專利名稱：低過敏原性嵌合抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然存在的過敏原(具體地說，為梯牧草花粉過敏原Phl p2)衍生的嵌合(mosaic)抗原。該嵌合抗原表現(xiàn)為過敏原活性降低，可用作過敏疫苗治療致敏的變應(yīng)性患者和接種。
一大部分人群患有IgE介導(dǎo)的過敏癥。那些病人患有針對幾種抗原的過敏反應(yīng)。相當(dāng)高比例的過敏反應(yīng)是由植物花粉引起的。過敏癥狀如過敏性結(jié)膜炎、哮喘、皮炎、過敏性休克是由于IgE對過敏原的識別。IgE分子是造成過敏反應(yīng)癥狀如枯草熱、哮喘和蕁麻疹的主要原因。
IgE分子結(jié)合過敏原如植物花粉。IgE分子尾部Fc部分結(jié)合在Fc受體上，這些受體主要分布在組織中的肥大細(xì)胞和血液中的嗜堿性粒細(xì)胞上?？乖Y(jié)合觸發(fā)肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和生物活性化合物，特別是組胺。這些分子導(dǎo)致血管擴(kuò)張和通透性增加，從而幫助白細(xì)胞、抗體和補(bǔ)體成分進(jìn)入反應(yīng)部位。另一方面，那些分子是造成過敏反應(yīng)癥狀的主要原因。有不同程度的過敏反應(yīng)，從眼睛輕微刺癢和輕微感冒癥狀到嚴(yán)重疼痛甚至到威脅生命的癥狀如過敏性休克，例如，蜜蜂叮咬后可能發(fā)生的過敏性休克。
為了防止這些過敏反應(yīng)的發(fā)生，基于應(yīng)用少量低過敏原性化合物制備了過敏疫苗。據(jù)認(rèn)為通過低過敏原性疫苗的應(yīng)用能使IgG抗體產(chǎn)生，在個體接觸到過敏原后該抗體立即與過敏原反應(yīng)。通過那些所謂的阻斷性抗體(blocking antibody)大大地阻止了過敏原與患者體內(nèi)存在的IgE分子之間的接觸。因此，大大地阻止了IgE分子介導(dǎo)的過敏原和肥大細(xì)胞之間的反應(yīng)。
已有各種各樣的疫苗應(yīng)用于過敏反應(yīng)的治療領(lǐng)域中。以前已將少量過敏原應(yīng)用于患者。隨著基因工程的發(fā)展，重組過敏原可用作疫苗接種。這種包含過敏原的疫苗的一個主要缺點(diǎn)是應(yīng)用這種疫苗會引起患者不必要的副作用。例如給患者皮下應(yīng)用其所過敏的過敏原，不必要的副作用如刺癢直到過敏性休克就可能發(fā)生，因?yàn)槌霈F(xiàn)在病人體內(nèi)的IgE抗體與過敏原發(fā)生了反應(yīng)并引起過敏反應(yīng)。
為了克服不希望的副作用，由此公開一種制備過敏原衍生的低過敏原性嵌合抗原的方法，a)第一步將過敏原分裂(split into)成至少兩部分并測定每一部分的IgE反應(yīng)性，b)第二步將沒有可檢測的IgE反應(yīng)性的那些過敏原部分組合成包含過敏原氨基酸的嵌合抗原，但嵌合抗原氨基酸的順序不同于天然存在的過敏原。
本方法提出的術(shù)語“低過敏原性嵌合抗原”是指該抗原包含天然存在的過敏原實(shí)質(zhì)上全部氨基酸。然而，與天然存在的過敏原的不同之處是在第一步過敏原被分裂成不同部分。當(dāng)過敏原氨基酸序列已知時(shí)，從抗原中制備出不同長度的肽段是本領(lǐng)域技術(shù)人員的基本常識。肽段既可以通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)合成方法制備，或者簡單容易地通過聚合酶鏈反應(yīng)制備，因?yàn)楫?dāng)序列已知時(shí)，就能容易地合成適當(dāng)?shù)囊铩?br> 以肽或多肽存在的過敏原每一部分的反應(yīng)性必須進(jìn)行測定。這可通過將對天然存在的過敏原過敏患者的血清與肽反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。若肽段上存在IgE表位，則這種血清中的IgE抗體將與該肽反應(yīng)。然而，如果不存在線性IgE表位或由于分裂完整天然過敏原時(shí)構(gòu)象性IgE表位被破壞，將不存在IgE與肽的結(jié)合。隨后可容易地通過能結(jié)合IgE抗體的特異性抗抗體反應(yīng)來檢測IgE抗體。那些抗抗體通常被標(biāo)記用于探測。
本發(fā)明的一個重要方面是將過敏原分成不與IgE抗體發(fā)生反應(yīng)的幾部分。如果過敏原部分仍以相當(dāng)?shù)牧颗cIgE抗體反應(yīng)，這些過敏原部分不應(yīng)該用于嵌合抗原的制備中。建議用不同變應(yīng)性患者血清測試用于嵌合抗原中的天然存在的過敏原的部分，因?yàn)榭紤]到每種血清中特異性和IgE濃度的量會有所變化。
當(dāng)過敏原被分成幾個沒有可檢測到的IgE反應(yīng)性的部分時(shí)，重新排列這些部分以制備嵌合抗原。過敏原的一部分無實(shí)質(zhì)性IgE反應(yīng)性是指最好用至少5種變應(yīng)性患者的血清檢測完整天然存在的過敏原的IgE反應(yīng)性，并也檢測其各個部分。定量測定IgE分子與過敏原及其部分的結(jié)合，各部分的IgE反應(yīng)性必須降至不高于天然存在的過敏原獲得值的10％，最好不高于5％。
所述天然存在的過敏原的部分重排為嵌合抗原從最簡單意義上是指過敏原被分裂成兩部分，即具有N-末端并以切割側(cè)結(jié)尾的A部分，和始于切割側(cè)并以多肽的C末端結(jié)尾的B部分。切割位點(diǎn)是指多肽上的一個部位，該部位是一個部分的結(jié)尾和另一個部分的開始。如果天然存在的抗原的兩部分均無實(shí)質(zhì)性IgE反應(yīng)性，則這兩部分就以這種方式重排，即現(xiàn)在B部分代表N-末端，A部分代表C-末端。
當(dāng)天然存在的過敏原被分成具有天然存在順序A、B和C的3個部分，就可能有幾種嵌合抗原例如即例如C、B、A或A、C、B。組成部分越多，所提供的制備嵌合抗原的選擇性也就越多。本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中避免組合位于天然存在的過敏原相鄰位置上的部分，例如C、A、B。之所以這樣的原因是IgE的結(jié)合表位在嵌合抗原上可以再次形成。然而，嵌合抗原包含實(shí)質(zhì)上天然存在抗原的全部氨基酸是十分必要的。當(dāng)然某些明確無功能的氨基酸可以被刪除或者由于制備原因某些氨基酸可被刪除，但是，應(yīng)該盡可能較多地保留氨基酸。此外，嵌合抗原也可以包含用于制備目的的氨基酸。優(yōu)選的是，嵌合抗原中改組的天然存在的過敏原部分要盡可能大。優(yōu)選選擇切割位點(diǎn)以破壞IgE表位由此將IgE表位盡可能地保留在遠(yuǎn)處。
優(yōu)選實(shí)施方案中的方法采用第2組過敏原，優(yōu)選的第2組過敏原在下列文獻(xiàn)中描述Freidhoff LR，Ehrlich-Kautzky E，Grant JH，Meyers DA，Marsh DG.對黑麥草(Lolium perenne)(黑麥)花粉及其成分Lol pI和Lol pII(黑麥I和黑麥II)人類免疫應(yīng)答的研究。I.對過敏原反應(yīng)性的發(fā)病率及皮試、IgE抗體和IgG抗體數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)性。J Allergy Clin Immunol 1986，78，1190-1201。
Freidhoff LR，Ehrlich-Kautzky E，Meyers DA，Marsh DG.對黑麥草(黑麥)花粉及其成分Lol pI和Lol pII(黑麥I和黑麥II)人類免疫應(yīng)答的研究。II.與癥狀學(xué)和花粉暴露有關(guān)的抗體水平縱向變化以及將季節(jié)性升高的抗體水平修正為正常值。J Allergy Clin Immunol 1987，80，646-655。Ansari AA，Shenbagamurthi P，Marsh DG.黑麥草(多年生黑麥草)花粉過敏原Lol pII的完整氨基酸序列。J Biol Chem 1989，264，11181-11185.Dolecek C，Vrtala S，LafferS，Steinberger P，Kraft D，ScheinerO，Valenta R.一種主要的梯牧草(Phleumpratense)花粉過敏原Phl pII的分子特性。FEBS Lett 1993，335，299-304。
一個特別優(yōu)選實(shí)施方案中用作嵌合抗原的過敏原是梯牧草花粉過敏原Phl p2。草花粉過敏原Phl p2的序列在WO 94/23035中公開。De Marino et al.，Structure(1999)Vol.7，No.8，p 943-952中提供了來自梯牧草花粉的Phl p2的更詳細(xì)描述。優(yōu)選Phl p2抗原的原因是Phl p2能與大約70％的草花粉過敏患者血清中的IgE反應(yīng)并引起致敏患者嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺。
在本發(fā)明過程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Phl p2過敏原最好分裂成3個肽，即具有氨基酸1-33的肽1，具有氨基酸34-64的肽2，和具有氨基酸65-96的肽3。通過按1、3和2的順序重排肽段制備嵌合抗原，所述嵌合抗原可用于低過敏原性接種。這種嵌合抗原的優(yōu)勢是產(chǎn)生足夠量的阻斷性IgE抗體，但幾乎完全避免了接種相關(guān)的不必要的副反應(yīng)。
優(yōu)選嵌合抗原的氨基酸序列具有SEQ ID NO1。編碼這一優(yōu)選嵌合過敏原的DNA為SEQ ID NO2。
優(yōu)選本公開提出的嵌合過敏原用于治療過敏反應(yīng)藥物的制備。優(yōu)選的Phl p2嵌合抗原可用于治療草花粉過敏癥藥物的制備。由于Phl p2是一種相當(dāng)大部分變應(yīng)性患者已針對其形成IgE抗體的抗原，因此該嵌合抗原十分有助于枯草熱患者的治療。
通過所描述的方法制備的嵌合過敏原可制備成治療過敏反應(yīng)的藥物。主要成分為嵌合抗原，所述嵌合抗原優(yōu)選與佐劑一起使用。有幾種適合應(yīng)用于人的佐劑如氫氧化鋁凝膠。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，也可能通過共價(jià)結(jié)合將嵌合抗原直接連接到另一個通常能增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)的成分上。
也有可能采用編碼嵌合抗原的DNA或與其互補(bǔ)的DNA序列作為疫苗。對于核酸疫苗而言，是將適當(dāng)?shù)亩嗪塑账嵝蛄胁迦氲桨屑?xì)胞中。除了編碼嵌合抗原的序列之外，這種DNA疫苗也可以包含調(diào)節(jié)元件如啟動子、核糖體結(jié)合點(diǎn)或終止序列。優(yōu)選的是，這種DNA序列應(yīng)該整合適宜載體中，所述載體能使DNA到達(dá)細(xì)胞的蛋白合成機(jī)制。
這里詳述的嵌合抗原優(yōu)選應(yīng)用于人類。不過也可能將該嵌合抗原用于有價(jià)值的動物如寵物(例如狗或貓)或馬。
圖和表描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案

圖1比較了合成的Phl p2衍生的肽與完整rPhl p2(重組生成的野生型過敏原)的IgE反應(yīng)性。硝基纖維素包含(A)點(diǎn)樣的Phl p2肽(P1、P2、P3)、人血清白蛋白(HSA)、對照肽(P)和一種無交叉反應(yīng)的梯牧草花粉過敏原(rPhlp5)和(B)Phl p5和Phl p2暴露于35例草花粉過敏患者的血清(1-35)和一例非過敏個體(N)的血清中。
圖2重組組氨酸標(biāo)記的Phl p2野生型和重組組氨酸標(biāo)記的Phl p2嵌合體的示意圖。標(biāo)明了3個肽的位置。
圖3用于構(gòu)建Phl p2嵌合體的引物DNA序列和用于裝配編碼rPhl p2嵌合體的cDNA的PCR程序示意圖。在引物P2/1和P2/6中NdeI和EcoRI限制性位點(diǎn)用下劃線分別標(biāo)出。引物對應(yīng)于SEQ ID NO6到SEQ IDNO11。
圖4組氨酸標(biāo)記的Phl p2嵌合體的cDNA(SEQ ID NO2)和導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。氨基酸以單個字母碼表示，堿基對和氨基酸數(shù)目顯示在右邊緣。
圖5重組rPhl p2嵌合體和重組rPhl p2的純度。考馬斯染色的膠包含Phl p2(P2泳道)、Phl p2嵌合體(P2M泳道)和分子量標(biāo)準(zhǔn)(M泳道)。
圖6純化的rPhl p2嵌合體(A)和rPhl p2(B)的質(zhì)譜分析。X-軸顯示質(zhì)量/電荷比率，信號強(qiáng)度表示為在所觀測的質(zhì)量范圍內(nèi)獲得的最強(qiáng)信號的百分比。
圖7比較rPhl p2(P2)和rPhl p2嵌合體(P2M)的IgE結(jié)合能力。用來自12個Phl p2草花粉過敏患者的血清(1-12)探測硝基纖維素上點(diǎn)樣的rPhl p2(P2)、rPhl p2嵌合體(P2M)和人血清白蛋白(HSA)。用125I標(biāo)記的抗人IgE抗體檢測被結(jié)合的IgE抗體并通過放射自顯影顯像。
圖8通過嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放法測定rPhl p2嵌合體降低了的過敏原活性。一例草花粉過敏患者的嗜堿性粒細(xì)胞暴露于濃度漸增的rPhl p2和rPhlp2嵌合體中(X-軸)。組胺釋放表示為y-軸上總組胺釋放的百分比。
圖9兔抗rPhl p2嵌合抗體識別rPhl p2野生型過敏原。針對rPhl p2嵌合體(αP2M)、KLH-耦聯(lián)的嵌合體(αP2M-KLH)和rPhl p2(αPhl p2)以及緩沖液(C)的兔抗血清暴露于點(diǎn)印跡的KLH、人血清白蛋白(HSA)、rPhl p2(P2)和rPhl p2嵌合體(P2M)。用125I標(biāo)記的驢抗兔IgG檢測被結(jié)合的兔抗體并通過放射自顯影顯像。
表1Phl p2衍生的合成肽的性質(zhì)。顯示肽的序列、氨基酸數(shù)目、在Phl p2過敏原中的位置、分子量和等電點(diǎn)。肽1對應(yīng)于SEQ ID NO3，肽3對應(yīng)于SEQ ID NO4，肽2對應(yīng)于SEQ ID NO5。
表2對完整rPhl p2和Phl p2嵌合體(P2M)的速發(fā)型皮膚反應(yīng)。用P2和P2M對兩例梯牧草花粉過敏患者(個體1、2)測試皮膚反應(yīng)性。顯示對5種不同濃度的rPhl p2和Phl p2嵌合體、以及梯牧草花粉提取物和組胺出現(xiàn)的平均風(fēng)疹塊直徑(mm)。
表3兔αP2 M和兔抗αP2抗體對草花粉過敏患者IgE結(jié)合rPhl p2的抑制作用。顯示5例患者IgE結(jié)合的抑制百分率。
以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明實(shí)施例1.合成無過敏原活性的Phl p2衍生肽為了確定無過敏原活性的Phl p2片段，化學(xué)合成每個包含約1/3的Phl p2蛋白的肽段(表1)。肽段長度介于32-34個氨基酸，分子量約為3.7kDa，加起來覆蓋整個Phl p2氨基酸序列。
在433A型Applied Biosystems(Foster City，CA)肽合成儀上，采用Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)策略，用HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)1，1，3，3，四甲基脲六氟代磷酸酯)活化(0.1mmol小規(guī)模循環(huán))，合成這三種肽。預(yù)上樣的PEG-PS(聚乙二醇聚苯乙烯)樹脂(0.15-0.2mmol/g上樣)(Septive Biosystems，Warrington，UK)被用作固相來構(gòu)建肽?；瘜W(xué)制品購自Applied Biosystems。通過在反饋控制系統(tǒng)中的傳導(dǎo)性監(jiān)測證實(shí)氨基酸的接合。在每個肽的N-或C-末端上添加一個半胱氨酸殘基以促使多肽與載體接合。用混合物(250μl蒸餾水、250μl三異丙硅烷(Flukan，Buchs，Switzerland)、9.5ml TFA)作用2小時(shí)，以將肽從樹脂上切下并在叔丁基甲基醚(Flukan，Buchs，Switzerland)中沉淀。用質(zhì)譜檢查肽的同一性并用制備性HPLC(PiChem，Graz，Austria)純化至＞90％純。(Focke M，Mahler V，Ball T，Sperr WR，Majlesi Y，Valent P，KraftD，Valenta R.源自主要草花粉過敏原B細(xì)胞表位的非過敏性合成肽Phl p1B用于過敏反應(yīng)接種。FASEB J.2001，152042-2044。
通過用斑點(diǎn)印跡分析比較完整rPhl p2與肽的IgE反應(yīng)性，評價(jià)Phl p2衍生肽的過敏原活性(圖1)。將硝化纖維素印跡的Phl p2衍生肽(P1-P3)、在免疫上無關(guān)的主要草花粉過敏原rPhl p5(Vrtala S，Sperr WR，Reimitzer I，vanRee R，Laffer S，Mller WD，Valent P，Lechner K，Rumpold H，Kraft D，ScheinerO，Valenta R.梯牧草(Phleum pratense)花粉主要過敏原的cDNA克??；重組Phl pV過敏原的表征。J.Immunol.1993，1514773-4781)、和用于對照目的的人血清白蛋白和對照肽暴露于來自草花粉變應(yīng)性患者的血清和來自非變應(yīng)性個體的血清。
按先前描述地測定結(jié)合的IgE抗體(Valenta R，Duchene M，Ebner C，Valent P，Sillaber C，Deviller P，F(xiàn)erreira F，TejklM，Edelmann H，Kraft D，ScheinerO.抑制蛋白是功能性植物泛過敏原的新家族J.Exp.Med.1992，175377-385).。來自所有35例草花粉變應(yīng)性患者的血清顯示對硝化纖維素印跡的rPhl p2有IgE反應(yīng)性，但沒有血清與三種Phl p2衍生肽中的任何一個發(fā)生反應(yīng)(圖1)。非變應(yīng)性個體的血清對所述肽或蛋白的任一種均不顯示IgE反應(yīng)性。
實(shí)施例2.重組Phl p2嵌合蛋白的表征按不同順序重組三種Phl p2衍生肽，獲得重組Phl p2嵌合蛋白。這種嵌合蛋白的產(chǎn)生基于一種設(shè)想，即按不同順序重組三種非變應(yīng)性Phl p2片段將得到一種嵌合蛋白，其具有破壞的三維結(jié)構(gòu)，并因此變應(yīng)性活性降低的。此外，預(yù)期嵌合蛋白與單個的較小肽單位相比將展示更好的免疫原性，且保留了Phl p2整個一級氨基酸序列，也就包含Phl p2相關(guān)的T細(xì)胞表位。
圖2顯示了天然Phl p2過敏原與Phl p2嵌合蛋白中三種肽段裝配的比較。為了比較這兩種蛋白，制備包含C-末端六個組氨酸的尾巴的重組Phl p2，和重組Phl p2嵌合蛋白，后者也包含C-末端六個組氨酸的尾巴(圖2)，目的是通過鎳親和層析(Quiagen，Hilden，Germany)純化這兩種蛋白。
構(gòu)建重組Phl p2嵌合體，采用如下方式對編碼三種多肽的cDNA通過圖2所示順序、采用圖3所示的引物、進(jìn)行以PCR為基礎(chǔ)的基因擴(kuò)增，編碼Phl p2的cDNA(Dolecek C，Vrtala S，Laffer S，Steinberger P，Kraft D，ScheinerO，Valenta R.一種主要的梯牧草(Phleum pratense)花粉過敏原Phl pII的分子表征。FEBS Lett.1993，335299-304)作為文獻(xiàn)所描述的模板(LinhartB，Jahn-Schmid B，Verdino P，Keller W，Ebner C，Kraft D，Valenta R.用于治療草花粉過敏組合疫苗，由免疫原性增強(qiáng)的基因工程化雜交分子組成。FASEBJ.2002，161301-1303)。
圖4顯示重組Phl p2嵌合蛋白的DNA及推導(dǎo)的氨基酸序列。組氨酸標(biāo)記的嵌合蛋白由309bp的DNA編碼，編碼計(jì)算出的分子量為11769Da的蛋白質(zhì)，幾乎與組氨酸標(biāo)記的重組Phl p2過敏原的分子量相同(11784Da)。
通過PCR獲得編碼組氨酸標(biāo)記的rPhl p2過敏原的cDNA，聯(lián)合采用5′引物P2/1(SEQ ID NO6)和3′引物P2/7(SEQ ID NO12)CGC GAA TTCTCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC TTC TGG CGC GTA GGT GGC，及編碼Phl p2的cDNA作為模板。
將編碼組氨酸標(biāo)記的Phl p2嵌合體和組氨酸標(biāo)記的Phl p2過敏原的cDNAs分別連接在Nde I/EcoRI酶切的質(zhì)粒pET17b(Novagen)中。通過序列分析確定這兩種質(zhì)粒構(gòu)建物的DNA序列并在大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)中通過誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，誘導(dǎo)用0.5mM異丙基-β-硫代半乳吡喃糖苷以O(shè)D600nm為0.4在液體培養(yǎng)物(含100mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基)中37℃再孵育4小時(shí)來進(jìn)行。從500ml培養(yǎng)物中離心收集大腸桿菌細(xì)胞，并根據(jù)廠家建議(Quiagen，Hilden，Germany)在自然(rPhl p2)或變性條件(rPhl p2嵌合體)下制備用于純化。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白染色(Fling SP，Gregerson DS.采用無尿素的高摩爾濃度Tris緩沖液系統(tǒng)電泳測定肽和蛋白的分子量。Anal.Biochem.1986，15583-88)分析蛋白樣品純度(圖4)。
圖5顯示組氨酸標(biāo)記的重組蛋白(rPhl p2P2、rPhl p2嵌合體P2M)的純度。雖然這兩種蛋白在SDS-PAGE中的遷移行為不完全相同，但文獻(xiàn)“Niederberger V，Hayek B，Vrtala S，Laffer S，Twardosz A，Vangelista L，SperrWR，Valent P，Rumpold H，Kraft D，Ehrenberger K，Valenta R，Spitzauer S.脂蛋白和鈣結(jié)合形式的交叉反應(yīng)性兩EF臂的梯牧草花粉過敏原Phl p7的鈣依賴性IgE識別FASEB J.1999，13843-856”所描述而進(jìn)行的質(zhì)譜分析顯示這兩種蛋白的分子量幾乎相同(rPhl p211775Da、rPhl p2嵌合體11770Da)，這與所導(dǎo)出的包含N-末端甲硫氨酸的分子量非常一致(圖6)。
實(shí)施例3.rPhl p2嵌合體缺乏IgE反應(yīng)性和變應(yīng)性特性用12例梯牧草花粉變應(yīng)性患者血清如所描述地進(jìn)行肽的斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)，比較純化Phl p2嵌合體(P2M)和Phl p2野生型的IgE結(jié)合能力(圖7)。所有12例草花粉變應(yīng)性患者血清包含抗rPhl p2的IgE抗體，但沒有血清表現(xiàn)出對rPhl p2嵌合體或作為陰性對照的人血清白蛋白的IgE反應(yīng)性(圖7)。用嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放和皮試實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)rPhl p2嵌合體大大減少的過敏原活性。用右旋糖酐沉淀法富集一例草花粉過敏患者的嗜堿性粒細(xì)胞并將其暴露于濃度漸增的純化的rPhl p2或rPhl p2嵌合體，如文獻(xiàn)所述(Valent P，Besemer J，Muhm M，Majdic O，Lechner K，Bettelhei P.IL-3通過高親和力結(jié)合位點(diǎn)激活人血中嗜堿性粒細(xì)胞。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，865542-5546)。
通過放免分析一式三份測定釋放到無細(xì)胞上清中的組胺并表示為細(xì)胞總組胺含量的平均百分比，正如Valent等所述。
圖8顯示rPhl p2嵌合體(最大釋放介于1-10μg/ml)與rPhl p2過敏原(最大釋放為10-3μg/ml)相比顯示過敏原活性減少1000倍以上。
通過草花粉過敏患者皮試實(shí)驗(yàn)證實(shí)了rPhl p2嵌合體明顯降低的過敏原活性(表2)。在患者前臂進(jìn)行SPT(皮膚點(diǎn)刺測試)。應(yīng)用含5個濃度(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)的rPhl p2和Phl p2衍生的嵌合體P2M的20μl等分試樣。此外，測試標(biāo)準(zhǔn)化的皮膚點(diǎn)刺溶液(梯牧草花粉提取物和組胺)(Allergopharma，Reinbeck，Germany)。SPT后20分鐘，采用攝影或?qū)A珠筆圈的疹塊區(qū)用透明膠帶轉(zhuǎn)移到紙上的方法記錄反應(yīng)。通過測量最大縱向和橫向直徑，二者之和除以2來計(jì)算平均疹塊直徑(Dm)，如Focke等(2001)所述。
rPhl p2已在所測試的最低濃度即1μg/ml誘導(dǎo)強(qiáng)烈的疹塊反應(yīng)，而rPhlp2嵌合體在所測試的最大濃度(即8-16μg/ml)只誘導(dǎo)輕微的疹塊反應(yīng)，因此證實(shí)了嵌合蛋白降低的過敏原活性。
實(shí)施例4.用rPhl p2嵌合體免疫誘導(dǎo)識別rPhl p2的野生型IgG抗體并抑制變應(yīng)性患者IgE結(jié)合Phl p2為了測試用Phl p2嵌合體和Phl p2嵌合體免疫是否誘導(dǎo)與天然Phl p2反應(yīng)的IgG抗體，采用弗氏佐劑用rPhl p2嵌合體、KLH-耦聯(lián)的rPhl p2嵌合體或rPhl p2免疫兔，如Focke等所述。
采用斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)研究兔IgG抗體與rPhl p2的反應(yīng)性(圖9)。Phl p2野生型(P2)和相應(yīng)的免疫原Phl p2嵌合體(P2M)點(diǎn)樣于硝化纖維素條上(1μg/點(diǎn))。硝化纖維素條暴露于兔預(yù)免疫或免疫血清(1∶500)，用1∶1000稀釋的125I標(biāo)記的驢抗兔抗血清(Amersham Pharmacia Biotech)檢測結(jié)合的兔抗體，如Valenta等(1992)所述。
兔抗rPhl p2嵌合體抗血清與免疫原(rPhl p2嵌合體)以及rPhl p2過敏原發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)(圖9)。抗體反應(yīng)性強(qiáng)度與KLH-耦聯(lián)的嵌合體免疫產(chǎn)生的抗血清所獲得的近似，強(qiáng)于rPhl p2過敏原免疫誘導(dǎo)的反應(yīng)性(圖9)。
實(shí)施例6封閉抗體的測定取5例草花粉變應(yīng)性患者血清，用ELISA競爭法研究是否rPhl p2嵌合體免疫誘導(dǎo)的IgG抗體抑制變應(yīng)性患者血清IgE與完整rPhl p2的結(jié)合(表3)。用rPhl p2(1μg/ml)包被ELISA板(Nunc Maxisorp，Rokslide，Denmark)，并分別用1∶100稀釋的抗Phl p2嵌合體和抗rPhl p2抗血清預(yù)孵育，并用相應(yīng)預(yù)免疫血清設(shè)立對照。ELISA板洗滌后用1∶3稀釋的來自5例Phl p2致敏的花粉變應(yīng)性患者血清孵育，用1∶1000稀釋的堿性磷酸酶偶聯(lián)的單克隆大鼠抗人IgE抗體(Pharmingen，San Diego，CA)檢測結(jié)合的IgE抗體。通過抗Phl p2嵌合體和抗rPhl p2預(yù)孵育獲得的IgE結(jié)合抑制百分率可按如下計(jì)算IgE結(jié)合抑制百分比(％)＝100-ODI/ODP×100。ODI和ODP分別代表用兔免疫和預(yù)免疫血清預(yù)先孵育后的消光，如Focke等(2001)所述。
抗Phl p2嵌合體抗體抑制草花粉變應(yīng)性患者IgE與Phl p2的結(jié)合(平均抑制20.93％)，雖然稍低于用rPhl p2過敏原免疫誘導(dǎo)的抗體預(yù)孵育所獲得的程度(平均抑制54.73％)。
因此免疫研究的結(jié)果表明針對rPhl p2嵌合體產(chǎn)生的抗體識別Phl p2野生型過敏原并抑制過敏患者IgE對Phl p2的識別。
序列表<110>比奧梅產(chǎn)品及貿(mào)易股份公司(Biomay Produktions-undHandels-Aktiengesellschaft)<120>低過敏原性嵌合抗原的制備方法<130>mosaic<140>
<141>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>103<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述重排多肽序列<400>1Met Val Pro Lys Val Thr Phe Thr Val Glu Lys Gly Ser Asn Glu Lys1 5 10 15His Leu Ala Val Leu Val Lys Tyr Glu Gly Asp Thr Met Ala Glu Val20 25 30Glu Leu Phe Arg Phe Leu Thr Glu Lys Gly Met Lys Asn Val Phe Asp35 40 45Asp Val Val Pro Glu Lys Tyr Thr Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Pro Glu50 55 60Glu Arg Glu His Gly Ser Asp Glu Trp Val Ala Met Thr Lys Gly Glu65 70 75 80Gly Gly Val Trp Thr Phe Asp Ser Glu Glu Pro Leu Gln Gly Pro Phe
85 90 95Asn His His His His His His100<210>2<211>309<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述重排核苷酸序列<400>2atggtcccga aggtgacgtt cacggtggag aaggggtcca acgagaagca cctggcggtg 60ctggtgaagt acgaggggga caecatggcg gaggtggagc tcttccggtt cctcaccgag 120aagggcatga agaacgtctt cgacgacgtc gtcccagaga agtacaccat tggggccacc 180tacgcgccag aagagcggga gcacggctcc gacgagtggg tcgccatgac caagggggag 240ggcggcgtgt ggacgttcga cagcgaggag ccgctccagg ggcccttcaa ccaccaccac 300caccaccac 309<210>3<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述多肽<400>3Val Pro Lys Val Thr Phe Thr Val Glu Lys Gly Ser Asn Glu Lys His1 5 10 15Leu Ala Val Leu Val Lys Tyr Glu Gly Asp Thr Met Ala Glu Val Glu20 25 30Leu Cys<210>4<211>33
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述多肽<400>4Arg Glu His Gly Ser Asp Glu Trp Val Ala Met Thr Lys Gly Glu Gly1 5 10 15Gly Val Trp Thr Phe Asp Ser Glu Glu Pro Leu Gln Gly Pro Phe Asn20 25 30Cys<210>5<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述多肽<400>5Cys Phe Arg Phe Leu Thr Glu Lys Gly Met Lys Asn Val Phe Asp Asp1 5 10 15Val Val Pro Glu Lys Tyr Thr Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Pro Glu Glu20 25 30<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>6ggatttccat atggtcccga aggtgacgtt cacg 34<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7ggtgaggaac cggaagagct ccacctccgc catggt36<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8gcggaggtgg agctcttccg gttcctcacc gagaag36<210>9<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9ggagccgtgc tcccgctctt ctggcgcgta ggtggc36<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10tacgcgccag aagagcggga gcacggctcc gacgag36<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11cgcgaattct cagtggtggt ggtggtggtg gttgaagggc ccctggagcg g 51<210>12<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12cgcgaattct cagtggtggt ggtggtggtg ctcttctggc gcgtaggtgg c 5權(quán)利要求
1.一種過敏原衍生的低過敏原性嵌合抗原的制備方法，其中a)第一步將過敏原分裂成至少兩部分并測定每一部分的IgE反應(yīng)性，b)第二步將不具有可檢測的IgE反應(yīng)的那些過敏原部分組合成包含過敏原氨基酸的嵌合抗原，但嵌合抗原氨基酸的順序不同于天然存在的過敏原。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，第一步中過敏原的至少兩部分是通過化學(xué)合成或采用聚合酶鏈反應(yīng)制備的，且過敏原的每一部分分別與變應(yīng)性個體中獲得的血清反應(yīng)，并且測定這種血清所含IgE抗體與過敏原每一部分的反應(yīng)性。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，在通常在N-末端存在的部分和通常在C-末端存在的部分相互替換的意義上，和變應(yīng)性個體中獲得的IgE抗體無實(shí)質(zhì)性反應(yīng)性的過敏原部分的順序與天然存在的過敏原中的那些部分的順序不一致。
4.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，過敏原是第2組過敏原。
5.前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中過敏原是梯牧草花粉過敏原Ph1p 2。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中，過敏原Ph1p 2被分裂成三個肽，即具有天然存在的Ph1p 2氨基酸序列的第1-33氨基酸的肽1，第34-64氨基酸的肽2，第65-96氨基酸的肽3，并且嵌合抗原是通過以肽1、肽3和肽2的順序連接肽段而制備的。
7.具有氨基酸序列為SEQ ID NO1的嵌合過敏原。
8.編碼權(quán)利要求7所述的嵌合過敏原的具有SEQ ID NO2的DNA序列，或其互補(bǔ)序列。
9.通過權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法可獲得的嵌合過敏原在制備治療變應(yīng)性反應(yīng)藥物中的用途。
10.權(quán)利要求9所述嵌合過敏原的用途，其中的變應(yīng)性反應(yīng)是由草花粉引起的。
11.權(quán)利要求10所述嵌合過敏原的用途，其中的變應(yīng)性反應(yīng)是由梯牧草花粉引起的。
12.權(quán)利要求11所述嵌合過敏原的用途，其中的變應(yīng)性反應(yīng)是由梯牧草花粉Ph1p 2引起的。
13.治療變應(yīng)性患者的疫苗，其特征在于包含通過權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的方法可獲得的嵌合過敏原，或權(quán)利要求7的嵌合過敏原。
14.治療草花粉變應(yīng)性患者的疫苗，其特征在于包含一種DNA序列，所述DNA序列編碼權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的方法可獲得的嵌合抗原，或包含權(quán)利要求8中的DNA，或與這些DNA序列中任一互補(bǔ)的序列。
全文摘要
本申請公開了一種過敏原衍生的低過敏原性嵌合抗原的制備方法，通過a)第一步將過敏原分裂成至少兩部分并測定每一部分的IgE反應(yīng)性，b)第二步將未測到IgE反應(yīng)性的那些過敏原部分組合成包含過敏原氨基酸的嵌合抗原，但嵌合抗原氨基酸順序不同于天然存在的過敏原。
文檔編號A61K38/16GK1742019SQ200380109077
公開日2006年3月1日 申請日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月21日
發(fā)明者內(nèi)丁·莫蒂斯, 薩拜因·斯圖沃爾, 瑪吉特·?？? 伯吉特·林哈特, 瑪麗亞－特里薩·克勞斯, 彼得·瓦倫特, 迪特里?！た死蛱? 魯?shù)婪颉ね邆愃?申請人:比奧梅產(chǎn)品及貿(mào)易股份公司