠。
2-5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)使用SAS軟件包統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行方差分析及q檢驗(yàn)，結(jié)果用x±SD表示。
3、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
3-1.XKC-AB2對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠原發(fā)性病變的影響于致炎前1小時(shí)給藥一次，并分別于致炎前1小時(shí)及致炎后第3、6.12、18、24h各測(cè)大鼠右足跖容積1次，計(jì)算其足跖腫脹度，結(jié)果見表1表1XKC-AB2對(duì)AA大鼠原發(fā)性足跖腫脹的影響(x±SD)大鼠右后足跖腫脹度(ml)組別 N 3h 6h 12h18h24h空白對(duì)照組100.002±0.004 0.006±0.007 0.01±0.0070.008±0.006 0.011±0.007模型對(duì)照組100.60±0.10*0.71±0.10*0.91±0.11*1.06±0.12*1.00±0.10*雷公藤多甙片 100.36±0.07▲*0.46±0.08▲*0.57±0.07▲*0.59±0.06▲*0.51±0.08▲*XKC-AB2(小) 100.46±0.08▲*0.57±007▲*0.67±0.07▲*0.73±0.08▲*0.65±0.08▲*XKC-AB2(中) 100.38±0.08▲*0.49±0.06▲*0.59±0.05▲*0.66±0.05▲*0.53±0.09▲*XKC-AB2(大) 100.33±0.06▲*0.42±0.07▲*0.49±0.06▲*0.56±0.05▲*0.42±0.08▲*與模型對(duì)照組比較 ▲P＜0.05 與空白對(duì)照組比較*P＜0.05從表1可以看出，注射佐劑后，模型組大鼠右后足跖逐漸腫脹，于造模后18h左右達(dá)到高峰，隨后開始下降。與模型組大鼠相比，雷公藤多甙片組和XKC-AB2各劑量組對(duì)AA大鼠原發(fā)性足跖腫脹均有很好的抑制作用，其中以雷公藤多甙片組和XKC-AB2大劑量組效果最好。
2.XKC-AB2對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性病變的影響模型對(duì)照組大鼠右后足趾在致炎后逐漸腫脹并于第24h達(dá)到高峰，持續(xù)3天后開始消退，于第8天后再次腫脹，于第15天達(dá)到高峰，以后逐漸消退。腫脹局部皮膚充血、紅腫、增厚、皮溫升高，觸之有明顯的躲避行為，大鼠爬行困難，倦怠，活動(dòng)和進(jìn)食均減少，體重增長(zhǎng)緩慢并于第15天開始有所下降，皮毛暗淡無(wú)光澤。從第10無(wú)起，左后肢、左前肢開始明顯腫賬，主要表現(xiàn)在踝關(guān)節(jié)，并逐漸累及整個(gè)腳趾，于腳趾關(guān)節(jié)間及前足跖出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大，耳和尾部出現(xiàn)紅斑和炎性小結(jié)；XKC-AB2各劑量組大鼠所出現(xiàn)的癥狀較輕，且進(jìn)食情況較好，體重持續(xù)增加，表現(xiàn)活躍，皮毛光華有光澤；雷公藤多甙組大鼠雖癥狀較輕，但進(jìn)食較少，體重增加緩慢，倦怠，不喜活動(dòng)，皮毛粗糙或發(fā)黃.于致炎后第8、10、12、16、20、24d所測(cè)各組大鼠足跖腫脹度結(jié)果見表2表2XKC-AB2對(duì)AA大鼠繼發(fā)性足跖腫脹的影響(x±SD)大鼠左后足跖腫脹度(ml)組別 N 8d 10d 12d 16d20d24d空白對(duì)照組 100.06±0.03 0.07±0.03 0.10±0.02 0.16±0.03 0.19±0.04 0.23±0.04模型對(duì)照組 100.10±0.05 0.31±0.13*0.64±0.14*0.84±0.16*0.95±0.19*0.89±0.19*雷公藤多甙片 100.06±0.04 0.33±0.08*0.52±0.13*0.51±0.11▲*0.47±0.12▲*0.42±0.11▲*XKC-AB2(小) 100.07±0.03 0.33±0.12*0.54±0.12*0.62±0.17▲*0.66±0.18▲*0.58±0.15▲*KKC-AB2(中) 100.07±0.03 0.27±0.07*0.50±0.09*0.47±0.11▲*0.44±0.12▲*0.40±0.11▲*XKC-AB2(大) 100.07±0.03 0.30±0.12*0.59±0.13*0.59±0.14▲*0.56±0.13▲*0.52±0.11▲*與模型對(duì)照組比較 ▲P＜0.05與空白對(duì)照組比較*P＜0.05從表2可以看出，從往射后第十天開始，模型組大鼠左后足跖逐漸腫脹，于造模后20d左右達(dá)到高峰，隨后開始下降。雷公藤多甙片組和XKC-AB2各劑量組對(duì)AA大鼠原發(fā)性足跖腫脹均有很好的抑制作用，其中以雷公藤多甙片組和XKC-AB2中劑量組效果最好，說明XKC-AB2中劑量抗免疫作用效果好。
(三)、XKC-AB3的藥效實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料1-1藥品與試劑XKC-AB3，含量為5-7g生藥/粒，口服，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，臨用前用蒸餾水配成所需濃度。批號(hào)020904。
疏風(fēng)活絡(luò)片，具有疏風(fēng)活絡(luò)、散寒祛濕之功，用于風(fēng)寒濕痹，四肢麻木，關(guān)節(jié)、腰膝酸癰等癥。含量為0.76(生藥)g/片，由珠海金沙(湖南)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)020508。
雷公藤多甙片，主治風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，含量為30mg/片，株洲制藥三廠生產(chǎn)，批號(hào)020324。
胃蛋白酶，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號(hào)020308丑。
冰醋酸，武漢市中南化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)030204。
DE-52層析樹脂，sigma公司北京天象人生物制品公司提供，批號(hào)011106。
小牛II型膠原蛋白，自制。
1-2、動(dòng)物ICR系、BALB/C系清潔級(jí)小鼠，體重18-20g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。合格證號(hào)152號(hào)。
SD系清潔級(jí)大鼠，體重140-160g，雄性，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。合格證號(hào)153號(hào)。
SD系清潔級(jí)大鼠，體重180-220g，由省中醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)035。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)027號(hào)。
1-3、儀器751G-W分光光度計(jì)，上海分析儀器廠生產(chǎn)。電子天平，湘儀儀器廠。
數(shù)字體溫儀，WMY-01型，上海分析儀器廠生產(chǎn)。NXE-1型錐板粘度計(jì)，成都儀器廠生產(chǎn)。QCC-A型磁性測(cè)厚儀，天津建筑實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)。
SN-695B型智能Y測(cè)量?jī)x，上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠生產(chǎn)。游標(biāo)卡尺，上海醫(yī)用儀表廠生產(chǎn)。HHS-85數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海天平儀器廠。
1-4、統(tǒng)計(jì)方法除特別說明外，均采用成組t檢驗(yàn)。
2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的影響1-1.方法取SD大鼠60只，雄性，隨機(jī)分成6組，體重150.0±7.6g，分別為模型空白組(蒸餾水10ml/kg)、模型對(duì)照組(蒸餾水10ml/kg)、疏風(fēng)活絡(luò)片組(疏風(fēng)活絡(luò)片0.4g生藥/kg，灌胃劑量為10ml/kg)、XKC-AB3低、中、高劑量組(分別XKC-AB35g、10g、20g生藥/kg，10ml/kg)。除模型空白組外，于其余動(dòng)物右后趾皮下注入Freunds’完全佐劑0.3ml/Kg以致炎，于致炎前1h灌胃給藥，每天1次，連續(xù)24天，停藥后觀察3天，觀察藥物對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用。
觀察指標(biāo)A、腫脹度測(cè)定采用游標(biāo)卡尺測(cè)定大鼠踝關(guān)節(jié)下約0.5Cm處的足趾中厚度代表足趾腫脹厚度，于致炎前及致炎后第8、12、15、18、21、24、27天測(cè)量左右后趾的厚度，右后足腫脹為原發(fā)性病變，左后足腫脹為繼發(fā)性病變，以所測(cè)厚度減去致炎前足趾厚度作為腫脹度，以腫脹度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。
1-2.內(nèi)容表1.XKC-AB3對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠原發(fā)性病變的影響(N＝10，X±S)致炎后不同時(shí)間足趾腫脹度(mm)組劑量第8天 第12天 第15天 第18天 第21天 第24天 第27天別(g/kg)空白 蒸餾 0.02 0.020.030.030.030.050.05組水±0.014*±0.018***±0.016***±0.014***±0.016***±0.021***±0.019***模型 蒸餾 0.02 0.931.962.172.482.262.00組水±0.012 ±0.45 ±0.74 ±0.83 ±0.73 ±0.68 ±0.81陽(yáng)性 0.4 0.02 0.700.891.081.201.060.98組 ±0.009*±0.29*±0.36***±0.51***±0.45***±0.39***±0.45***低劑 5.0 0.02 0.791.111.121.261.060.82量 ±0.018*±0.32*±0.44***±0.44***±0.49***±0.41***±0.31***中劑 10.0 0.01 0.760.981.081.160.940.81量 ±0.011*±0.31*±0.42***±0.36***±0.38***±0.35***±0.29***高劑 20.0 0.02 0.620.720.800.860.690.64量 ±0.01*±0.29*±0.33***±0.32***±0.27***±0.28***±0.26***與模型對(duì)照組比較，*p＞0.05**p＜0.05 ***P＜0.01表2.XKC-AB3對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性病變的影響(N＝10，X±S)組劑量第8天 第12天 第15天 第18天 第21天 第24天 第27天別(g/kg)空白 蒸餾0.02 0.020.030.030.030.050.05組水 ±0.014*±0.018***±0.016***±0.014***±0.016***±0.021***±0.019***模型 蒸餾0.02 0.931.962.172.482.262.00
組水 ±0.012±0.45±0.74 ±0.83 ±0.73 ±0.68 ±0.81陽(yáng)性 0.4 0.02 0.70 0.89 1.08 1.20 1.06 0.98組±0.009*±0.29*±0.36***±0.51***±0.45***±0.39***±0.45***低劑 5.0 0.02 0.79 1.11 1.12 1.26 1.06 0.82量±0.018*±0.32*±0.44***±0.44***±0.49***±0.41***±0.31***中劑 10.00.01 0.76 0.98 1.08 1.16 0.94 0.81量±0.011*±0.31*±0.42***±0.36***±0.38***±0.35***±0.29***高劑 20.00.02 0.62 0.72 0.80 0.86 0.69 0.64量±0.01*±0.29*±0.33***±0.32***±0.27***±0.28***±0.26***與模型對(duì)照組比較，*p＞0.05**p＜0.05 ***P＜0.012.對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的影響2-1方法制備II型膠原在4℃中將新鮮小牛關(guān)節(jié)軟骨搗碎，用Tris-HCI液浸泡洗滌得殘?jiān)儆梦傅鞍酌赶?，取上清液鹽析出膠原，過DE-52柱得到II型膠原蛋白。
膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的制作取SD大鼠60只，雄性，體重為148.6±6.5g，隨機(jī)分成6組，分別為模型空白組(蒸餾水10ml/kg)、模型對(duì)照組(蒸餾水10ml/kg)、疏風(fēng)活絡(luò)片組(疏風(fēng)活絡(luò)片5-7g(生藥)/kg，灌胃劑量為10ml/kg)、XKC-AB3低、中、高劑量組(分別口服XKC-AB35g、10g、20g生藥/kg)取冰醋酸溶解的II型膠原加入Freunds’佐劑研磨乳化，每只動(dòng)物(除模型空白組外)于尾根部、頸背部皮內(nèi)多點(diǎn)注入膠原共2.5mg/kg。7天后再于尾根部、頸背部皮內(nèi)注射膠原1.0mg/kg作加強(qiáng)免疫。
給藥治療觀察每鼠于第1次免疫后第10天開始給藥，每天1次，連續(xù)3周，觀察藥物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。從第1次免疫后第10天開始，每隔10天觀察下述指標(biāo)關(guān)節(jié)炎癥積分按文獻(xiàn)給大鼠計(jì)分，1分足爪或足墊單個(gè)區(qū)域炎癥，2分足爪或足墊兩個(gè)以上區(qū)域炎癥，3分整個(gè)肢體的輕度炎癥，4分引起關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形、功能障礙的重度炎癥，每足最高積分為4分，每鼠的總積分最高為16分。
1-2.內(nèi)容表3.XKC-AB3對(duì)II型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)通透性的影響(X±S)動(dòng)物數(shù) 劑量 不同時(shí)間的炎癥積分組別(n) (g/kg)第10天 第20天 第30天模型空白組 10 蒸餾水0.00±0.00***0.00±0.00***0.00±0.00***模型對(duì)照組 10 蒸餾水3.80±1.90 5.60±1.85 5.90±1.92疏風(fēng)活絡(luò)片組 10 0.4 3.40±2.46*2.60±2.63***2.20±1.54***XKC-AB3低劑量組 10 5.0 4.00±2.02*3.10±1.45***2.70±1.35***XKC-AB3中劑量組 10 10.0 3.90±1.57*2.90±1.51***2.50±1.36***XKC-AB3高劑量組 10 20.0 4.10±2.80*2.00±1.41***1.40±1.02***與模型對(duì)照組比較，*p＞0.05**p＜0.05 ***P＜0.013、結(jié)論表1、2、3可見與模型對(duì)照組比較，XKC-AB3各劑量組大鼠炎癥積分有顯著性降低。XKC-AB3各劑量對(duì)弗氏完全佐劑所致大鼠的原發(fā)性和繼發(fā)性損害具有顯著的對(duì)抗作用，對(duì)II型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎也有顯著的對(duì)抗作用。
權(quán)利要求
1.一種夏枯草提取物，其特征在于，所述提取物的活性成份總酚酸的含量為60-70％，迷迭香酸的含量為14％-21％。
2.如權(quán)利要求1所述的一種夏枯草提取物的制備方法，其特征在于，取夏枯草藥材，分別以藥材4～12倍量的40～85％乙醇回流提取2～4次，每次1～2.5小時(shí)，濾過，合并醇提液，回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮至相對(duì)密度至1.0～1.15，靜置冷藏12～36小時(shí)，傾出上清液，加醇至含醇量達(dá)60～75％，加入濃氨水使PH等于7～8，回收乙醇，濃縮液加5-15％的HCL調(diào)PH為3～4，用乙酸乙酯萃取5-7次，每次用量為濃縮液的2～4倍，回收乙酸乙酯至密度為1.30～1.40的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
3.如權(quán)利要求1所述的一種夏枯草提取物的制備方法，其特征在于，取夏枯草藥材，分別以藥材4～12倍量的40～85％乙醇回流提取2-4次，每次1～2.5小時(shí)，濾過，水煎液濃縮至密度為1.0～1.15，上大孔樹脂柱，用8-10倍柱體積水洗脫，水洗液棄去，再用12～14倍柱體積的50％～70％的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇至密度為1.3-1.4的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
4.如權(quán)利要求1所述的一種夏枯草提取物的制備方法，其特征在于，取夏枯草藥材，分別以藥材4～12倍量的40～85％乙酸乙酯回流提取2-4次，每次1～2.5小時(shí)，濾過，回收乙酸乙酯液并濃縮至密度為1.3-1.4的稠膏，加藥材0.5～1.0倍量的0.1～0.5％的NaOH溶解，再用10～20％的HCL調(diào)PH至3-4，加乙酸乙酯萃取5-7次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯并濃縮至密度達(dá)1.3-1.4的稠膏，真空干燥，粉碎即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4的一種夏枯草提取物的制備方法，其特征在于，所述提取物的干膏得率為1.5％-3.5％。
6.如權(quán)利要求1所述的一種夏枯草提取物制劑，其特征在于，以所述的夏枯草提取物為活性成份，加入醫(yī)用輔料，制成任何一種劑型的藥劑。
7.如權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述的夏枯草提取物作為活性成份在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種夏枯草提取物，其特征在于，所述提取物的活性成分總酚酸的含量為60－70％，迷迭香酸的含量為14％－21％。本發(fā)明還公開了該種夏枯草提取物的制備方法與新用途。本發(fā)明夏枯草提取物的酚酸部位具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有確切的治療作用，且其酚酸部位具有增強(qiáng)免疫抑制作用。
文檔編號(hào)A61P19/00GK1559519SQ20041001414
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月18日
發(fā)明者肖偉, 陳艷平, 王振中, 廖正根, 肖 偉 申請(qǐng)人:江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司