專利名稱：含有高濃度的異黃酮并具有高溶解度的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有異黃酮的組合物，盡管它具有高的純度，但是其在水中高度溶解，本發(fā)明還涉及一種制備該組合物的方法。
背景技術(shù)：
在大豆中所發(fā)現(xiàn)的異黃酮主要包括游離的異黃酮甙，例如黃豆甙、染料木甙以及大豆異黃銅；丙二?；慄S酮甙，例如6”-O-丙二?；S豆甙、6”-O-丙二?；玖夏具昂?”-O-丙二?；蠖巩慄S銅；乙?；慄S酮甙，例如6”-O-乙?；S豆甙、6”-O-乙?；玖夏具昂?”-O-乙?；蠖巩慄S銅；以及異黃酮甙元，例如黃豆苷元、染料木素和黃豆黃素。
異黃酮是大豆中的活性成分，其具有多種活性，例如減輕骨質(zhì)疏松癥和更年期綜合癥，并且被廣泛應(yīng)用，例如，用作健康食品的添加劑。因此，為了有效地攝取異黃酮，已開發(fā)出許多提取和純化異黃酮的方法。
JP-A 62-126186(專利文件1)披露了一種方法，其包括用水溶性有機溶劑回流提取豆汁或大豆而獲得提取物、讓提取物與例如苯乙烯-二乙烯基苯聚合物樹脂的合成吸附樹脂接觸、然后用水溶性有機溶劑(例如，乙醇或70％甲醇)從樹脂上洗下異黃酮。在專利文件1中，盡管對用于提取的水溶性有機溶劑的濃度沒有詳細的說明，但是在實施例2中所用的是80％乙醇水溶液。然而，專利文件1的目的是低成本地獲得大量的異黃酮，因此沒有關(guān)注所得組合物在水中的溶解性。
JP-A 8-283283(專利文件2)披露了一種純化丙二?；慄S酮甙的方法，包括用水提取大豆而得到提取物、將提取物與合成吸附樹脂接觸、然后用例如20-50％乙醇水溶液從樹脂上洗下異黃酮甙。專利文件2規(guī)定合適的提取溫度為45至65℃。專利文件2的目的是純化具有相對高親水性的丙二酰基異黃酮甙。然而，由于用水提取，異黃酮的提取率低，并且這樣也不能得到含高濃度的異黃酮的組合物。此外，關(guān)于所得組合物在水中的溶解性，也沒有描述。
專利文件1和2披露的方法所得到的組合物含低濃度的異黃酮，并且在水中的溶解性也不令人滿意。
JP-A 2002-80474(專利文件3)披露一種得到游離的異黃酮甙部分的方法，包括用低級醇的水溶液(例如，70％乙醇)在室溫至80℃下提取大豆胚軸得到提取物、將提取物與具有相同顆粒尺寸的陰離子交換樹脂接觸、用水沖洗樹脂、然后用例如70％乙醇水溶液從樹脂上洗脫游離的異黃酮甙。通過用陰離子交換樹脂純化所得到的組合物含有高濃度的異黃酮，也就是，含60％或更多。然而，由于是具有低溶解性的游離異黃酮甙的純化產(chǎn)品，該組合物在水中溶解性差，因而在水溶液中存在穩(wěn)定性的問題。
因此，專利文件1到3所披露的方法不能提供一種能被加到飲料中的具有高濃度的異黃酮并具有高溶解性的組合物。
這樣的問題是由異黃酮本身的低溶解性所引起的。例如，黃豆甙的溶解度僅大約為3.3mg/100ml。JP-A 10-298175(專利文件4)披露了一種提高異黃酮水溶解性的方法，包括用70-90％醇水溶液在約70℃下回流提取大豆胚軸得到提取物，將提取物與合成吸附樹脂接觸，用30-80％醇水溶液洗脫樹脂得到含有異黃酮的組合物，然后含有異黃酮的組合物與環(huán)糊精形成包合物。由于該方法需要向異黃酮提取物中加入至少等摩爾量的環(huán)糊精，最終產(chǎn)品中的異黃酮含量大為降低。而且，由于最終產(chǎn)品的溶解性取決于環(huán)糊精本身的溶解性，在使用時，需要通過加熱來溶解包合物的步驟，此外，在更高濃度時，包合物也不能被溶解。
JP-A 2000-327692(專利文件5)披露了一種增加溶解性的方法，包括通過在α-甙糖化合物存在下甙轉(zhuǎn)移酶的作用而形成α-甙異黃酮。然而，由于需要加入至少等摩爾量的糖化合物，該方法也存在降低異黃酮含量的問題。
因此，有必要開發(fā)一種含有異黃酮的組合物，其具有高的純度，在水中在高濃度下，能以自然方式被穩(wěn)定地溶解，不需要使用任何的例如環(huán)糊精的助溶劑，或任何的例如糖化合物的附加劑，因而適用于飲料等等。
參考資料專利文件1JP-A 62-126186
專利文件2JP-A 8-283283專利文件3JP-A 2002-80474專利文件4JP-A 10-298175專利文件5JP-A 2000-327692發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明要提供一種新的含有異黃酮的組合物，盡管其具有高的純度，但是在水中以自然狀態(tài)具有高溶解性，不需要加入任何的助溶劑或應(yīng)用任何的化學改性劑，本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)該含有異黃酮組合物的方法。
解決所述問題的辦法本發(fā)明者深入地研究，結(jié)果從大豆胚軸中制得一種含有異黃酮的組合物，其含有特定比例的丙二?；慄S酮甙、除了丙二?；慄S酮甙的異黃酮甙以及皂甙，后來發(fā)現(xiàn)該含有異黃酮的組合物令人驚訝地含有高濃度的異黃酮并且具有顯著的高溶解性。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該含有異黃酮的組合物能夠通過用醇水溶液在特定的溫度范圍內(nèi)提取大豆胚軸、用非極性的合成吸附樹脂吸附所得的提取物、然后用特定醇濃度的醇水溶液洗脫樹脂而制得，作為一種特別優(yōu)選的制備方法。
也就是，本發(fā)明披露了下列發(fā)明(1)一種含有異黃酮的組合物，其包括15-95％重量的丙二酰基異黃酮甙、0-50％重量的除了丙二酰基異黃酮甙的異黃酮以及5-60％重量的皂甙，將所述的組合物中異黃酮和皂甙的總量之和定為100％重量；(2)依照上述(1)的含有異黃酮的組合物，它是以大豆胚軸作為起始原料而制得的；(3)依照上述(1)的含有異黃酮的組合物，其中在皂甙中A組皂甙的比例為55％重量或更多，在所述的組合物中皂甙的總量為100％重量；(4)依照上述(1)的含有異黃酮的組合物，在25℃時，其水溶解度基于異黃酮的數(shù)量為20mg/100ml(5)一種生產(chǎn)依照上述(2)的含有異黃酮的組合物，包括在10-50℃下用15-95％體積的乙醇水溶液提取大豆胚軸的步驟；
(6)一種生產(chǎn)依照上述(2)的含有異黃酮的組合物，其包括步驟(A)在10-50℃下用15-95％體積的乙醇水溶液提取大豆胚軸得到提取物；(B)使(A)步驟所得到的提取液與非極性的吸附樹脂接觸，使異黃酮吸附于樹脂上；和(C)用15-40％體積的乙醇水溶液從吸附樹脂上洗脫異黃酮；(7)一種可食用的組合物，含有依照上述(1)的含有異黃酮的組合物；和(8)一種分離異黃酮和皂甙的生產(chǎn)工藝，其包括在10-50℃下用15-95％體積的乙醇水溶液提取大豆胚軸得到提取物，將提取物水溶液與非極性的吸附樹脂接觸，用15-40％體積的乙醇水溶液從吸附樹脂上洗脫含有異黃酮的部分，然后用65-90％體積的乙醇水溶液從吸附樹脂上洗脫含皂甙的部分。
發(fā)明的效果本發(fā)明能夠提供一種含有異黃酮的組合物，其具有高的溶解性，并包含沒有加任何的溶解助劑或沒有應(yīng)用任何的化學改性劑的以自然形態(tài)存在的高濃度異黃酮，并且與被認為在水中易溶的常規(guī)的含有異黃酮組合物相比，所述的組合物在水中具有高度的溶解性。
發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的含有異黃酮組合物優(yōu)選在總固體成分中包含25-95％重量的異黃酮，更優(yōu)選25-60％重量，還更優(yōu)選30-60％重量，最優(yōu)選40-60％重量。
本發(fā)明的含有異黃酮組合物具有下列三個特征，其中在所述的組合物中所包含的異黃酮和皂甙的總量之和被定為100％1、丙二?；慄S酮甙的含量為15-95％重量，更優(yōu)選20-90％重量，還更優(yōu)選25-85％重量，最優(yōu)選30-80％重量；2、除丙二?；慄S酮甙外的異黃酮的含量(舉例來說，異黃酮甙、乙酰基異黃酮甙、異黃酮甙元等等，也就是，從所有異黃酮的總量中減去丙二?；慄S酮甙的量后的數(shù)量)，為0-50％重量，更優(yōu)選0-45％重量，還更優(yōu)選0-40％重量，最優(yōu)選0-30％重量；和3、皂甙的含量為5-60％重量，更優(yōu)選10-50％重量，還更優(yōu)選15-45％重量，最優(yōu)選為20-40％重量。
通過使用在上述范圍內(nèi)的成分百分數(shù)，可制得含有異黃酮的組合物，盡管其包含高濃度的異黃酮，其在水中具有高溶解性，而且溶解之后，既便在冷藏下也保持高度穩(wěn)定性。
只要在上述所述的范圍之內(nèi)，本發(fā)明的含有異黃酮組合物的成分百分數(shù)沒有被特別限制。更具體地，除了異黃酮和皂甙之外，本發(fā)明的含有異黃酮的組合物可包含基于總固體成分的8-20％重量的蛋白質(zhì)，以及還可包含糖。更優(yōu)選皂甙的含量為異黃酮含量的1/4至3/4重量。
大豆皂甙包括A組皂甙、B組皂甙、E組皂甙等等。將所述的組合物中皂甙的總量定為100％重量，在本發(fā)明的含有異黃酮的組合物中所包含的皂甙中A組皂甙的合適比例為至少55％重量，更優(yōu)選至少60％重量。
在本發(fā)明的含有異黃酮組合物中，異黃酮在水中的溶解度為25℃時至少20mg/100ml，優(yōu)選50-1200mg/100ml，更優(yōu)選100-1200mg/100ml，還更優(yōu)選500-1200mg/100ml。本發(fā)明的含有異黃酮組合物不但具有高溶解性，而且如上所述的高濃度溶液甚至冷藏(10℃或更低)一段時間也不形成沉淀和變得混濁。在本發(fā)明中，“溶解度”被定義為在25℃時在100ml的水中能夠溶解的溶質(zhì)的最大數(shù)量(g)，并以異黃酮的量(mg)表示。
本發(fā)明的含有異黃酮組合物可以含有例如環(huán)糊精或淀粉琥珀酸辛酯的助溶劑，使不溶的物質(zhì)溶解，或可以含有親水性糖化合物，通過糖轉(zhuǎn)移酶等的作用，使組合物中的異黃酮和糖化合物粘結(jié)。然而，加入這樣的添加劑不是必需的，并且優(yōu)選避免加入這樣的添加劑。這是因為當加入這樣的添加劑時，異黃酮在所得到的組合物總固體成分中的比例下降，并且，當組合物含環(huán)糊精時，由于環(huán)糊精在室溫時低的溶解性，如果不加熱，所得到的組合物幾乎不溶解。因此，如果加入助溶劑，優(yōu)選所加入的量少于含有異黃酮組合物中所含的異黃酮的量。
上面所述的本發(fā)明的含有異黃酮組合物是含高濃度的異黃酮并具有高溶解性的組合物，并且也是新的天然原料，其不需要加入任何的助溶劑和化學改進劑。還不能解釋本發(fā)明的含有異黃酮組合物不顧組合物含有高濃度的通常在水中溶解性不好的異黃酮的事實而具有高溶解性的原因。換句話說，還不能說明增溶的機理。然而，看來在大豆胚軸中所含的按特定量共存的除皂甙和異黃酮以外的成分與異黃酮相互作用，由此而使異黃酮變得高度溶解。
下文中將描述制備本發(fā)明的含有異黃酮組合物的方法方面。
(用于提取的起始原料)用于提取本發(fā)明的含有異黃酮組合物的起始原料包括但不限于整個大豆、脫脂大豆、分離后的大豆蛋白、大豆凝乳廢物(okara)等等。優(yōu)選使用大豆胚軸。大豆胚軸的異黃酮含量占總固體成分重量的1-2％，這比大豆種子中含量10倍還要多。因此，大豆胚軸是用來獲得具有高的純度的含有異黃酮組合物的優(yōu)選原料，并對于獲得具有高溶解性的含有異黃酮組合物來說也是重要的。盡管溶解性和皂甙組分之間的關(guān)系是未知的，A組皂甙占大豆胚軸的總皂甙重量比例為60％或更多而B組皂甙的比例更低。在大豆胚軸與大豆子葉中這樣的皂甙組分(A組∶B組的比例)是不同的。制備大豆胚軸的方法沒有特殊的限制，例如通過去除大豆的表皮、然后將其粗粗地碾壓便可以將其容易地分離出。優(yōu)選地，這樣得到的大豆胚軸通過篩分，提高了胚軸的純度。作為選擇，也可使用被作為“大豆胚軸”或“大豆微生物”而出售的商業(yè)性產(chǎn)品。為了改善其香味等，對大豆胚軸進行預(yù)處理，例如加熱處理。然而，通過加熱，丙二?；慄S酮甙可能轉(zhuǎn)化為游離的甙，并在這情況下，將異黃酮從其他成分例如皂甙中分離出來變得困難。因此，優(yōu)選使用未加工過的大豆胚軸或微熱處理后的大豆胚軸。也可以使用全脂大豆或脫脂大豆。然而，它們的異黃酮含量低，所以獲得所要純度的異黃酮是費時和費錢的。因此，大豆胚軸是優(yōu)選的(提取溶劑)作為從大豆胚軸中提取異黃酮的溶劑，可以使用水溶性的含醇有機溶劑，例如乙醇、甲醇或丙醇?？紤]到用于食品，優(yōu)選使用乙醇。提取溶劑的醇濃度優(yōu)選為15-95％體積，更優(yōu)選30-90％體積，還更優(yōu)選40-85％體積，并最優(yōu)選為60-80％體積。當醇濃度太低時，異黃酮難于被提取出，導(dǎo)致異黃酮的產(chǎn)率下降，另外，在大豆胚軸所天然含的β-甙酶的作用下，在提取過程中，如大豆甙和染料木甙和丙二?；慄S酮甙的異黃酮甙將趨于轉(zhuǎn)化成如大豆甙元和染料木素的異黃酮甙元，以至于難于獲得具有高溶解性的含有異黃酮組合物。當醇濃度太高時，異黃酮的產(chǎn)率下降，此外，產(chǎn)品的成本提高。因此，這樣的高濃度醇水溶液是不合適的。
(提取溫度)在本發(fā)明中，提取溫度10至50℃是重要的，更優(yōu)選20至40℃。由于室溫在上述溫度范圍內(nèi)，所以沒有必要說可以在室溫下進行提取。當提取溫度太低時，提取的效率下降。相反，當提取的溫度太高時，丙二?；慄S酮甙發(fā)生熱降解然后轉(zhuǎn)變成游離的異黃酮甙，結(jié)果難于獲得在25℃時具有高溶解性的含有異黃酮組合物。以胚軸作為起始原料，通過用如上所述的特定濃度的溶劑并在特定的溫度下提取，異黃酮能以80％或更多的高產(chǎn)率以高濃度的含有異黃酮的溶液形式被提取得到，其取決于提取的條件。為了提高異黃酮的產(chǎn)率，上述所述的提取步驟優(yōu)選被重復(fù)不止一次。
(吸附劑的處理)上述所述的提取步驟所獲得的異黃酮粗提取物，經(jīng)過純化而得到具有高溶解性并含高濃度的異黃酮的含有異黃酮組合物。第一步純化包括將粗提取物溶于水中，如必要的話，將粗提取物與非極性吸附樹脂。由于通過上述所述的提取步驟所獲得的提取物含有醇，如有必要的話，優(yōu)選將其進行預(yù)處理，例如除去醇并濃縮。由于起始原料中所含的油脂在提取溶劑的醇濃度高時可能被提取出來，起始原料或提取物可以被脫脂。所使用的非極性吸附樹脂優(yōu)選包括非極性的合成吸附樹脂，例如HP-20(Mitsubishi化學公司所制造)、SP-825(Mitsubishi化學公司所制造)、Amberlite XAD-2和XAD-4(Rohm和Haas公司所制造)、以及Duolite S-861和S-862(Sumitomo化學工業(yè)公司所制造)，它們?yōu)槎嗫妆揭蚁?二乙烯基苯樹脂。極性陽離子交換樹脂Duolite C26A(Sumitomo化學工業(yè)公司所制造)，以及陰離子交換樹脂WA-30(Mitsubishi化學公司所制造)，由于它們不吸附異黃酮或所得的異黃酮原料的低溶解性，所以是不合適的。通過將吸附樹脂放入罐中，或者將吸附樹脂裝入柱中，來對吸附劑進行批處理。從產(chǎn)率和生產(chǎn)力角度來說，最好是將粗提取物的水溶液通過裝有樹脂的樹脂柱。
(含有異黃酮組合物的洗脫)
下一步，用含醇有機溶劑的水溶液從吸附于吸附樹脂的片段中選擇性地洗脫并收集特定的異黃酮。含醇有機溶劑的水溶液優(yōu)選為乙醇水溶液。在本發(fā)明中，重要的是洗脫溶劑的乙醇濃度為15-40％體積，更優(yōu)選為20-35％體積。當乙醇濃度太低時，需要大量的溶劑來收集異黃酮組合物，并且異黃酮不好被洗脫下來，結(jié)果在所得的組合物中異黃酮的濃度降低。當乙醇濃度太高時，除異黃酮以外的大量的雜質(zhì)，例如皂甙，將要被洗脫下來，結(jié)果所得的組合物中異黃酮的純度下降，此外，具有低水溶性的非極性物質(zhì)，例如異黃酮甙元，也要被洗脫下來，結(jié)果不能獲得具有高溶解性的異黃酮片段。
(含有異黃酮組合物的生產(chǎn)方法)通過上述所述的產(chǎn)品制備方法而獲得的含有異黃酮組合物在被加熱之后，減壓蒸發(fā)以除去有機溶劑，然后進行濃縮，濃縮物可被用作為“異黃酮提取物”，或通過噴霧干燥、冷凍干燥等制成粉末。這樣所獲得的含有異黃酮的組合物為包含高濃度異黃酮的新的含有異黃酮組合物，并具有非常高的溶解性，其中異黃酮濃度占總的固體成分重量的25-95％，并且在25℃時水溶解度至少基于異黃酮的數(shù)量為20mg/100ml。
(酸沉淀處理)上述所述方法獲得的含有異黃酮組合物可在常用的濃度范圍內(nèi)被應(yīng)用，例如，基于異黃酮的量為20mg/100ml。然而，當含有異黃酮的組合物以高濃度被加到酸性食物或飲料中時，可事先將含有異黃酮的組合物的pH調(diào)整到酸性范圍，接著除去所產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì))，以提高溶液的澄明度?？捎每墒秤脽o機酸或有機酸來調(diào)節(jié)pH值，例如可用鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸或抗壞血酸維生素C。含有異黃酮組合物的pH可被調(diào)到要加入的食物或飲料的pH或更低，通常為pH4或更低，優(yōu)選pH3.5或更低。然后，將含有異黃酮的組合物在酸性pH下保持一段預(yù)定的時間。在整個時間過程中，組合物在室溫或更低溫度下，優(yōu)選10℃或更低溫度下，保持穩(wěn)定。大豆胚軸等提取物通常包含蛋白質(zhì)和異黃酮。當提取物中的蛋白質(zhì)在酸性條件下沉淀時，其沉淀通常趨向于與異黃酮的沉淀相結(jié)合(共沉淀)。然而，在本發(fā)明中，由于用醇提取并用吸附樹脂純化，降低了本發(fā)明的含有異黃酮提取物中蛋白質(zhì)的含量，從而避免發(fā)生這樣的共沉淀?？赏ㄟ^像過濾和離心的常規(guī)固-液分離方法來從不溶性物質(zhì)中分離出異黃酮。
(含皂甙組分的洗脫)在本發(fā)明中，在用15-40％體積的乙醇水溶液從非極性吸附樹脂洗出含有異黃酮組分之后，主要包含皂甙的組分仍然被吸附在樹脂上。用更高濃度的醇能夠洗脫含皂甙的組分，優(yōu)選用60-95％體積、更優(yōu)選65-90％體積的乙醇水溶液來得到皂甙含量占總固體成分重量的40％或更多的含皂甙組合物。如上所述，通過在特定溫度下獲得提取物、將提取物吸附于非極性吸附樹脂上并接著用不同濃度的醇水溶液從樹脂上洗出組分而有效地分離含高濃度的異黃酮并具有高溶解性的異黃酮組分以及含高濃度皂甙的皂甙組分，并由此能夠提供含高濃度皂甙的皂甙原料。
(食物的適用性)由于含有異黃酮的組合物含高濃度的異黃酮，所以通過僅僅加入少量的如此獲得的含有異黃酮的組合物到像藥品、食品和飲料的各種可食用的組合物中，便能夠向攝取所述的可食用的組合物的人提供大量的異黃酮。而且，由于在含有異黃酮的組合物中同時含有皂甙，異黃酮和皂甙兩成分能夠有效地被吸收。由于含有異黃酮的組合物是高度溶解的，在液體藥物和食物方面，其特別有效。該含有異黃酮的組合物可以以如片劑或膠囊的固體形式被供應(yīng)。通過利用其高溶解性，該含有異黃酮的組合物也可以以如一份的濃縮液形式被供應(yīng)，因而可被用作例如果醬和沙司的調(diào)味品的成分。
在本發(fā)明中，根據(jù)日本健康食品和營養(yǎng)品食品協(xié)會所制訂的大豆異黃酮標準分析方法來進行異黃酮的分析。通過下面所述的薄層色譜來測定皂甙，通過Kjeldahl方法來測定蛋白質(zhì)。
(異黃酮的定量方法)精確稱取1到10mg的異黃酮樣品，并向樣品中加入25ml的70％(V/V)乙醇。在室溫下攪動30分鐘提取之后，對提取物進行離心。用上述同樣的方法再提取殘余物兩次。合并三次的提取液，用70％(V/V)乙醇調(diào)整體積為100ml，然后用0.45μm的PVDF濾紙過濾，得到供試溶液。在異黃酮的確認試驗中，供試溶液的峰的確認是通過與12種標準品，即大豆甙、染料木甙、大豆異黃銅、大豆甙元、染料木素、黃豆黃素、丙二?；蠖惯啊⒈；玖夏具啊⒈；蠖巩慄S銅、乙?；蠖惯啊⒁阴；玖夏具耙约耙阴；蠖巩慄S銅(均由Waco Pure化學工業(yè)研究所制備的)相比較，具有大約相同的保留時間，進行確認。在含量測定方面，通過使用大豆甙標準品作為內(nèi)標，來測定供試溶液中12種異黃酮的濃度(等量轉(zhuǎn)換為大豆甙)。通過將所得的值乘以下列數(shù)量因子來計算真正的異黃酮的濃度大豆甙(1.000)、染料木甙(0.814)、大豆異黃銅(1.090)、丙二酰基大豆甙(1.444)、丙二?；玖夏具?1.095)、丙二?；蠖巩慄S銅(1.351)、乙?；蠖惯?1.094)、乙?；玖夏具?1.064)以及乙?；蠖巩慄S銅(1.197)、大豆甙元(0.583)、染料木素(0.528)、以及黃豆黃素(0.740)。從所有異黃酮濃度的之和測得異黃酮的總量。供試溶液和標準溶液的HPLC條件如表1所示。
(表1)HPLC條件

(皂甙的測定)精確稱取樣品，用乙醇攪動1小時提取，然后離心得到提取液。再重復(fù)該操作。合并所得的提取液，將合并后溶液的體積調(diào)到預(yù)定的體積。將該樣品溶液在薄層色譜(TLC)板上點樣。樣品點的Rf值與皂甙標準品的Rf值相比較，以確認樣品中有皂甙斑點。通過使用事先用皂甙標準品而制得的標準曲線，測得斑點面積的積分值，這樣便測得皂甙的量。薄層色譜的條件如表2所示。
(表2)TLC條件

實施例在下文中，通過不限制本發(fā)明的技術(shù)范圍的實施例，來解釋本發(fā)明。
實施例1向500g的未加工的大豆胚軸中加入2.0L的70％體積的乙醇水溶液，在30℃下攪動混合物8小時進行提取。通過過濾分離提取液之后，按上述所述的方法，用2.0L的70％體積的乙醇水溶液再提取殘余物一次。合并兩次提取溶液。
在40℃下，減壓濃縮該合并后的提取液，以完全除去有機溶劑。將所得的粗提取物溶于水中，并在SV2時加到裝有非極性合成吸附樹脂Diaion HP-20(由Mitsubishi化學公司所制造的)的柱上。然后，用30％體積乙醇水溶液洗脫柱子，得到異黃酮餾份。該餾份被在40℃下減壓濃縮、干燥并粉碎，得到15g的含有異黃酮的組合物。在所得的含有異黃酮的組合物中異黃酮的含量為占總固體成分重量的48.0％。該組合物也含23.8％的皂甙和14.1％的蛋白質(zhì)。
試驗實施例1提取溶劑中乙醇濃度的研究除提取溶劑的乙醇濃度按表3所示變化外，用與實施例1相同的方法提取大豆胚軸，并測定所得的提取物中異黃酮的相對比例變化以及從大豆胚軸中提取異黃酮的產(chǎn)率。結(jié)果如表3所示。
(表3)乙醇提取液的異黃酮的相對比例以及異黃酮的產(chǎn)率

*Mal-ISO丙二?；慄S酮甙Ac-ISO乙?；慄S酮甙ISO異黃酮甙Agl異黃酮甙元當提取溶劑的乙醇濃度為10％體積時，異黃酮的產(chǎn)率會下降，異黃酮甙元的量會增加，并且丙二酰基異黃酮甙的量會迅速下降。這很可能是因為大豆胚軸中的β-甙酶由于乙醇濃度低而對丙二?；慄S酮甙起作用并導(dǎo)致丙二?；慄S酮甙降解為甙元。當乙醇濃度為100％體積時，異黃酮的產(chǎn)率會迅速下降，異黃酮甙的量會增加，并且丙二?；慄S酮甙的量會迅速下降。因此，提取溶劑中合適的乙醇濃度至少為15-95％體積，優(yōu)選為30-90％，更優(yōu)選為40-85％體積，最優(yōu)選為60-80％體積。
比較實施例1高溫下用乙醇提取向500g的未加工的大豆胚軸中加入1.5L的70％體積的乙醇水溶液，在70℃下加熱回流提取混合物8小時。通過過濾分離提取液之后，按上述所述的方法，殘余物用1.5L的70％體積的乙醇水溶液再提取一次。合并兩次提取溶液。
在60℃下，減壓濃縮該合并后的提取液，完全除去有機溶劑。將所得的粗提取物溶于水中，并在SV2時加到裝有非極性吸附樹脂HP-20(由Mitsubishi化學公司所制造的)的柱(100mL)上。用30％體積乙醇水溶液洗脫柱子，得到異黃酮餾份。該餾份在60℃下減壓濃縮、干燥并粉碎，得到20g的含有異黃酮的組合物。在所得的含有異黃酮的組合物中異黃酮的含量為占總固體成分重量的38％。皂甙含量占總固體成分重量的18％。
比較實施例2用高濃度乙醇提取除了用來從柱子上洗脫異黃酮的乙醇水溶液的濃度為70％體積外，按實施例1的相同方法得到異黃酮餾份。該餾份在60℃下減壓濃縮、干燥并粉碎，得到30g的含有異黃酮的組合物。在所得的含有異黃酮的組合物中異黃酮的含量為占總固體成分重量的20.7％。皂甙含量占總固體成分重量的33％。
比較實施例3高溫提取、陰離子樹脂以及用高濃度乙醇洗脫向500g的未加工的大豆胚軸中加入1.5L的70％體積的乙醇水溶液，在70℃下加熱回流提取混合物8小時。通過過濾分離提取液之后，按上述所述的相同方法，殘余物用1.5L的70％體積的乙醇水溶液再提取一次。合并兩次提取溶液。
在60℃下，減壓濃縮該合并后的提取液，完全除去有機溶劑。將所得的粗提取物溶于水中，并在SV2時加到裝有陰離子交換樹脂WA-30(由Mitsubishi化學公司所制造的)的柱(100mL)上。然后用70％體積乙醇水溶液洗脫柱子，得到異黃酮餾份。該餾份在60℃下減壓濃縮、干燥并粉碎，得到6g的含有異黃酮的組合物。在所得的含有異黃酮的組合物中異黃酮的含量為占總固體成分重量的75％。皂甙含量占總固體成分重量的0.5％。
表4中顯示實施例1和比較實施例1-3所得的含有異黃酮組合物中異黃酮的相對比例。與比較實施例1到3中所得的含有異黃酮組合物相比較，實施例1所得的含有異黃酮組合物中丙二?；慄S酮甙的比例高而異黃酮甙和異黃酮甙元的比例低。在比較實施例1中，丙二酰基異黃酮甙比例下降的原因可能是因提高提取溫度至70℃，使丙二?；慄S酮甙降解為異黃酮甙。在比較實施例2中，丙二酰基異黃酮甙比例下降的原因可能是因增加洗脫用的乙醇的濃度，使大量的非丙二?；慄S酮甙的成分被洗脫下來。
(表4)(單位％)

比較實施例4使用環(huán)糊精制備可溶性的異黃酮在80℃時，在500ml的50％乙醇水溶液中，溶解5g的比較實施例1(用高濃度乙醇提取)所得的含有異黃酮組合物和25g的β-環(huán)糊精(由Nihon Shokuhin Kako Co.生產(chǎn))，并將溶液在80℃下攪動3小時。將溶液在室溫下放置過夜。上清液減壓干燥，得到10g粉末。這樣得到的含有異黃酮的組合物，異黃酮的含量占總固體成分的重量的8.4％。皂甙的含量占總固體成分的重量的1.8％。
試驗實施例2在25℃，在pH7.0，將實施例1和比較實施例1-4所得的含有異黃酮組合物邊攪動溶解到水中，以至于異黃酮的濃度為20mg/100ml。攪動后，測得溶解度。在4℃下冷藏2周，也測得其穩(wěn)定性。結(jié)果示于表5中。
(表5)

(測定標準)○沒有觀測到沉淀和混濁。
×觀測到沉淀或混濁。
如表5所示，在實施例1中，在總固體成分中異黃酮的百分含量高達48％，并且在25℃時的溶解性也非常高。在實施例1中，冷藏2周后的穩(wěn)定性也非常地好。因此，用實施例1的條件能夠得到具有高濃度的異黃酮和非常高水溶解性的含有異黃酮組合物。在25℃下，實施例1所得到的含有異黃酮組合物在水中溶解的最大量(溶解度)，令人驚奇地，基于異黃酮的量至少為1,000mg/100ml。
在比較實施例1中，盡管異黃酮的含量高達38％，但是在25℃的溶解性和冷藏后的穩(wěn)定性都差。這很可能是因為包括異黃酮甙元、異黃酮甙和色素在內(nèi)的通常情況下水不溶性的物質(zhì)由于高溫(在70℃)加熱回流提取的結(jié)果而被提取出來。
在比較實施例2中，異黃酮的含量低達20％，并且25℃時的溶解度也差。這很可能是因為用高濃度的乙醇水溶液洗脫異黃酮餾份使大量的弱水溶性的非極性物質(zhì)被從吸附樹脂上洗脫下來。
盡管比較實施例3所得的含有異黃酮組合物中異黃酮的含量高達75％，但是該組合物在25℃時在水中根本不溶解。這可能因為異黃酮自身的溶解度通常低達約5mg/L，而通過高度的純化不能提高其溶解度。
在比較實施例4中，由于異黃酮與環(huán)糊精的包合作用造成總固體成分中糖的百分比增加，異黃酮的含量低達8.4％。所得到的含有異黃酮的組合物在25℃時在水中根本不溶解。這很可能是由于所得的組合物的溶解度取決于環(huán)糊精的溶解度，但在25℃時環(huán)糊精在水中不溶解。為了溶解該組合物，需要在80℃時加熱10分鐘或更多。
從上述所述的結(jié)果看出，僅在實施例1中，也即在組合用特定濃度的乙醇提取、洗脫和在特定溫度下提取的情況下，所得到的含有異黃酮的組合物具有高的純度、高溶解度并在冷藏下具有好的穩(wěn)定性。對具有這樣突出優(yōu)點的組合物中的成分的相對比例進行測定。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)重要的是(1)異黃酮的含量高達占總固體成分重量的25％或更多；(2)將異黃酮和皂甙的總量之和作為100％重量，丙二?；慄S酮甙含量為15-95％重量，更優(yōu)選為30-90％重量，還更優(yōu)選為35-85％重量，最優(yōu)選為35-80％重量；以及(4)將異黃酮和皂甙的總量之和作為100％重量，皂甙的含量為5-60％重量，更優(yōu)選為10-50％重量，還更優(yōu)選為15-45％重量，最優(yōu)選為20-40％重量。
實施例2在100ml的水中，溶解5g實施例1所得的含有異黃酮組合物，并用檸檬酸調(diào)節(jié)溶液的pH3.0。在室溫下將溶液放置過夜，以3000g離心溶液10分鐘，收集上清液。用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)上清液的pH至6.5、干燥并粉碎得到4g粉末。這樣得到的含有異黃酮的組合物的異黃酮含量為總固體成分重量的37％。這樣所得到的含有異黃酮組合物在中性范圍內(nèi)(pH7.0)甚至在酸性范圍(pH3.0)具有非常高的溶解度，基于異黃酮的量，其至少為100mg/100ml。此外，冷藏2周，在該組合物中沒有觀測到沉淀和混濁。因此，得到具有高溶解度和良好穩(wěn)定性的含有異黃酮組合物。
實施例3含有異黃酮的飲料用表6中所示的混合比，將實施例1所得的異黃酮組合物進行混合，然后超熱殺菌處理制得飲料。
(表6)

該飲料具有高度的溶解性、良好的外觀和好的口感。喝50ml的該飲料能夠攝入40mg的異黃酮。
實施例4含有異黃酮的包裝飲料的制備用表7所示的混合比，將實施例2所得的含有異黃酮組合物進行混合，超熱處理然后無菌灌裝到產(chǎn)品包裝(10g×15)中。
(表7)

當用100ml的水稀釋時，這樣所得的包裝飲料具有良好的外觀，以及良好的口感。飲用一袋這樣的包裝飲料能夠攝取40mg的異黃酮。該包裝飲料也非常便于攜帶。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，能夠顯著地擴大異黃酮在包括要求異黃酮在低溫下易溶于水的飲料在內(nèi)的各種食品以及藥品和化妝品中的應(yīng)用。尤其是，本發(fā)明能夠極大地貢獻于與利用異黃酮各種生理功能的健康食品有關(guān)的工業(yè)。
權(quán)利要求
1.一種含有異黃酮的組合物，其包括15-95％重量的丙二酰基異黃酮甙、0-50％重量的除丙二?；慄S酮甙外的異黃酮以及5-60％重量的皂甙，在所述的組合物中異黃酮和皂甙的總量之和為100％重量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有異黃酮的組合物，其是以大豆胚軸作為起始原料而制得的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有異黃酮的組合物，其中在皂甙中A組皂甙的比例為55％重量或更多，將所述的組合物中皂甙的總量定為100％重量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有異黃酮的組合物，在25℃時，其水溶解度基于異黃酮的數(shù)量至少為20mg/100ml。
5.一種生產(chǎn)權(quán)利要求2所述的含有異黃酮的組合物的方法，其包括在10-50℃下用15-95％體積的乙醇水溶液提取大豆胚軸的步驟。
6.一種生產(chǎn)權(quán)利要求2所述的含有異黃酮的組合物的方法，其包括步驟(A)在10-50℃下用15-95％體積的乙醇水溶液提取大豆胚軸得到提取物；(B)使(A)步驟所得到的提取液在水中的溶液與非極性的吸附樹脂接觸，使異黃酮吸附于樹脂上；和(C)用15-40％體積的乙醇水溶液從吸附樹脂上洗脫異黃酮。
7.一種含有權(quán)利要求1所述的含有異黃酮組合物的可食用組合物。
8.一種分離異黃酮和皂甙的生產(chǎn)工藝，其包括在10-50℃下用15-95％體積的乙醇水溶液提取大豆胚軸得到提取物，使提取物為水溶液與非極性的吸附樹脂接觸，用15-40％體積的乙醇水溶液從吸附樹脂上洗脫含有異黃酮的部分，然后用65-90％體積的乙醇水溶液從吸附樹脂上洗脫含皂甙的部分。
全文摘要
本發(fā)明提供一種包含有異黃酮的組合物，該異黃銅具有高的純度并且以天然形態(tài)在水中高度溶解，不需要加入任何的助溶劑或應(yīng)用任何的化學改性劑。已發(fā)現(xiàn)包含具有高的純度和高的水溶解度的異黃酮的組合物能夠通過用含水的醇在特定的溫度范圍內(nèi)提取大豆胚軸、然后用合成吸附樹脂吸附所得的提取物并且用特定濃度的含水的醇進行洗脫而制得。
文檔編號A61K31/7084GK1750762SQ20038010981
公開日2006年3月22日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月24日
發(fā)明者和根崎智, 荒木秀雄 申請人:不二制油株式會社