專利名稱：用于治療狼瘡性腎炎的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及核酸和多肽，并且更具體地涉及編碼可用于檢測(cè)和治療狼瘡性腎炎、以及可用于鑒定用以治療該病的治療劑的多肽的核酸及多肽。
背景技術(shù)：
狼瘡性腎炎為其中患者的免疫系統(tǒng)攻擊他/她的自身器官的“經(jīng)典”自身免疫病的實(shí)例。據(jù)估計(jì)45-75％的狼瘡患者最終遭受某些或其它形式的腎臟損傷。狼瘡在嚴(yán)重程度上從需要最小限度干預(yù)的輕度病例到重要器官如肺、腎、心和腦發(fā)生重大損傷且最后可以是致命的那些病例而變化極大。狼瘡主要地為女性疾病，大概的女性與男性比率為9∶1。在北美洲，據(jù)估計(jì)它侵襲五百分之一的主要在20到40歲之間的女性。
對(duì)于狼瘡尚無(wú)公知的療法。治療一般涉及控制癥狀，寄希望于使疾病減輕。最近，已在狼瘡性腎炎的小鼠模型中證明抗生素雷帕霉素是治療該病的有效療法。
發(fā)明概述本發(fā)明部分地是基于命名為BFLP1698的基因的發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)在患狼瘡性腎炎小鼠的腎組織中升高；可是，該基因的表達(dá)水平并不響應(yīng)雷帕霉素的治療而顯著降低。這種表達(dá)特征表明，當(dāng)施用抗生素雷帕霉素以改善狼瘡性腎炎癥狀時(shí)，BFLP1698基因的產(chǎn)物與這種抗生素相互作用。在不存在雷帕霉素時(shí)，該基因產(chǎn)物可不受約束地導(dǎo)致疾病狀態(tài)，且其作用可包括導(dǎo)致疾病狀態(tài)所必需的基因激活。在存在雷帕霉素時(shí)，BFLP1698基因產(chǎn)物失活，而疾病狀態(tài)減小。因此，BFLP1698蛋白可用作用于鑒定可用以治療狼瘡性腎炎癥狀的試劑如雷帕霉素的靶標(biāo)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包括編碼BFLP1698基因產(chǎn)物的核苷酸序列的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸序列包括SEQ ID NO1的序列，或其片段、同系物、類似物或衍生物。所述核酸可包括例如編碼與包括SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽至少70％，例如80％、85％、90％、95％、98％、或者甚至99％、或者更高同一性的多肽的核酸序列。所述核酸可以是例如基因組DNA片段，或cDNA分子。
同樣包括在本發(fā)明之中的，是含有本文中所述的一種或多種核酸的載體、以及含有本文中所述載體或核酸的細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)化有包含了上文所述的任何核酸分子的載體的宿主細(xì)胞。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括藥物組合物，其包括BFLP1698核酸以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
在另一方面，本發(fā)明包括基本上純化的BFLP1698多肽，例如由BFLP1698核酸編碼的任何BFLP1698多肽，及其片段、同系物、類似物及衍生物。本發(fā)明也包括藥物組合物，其包括BFLP1698多肽以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
又在另一方面，本發(fā)明提供了與BFLP1698多肽特異性結(jié)合的抗體。所述抗體可以是，例如單克隆或多克隆抗體，及其片段、同系物、類似物及衍生物。本發(fā)明也包括藥物組合物，包括BFLP1698抗體以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。本發(fā)明也涉及分離的與由上文所述的任何核酸分子所編碼的多肽上的表位結(jié)合的抗體。
本發(fā)明也包括試劑盒，其在一個(gè)或多個(gè)容器內(nèi)包含一種或多種化合物，所述化合物為BFLP1698核酸、BFLP1698多肽和/或抗BFLP1698多肽的抗體。所述試劑盒優(yōu)選提供有使用說(shuō)明書。如果期望，試劑盒中的化合物連同藥學(xué)上可接受的載體一起提供。
本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)BFLP多肽的方法，所述方法包括提供含BFLP1698核酸、例如包括BFLP1698核酸的載體的細(xì)胞，并在足以表達(dá)由該核酸編碼的BFLP1698多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。然后從細(xì)胞中回收所表達(dá)的BFLP1698多肽。優(yōu)選地，所述細(xì)胞產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生內(nèi)源BFLP1698多肽。所述細(xì)胞可以是例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及通過(guò)使樣品同與BFLP1698多肽或核酸特異性結(jié)合的化合物接觸，并且如果存在的話，檢測(cè)復(fù)合物的形成來(lái)鑒定樣品中的所述多肽或核酸的方法。
本發(fā)明還提供了通過(guò)使BFLP1698多肽與化合物接觸并測(cè)定BFLP1698多肽活性是否被修飾而鑒定調(diào)節(jié)BFLP1698多肽活性的化合物的方法。
本發(fā)明也涉及通過(guò)使BFLP1698多肽與化合物接觸并測(cè)定該化合物是否修飾BFLP1698多肽活性、是否結(jié)合BFLP1698多肽、或者是否結(jié)合編碼BFLP1698多肽的核酸分子鑒定的調(diào)節(jié)BFLP1698多肽活性的化合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了確定受試者中BFLP1698相關(guān)紊亂的存在或易感性的方法。該方法包括提供來(lái)自受試者的樣品，并測(cè)量受試者樣品中BFLP1698多肽的量。然后將受試者樣品中BFLP1698多肽的量與對(duì)照樣品中BFLP1698多肽的量進(jìn)行比較。受試者蛋白樣品中BFLP1698多肽的量相對(duì)于對(duì)照蛋白樣品中BFLP1698多肽的量的改變表明受試者具有組織增生相關(guān)的狀況。對(duì)照樣品優(yōu)選取自匹配的個(gè)體，即具有相似的年齡、性別或其它一般條件但并不懷疑其具有組織增生相關(guān)狀況的個(gè)體。或者，對(duì)照樣品可在不懷疑受試者具有組織增生相關(guān)紊亂的時(shí)候取自受試者。在有些實(shí)施方案中，利用BFLP1698抗體檢測(cè)BFLP1698。
在另一方面，本發(fā)明提供了確定受試者中BFLP1698相關(guān)紊亂的存在或易感性的方法。該方法包括提供來(lái)自受試者的核酸樣品，例如RNA或DNA或兩者兼有，并測(cè)量受試者核酸樣品中BFLP1698核酸的量。然后將受試者核酸樣品中BFLP1698核酸的量與對(duì)照樣品中BFLP1698核酸的量進(jìn)行比較。樣品中BFLP1698核酸的量相對(duì)于對(duì)照樣品中BFLP1698量的改變表明受試者具有組織增生相關(guān)的紊亂。
又在另一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防或延緩BFLP1698相關(guān)紊亂的方法。該方法包括向期望此類治療或預(yù)防或延緩的受試者施用足以治療、預(yù)防或延緩受試者組織增生相關(guān)紊亂的量的BFLP1698核酸、BFLP1698多肽或BFLP1698抗體。此類紊亂的實(shí)例包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化。
除非另行定義，所有本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有同本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的一樣的含義。盡管可利用類似于或等同于本文所述那些的方法和材料來(lái)實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，下文仍描述了合適的方法和材料。特此將本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利及其它參考文獻(xiàn)整體并入作為參考。在沖突的情況下，將以本說(shuō)明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例僅僅是舉例說(shuō)明性的而并非旨在限制。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)由于如下的詳細(xì)說(shuō)明和權(quán)利要求而變得顯而易見(jiàn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為表示人BFLP1698基因的小鼠直向同源物(ortholog)在雷帕霉素治療之前、期間和之后，在NZBx NZWF1腎中、以及在各種對(duì)照小鼠品系和條件下的基因表達(dá)相對(duì)水平的柱形圖。

發(fā)明內(nèi)容
本文所公開的BFLP1698核酸序列是根據(jù)狼瘡性腎炎模型小鼠腎臟中的基因表達(dá)較之于非疾病小鼠腎臟中基因表達(dá)的變化而鑒定的。更特別地，該基因在年輕小鼠以及不表現(xiàn)出狼瘡性腎炎癥狀的小鼠中以相對(duì)低的水平表達(dá)?；虮磉_(dá)在具有狼瘡性腎炎的小鼠中升高，并且在已用雷帕霉素或抗-B7抗體成功治療的小鼠中較低。當(dāng)腎臟功能正常時(shí)表達(dá)水平回歸正常的觀察現(xiàn)象表明升高的水平與疾病的發(fā)展有關(guān)并有診斷價(jià)值。封閉這些基因的功能可能抑制或者阻止疾病的發(fā)展。表達(dá)水平也可用于評(píng)估和比較各種治療性干預(yù)的有效性。
因此，所述BFLP1698核酸序列可用于檢測(cè)受試者中狼瘡性腎炎的存在。BFLP01698轉(zhuǎn)錄物或多肽水平相對(duì)于對(duì)照樣品中水平的升高表明受試者中狼瘡性腎炎的存在。BFLP1698核酸序列也可用于監(jiān)控狼瘡性腎炎治療的有效性BFLP1698基因表達(dá)相對(duì)于疾病的治療中水平的下降證明該治療是有效的。
BFLP1698序列可另外用于鑒定用以治療或預(yù)防受試者中狼瘡性腎炎的治療劑。例如，可使BFLP1698多肽與測(cè)試劑進(jìn)行接觸。BFLP1698多肽與測(cè)試劑的結(jié)合揭示該測(cè)試劑調(diào)節(jié)BFLP1698的活性?？蛇M(jìn)一步對(duì)所述BFLP1698結(jié)合劑進(jìn)行測(cè)試，以確定其是否在測(cè)試生物(如，NZBXNZW小鼠)中起促進(jìn)或抑制狼瘡癥狀的作用。狼瘡癥狀的抑制揭示該試劑可用于治療或預(yù)防狼瘡性腎炎、或者與狼瘡性腎炎相關(guān)的癥狀。本文中公開了另外的效用。
包括人BFLP1698核酸的3652個(gè)核苷酸的序列示于表1之中(SEQID NO1)。該人序列被鑒定為鼠基因的人類直向同源物，其表達(dá)在具有狼瘡性腎炎樣癥狀的NZB X NZW小鼠中提高。
表1所示序列的核苷酸1-3486編碼1162個(gè)氨基酸的多肽，其序列示于表2之中(SEQ ID NO2)。
表1ATGGCCCTTGTGCCAGGGAGAAGCAAGGAGGATGGGCTTTGGACTAGAAATAGCCCAGGCTCCTCCCAGCATCCAGAAAGTCCCAGGCTGCCCAACCCTCTCTGGGACAGAGGAAAAATTGGCAAGGTTGAAGGTCACCAGCACATTCAGGATTTCTCTCAAAAGTCCCATCTGCCGTCTATTGTGGTGGAATCCAGTGAGGTGAATGAAGAGAGTGGGGATCTCCATTTGCCCCATGAGGAGCTGCTGCTGCTCACTGATGGTGAGGAAGAGGATGCTGAGGCCTTCTTCCAAGACCAAAGTGAAGAGCCAGGGGCGGCACGTCCCCATCATCAGGCTCGGCAAGTGGAGCATTCGACGCAGCGCGGCCATCTGGAGATTCGGGAGCTGAAGAAGAAGCTGTTCAAACGCCGGCGGGTGTTGAATCGGGAGCGGCGTCTGAGGCACCGGGTGGTCGGGGCTGTGATAGACCAAGGGCTGATCACGCGGCACCACCTCAAGAAGCGGGCTGCTCAGGAGCTGTCCCAGGAAATCAAGGCTTTTCTGACTGGCGTAGACCCCATTCTGGGCCACCAACTCTCAGCCCGGGAACATGCTCGCTGTGGTCTTCTCCTGCTCCGTTCTTTGCCACCTGCTCGGGCTGCTGTGCTTGACCACTTGAGAGGTGTCTTTGATGAGAGTGTCCGGGCCCACCTGGCTGCCCTGGATGAAACCCCTGTGGCTGGTCCACCTCACCTCCGTCCACCTCCACCCTCTCATGTCCCTGCTGGTGGACCTGGTCTAGAGGATGTGGTTCAGGAAGTGCAGCAGGTGCTGTCTGAGTTTATCCGGGCCAACCCAAAGGCCTGGGCACCTGTGATTAGTGCATGGTCCATTGACCTCATGGGGCAACTGAGCAGCACGTACTCAGGCCAGCACCAGCGTGTTCCCCACGCTACTGGCGCTCTTAATGAACTGCTACAGCTGTGGATGGGTTGTAGGGCCACGCGTACATTAATGGACATCTATGTGCAGTGCCTCTCGGCTCTCATTGGTAGCTGCCCAGATGCGTGTGTGGATGCCTTGCTGGATACCTCTGTTCAGCATTCTCCACACTTTGACTGGGTTGTGGCACATATTGGCTCCTCTTTTCCTGGCACCATCATTTCCCGGGTTCTCTCCTGTGGCCTTAAGGACTTTTGTGTCCATGGTGGGGCTGGAGGTGGAGCTGGCAGTAGTGGTGGAAGCTCTTCTCAGACCCCCTCTACAGACCCCTTCCCTGGATCTCCTGCCATTCCTGCGGAGAAACGGGTGCCCAAGATTGCCTCAGTTGTAGGCATCCTAGGTCACCTGGCCTCCCGCCACGGAGATAGCATCCGACGGGAGCTCCTGCGAATGTTCCATGATAGCCTGGCAGGGGGATCTGGAGGCCGCAGTGGGGACCCCTCCCTTCAGGCCACGGTTCCGTTCCTACTGCAGCTGGCAGTCATGTCACCAGCTTTGCTGGGCACTGTCTCTGGAGAGCTTGTGGATTGCCTCAAGCCCCCAGCTGTGCTGAGCCAGCTGCAGCAACACCTTCAAGGATTCCCCCGAGAGGAGCTGGACAACATGTTGAACCTGGCTGTGCACCTGGTGAGCCAGGCCTCTGGGGCAGGTGCCTAGCGCTTGCTGCAGTTCCTGGTGGACACAGCTATGCCTGCTTCGGTCATTACCACCCAGGGCCTGGCTGTGCCAGACACCGTGCGTGAGGCTTGTGACCGGCTAATCCAGCTGCTGCTGCTGCACCTGCAAAAACTGGTTCATCACCGGGGAGGGTCTCCTGGGGAAGGGGTGCTAGGCCCGCCCCCACCTCCCCGCTTGGTGCCCTTTTTAGATGCGCTCAAAAACCATGTTGGAGAGCTGTGTGGAGAGACGTTACGATTGGAACGGAAGCGCTTCCTCTGGCAGCACCAGCTCTTGGGCCTGCTGTCTGTCTATACCCGGCCTAGCTGTGGACCTGAGGCCTTGGGCCATCTGCTGAGCCGAGCCCGAAGCCCTGAAGAGTTGAGTTTGGCCACCCAGTTATATGCAGGGCTAGTGGTCAGCCTCTCTGGCCTCCTGCCCCTGGCTTTCCGAAGCTGTCTGGCTCGGGTGCATGCAGGGACATTACAGCCTCCCTTCACGGCCCGGTTCCTGCGCAACTTGGCACTGCTAGTAGGGTGGGAACAGCAGGGTGGCGAGGGCCCTGCAGCCCTAGGGGCGCACTTTGGGGAATCTGCCTCAGCCCATCTGTCTGACCTGGCTCCTCTCCTGCTACATCCTGAGGAGGAAGTAGCTGAAGCTGCTGCCTCTCTCCTGGCCATTTGTCCCTTTCCTTCTGAAGCCTTATCCCCCTCCCAGCTCCTGGGACTGGTAAGGGCTGGGGTGCACCGCTTCTTTGCCTCTCTGAGGCTGCATGGACCCCCAGGTGTGGCCTCAGCCTGTCAGCTTCTCACCCGCCTGTCTCAGACATCCCCAGCTGGGCTCAAGGCTGTCCTGCAGCTGCTGGTTGAAGGAGCCTTACATCGAGGCAACACAGAACTGTTTGGTGGGCAAGTAGATGGGGACAATGAGACTCTCTCAGTTGTTTCAGCTTCTTTGGCTTCTGCCTCCCTGTTGGACACTAACCGGAGGCACACTGCAGCTGTGCCAGGTCCTGGAGGGATTTGGTCAGTTTTCCATGCTGGAGTCATCGGCCGTGGCTTAAAGCCACCCAAGTTTGTCCAGTCACGAAATCAGCAGGAAGTGATCTATAACACCCAGAGCCTCCTCAGCCTCCTGGTTCACTGCTGCAGTGCCCCAGGGGGCACTGAATGTGGGGAATGCTGGGGGGCACCCATCTTGAGTCCAGAGGCAGCCAAAGCAGTGGCAGTGACCTTGGTGGAGAGTGTGTGTCCCGATGCAGCTGGTGCAGAGCTGGCCTGGCCCCCCGAGGAACACGCCCGGGCCACCGTGGAGCGGGATCTCCGCATTGGCCGGCGCTTCCGCGAACAGCCCCTGCTCTTTGAGCTGTTAAAGCTGGTAGCAGCTGCACCCCCAGCCCTGTGCTACTGTTCCGTGCTGCTTCGGGGGCTGCTGGCCGCCCTCTTGGGCCATTGGGAAGCCTCTCGCCACCCTGACACGACCCACTCCCCCTGGCACCTGGAGGCATCCTGCACCTTAGTGGCTGTCATGGCTGAGGGAAGCCTCCTGCCTCCGGCCCTGGGTAATATGCATGAAGTATTTAGCCAACTGGCACCTTTCGAGGTGCGTCTGCTGCTGCTCAGTGTCTGGGGTTTTCTCCGGGAGCATGGGCCCTTGCCTCAGAAGTTCATCTTCCAATCAGAGCGGGGTCGCTTCATTCGGGACTTCTCCAGGGAGGGTGGAGGTGAGGGTGGACCCCATCTGGCTGTGCTGCACAGTGTCCTCCACCGCAACATCGACCGCCTAGGTCTTTTCTCTGGCCGTTTCCAGGCACCTTCACCGTCCACTCTCCTTCGACAGGGGACGTAGCCTTTTCTTGCTCTGGAAGCCCAGGGAGGTTGAGCAGTGAGAGAGGGAAGGGACTAACGTGCTCCGGAAGGGTGGAGGTTTCTCTTCTAAGTCCTTGGTCTAAAGAGCGCTGTCACTTTTTTCTCTCCCACTTTTTTTTTTCTAAATAAAATTTGCCAACTTG(SEQ ID NO1)
表2MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO2)本發(fā)明的BFLP1698樣核酸和多肽(包括表1中所示的那些)在文中被稱為“BFLP1698”核酸和多肽。
根據(jù)本發(fā)明，BFLP1698核酸以及所編碼的多肽可用于多種應(yīng)用和環(huán)境中。
BFLP1698表現(xiàn)出與其它蛋白的同源性，如表3所描述的BLAST結(jié)果中所示的。KIAA0169、IMAGE3461492和3598686以及cDNAFLJ21639都是由見(jiàn)于基因組DNA的部分讀框(已表達(dá)序列標(biāo)志(ESTs))編碼的蛋白。因?yàn)锽FLP1698與這些蛋白具有同源性，所以它也由完整的可讀框或者較大可讀框的一部分(EST)編碼。

表4顯示了BFLP1698(SEQ ID NO2)針對(duì)上文表3中所述蛋白的ClustalW比對(duì)。
表4.SEQ ID NO2的ClustalW分析1)SEQ ID NO22)gi|20480454|ref|XP_167747.1|(XM_167747)(SEQ ID NO17)3)gi|12697941|dbj|BAB21789.1|(AB051485)(SEQ ID NO18)4)gi|20380408|gb|AAH28025.1|(BC028025)(SEQ ID NO19)5)gi|20849521|ref|XP_144111.1|(XM_144111)(SEQ ID NO20)6)gi|21296297|gb|EAA08442.1|(AAAB01008879)(SEQ ID NO21)102030405060....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|SEQ ID NO2 MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPS 60gi|20480454|ref ------------------------------------------------------------ 1gi|12697941|dbj ------------------------------------------------------------ 1gi|20380408|gb| ------------------------------------------------------------ 1gi|20849521|ref ----------MILMITLFTTATFLVLGVSVWVLIKEILTVHVPPPIPQRVKFHMLHYFFQ 50gi|21296297|gb| ------------------------------------------------------------ 1708090 100 110 120....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|SEQ ID NO2 IVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHST 120gi|20480454|ref ------------------------------------MSALCDPPGAPGPPGPAPATHG-- 22gi|12697941|dbj ------------------------------------------------------------ 1gi|20380408|gb| ------------------------------------------------------------ 1gi|20849521|ref LTIALGNVLEKMKICPMPRFFCFIQDLLVSKNNFGVLVKNMHFGTIPVRLFQPKATSSGP 110gi|21296297|gb| ------------------------------------------------------------ 1130 140 150 160 170 180....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|SEQ ID NO2 QRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKA 180
gi|20480454|ref ---------------------PAP--LS----------------------AQELSQEIKA 37gi|12697941|dbj ------------------------------------------------------------ 1gi|20380408|gb| ------------------------------------------------------------ 1gi|20849521|ref RKGIIFYHGGGGVFGSLDSYHNTCSYLAHET------------------DSVVMAVGYRK 152gi|21296297|gb| ------------------------------------------------------------ 1190 200 210 220 230 240....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|SEQ ID NO2 FLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDNLRGVFDESVRAHLAALDETPV 240gi|20480454|ref FLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDRLRGVFDESVRAHLAALDETPV 97gi|12697941|dbj ------------------------------------------------------------ 1gi|20380408|gb| ------------------------------------------------------------ 1gi|20849521|ref LPDHHHPTAYHDCLNATVHFLKELKTYGVDPARVVVSGESIGAGAAAIIAQVVLARRDLP 212gi|21296297|gb| ------------------------------------------------------------ 1

SEQ ID NO2的殘基1-170在本文中稱為SEQ ID NO16。包括氨基酸1-27的SEQ ID NO17片段在本文中稱為SEQ ID NO22。
BFLP1698核酸本發(fā)明的核酸包括編碼BFLP1698多肽或蛋白的那些核酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)多肽和蛋白是可互換的。
在有些實(shí)施方案中，BFLP1698核酸編碼成熟BFLP1698多肽。如本文所用，本文中所述“成熟”形式的多肽或蛋白涉及天然存在的多肽產(chǎn)物或前體形式或蛋白原。天然存在的多肽、前體或蛋白原，作為非限制性的實(shí)例，包括由相應(yīng)基因編碼的全長(zhǎng)基因產(chǎn)物?；蛘撸淇啥x為由本文中所述的可讀框編碼的多肽、前體或蛋白原。產(chǎn)物的“成熟”形式，再次地作為非限制性的實(shí)例，由于一種或多種天然發(fā)生的加工步驟而產(chǎn)生，所述加工步驟可能在產(chǎn)生該基因產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)發(fā)生。導(dǎo)致產(chǎn)生“成熟”形式的多肽或蛋白的此類加工步驟的實(shí)例包括由可讀框起始密碼子編碼的N-末端甲硫氨酸殘基的切割，或者信號(hào)肽或前導(dǎo)序列的蛋白酶剪切。從而由具有殘基1到N、其中殘基1為N-末端甲硫氨酸的的前體多肽或蛋白產(chǎn)生的成熟形式，在去除N-末端甲硫氨酸之后將保留殘基2至N。或者，由具有殘基1到N、其中自殘基1到殘基M的N-末端信號(hào)序列被切割的前體多肽或蛋白產(chǎn)生的成熟形式，將保留自殘基M+1到殘基N的殘基。此外如本文所用，“成熟”形式的多肽或蛋白可由除蛋白酶剪切事件之外的翻譯后修飾步驟產(chǎn)生。此類額外加工，作為非限制性的實(shí)例，包括糖基化、豆蔻?；蛄姿峄Ｒ话愣裕墒於嚯幕虻鞍卓蓛H僅由進(jìn)行這些加工過(guò)程中的一個(gè)而產(chǎn)生，或者由它們?nèi)魏蔚慕M合而產(chǎn)生。
本發(fā)明包括SEQ ID NO1或其片段的突變或變體核酸，其任何堿基都可能由SEQ ID NO1中所示的相應(yīng)堿基發(fā)生變化，同時(shí)仍然編碼維持了至少一種其BFLP1698樣活性及生理學(xué)功能(即調(diào)節(jié)血管發(fā)生、神經(jīng)元發(fā)育)的蛋白。本發(fā)明還包括SEQ ID NO1核酸序列的互補(bǔ)物，包括其片段、衍生物、類似物及同系物。本發(fā)明另外還包括在其結(jié)構(gòu)上包括了化學(xué)修飾的核酸或核酸片段或它們的互補(bǔ)物。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的編碼BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分的核酸分子。同樣包括在內(nèi)的有足以用作為雜交探針以鑒定編碼BFLP1698的核酸(如BFLP1698 mRNA)的核酸片段，以及用作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物以用于擴(kuò)增或突變BFLP1698核酸分子的片段。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”旨在包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(如mRNA)、利用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物、及其衍生物、片段和同系物。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈DNA。
“探針”是指具有可變長(zhǎng)度的核酸序列，優(yōu)選在至少大約10個(gè)核苷酸(nt)、100nt或者多至大約如6,000nt之間，視用途而定。探針用于相同、相似或互補(bǔ)核酸序列的檢測(cè)中。較長(zhǎng)長(zhǎng)度的探針通常由天然或重組來(lái)源獲得，是高度特異性的，且雜交比寡聚體慢得多。探針可以是單鏈或雙鏈的，并設(shè)計(jì)為在PCR、基于膜的雜交技術(shù)或ELISA-類技術(shù)中具有特異性。
“分離的”核酸分子是從該核酸的天然來(lái)源中存在的其它核酸分子中分離出來(lái)的核酸分子。分離的核酸分子的實(shí)例包括但不限于包含在載體之中的重組DNA分子、維持在異種宿主細(xì)胞之中的重組DNA分子、部分或基本上純化的核酸分子、以及合成的DNA或RNA分子。優(yōu)選地，“分離的”核酸不含在得到該核酸的生物的基因組DNA中天然位于該核酸側(cè)面的序列(即位于該核酸5′和3′端的序列)。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的BFLP1698核酸分子可含有小于大約50kb、25kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其在得到該核酸的細(xì)胞的基因組DNA中天然位于該核酸分子的側(cè)面。而且，“分離的”核酸分子如cDNA分子，當(dāng)由重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)可基本上不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時(shí)可基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)制劑。
本發(fā)明的核酸分子，例如具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子，或其互補(bǔ)物可利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息分離。使用所有或部分SEQ ID NO1的核酸序列作為雜交探針，BFLP1698核酸序列可利用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)分離(例如，如在Sambrook等，編輯，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989以及Ausubel等，編輯，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，NY，1993中所描述的那樣)。
本發(fā)明的核酸可利用cDNA、mRNA或者備選地基因組DNA作為模板以及合適的寡核苷酸引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增?？蓪⑷绱藬U(kuò)增的核酸克隆到合適的載體中，并通過(guò)DNA序列分析予以表征。此外，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)如利用自動(dòng)化DNA合成儀制備與BFLP1698核苷酸序列對(duì)應(yīng)的寡核苷酸。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指一串相連的核苷酸殘基，該寡核苷酸具有足夠數(shù)目的核苷酸堿基以用于PCR反應(yīng)。短寡核苷酸序列可根據(jù)或由基因組或cDNA序列設(shè)計(jì)，并用于擴(kuò)增、確認(rèn)或揭示特定細(xì)胞或組織中存在相同、相似或互補(bǔ)的DNA或RNA。寡核苷酸包括具有長(zhǎng)度約為10nt、50nt或100nt、優(yōu)選長(zhǎng)度約為15nt到30nt的部分核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括長(zhǎng)度小于100nt的核酸分子的寡核苷酸還將包括SEQ ID NO1的至少6個(gè)鄰接的核苷酸或其互補(bǔ)物。寡核苷酸可以化學(xué)合成并且可用作為探針。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子包括為SEQ IDNO1所示核苷酸序列的互補(bǔ)物的核酸分子，或該核苷酸序列的一部分。與SEQ ID NO1所示核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子為與SEQ IDNO1所示核苷酸序列足夠互補(bǔ)的核酸分子，從而其能夠以很少或沒(méi)有錯(cuò)配地與SEQ ID NO1所示核苷酸序列以氫鍵鍵合，由此形成穩(wěn)定的雙鏈體。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指核酸分子核苷酸單位之間的沃森-克里克(Watson-Crick)或Hoogsteen堿基配對(duì)，并且術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”意味著兩多肽或化合物或相關(guān)多肽或化合物或其組合之間的物理或化學(xué)相互作用。結(jié)合包括離子、非離子、范德瓦耳斯、疏水相互作用等。物理相互作用可以是直接或者間接的。間接相互作用可能通過(guò)或者歸因于另一多肽或化合物的作用。直接結(jié)合是指不通過(guò)或者歸因于另一多肽或化合物的作用而發(fā)生的相互作用，相反其無(wú)需其它實(shí)質(zhì)的化學(xué)中間物。
而且，本發(fā)明的核酸分子可僅僅包括SEQ ID NO1的核酸序列的一部分，例如可用作為探針或引物的片段、或者編碼BFLP1698生物學(xué)活性部分的片段。本文提供的片段定義為具有至少6個(gè)(鄰接的)核酸或者至少4個(gè)(鄰接的)氨基酸的序列，該長(zhǎng)度分別地，在核酸的情況下足以允許特異性雜交，或者在氨基酸的情況下足以允許特異性識(shí)別表位，并且至多為小于全長(zhǎng)序列的某一部分。片段可來(lái)源于所選核酸或氨基酸序列的任何鄰接的部分。片段可包括多至4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。衍生物為由天然化合物直接地或者通過(guò)修飾或部分取代形成的核酸序列或氨基酸序列。類似物為具有類似于但不同于天然化合物的結(jié)構(gòu)、但就某些成分或側(cè)鏈而言有別于天然化合物的結(jié)構(gòu)的核酸序列或氨基酸序列。類似物可以是合成的或者來(lái)自于不同的進(jìn)化起源，并且與野生型相比可能具有類似或相反的代謝活性。
衍生物和類似物可以是全長(zhǎng)或不同于全長(zhǎng)的，如果所述衍生物或類似物含有修飾核酸或氨基酸的話，如下文所述。本發(fā)明核酸或蛋白的衍生物或類似物包括但不限于包括與本發(fā)明的核酸或蛋白基本上同源的區(qū)域的分子，其在各種實(shí)施方案中相對(duì)于相同大小的核酸或氨基酸序列或者當(dāng)與比對(duì)序列進(jìn)行比較時(shí)(其中所述比對(duì)由本領(lǐng)域公知的計(jì)算機(jī)同源程序進(jìn)行)，具有至少大約70％、80％、85％、90％、95％、98％或者甚至99％的同一性(優(yōu)選為80-99％的同一性)，或其編碼核酸能夠在嚴(yán)格、中度嚴(yán)格或低度嚴(yán)格條件下與編碼前述蛋白的序列的互補(bǔ)物雜交。例示性的程序?yàn)椴捎萌笔≡O(shè)置的Gap程序(Wisconsin序列分析包，Version 8 for UNIX，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，Madison，WI)，其使用Smith和Waterman的算法。
“同源核酸序列”或“同源氨基酸序列”或其變異是指如上文所討論的以核苷酸水平或氨基酸水平上的同源性為特征的序列。同源核苷酸序列編碼為BFLP1698多肽同工型編碼的那些序列。作為例如RNA可變剪接的結(jié)果，同工型可在同一生物的不同組織中表達(dá)?；蛘?，同工型可由不同的基因編碼。在本發(fā)明中，同源核苷酸序列包括編碼除人以外物種的BFLP1698多肽的核苷酸序列，所述物種包括但不限于哺乳動(dòng)物，并因而可包括例如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、母牛、馬及其它生物。同源核苷酸序列也包括但不限于天然存在的本文所列核苷酸序列的等位基因變異和突變。然而，同源核苷酸序列并不包括編碼人BFLP1698蛋白的核苷酸序列。同源核酸序列包括編碼SEQ IDNO2中的保守氨基酸取代(見(jiàn)下文)以及具有BFLP1698活性的多肽的那些核酸序列。BFLP1698蛋白的生物學(xué)活性在下文描述。同源氨基酸序列并不編碼人BFLP1698多肽的氨基酸序列。
由人BFLP1698基因的克隆所確定的核苷酸序列使得能夠產(chǎn)生設(shè)計(jì)用來(lái)鑒定和/或克隆其它細(xì)胞類型(如來(lái)自其它組織)中的BFLP1698同系物、以及來(lái)自其它哺乳動(dòng)物的BFLP1698同系物的探針和引物。所述探針/引物一般包含基本上純的寡核苷酸。所述寡核苷酸一般包括在嚴(yán)格條件下與至少大約12、25、50、100、150、200、250、300、350或400或者更長(zhǎng)的連續(xù)的SEQ ID NO1有義鏈核苷酸序列或SEQ IDNO1反義鏈核苷酸序列雜交的核苷酸序列區(qū)域或天然存在的SEQ IDNO1突變體的核苷酸序列區(qū)域。
基于人BFLP1698核苷酸序列的探針可用于檢測(cè)編碼相同或同源蛋白的轉(zhuǎn)錄物或基因組序列。在各種實(shí)施方案中，所述探針進(jìn)一步包括與之附著的標(biāo)記基團(tuán)，例如標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。此類探針可用作為診斷檢驗(yàn)試劑盒的一部分，用以鑒定錯(cuò)誤表達(dá)BFLP1698蛋白的細(xì)胞或組織，例如通過(guò)測(cè)量來(lái)自受試者的細(xì)胞樣品中的編碼BFLP1698的核酸的水平，例如檢測(cè)BFLP1698 mRNA水平或確定基因組BFLP1698基因是否已被突變或缺失。
“具有BFLP1698生物學(xué)活性部分的多肽”是指如在特定的生物學(xué)測(cè)定中所測(cè)量的那樣，以或不以劑量依賴性地表現(xiàn)出與本發(fā)明的多肽(包括成熟形式)的活性相似、但并非必然完全相同的活性的多肽。編碼“BFLP1698生物學(xué)活性部分”的核酸片段可通過(guò)如下方法制備，即分離SEQ ID NO1中編碼具有BFLP1698生物學(xué)活性(BFLP1698蛋白的生物學(xué)活性如下文所述)的多肽的部分、表達(dá)編碼的部分BFLP1698蛋白(如通過(guò)體外重組表達(dá))并評(píng)估編碼的部分BFLP1698的活性。
本發(fā)明也提供了多態(tài)形式的BFLP1698核酸序列，以及檢測(cè)BFLP1698序列中的多態(tài)序列的方法。所述多態(tài)形式包括對(duì)應(yīng)于與BFLP1698相關(guān)的外顯子和/或內(nèi)含子的基因組序列。
攜帶本發(fā)明的多態(tài)等位基因的個(gè)體可在DNA、RNA或蛋白水平利用本領(lǐng)域熟知的多種技術(shù)檢測(cè)?，F(xiàn)有的方法通常使用預(yù)先表征過(guò)的多態(tài)性。也就是說(shuō)，存在于某位點(diǎn)上的多態(tài)形式的基因型分布和性質(zhì)早已確定。這種信息的可獲得性使得能夠設(shè)計(jì)探針組以特異性地鑒定已知的多態(tài)形式。
用于診斷的基因組DNA可由軀體的任何有核細(xì)胞獲得，例如存在于外周血、尿、唾液、口腔樣品、外科手術(shù)樣品以及尸體解剖樣品的那些有核細(xì)胞。所述DNA可直接使用，或者可在突變分析前，通過(guò)使用PCR或其它體外擴(kuò)增法如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)在體外酶促擴(kuò)增。
特定DNA序列中多態(tài)性的檢測(cè)可通過(guò)多種方法完成，包括但不限于基于等位基因特異性的限制性內(nèi)切核酸酶切割的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)、與等位基因特異性的寡核苷酸探針(包括固定的寡核苷酸或寡核苷酸陣列)雜交、等位基因特異性PCR、錯(cuò)配修復(fù)檢測(cè)(MRD)、MutS蛋白的結(jié)合、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)、錯(cuò)配堿基對(duì)上的RNA酶切割、異源雙鏈體DNA的化學(xué)或酶促切割、基于等位基因特異性引物延伸的方法、遺傳位分析(geneticbit analysis)(GBA)、寡核苷酸連接測(cè)定(OLA)、等位基因特異性連接鏈反應(yīng)(LCR)、缺口-LCR、使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)操作的放射性和/或熒光DNA測(cè)序以及肽核酸(PNA)測(cè)定。
BFLP1698變體本發(fā)明還包含由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而不同于SEQ ID NO1所示核苷酸序列的核酸分子。因而這些核酸編碼與SEQ ID NO1所示核苷酸序列編碼的蛋白相同的BFLP1698蛋白，如SEQ ID NO2的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子具有編碼具有SEQID NO2所示氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。
除了SEQ ID NO1所示的人BFLP1698核苷酸序列之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，群體(如人群)內(nèi)可能存在著導(dǎo)致BFLP1698氨基酸序列變化的DNA序列多態(tài)性。BFLP1698基因中的此種遺傳多態(tài)性可能由于天然等位基因變異而在群體內(nèi)的個(gè)體中存在。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”和“重組基因”是指包括編碼BFLP1698蛋白、優(yōu)選為哺乳動(dòng)物BFLP1698蛋白的可讀框的核酸分子。此類天然等位基因變異一般地可導(dǎo)致BFLP1698基因核苷酸序列中1-5％的變異。任何和所有此類核苷酸變異以及所造成的因天然等位基因變異產(chǎn)生的、且不改變的BFLP1698功能活性的BFLP1698氨基酸多態(tài)性都落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
而且，編碼來(lái)自其它物種的BFLP1698蛋白的核酸分子，并且從而具有不同于SEQ ID NO1的人序列的核苷酸序列的核酸分子都落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。與本發(fā)明的BFLP1698 cDNA的天然等位基因變體和同系物對(duì)應(yīng)的核酸分子可基于其與本文所公開的人BFLP1698核酸的同源性，利用人cDNA或其部分作為雜交探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)在嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行分離。例如，可溶的人BFLP1698 cDNA可基于其與人膜結(jié)合的BFLP1698的同源性進(jìn)行分離。同樣地，膜結(jié)合的人BFLP1698 cDNA可基于其與可溶的人BFLP1698的同源性進(jìn)行分離。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子長(zhǎng)度至少為6個(gè)核苷酸，且在嚴(yán)格條件下與包括SEQ ID NO1核苷酸序列的核酸分子雜交。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸長(zhǎng)度至少為10、25、50、100、250、500或750個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子與編碼區(qū)雜交。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下雜交”旨在描述用于雜交和洗滌的條件，在此條件下，彼此至少60％同源的核苷酸序列一般保持相互雜交。
同系物(即編碼來(lái)源于人以外的物種的BFLP1698蛋白的核酸)或其它相關(guān)序列(如平行進(jìn)化同源物(paralog))可利用核酸雜交和克隆領(lǐng)域所熟知的方法通過(guò)與作為探針的全部或部分特定人序列的低度、中度或高度嚴(yán)格雜交獲得。
從而，本發(fā)明也包括能夠與本文所述的多核苷酸在降低的嚴(yán)格條件下、更優(yōu)選在嚴(yán)格條件下、并且更優(yōu)選在高度嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。嚴(yán)格條件的實(shí)例示于下表高度嚴(yán)格條件為至少同例如條件A-F一樣嚴(yán)格的那些條件；嚴(yán)格條件至少同例如條件G-L一樣嚴(yán)格；而降低的嚴(yán)格條件至少同例如條件M-R一樣嚴(yán)格。
表4.嚴(yán)格條件


1雜交體長(zhǎng)度為預(yù)期的雜交多核苷酸雜交區(qū)域的長(zhǎng)度。當(dāng)將多核苷酸與未知序列的靶多核苷酸進(jìn)行雜交時(shí)，雜交體長(zhǎng)度被假定為雜交多核苷酸的長(zhǎng)度。當(dāng)已知序列的多核苷酸進(jìn)行雜交時(shí)，雜交體長(zhǎng)度可通過(guò)比對(duì)所述多核苷酸的序列并鑒定具有最佳序列互補(bǔ)性的區(qū)域(或多個(gè)區(qū)域)來(lái)確定。
HSSPE(1xSSPE為0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mMEDTA，pH7.4)可用以替代雜交和緩沖液中的SSC(1xSSC為0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；洗滌于雜交完成之后進(jìn)行15分鐘。
TB*-TR*預(yù)期長(zhǎng)度小于50個(gè)堿基對(duì)的雜交體的雜交溫度應(yīng)當(dāng)比該雜交體的解鏈溫度(Tm)低5-10℃，其中Tm根據(jù)如下方程式確定。對(duì)于長(zhǎng)度小于18個(gè)堿基對(duì)的雜交體，Tm(℃)＝2(A+T堿基的數(shù)目)+4(G+C堿基的數(shù)目)。對(duì)于長(zhǎng)度在18和49個(gè)堿基對(duì)之間的雜交體，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N為雜交體中的堿基數(shù)目，而Na+為雜交緩沖液中鈉離子的濃度(對(duì)于1xSSC，Na+＝0.165M)。
優(yōu)選地，每一個(gè)這樣的雜交多核苷酸具有與之雜交的本發(fā)明多核苷酸長(zhǎng)度的至少25％(更優(yōu)選至少50％，并且最優(yōu)選至少75％)的長(zhǎng)度，并且同與之雜交的本發(fā)明多核苷酸具有至少60％的序列同一性(更優(yōu)選至少75％的同一性；最優(yōu)選至少90％或95％的同一性)，其中序列同一性是通過(guò)在比對(duì)時(shí)對(duì)雜交多核苷酸進(jìn)行比較，從而使重疊和同一性最大化、同時(shí)又使序列缺口最小化來(lái)確定的。
嚴(yán)格雜交條件的非限制性實(shí)例為在包括6X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500mg/ml變性鮭精DNA的高鹽緩沖液中于65℃雜交。該雜交之后跟著在0.2X SSC、0.01％BSA中于50℃進(jìn)行一次或多次洗滌。本發(fā)明分離的在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1的序列雜交的核酸分子對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。如本文所用，“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列(如編碼天然蛋白)的RNA或DNA分子。
在第二實(shí)施方案中，提供了在中度嚴(yán)格條件下與包含SEQ IDNO1的核苷酸序列的核酸分子、或者其片段、類似物或衍生物雜交的核酸序列。中度嚴(yán)格雜交條件的非限制性實(shí)例為在6X SSC，5XDenhardt′s溶液、0.5％SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中于55℃雜交，隨后的37℃下1X SSC、0.1％SDS中的一次或多次洗滌。
在第三實(shí)施方案中，提供了在低度嚴(yán)格條件下與包含SEQ IDNO1的核苷酸序列的核酸分子、或者其片段、類似物或衍生物雜交的核酸。低度嚴(yán)格雜交條件的非限制性實(shí)例為在35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％ Ficoll、0.2％ BSA、100mg/ml變性鮭精DNA、10％(重量/體積)硫酸葡聚糖中于40℃雜交，隨后為50℃下2XSSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS中的一次或多次洗滌。
保守突變除了可能存在于群體中的天然存在的BFLP1698序列等位基因變體之外，熟練技術(shù)人員將會(huì)進(jìn)一步理解可通過(guò)突變SEQ ID NO1的核苷酸序列而引入變化，由此導(dǎo)致所編碼的BFLP1698蛋白氨基酸序列的變化，而不會(huì)改變所述BFLP1698蛋白的功能能力。例如，可在SEQ ID NO1序列中進(jìn)行導(dǎo)致“非必需”氨基酸殘基處的氨基酸取代的核苷酸取代?！胺潜匦琛卑被釟埢鶠榭勺砸吧虰FLP1698序列改變而不會(huì)改變所述生物學(xué)活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物學(xué)活性所必需的。例如，改變本發(fā)明的BFLP1698蛋白中保守的氨基酸殘基，很可能導(dǎo)致該BFLP1698蛋白活性的喪失。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及編碼包含了對(duì)于活性并非必需的氨基酸殘基的改變的BFLP1698蛋白的核酸分子。此類BFLP1698蛋白與SEQID NO2存在著氨基酸序列的差異，但仍保留生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子包括編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少大約75％同源的氨基酸序列。
優(yōu)選地，由該核酸編碼的蛋白與SEQ ID NO2至少為大約80％同源的，更優(yōu)選至少大約90％、95％、98％并且最優(yōu)選與SEQ IDNO2至少為大約99％同源的。
分離的編碼與SEQ ID NO2的蛋白同源的BFLP1698蛋白的核酸分子可通過(guò)向SEQ ID NO1的核苷酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失而生成，從而向所編碼的蛋白之中引入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失。
可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)向SEQ ID NO1的核苷酸序列中引入突變，例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選地，在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基上進(jìn)行保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔且环N其中氨基酸殘基被置換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域業(yè)已定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。從而，預(yù)測(cè)的BFLP1698中的非必需氨基酸殘基被置換為來(lái)自相同側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸殘基。備選地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，可例如通過(guò)飽和誘變沿全部或部分BFLP1698編碼序列隨機(jī)引入突變，并且所得的突變體可進(jìn)行BFLP1698生物學(xué)活性的篩選，以鑒定保留活性的突變體。繼SEQ IDNO1誘變之后，可通過(guò)任何本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)表達(dá)所編碼的蛋白，并且可測(cè)定該蛋白的活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)突變BFLP1698蛋白進(jìn)行如下測(cè)定(1)與其它BFLP1698蛋白、其它細(xì)胞表面蛋白或其生物學(xué)活性部分形成蛋白蛋白相互作用的能力；(2)突變BFLP1698蛋白和BFLP1698受體之間復(fù)合物的形成；(3)突變BFLP1698蛋白與胞內(nèi)靶蛋白或其生物學(xué)活性部分(如抗生物素蛋白)結(jié)合的能力；(4)與BFLP1698蛋白結(jié)合的能力；或(5)與抗-BFLP1698蛋白抗體特異性結(jié)合的能力。反義BFLP1698核酸本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及分離的反義核酸分子或者其片段、類似物或衍生物，其可與包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子雜交或與之互補(bǔ)。“反義”核酸包含互補(bǔ)于編碼蛋白的“有義”核酸(例如互補(bǔ)于雙鏈cDNA分子的編碼鏈或互補(bǔ)于mRNA序列)的核苷酸序列。在具體的方面，提供了包含互補(bǔ)于至少約10、25、50、100、250或500個(gè)核苷酸或完整的BFLP1698編碼鏈、或僅與其部分互補(bǔ)的序列的反義核酸分子。另外提供了編碼SEQ ID NO2的BFLP1698蛋白的片段、同系物、衍生物和類似物的核酸分子或互補(bǔ)于SEQ ID NO1的BFLP1698核酸序列的反義核酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子與編碼BFLP1698的核苷酸序列編碼鏈的“編碼區(qū)”反義。術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”是指包含了翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列的區(qū)域(如對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的人BFLP1698的蛋白編碼區(qū))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子與編碼BFLP1698的核苷酸序列編碼鏈的“非編碼區(qū)”反義。術(shù)語(yǔ)“非編碼區(qū)”是指位于編碼區(qū)側(cè)面并不翻譯成氨基酸的5′和3′序列(即，也稱為5′和3′非翻譯區(qū))。
給定編碼本文公開的BFLP1698的編碼鏈序列(如SEQ IDNO1)，則可根據(jù)沃森-克里克或Hoogsteen堿基配對(duì)規(guī)則來(lái)設(shè)計(jì)本發(fā)明的反義核酸。所述反義核酸分子可與BFLP1698 mRNA的整個(gè)編碼區(qū)互補(bǔ)，但更優(yōu)選為僅與BFLP1698 mRNA的部分編碼或非編碼區(qū)反義的寡核苷酸。例如，所述反義寡核苷酸可與BFLP1698 mRNA翻譯起始位點(diǎn)周圍的區(qū)域互補(bǔ)。例如，反義寡核苷酸長(zhǎng)度可以為約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸可利用本領(lǐng)域公知的操作利用化學(xué)合成或酶促連接反應(yīng)構(gòu)建。例如，反義核酸(如反義寡核苷酸)可利用天然存在的核苷酸、或設(shè)計(jì)用以提高該分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或提高反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的各式各樣的修飾核苷酸化學(xué)合成，例如可使用硫代磷酸酯衍生物及吖啶取代的核苷酸。
可用于產(chǎn)生反義核酸的修飾核苷酸的實(shí)例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2，6-二氨基嘌呤。備選地，反義核酸可利用已向其中以反義方向亞克隆了核酸的表達(dá)載體(即，由插入核酸轉(zhuǎn)錄的RNA將具有與目的靶核酸反義的方向，在以下的分節(jié)中進(jìn)一步描述)生物學(xué)產(chǎn)生。
本發(fā)明的反義核酸分子一般向受試者施用或原位產(chǎn)生，從而它們與編碼BFLP1698蛋白的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，由此例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來(lái)抑制蛋白的表達(dá)。雜交可以是通過(guò)常規(guī)的核苷酸互補(bǔ)以形成穩(wěn)定的雙鏈體來(lái)進(jìn)行的，或者，例如，在與DNA雙鏈體結(jié)合的反義核酸分子的情況下，是通過(guò)雙螺旋大溝中的特異性相互作用來(lái)進(jìn)行的。施用本發(fā)明的反義核酸分子的途徑的實(shí)例包括在組織位點(diǎn)上直接注射。備選地，可修飾反義核酸分子以靶向選擇的細(xì)胞，然后全身性施用。例如，為全身性施用，可修飾反義分子從而它們與表達(dá)在所選細(xì)胞表面上的受體或抗原特異性地結(jié)合，例如通過(guò)將反義核酸分子連接于與細(xì)胞表面受體或抗原結(jié)合的肽或抗體。反義核酸分子也可以利用本文所述的載體送遞到細(xì)胞中。為實(shí)現(xiàn)反義分子足夠的胞內(nèi)濃度，優(yōu)選其中將反義核酸分子置于強(qiáng)polII或polIII啟動(dòng)子控制之下的載體構(gòu)建體。
而在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸分子為α-異頭核酸分子。α-異頭核酸分子與互補(bǔ)RNA形成特異性的雙鏈雜交體，其中與常見(jiàn)的β-單位相反，兩鏈彼此平行。反義核酸分子也可以包括2′-o-甲基核糖核苷酸。
作為非限制性的實(shí)例，此類修飾包括修飾的堿基以及其糖磷酸主鏈被修飾或衍生化的核酸。實(shí)施這些修飾至少部分地是為了增強(qiáng)修飾的核酸的化學(xué)穩(wěn)定性，從而它們可以，例如在對(duì)受試者的治療應(yīng)用中用作反義結(jié)合核酸。
BFLP1698核酶和PNA部分又在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸為核酶。核酶為具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能夠切割它們與之具有互補(bǔ)區(qū)的單鏈核酸如mRNA。因而，核酶(如錘頭狀核酶)可用于催化性地切割BFLP1698 mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此抑制BFLP1698 mRNA的翻譯。對(duì)編碼BFLP1698的核酸具有特異性的核酶可基于本文所公開的BFLP1698 DNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)(即SEQ ID NO1)。例如，可構(gòu)建四膜蟲(Tetrahymena)L-19 IVS RNA衍生物，其中活性位點(diǎn)的核苷酸序列互補(bǔ)于編碼BFLP1698的mRNA中待切割的核苷酸序列。備選地，可利用BFLP1698 mRNA從RNA分子庫(kù)中選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。
備選地，BFLP1698基因的表達(dá)可通過(guò)靶向互補(bǔ)于BFLP1698調(diào)控區(qū)(如BFLP1698啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)的核苷酸序列以在靶細(xì)胞中形成防止BFLP1698基因轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)而抑制。
在各種實(shí)施方案中，BFLP1698的核酸可在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈上進(jìn)行修飾，以改善例如分子的穩(wěn)定性、雜交或溶解度。例如，可修飾核酸的脫氧核糖磷酸主鏈以產(chǎn)生肽核酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肽核酸”或“PNA”是指核酸模擬物如DNA模擬物，其中脫氧核糖磷酸主鏈被置換為假肽主鏈，并且只保留了四種天然核堿基(nucleobase)。PNA的中性主鏈已顯示能夠與DNA和RNA在低離子強(qiáng)度的條件下特異性雜交。PNA寡聚體的合成可利用標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方案進(jìn)行。
BFLP1698的PNA可用在治療和診斷應(yīng)用中。例如，通過(guò)如誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯停滯或抑制復(fù)制，PNA可用作為反義或抗基因劑(antigeneagent)用于基因表達(dá)的序列特異性調(diào)節(jié)。BFLP1698的PNA也可通過(guò)例如PNA指導(dǎo)的PCR鎖止技術(shù)(PCR clamping)而用于例如基因中單堿基對(duì)突變的分析中；當(dāng)與其它酶如S1核酸酶聯(lián)用時(shí)用作人工限制性內(nèi)切酶；或者用作用于DNA序列分析和雜交的探針或引物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)在PNA上附著親脂或其它輔助基團(tuán)、通過(guò)形成PNA-DNA嵌合體、或通過(guò)利用脂質(zhì)體或本領(lǐng)域公知的其它藥物送遞技術(shù)來(lái)修飾BFLP1698的PNA，以例如增強(qiáng)其穩(wěn)定性或細(xì)胞吸收。例如，可產(chǎn)生可能結(jié)合了PNA和DNA有利性質(zhì)的BFLP1698的PNA-DNA嵌合體。
寡核苷酸可包括其它附加基團(tuán)，例如肽(如用于在體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞受體)或促進(jìn)跨細(xì)胞膜或血-腦屏障運(yùn)輸?shù)脑噭?。另外，寡核苷酸可用雜交觸發(fā)的切割劑或嵌入劑修飾。為此目的，可將寡核苷酸與另一分子綴合，如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)劑、雜交觸發(fā)的切割劑等。
BFLP1698干涉核酸同樣由本發(fā)明提供的是分離的雙鏈核酸(DNA或RNA)，其能夠介導(dǎo)BFLP1698基因表達(dá)的特異性抑制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該雙鏈分子的一條或兩條鏈均為RNA分子。優(yōu)選地，每一條RNA鏈具有19-25，特別是19-23個(gè)核苷酸、更特別是20-22個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，并且能夠介導(dǎo)BFLP1698靶特異性的核酸修飾，特別是RNA干涉和/或DNA甲基化。雙鏈BFLP1698分子可以是雙鏈的，或者在5’和/或3’末端之一或兩端均具有突出端。例如，所述分子可具有3’突出端。3’突出端的長(zhǎng)度可以是例如1-6個(gè)核苷酸、2-5個(gè)核苷酸、3-4個(gè)核苷酸或2個(gè)核苷酸。對(duì)于每條鏈，突出端的長(zhǎng)度可以相同或不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA由配對(duì)的兩條21個(gè)核苷酸的鏈組成，從而在該雙鏈RNA的兩端都存在著1、2或3個(gè)核苷酸的突出端。
RNA鏈優(yōu)選具有3’-羥基基團(tuán)。5’-末端優(yōu)選包括磷酸、二磷酸、三磷酸或羥基基團(tuán)。如果期望，3-’突出端可被穩(wěn)定化以防降解。例如，可對(duì)其進(jìn)行選擇，從而它們由嘌呤核苷酸、特別是腺嘌呤或鳥嘌呤核苷酸組成。備選地，嘧啶核苷酸可用修飾的類似物置換，例如將尿苷-2核苷酸3’突出端置換為2’-脫氧胸苷可被耐受，且并不影響RNA干涉的效率。RNA分子可含有至少一個(gè)修飾的核苷酸類似物。所述核苷酸類似物可位于其中靶特異性的活性如介導(dǎo)RNAi的活性基本上不受影響的位置上。修飾的核苷酸優(yōu)選存在于位于雙鏈RNA分子5’-端/或3’-端的區(qū)域。在有些實(shí)施方案中，突出端通過(guò)整合入修飾的核苷酸類似物予以穩(wěn)定。
核苷酸類似物可包括糖或主鏈修飾的核糖核苷酸。其它合適的核苷酸包括非天然存在的核堿基而非天然存在的核堿基。例如，類似物可包括于在5-位修飾的尿苷或胞苷，如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；于8-位修飾的腺苷和鳥苷，如8-溴鳥苷；脫氮核苷酸，如7-脫氮-腺苷；O-及N-烷化核苷酸，如N6-甲基腺苷是適合的。在優(yōu)選的糖修飾的核糖核苷酸中，2’OH-基團(tuán)由選自H、OR、R、鹵素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基團(tuán)置換，其中R為C1-C6烴基、鏈烯基或炔基，而鹵素為F、Cl、Br或I。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)主鏈修飾的核糖核苷酸被用作為連接于鄰近核糖核苷酸的磷酸酯基團(tuán)時(shí)，它們被置換為修飾基團(tuán)，如硫代磷酸酯基團(tuán)。應(yīng)當(dāng)指出，上述修飾可以組合起來(lái)。
所述BFLP1698干涉RNA分子可以是天然分離的RNA分子，或者可以是合成的RNA分子。優(yōu)選地，所述BFLP1698干涉RNA分子基本上不含細(xì)胞提取物中存在的如來(lái)自果蠅(Drosophila)胚的污染物。此外，所述BFLP1698干涉RNA分子優(yōu)選基本上不含任何非靶特異性的污染物，特別是非靶特異性的RNA分子，如基本上不含細(xì)胞提取物中存在的污染物。
分離的雙鏈BFLP1698干涉分子可用于介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中尤其是人細(xì)胞中BFLP1698靶特異性的核酸修飾，尤其是RNAi。
本發(fā)明雙鏈BFLP1698干涉分子的序列與核酸BFLP1698靶分子具有足夠的同一性，以實(shí)現(xiàn)BFLP1698基因表達(dá)和/或DNA甲基化的靶特異性干涉。優(yōu)選地，該序列與RNA分子雙鏈部分中期望的靶分子具有至少50％、特別是至少70％的同一性。更優(yōu)選地，RNA分子雙鏈部分中的同一性至少為85％并且最優(yōu)選100％。BFLP1698雙鏈干涉RNA分子與預(yù)定核酸靶分子例如具有SEQ ID NO1所示序列的BFLP1698 mRNA靶分子的同一性，可利用方程式I＝(n/L)×100確定，其中I為同一性百分比，n為ds RNA雙鏈部分和靶中相同核苷酸的數(shù)目，而L為ds RNA雙鏈部分和靶中序列重疊的長(zhǎng)度。
備選地，雙鏈RNA分子相對(duì)于靶序列的同一性也可以定義為包括3’突出端，特別是具有1-3個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的突出端。在這種情況下，與靶序列的序列同一性優(yōu)選至少為50％，更優(yōu)選至少70％，并且最優(yōu)選至少85％。例如，來(lái)自3’突出端的核苷酸以及距雙鏈5’和/或3’末端最多2個(gè)的核苷酸可被修飾而沒(méi)有顯著的活性喪失。
雙鏈BFLP1698RNA分子可通過(guò)如下方法制備，包括合成分別具有19-25如19-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的兩條RNA鏈，其中所述RNA鏈能夠形成雙鏈RNA分子，其中優(yōu)選至少一條鏈具有1-5個(gè)核苷酸的3’-突出端，并且(b)使合成的RNA鏈在雙鏈RNA分子得以形成的條件下結(jié)合。所述雙鏈RNA分子能夠介導(dǎo)靶特異性的核酸修飾，特別是RNA干涉和/或DNA甲基化。
合成RNA分子的方法是本領(lǐng)域公知的。單鏈RNA也可以通過(guò)酶促轉(zhuǎn)錄由合成的DNA模板或由從重組細(xì)菌中分離的DNA質(zhì)粒制備。一般地，使用噬菌體RNA聚合酶，例如T7、T3或SP6 RNA聚合酶。
本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)使細(xì)胞或生物與本發(fā)明的雙鏈RNA分子在其中靶特異性核酸修飾可能發(fā)生的條件下進(jìn)行接觸，介導(dǎo)細(xì)胞或生物中BFLP1698特異性核酸修飾、特別是RNA干涉和/或DNA甲基化以及介導(dǎo)由雙鏈RNA對(duì)BFLP1698靶核酸施加的靶特異性核酸修飾的方法。
BFLP1698多肽本發(fā)明的BFLP1698多肽包括BFLP1698樣蛋白，其序列在SEQID NO2中提供。本發(fā)明也包括所公開的BFLP1698多肽或本文公開的BFLP1698多肽序列的任何片段的突變體或變體形式。
從而，BFLP1698多肽包括其中任何殘基可能由SEQ ID NO2所示的對(duì)應(yīng)殘基發(fā)生改變而同時(shí)仍編碼保留其BFLP1698樣活性和生理學(xué)功能的蛋白或其功能性片段的多肽。在有些實(shí)施方案中，突變體或變體蛋白中最多20％或更多的殘基可能如此改變。在有些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的BFLP1698多肽為成熟多肽。
雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)殍b定BFLP1698多肽序列(如包括全部或部分SEQ ID NO2的多肽)中包含雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，測(cè)試了完整的編碼序列或BFLP1698多肽序列的片段結(jié)合雷帕霉素的能力?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的用于測(cè)定多肽與小分子結(jié)合的任何技術(shù)。例如，可標(biāo)記雷帕霉素(即用非放射性標(biāo)記或用放射性標(biāo)記(如14C、32P、3H或125I)、并與包含某些或全部BFLP1698多肽序列的多肽混合。多肽任選地包括促進(jìn)檢測(cè)的部分，例如多肽可以是包括BFLP1698序列和非BFLP1698多肽序列的融合多肽。
向混合物中添加特異于含BFLP1698多肽序列的多肽的試劑(如特異于BFLP1698的抗體或在融合多肽的情況下特異于非BFLP1698多肽的探針)。分離與試劑結(jié)合的復(fù)合物，并測(cè)定揭示著雷帕霉素存在的標(biāo)記的存在。
一般而言，保持了BFLP1698樣功能的BFLP1698樣變體包括其中序列中特定位置上的殘基已被另一氨基酸取代的任何變體，并且還包括在親本蛋白兩殘基之間插入另外一個(gè)殘基或多個(gè)殘基的可能性，以及從親本序列中缺失一個(gè)或多個(gè)殘基的可能性。任何氨基酸取代、插入或缺失都包含在本發(fā)明中。在有利的情形下，取代為如上文所定義的保守取代。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的BFLP1698蛋白及其生物學(xué)活性部分，或其衍生物、片段、類似物或同系物。片段可包括鄰接的一段SEQID NO2，或SEQ ID NO2的散布的片段。同樣提供的有適合用作為免疫原以產(chǎn)生抗-BFLP1698抗體的多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)合適的純化方案利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)從細(xì)胞或組織來(lái)源中分離天然BFLP1698蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BFLP1698蛋白是通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的。作為重組表達(dá)的備選方法，BFLP1698蛋白或多肽可利用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成。
“純化的”蛋白或其生物學(xué)活性部分基本上不含細(xì)胞材料或來(lái)自取得BFLP1698蛋白的細(xì)胞或組織來(lái)源的其它污染蛋白，或者當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)制劑。用語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞材料”包括其中蛋白與分離或重組產(chǎn)生該蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞組分分離開來(lái)的BFLP1698蛋白制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，用語(yǔ)“基本上不含細(xì)胞材料”包括具有少于大約30％(干重)的非BFLP1698蛋白(本文中也稱為“污染蛋白”)、更優(yōu)選少于大約20％的非BFLP1698蛋白、還更優(yōu)選少于大約10％的非BFLP1698蛋白、并且最優(yōu)選少于大約5％的非BFLP1698蛋白的BFLP1698蛋白制劑。當(dāng)BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分是重組產(chǎn)生的時(shí)候，也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，也就是說(shuō)，培養(yǎng)基構(gòu)成少于大約20％、更優(yōu)選少于大約10％、并且最優(yōu)選少于大約5％的蛋白制劑體積。
用語(yǔ)“基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)制劑”包括其中蛋白與參與該蛋白合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)制劑分離開來(lái)的BFLP1698蛋白制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，用語(yǔ)“基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)制劑”包括具有少于大約30％(干重)的化學(xué)前體或非BFLP1698化學(xué)制劑、更優(yōu)選少于大約20％的化學(xué)前體或非BFLP1698化學(xué)制劑、還更優(yōu)選少于大約10％的化學(xué)前體或非BFLP1698化學(xué)制劑、并且最優(yōu)選少于大約5％的化學(xué)前體或非BFLP1698化學(xué)制劑的BFLP1698蛋白制劑。
BFLP1698蛋白的生物學(xué)活性部分包括這樣的肽，其包含有與BFLP1698蛋白的氨基酸序列足夠同源或由其衍生的氨基酸序列，例如比全長(zhǎng)BFLP1698蛋白包括更少氨基酸的SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列，并且表現(xiàn)出BFLP1698蛋白的至少一種活性。一般地，生物學(xué)活性部分包含具有BFLP1698蛋白的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。BFLP1698蛋白的生物學(xué)活性部分可以是例如長(zhǎng)度為10、25、50、100或更多個(gè)氨基酸的多肽。
本發(fā)明BFLP1698蛋白的生物學(xué)活性部分可含有至少一個(gè)上文所鑒定到的在BFLP1698蛋白之間保守的結(jié)構(gòu)域。而且，其中蛋白其它區(qū)域缺失的其它生物學(xué)活性部分可通過(guò)重組技術(shù)制備，并評(píng)價(jià)其天然BFLP1698蛋白的一種或多種功能活性。
在一實(shí)施方案中，BFLP1698蛋白具有SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，BFLP1698蛋白與SEQ ID NO2基本上同源，并保留SEQ ID NO2蛋白的功能活性，然而由于天然等位基因變異或誘變而在氨基酸序列上有差別，如下文所詳述的那樣。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，BFLP1698蛋白為包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少大約45％同源的氨基酸序列且保留了SEQ ID NO2的BFLP1698蛋白的功能活性的蛋白。
確定兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同源性為確定兩氨基酸序列或兩核酸序列的百分比同源性，為最佳比較的目的將序列進(jìn)行比對(duì)(例如可在進(jìn)行比較的任一序列中引入缺口以取得序列間的最佳比對(duì))。然后比較對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械哪澄恢脼榕c第二序列對(duì)應(yīng)位置上相同的氨基酸殘基或核苷酸所占據(jù)時(shí)，則所述分子在該位置上是同源的(也就是說(shuō)，如本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。
核酸序列同源性可確定為兩序列間的同一性程度。同源性可以利用本領(lǐng)域公知的計(jì)算機(jī)程序確定，例如GCG程序包中提供的GAP軟件。使用具有如下設(shè)置的GCG GAP軟件用于核酸序列比較5.0的GAP建立罰分(creation penalty)和0.3的GAP延伸罰分(elongationpenalty)，上述類似核酸序列的編碼區(qū)表現(xiàn)出與SEQ ID NO1中所示DNA序列的CDS(編碼)部分優(yōu)選至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性程度。
術(shù)語(yǔ)“序列同一性”是指兩多核苷酸或多肽序列在特定的比較區(qū)域上基于逐個(gè)殘基完全相同的程度。術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分比”是通過(guò)如下方法計(jì)算的，即在所述比較區(qū)域上比較兩最佳比對(duì)的序列、確定兩序列中出現(xiàn)的完全相同的核酸堿基(例如在核酸情況下的A、T、C、G、U或I)的位置數(shù)目以得出匹配位置的數(shù)目、用匹配位置的數(shù)目除以比較區(qū)域中的位置總數(shù)目(即窗口大小)、并用結(jié)果乘以100以得出序列同一性百分比。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本同一性”表示多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含與參照序列在比較區(qū)域上相比具有至少80％序列同一性、優(yōu)選至少85％同一性并且通常90％到95％序列同一性、更通常至少99％序列同一性的序列。術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)性殘基百分比”是通過(guò)如下方法計(jì)算的，即在所述比較區(qū)域上比較兩最佳比對(duì)的序列、確定兩序列中出現(xiàn)的如上文所定義的完全相同以及保守氨基酸取代的位置數(shù)目以得出匹配位置的數(shù)目、用匹配位置的數(shù)目除以比較區(qū)域中的位置總數(shù)目(即窗口大小)、并用結(jié)果乘以100以得出陽(yáng)性殘基百分比。
嵌合及融合蛋白本發(fā)明也提供了BFLP1698嵌合或融合蛋白。如本文所用，BFLP1698“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括可操作地連接于非BFLP1698多肽的BFLP1698多肽?！癇FLP1698多肽”是指具有與BFLP1698相應(yīng)的氨基酸序列的多肽，而“非BFLP1698多肽”是指具有與并不基本上與BFLP1698蛋白同源的蛋白(如不同于BFLP1698蛋白且來(lái)源于相同或不同生物的蛋白)相應(yīng)的氨基酸序列的多肽。在BFLP1698融合蛋白內(nèi)，BFLP1698多肽可對(duì)應(yīng)于全部或部分BFLP1698蛋白。BFLP1698融合多肽的實(shí)例是包括SEQ ID NO2的氨基酸21-230的多肽(如包括SEQ ID NO2的氨基酸1-246或氨基酸21-246的多肽)。在一個(gè)實(shí)施方案中，BFLP1698融合蛋白包含BFLP1698蛋白的至少一個(gè)生物學(xué)活性部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BFLP1698融合蛋白包含BFLP1698蛋白的至少兩個(gè)生物學(xué)活性部分。在融合蛋白內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”旨在表明BFLP1698多肽和非BFLP1698多肽是以框內(nèi)彼此融合的。非BFLP1698多肽可融合于BFLP1698多肽的N-末端或C-末端。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，BFLP1698融合蛋白包含可操作地連接于第二蛋白(即非BFLP1698蛋白)的胞外結(jié)構(gòu)域或第二蛋白(即非BFLP1698蛋白)的跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的BFLP1698多肽。此類融合蛋白可進(jìn)一步用于調(diào)節(jié)BFLP1698活性的化合物的篩選測(cè)定(此類測(cè)定在下文詳細(xì)描述)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白為GST-BFLP1698融合蛋白，其中BFLP1698序列融合于GST(即谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)序列的C-端。此類融合蛋白可促進(jìn)重組BFLP1698的純化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白為BFLP1698-免疫球蛋白融合蛋白，其中包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的BFLP1698序列融合于來(lái)自于免疫球蛋白蛋白家族成員的序列。
BFLP1698配體/BFLP1698相互作用的抑制通過(guò)改變細(xì)胞因子和趨化因子級(jí)聯(lián)機(jī)制可在治療上用于治療增生及分化紊亂如癌癥，以及調(diào)節(jié)(如促進(jìn)或抑制)細(xì)胞存活以及免疫調(diào)節(jié)紊亂、自身免疫、移植和炎癥。而且，本發(fā)明的BFLP1698-免疫球蛋白融合蛋白可用作免疫原以在受試者中產(chǎn)生抗-BFLP1698抗體、純化BFLP1698配體、以及在篩選測(cè)定中鑒定抑制BFLP1698與BFLP1698配體相互作用的分子。
本發(fā)明的BFLP1698嵌合或融合蛋白可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片段框內(nèi)連接在一起，例如通過(guò)使用平頭末端或交錯(cuò)末端用于連接、限制性內(nèi)切酶消化以提供合適的末端、適用時(shí)粘性末端的填充、堿性磷酸酶處理以避免不期望的連接以及酶促連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合基因可通過(guò)常規(guī)技術(shù)包括自動(dòng)化DNA合成儀合成。備選地，可利用錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述錨定引物在能夠隨后進(jìn)行退火和再擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列的兩連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)突出端。而且，許多早已編碼融合部分(如GST多肽)的表達(dá)載體是商業(yè)上可獲得的?？蓪⒕幋aBFLP1698的核酸克隆到這樣的表達(dá)載體中，從而融合部分框內(nèi)連接于BFLP1698蛋白。
如果期望，可利用BFLP1698蛋白編碼序列片段的文庫(kù)產(chǎn)生多樣化的BFLP1698片段群，以用于BFLP1698蛋白變體的篩選以及隨后的選擇。
BFLP1698抗體同樣包含在本發(fā)明中的有抗BFLP1698蛋白或BFLP1698蛋白片段的抗體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白(Ig)分子的免疫學(xué)活性部分，即含有與抗原特異性結(jié)合(與之免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合部位的分子。此類抗體包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fab、Fab’和F(ab′)2片段、以及Fab表達(dá)文庫(kù)。通常，由人類獲得的抗體分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD類中的任何一種，它們因存在于分子中的重鏈性質(zhì)而彼此不同。某些類還有亞類，如IgG1、IgG2等。此外，在人類中，輕鏈可以是κ鏈或λ鏈。本文提及的抗體包括提及的人抗體種類的所有類、亞類和型。
本發(fā)明分離的BFLP1698相關(guān)蛋白可旨在用作為抗原或其部分或片段，并且另外可用作為免疫原，以利用多克隆和單克隆抗體制備的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生與抗原免疫特異性結(jié)合的抗體?？墒褂萌L(zhǎng)蛋白，或者備選地，本發(fā)明提供了抗原的抗原性肽片段用作為免疫原?？乖噪钠伟L(zhǎng)蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的至少6個(gè)氨基酸殘基，并包含其表位，從而針對(duì)該肽所產(chǎn)生的抗體與全長(zhǎng)蛋白或與含此表位的任何片段形成特異性的免疫復(fù)合物。優(yōu)選地，抗原性肽包含至少10個(gè)氨基酸殘基、或至少15個(gè)氨基酸殘基、或至少20個(gè)氨基酸殘基、或至少30個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選的為抗原性肽所包含的表位是位于其表面的蛋白區(qū)域；通常這些為親水區(qū)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)為抗原性肽所包含的表位是位于蛋白表面的BFLP1698相關(guān)蛋白區(qū)域，如親水區(qū)。BFLP1698相關(guān)蛋白序列的疏水性分析將表明BFLP1698相關(guān)蛋白的哪些區(qū)域是特別親水的，因而很可能編碼可用于靶向抗體生產(chǎn)的表面殘基。作為靶向抗體生產(chǎn)的工具，親水性圖顯示親水性和疏水性區(qū)域，并且可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的任何方法產(chǎn)生，包括例如，有或無(wú)傅里葉變換的Kyte Doolittle或Hopp Woods方法。已產(chǎn)生了關(guān)于BFLP1698蛋白的Kylte & Doolitle圖，并示于下文表5。
表5.BFLP1698的Kyte & Doolittle圖 編碼本發(fā)明BFLP1698蛋白的新核酸或其片段還可用于診斷應(yīng)用，其中核酸或蛋白的存在或量有待評(píng)估。這些材料還可用于產(chǎn)生與本發(fā)明的新物質(zhì)免疫特異性結(jié)合的抗體，以用于治療或診斷方法中。所公開的BFLP1698蛋白具有多個(gè)親水區(qū)，其中每一個(gè)都可用作為免疫原。在一個(gè)實(shí)施方案中，所預(yù)期的BFLP1698表位來(lái)自于大約氨基酸1到60。在另一個(gè)實(shí)施方案中，BFLP1698表位來(lái)自于大約氨基酸70到80。在另外的實(shí)施方案中，BFLP1698表位來(lái)自于大約氨基酸85到170、來(lái)自于大約氨基酸180到190、來(lái)自于大約氨基酸210到220、來(lái)自于大約氨基酸230到260、來(lái)自于大約氨基酸290到310、來(lái)自于大約氨基酸350到360、來(lái)自于大約氨基酸370到380、來(lái)自于大約氨基酸400到430、來(lái)自于大約氨基酸450到480、來(lái)自于大約氨基酸520到540、來(lái)自于大約氨基酸600到620、來(lái)自于大約氨基酸630到640、來(lái)自于大約氨基酸680到690、來(lái)自于大約氨基酸730到740、來(lái)自于大約氨基酸850到860、來(lái)自于大約氨基酸870到890、來(lái)自于大約氨基酸970到1010、來(lái)自于大約氨基酸1030到1050、來(lái)自于大約氨基酸1080到1130、來(lái)自于大約氨基酸1150到1160，以及來(lái)自于大約氨基酸1180到1190。
本文也提供了特異于抗原性蛋白或其衍生物、片段、類似物或者同系物內(nèi)一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的抗體。
本發(fā)明的蛋白或其衍生物、片段、類似物、同系物或者直向同源物可用作為免疫原，以產(chǎn)生與這些蛋白成分免疫特異性結(jié)合的抗體。
本領(lǐng)域內(nèi)公知的各種方法可用于生產(chǎn)抗本發(fā)明的蛋白或者抗其衍生物、片段、類似物、同系物或直向同源物的多克隆或單克隆抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”(MAb)或“單克隆抗體組合物”是指僅含有一種分子種類的由唯一的輕鏈基因產(chǎn)物和唯一的重鏈基因產(chǎn)物組成的抗體分子的抗體分子群。
抗本發(fā)明蛋白抗原的抗體可進(jìn)一步包括人源化抗體或人抗體。人源化形式的抗體包括主要由人免疫球蛋白序列組成、且含有最小限度的衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其它抗原結(jié)合亞序列)。
抗體也可以是人抗體，如，其中基本上輕鏈和重鏈兩者的整個(gè)序列包括CDRs都是來(lái)自于人基因的抗體分子。人單克隆抗體可通過(guò)三體瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EBV雜交瘤技術(shù)制備。
人抗體也可利用噬菌體展示文庫(kù)、或通過(guò)將人免疫球蛋白基因座引入到其中內(nèi)源免疫球蛋白基因已被部分或完全滅活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如小鼠中生產(chǎn)。人抗體可另外利用修飾的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物生產(chǎn)，從而響應(yīng)抗原攻擊產(chǎn)生完全人抗體而不是動(dòng)物的內(nèi)源抗體。
本發(fā)明也提供了對(duì)本發(fā)明的抗原性蛋白特異性的單鏈抗體。另外，可對(duì)方法加以改造以適應(yīng)Fab表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建，以使得能夠快速和有效地鑒定對(duì)蛋白或其衍生物、片段、類似物或者同系物具有期望的特異性的單克隆Fab片段。含蛋白抗原獨(dú)特型的抗體片段可通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)生產(chǎn)，包括但不限于(i)由抗體分子的胃蛋白酶消化生產(chǎn)的F(ab′)2片段；(ii)通過(guò)還原F(ab′)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab片段；(iii)通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段以及(iv)Fv片段。
同樣由本發(fā)明所提供的有雙特異性抗體。雙特異性抗體為對(duì)至少兩個(gè)不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選為人或人源化抗體。結(jié)合特異性之一是針對(duì)本發(fā)明的抗原性蛋白的。第二結(jié)合靶為任何其它抗原，并且有利地是細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞單位。
如果期望，可將具有期望的結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))融合于免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。融合優(yōu)選與免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合，包含至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合必需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)存在于至少一個(gè)融合物中。
雙特異性抗體可作為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異性抗體)提供。
同樣落在本發(fā)明之內(nèi)的是具有多于兩效價(jià)的抗體(例如三特異性抗體)。
例示性的雙特異性抗體結(jié)合兩個(gè)不同的表位，至少其中一個(gè)來(lái)源于本發(fā)明的蛋白抗原。
本發(fā)明也包括異綴合(heteroconjugate)抗體，其包括兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的抗體可加以修飾以改變(如增強(qiáng)或減小)其功能。例如，可將半胱氨酸殘基引入到Fc區(qū)，由此使得該區(qū)域能夠形成鏈間二硫鍵。本發(fā)明也包括免疫綴合物，其包括與細(xì)胞毒性劑綴合的抗體，例如化療劑、毒素(如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶促活性毒素或其片段)、或放射性同位素(即放射性綴合物(radioconjugate))。
能夠使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自于銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素、油酮(Aleurites fordii)蛋白、dianthin蛋白、垂序商陸(phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素以及單端孢霉菌烯醇(tricothecenes)?？色@得多種放射性核素用于生產(chǎn)放射性綴合的抗體。實(shí)例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
抗體可與“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)綴合用于腫瘤預(yù)靶向，其中向患者施用抗體-受體綴合物，緊接著利用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的綴合物，然后施用“配體”(如抗生物素蛋白)，其依次與細(xì)胞毒性劑綴合。
BFLP1698重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及含編碼BFLP1698蛋白、或其衍生物、片段、類似物或同系物的核酸的載體，優(yōu)選為表達(dá)載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠運(yùn)送已與之相連的另一核酸的核酸分子。一類載體為“質(zhì)粒”，它是指環(huán)形雙鏈DNA環(huán)，其內(nèi)可連接附加的DNA片段。另一類載體為病毒載體，其中附加的DNA片段可連接到此病毒基因組中。某些載體能夠在引入了它們的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體以及附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(如非附加型哺乳動(dòng)物載體)一經(jīng)引入到宿主細(xì)胞內(nèi)就整合到宿主細(xì)胞的基因組中，由此與整合了它們的宿主基因組序列一起復(fù)制。而且，某些載體能夠指導(dǎo)它們與之可操作連接的基因的表達(dá)。此類載體在文中稱為“表達(dá)載體”?！百|(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。不過(guò)，本發(fā)明旨在包括其它形式的表達(dá)載體如病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們可作等同功能之用。
在重組表達(dá)載體內(nèi)，“可操作地連接”旨在表示目的核苷酸序列以允許該核苷酸序列表達(dá)(如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當(dāng)載體被引入到宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中)的方式連接于調(diào)控序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其它表達(dá)控制元件(如多聚腺苷酸化信號(hào))。調(diào)控序列包括指導(dǎo)核苷酸序列在許多類型的宿主細(xì)胞中組成型表達(dá)的那些以及指導(dǎo)核苷酸序列僅在某些宿主細(xì)胞中表達(dá)的那些(如組織特異性調(diào)控序列)。可將本發(fā)明的表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中，由此生產(chǎn)由如本文所述的核酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(如BFLP1698蛋白、突變形式的BFLP1698蛋白、融合蛋白等)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可設(shè)計(jì)為用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)BFLP1698蛋白。例如，BFLP1698蛋白可在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌(Escherichia coli)、昆蟲細(xì)胞(利用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。備選地，例如，使用T7啟動(dòng)子調(diào)控序列和T7聚合酶，重組表達(dá)載體可在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。
又在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸利用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括pCDM8和pMT2PC。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用時(shí)，表達(dá)載體的控制功能通常是由病毒調(diào)控元件提供的。例如，通常使用的啟動(dòng)子衍生自多瘤病毒(polyoma)、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒以及猿猴病毒40。見(jiàn)關(guān)于其它合適的用于原核和真核細(xì)胞兩者的表達(dá)載體系統(tǒng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)選在特定的細(xì)胞類型中表達(dá)(如使用組織特異性調(diào)控元件表達(dá)核酸)。組織特異性調(diào)控元件是本領(lǐng)域公知的。合適的組織特異性啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括清蛋白啟動(dòng)子(肝特異性)，淋巴樣特異性啟動(dòng)子，特別是T細(xì)胞受體和免疫球蛋白啟動(dòng)子，神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(如神經(jīng)絲啟動(dòng)子)、胰腺特異性啟動(dòng)子以及乳腺特異性啟動(dòng)子(如乳汁乳清啟動(dòng)子)。也包括發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子，如鼠hox啟動(dòng)子和甲胎蛋白啟動(dòng)子。
本發(fā)明還提供了包含以反義方向克隆到表達(dá)載體中的本發(fā)明的DNA分子的重組表達(dá)載體。也就是說(shuō)，DNA分子以允許表達(dá)(通過(guò)該DNA分子的轉(zhuǎn)錄)對(duì)BFLP1698mRNA而言反義的RNA分子的方式可操作地連接于調(diào)控序列?？蛇x擇指導(dǎo)反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中持續(xù)表達(dá)的可操作地連接于以反義方向克隆的核酸的調(diào)控序列，例如病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，或者可選擇指導(dǎo)反義RNA組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)的調(diào)控序列。反義表達(dá)載體可以是重組質(zhì)粒、噬菌粒或減毒病毒的形式，其中反義核酸在高效調(diào)控區(qū)的控制下產(chǎn)生，其活性可由引入了載體的細(xì)胞類型決定。
本發(fā)明的另一方面涉及業(yè)已引入了本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文中互換使用。人們理解此類術(shù)語(yǔ)不僅指特定的受試細(xì)胞，而且也指此細(xì)胞的子代或潛在子代。由于后代中因突變或環(huán)境影響可能會(huì)發(fā)生某些修飾，所以此子代可能事實(shí)上與親代細(xì)胞并不完全相同，但仍包括在如本文所用術(shù)語(yǔ)的范圍之內(nèi)。
宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，BFLP1698蛋白可在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如人、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)中表達(dá)。其它合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
一般將編碼可選擇標(biāo)記(如對(duì)抗生素的抗性)的基因與目的基因一起引入到宿主細(xì)胞之中。各種可選擇標(biāo)記包括賦予對(duì)藥物抗性的那些標(biāo)記，所述藥物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。編碼可選擇標(biāo)記的核酸可在編碼BFLP1698的同一載體上引入到宿主細(xì)胞中，或者在不同的載體上引入。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有引入的核酸的細(xì)胞可通過(guò)藥物選擇鑒定(如，已整合入可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞死亡)。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞如培養(yǎng)物中的原核或真核宿主細(xì)胞可用來(lái)生產(chǎn)(即表達(dá))BFLP1698蛋白。從而，本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)BFLP1698蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中業(yè)已引入編碼BFLP1698蛋白的重組表達(dá)載體)，從而BFLP1698蛋白得以產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離BFLP1698蛋白。轉(zhuǎn)基因BFLP1698動(dòng)物本發(fā)明的宿主細(xì)胞也可用于產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為其中已引入了BFLP1698蛋白編碼序列的受精卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞。然后可利用此類宿主細(xì)胞生成其中外源BFLP1698序列已被引入到其基因組中的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，或者其中內(nèi)源BFLP1698序列已被改變了的同源重組動(dòng)物。此類動(dòng)物可用于研究BFLP1698蛋白的功能和/或活性，以及用于鑒定和/或評(píng)價(jià)BFLP1698蛋白活性的調(diào)節(jié)劑。如本文所用，“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”為非人動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為嚙齒類動(dòng)物如大鼠或小鼠，其中該動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞包括轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其它實(shí)例包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、母牛、山羊、雞、兩棲動(dòng)物等。轉(zhuǎn)基因?yàn)檎系睫D(zhuǎn)基因動(dòng)物由之發(fā)育而來(lái)的細(xì)胞基因組中、并且保留在成熟動(dòng)物的基因組中的外源DNA，由此指導(dǎo)編碼的基因產(chǎn)物在該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種或多種細(xì)胞類型或組織中表達(dá)。如本文所用，“同源重組動(dòng)物”為非人動(dòng)物，優(yōu)選為優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為小鼠，其中內(nèi)源BFLP1698基因業(yè)已通過(guò)內(nèi)源基因和在動(dòng)物發(fā)育前引入到該動(dòng)物細(xì)胞如動(dòng)物胚胎細(xì)胞中的外源DNA分子之間的同源重組而被改變。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可通過(guò)將編碼BFLP1698的核酸引入到受精卵母細(xì)胞的雄性前核(如通過(guò)微注射、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染)中，并允許卵母細(xì)胞在假孕雌性代孕動(dòng)物中發(fā)育而生成。包括SEQ ID NO1在內(nèi)的序列可作為轉(zhuǎn)基因引入到非人動(dòng)物的基因組中。備選地，人BFLP1698基因的非人同系物如小鼠BFLP1698基因可基于與人BFLP1698cDNA的雜交(前文進(jìn)一步描述)而分離，并用作為轉(zhuǎn)基因。內(nèi)含子序列和多聚腺苷酸化信號(hào)也可包括在轉(zhuǎn)基因之中，以提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。可將組織特異性調(diào)控序列可操作地連接于BFLP1698轉(zhuǎn)基因以指導(dǎo)BFLP1698蛋白表達(dá)至特定細(xì)胞。經(jīng)由胚胎操作和微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，尤其是諸如小鼠的動(dòng)物，在本領(lǐng)域中已變得很常規(guī)。類似的方法用于產(chǎn)生其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因起始動(dòng)物可基于其基因組中BFLP1698轉(zhuǎn)基因的存在和/或該動(dòng)物組織或細(xì)胞中BFLP1698 mRNA的表達(dá)鑒定。然后可利用轉(zhuǎn)基因起始動(dòng)物繁育另外的攜帶該轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。而且，攜帶編碼BFLP1698蛋白的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可進(jìn)一步繁育為攜帶其它轉(zhuǎn)基因的其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
為生成同源重組動(dòng)物，制備含有至少一部分已向其中引入缺失、添加或取代的BFLP1698基因的載體，由此改變?nèi)绻δ苄云茐腂FLP1698基因。BFLP1698基因可以是人基因(如SEQ ID NO1的DNA)，但是更優(yōu)選地，為人BFLP1698基因的非人同系物。例如，SEQID NO1人BFLP1698基因的小鼠同系物可用于構(gòu)建適用于改變小鼠基因組中內(nèi)源BFLP1698基因的同源重組載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，如此設(shè)計(jì)載體，從而一經(jīng)同源重組，內(nèi)源BFLP1698基因就在功能上被破壞(即不再編碼功能性蛋白；也稱為“敲除(knock out)”載體)。
備選地，可如此設(shè)計(jì)載體，從而一經(jīng)同源重組，內(nèi)源BFLP1698基因被突變或以其它方式改變，但仍然編碼功能性蛋白(如可改變上游調(diào)控區(qū)，由此改變內(nèi)源BFLP1698蛋白的表達(dá))。在同源重組載體中，BFLP1698基因改變的部分在其5′-和3′-末端由BFLP1698基因另外的核酸在側(cè)面相接，以使得載體所攜帶的外源BFLP1698基因與胚胎干細(xì)胞中的內(nèi)源BFLP1698基因之間能夠發(fā)生同源重組。另外的側(cè)面相接的BFLP1698核酸具有足夠的長(zhǎng)度，以與內(nèi)源基因成功地重組。一般地，數(shù)千堿基的側(cè)面相接的DNA(在5′-和3′-末端)包含在載體中。然后將載體引入到胚胎干細(xì)胞系中(如通過(guò)電穿孔)，并選擇其中引入的BFLP1698基因已與內(nèi)源BFLP1698基因發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。
然后將選擇的細(xì)胞注射到動(dòng)物(如小鼠)胚泡中以形成聚集嵌合體。然后可將嵌合體胚胎植入到合適的假孕雌性代孕動(dòng)物中，并使胚胎生長(zhǎng)到足月。其生殖細(xì)胞中具有同源重組DNA的子代可通過(guò)轉(zhuǎn)基因的種系傳遞而用于繁育其中動(dòng)物的所有細(xì)胞都含有同源重組DNA的動(dòng)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可產(chǎn)生含有允許轉(zhuǎn)基因受調(diào)控地表達(dá)的選擇系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。此種系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例為噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統(tǒng)。見(jiàn)關(guān)于cre/loxP重組酶系統(tǒng)的描述。重組酶系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)例為釀酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP重組酶系統(tǒng)。如果利用cre/loxP重組酶系統(tǒng)調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，則需要含有編碼Cre重組酶和選擇蛋白兩者的轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。此類動(dòng)物可通過(guò)構(gòu)建“雙”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供，例如，通過(guò)使兩轉(zhuǎn)基因動(dòng)物交配，一個(gè)含有編碼選擇蛋白的轉(zhuǎn)基因，而另一個(gè)含有編碼重組酶的轉(zhuǎn)基因。
本文描述的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的克隆也可根據(jù)本領(lǐng)域描述的方法產(chǎn)生。簡(jiǎn)要地，可分離來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞(如體細(xì)胞)，并誘導(dǎo)退出生長(zhǎng)周期和進(jìn)入G0期。然后可例如通過(guò)使用電脈沖使該休眠細(xì)胞與來(lái)自分離該休眠細(xì)胞的同一物種的去核卵母細(xì)胞融合。然后培養(yǎng)重建的卵母細(xì)胞，從而其發(fā)育成桑椹胚或胚細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到假孕雌性代孕動(dòng)物中。由該雌性代孕動(dòng)物所生的后代將是由之分離細(xì)胞(如體細(xì)胞)的動(dòng)物的克隆。
檢測(cè)BFLP1698核酸及診斷狼瘡性腎炎的方法檢測(cè)BFLP1698核酸和/或多肽的試劑可用于檢測(cè)樣品中BFLP1698 RNA和/或蛋白序列的水平。由于升高的BFLP1698 RNA水平見(jiàn)于狼瘡性腎炎動(dòng)物之中，所以BFLP1698 RNA和/或BFLP1698多肽增高的水平的檢測(cè)指示著受試者中狼瘡的存在或易感性。另外，與未治療的狼瘡相比，治療過(guò)的狼瘡受試者中降低的BFLP1698 RNA水平意味著非狼瘡狀態(tài)的恢復(fù)。從而，狼瘡治療的效力可通過(guò)將來(lái)自治療群體的樣品中BFLP1698 RNA或蛋白的水平與患病但未治療樣品中的樣品(或來(lái)自業(yè)已經(jīng)過(guò)短期治療的個(gè)體的樣品)進(jìn)行比較予以監(jiān)控。
BFLP1698 RNA的水平可通過(guò)將來(lái)自其狼瘡狀態(tài)未知受試者的測(cè)試細(xì)胞群中的水平與其狼瘡狀態(tài)已知的參照細(xì)胞群中的水平進(jìn)行比較予以評(píng)估。從而，測(cè)試細(xì)胞群一般將包括至少一個(gè)能夠表達(dá)BFLP1698基因的細(xì)胞?！澳軌虮磉_(dá)”是指基因以完整的形式存在于細(xì)胞之中且能夠得以表達(dá)。若存在的話，則檢測(cè)BFLP1698序列的表達(dá)，并且優(yōu)選地利用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行測(cè)量。例如，本文公開的BFLP1698序列可用以構(gòu)建用于檢測(cè)BFLP1698RNA序列的探針，例如在RNA印跡雜交分析中或在特異性且優(yōu)選地定量擴(kuò)增BFLP1698特異性核酸序列的方法中。備選地，所述序列可用以構(gòu)建用于特異性擴(kuò)增BFLP1698序列的引物，例如在基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法中，如基于遞轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈反應(yīng)。
BFLP1698表達(dá)也可在蛋白水平，即通過(guò)測(cè)量BFLP1698多肽的水平來(lái)測(cè)量。此類方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括例如基于針對(duì)由基因編碼的蛋白的抗體的免疫測(cè)定。
測(cè)試及對(duì)照細(xì)胞群中序列的表達(dá)可利用任何本領(lǐng)域公認(rèn)的用于比較核酸序列表達(dá)的方法進(jìn)行比較。測(cè)試細(xì)胞群中基因表達(dá)特征與參照細(xì)胞群中的比較是否能夠揭示測(cè)量參數(shù)的存在或程度，依賴于參照細(xì)胞群的組成。例如，如果參照細(xì)胞群由來(lái)自無(wú)狼瘡受試者的細(xì)胞組成，那么測(cè)試細(xì)胞群和參照細(xì)胞群中相似的基因表達(dá)水平意味著測(cè)試細(xì)胞群來(lái)自無(wú)狼瘡受試者。相反，如果參照細(xì)胞群由來(lái)自患病受試者的細(xì)胞構(gòu)成，那么測(cè)試細(xì)胞群和參照細(xì)胞群之間相似的基因表達(dá)特征意味著測(cè)試細(xì)胞群來(lái)自狼瘡受試者。
在各種實(shí)施方案中，如果測(cè)試細(xì)胞群中BFLP1698序列的表達(dá)水平以2.0、1.5或1.0倍于參照細(xì)胞群中BFLP1698轉(zhuǎn)錄物水平的因數(shù)變動(dòng)，則認(rèn)為其在表達(dá)水平上與參照細(xì)胞群中ADIPO序列的表達(dá)水平是相當(dāng)?shù)?。在各種實(shí)施方案中，如果測(cè)試細(xì)胞群中BFLP1698序列的表達(dá)水平與參照細(xì)胞群的區(qū)別大于參照細(xì)胞群中相應(yīng)BFLP1698序列的表達(dá)水平的1.0、1.5、2.0或更多倍，則可認(rèn)為其在表達(dá)水平上改變了。
如果期望，測(cè)試細(xì)胞群和參照細(xì)胞群之間差異表達(dá)序列的比較可關(guān)于其表達(dá)不依賴于所測(cè)參數(shù)或條件的對(duì)照核酸來(lái)進(jìn)行。測(cè)試和參照核酸中對(duì)照核酸的表達(dá)水平可用于標(biāo)準(zhǔn)化比較群中的信號(hào)水平。合適的對(duì)照核酸可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定。
在有些實(shí)施方案中，測(cè)試細(xì)胞群與多個(gè)參照細(xì)胞群進(jìn)行比較。多個(gè)參照細(xì)胞群中的每一個(gè)都可能在已知參數(shù)上有所不同。因而，測(cè)試細(xì)胞群可能與來(lái)自已知具有狼瘡的受試者的第一參照細(xì)胞群、以及已知沒(méi)有狼瘡的第二參照群進(jìn)行比較。
所暴露的測(cè)試細(xì)胞群可以是任意數(shù)目的細(xì)胞，即一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，并且可在體外、體內(nèi)或離體提供。
優(yōu)選地，參照細(xì)胞群中的細(xì)胞來(lái)源于與測(cè)試細(xì)胞盡可能相似的組織類型，如腎組織。在有些實(shí)施方案中，對(duì)照細(xì)胞來(lái)源于與測(cè)試細(xì)胞相同的受試者。在其它實(shí)施方案中，參照細(xì)胞群來(lái)源于來(lái)自多個(gè)受試者的多個(gè)細(xì)胞。例如，參照細(xì)胞群可以是來(lái)自以前測(cè)試的細(xì)胞的表達(dá)模式的數(shù)據(jù)庫(kù)。
受試者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物可以是例如人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或母牛。
藥物組合物本發(fā)明的BFLP1698核酸分子、BFLP1698蛋白以及抗-BFLP1698抗體(本文中也稱為“活性化合物”)及其衍生物、片段、類似物和同系物可整合入適合于施用的藥物組合物之中。此類組合物一般包括核酸分子、蛋白或抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括任何以及所有的與藥物施用相容的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸附延緩劑等。合適的載體描述在最近版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences中，它是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考教科書，特此將其并入作為參考。此類載體或稀釋劑優(yōu)選的實(shí)例包括但不限于水、鹽水、林格液、葡萄糖溶液以及5％人血清清蛋白。也可使用脂質(zhì)體和非水載體如固定油。此類介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域眾所周知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容之外，都將預(yù)期其在組合物中用途。補(bǔ)充活性化合物也可整合到組合物中。
本發(fā)明的藥物組合物配制為與其預(yù)期施用途徑相容。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外，如靜脈內(nèi)，皮內(nèi)，皮下，口腔(如吸入)，經(jīng)皮(即局部)，跨粘膜以及直腸施用。
適于注射用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(其中水可溶)或分散體，以及用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射液或分散體的無(wú)菌粉末。
如本文所用的劑量單位形式是指物理上分離的適合作為用于待治療受試者的單位劑量的單位；每個(gè)單位含預(yù)定量的經(jīng)計(jì)算結(jié)合所需藥物載體可產(chǎn)生期望療效的活性化合物。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格受控于且直接地依賴于活性化合物的獨(dú)特特征和待實(shí)現(xiàn)的特定療效、以及為治療個(gè)體組合此種活性化合物領(lǐng)域所固有的局限性。
可制備持續(xù)釋放制劑。合適的持續(xù)釋放制劑實(shí)例包括含抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)為成型制品的形式，例如膜或微囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸(glycolicacid)共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成的可注射微球體)以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠超過(guò)100天釋放分子，但某些水凝膠以更短的時(shí)間周期釋放蛋白。
藥物組合物可連同施用說(shuō)明書一起包含在容器、包裝或分配器中。
篩選和檢測(cè)方法本發(fā)明分離的核酸分子可用于表達(dá)BFLP1698蛋白(如在基因治療應(yīng)用中經(jīng)由宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體)、檢測(cè)BFLP1698mRNA(如生物學(xué)樣品中的)或BFLP1698基因中的遺傳病變以及調(diào)節(jié)BFLP1698活性，如下文進(jìn)一步描述的那樣。另外，BFLP1698蛋白可用于篩選調(diào)節(jié)BFLP1698蛋白活性或表達(dá)的藥物或化合物，以及治療以BFLP1698蛋白產(chǎn)生不足或過(guò)度或者產(chǎn)生與BFLP1698野生型蛋白相比活性降低或異常的BFLP1698蛋白形式為特征的紊亂。另外，本發(fā)明的抗-BFLP1698抗體可用于檢測(cè)和分離BFLP1698蛋白以及調(diào)節(jié)BFLP1698活性。例如，BFLP1698活性包括T細(xì)胞或NK細(xì)胞生長(zhǎng)及分化、抗體產(chǎn)生以及腫瘤生長(zhǎng)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)本文描述的篩選測(cè)定鑒定的新試劑及其用于如前所述的治療的用途。
篩選測(cè)定本發(fā)明提供了用于鑒定調(diào)節(jié)劑的方法(本文中也稱為“篩選測(cè)定”)，所述調(diào)節(jié)劑即與BFLP1698蛋白結(jié)合或例如對(duì)BFLP1698蛋白表達(dá)或BFLP1698蛋白活性具有刺激或抑制作用的候選或測(cè)試化合物或試劑(如肽、肽模擬物(peptidomimetic)、小分子或其它藥物)。本發(fā)明也包括在此所述的篩選測(cè)定中鑒定到的化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，利用所述篩選測(cè)定鑒定用于治療自身免疫病的治療試劑。自身免疫病可以是例如狼瘡，包括狼瘡性腎炎。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選結(jié)合膜結(jié)合形式的BFLP1698蛋白或多肽或其生物學(xué)活性部分或調(diào)節(jié)其活性的候選或測(cè)試化合物的測(cè)定。本發(fā)明的測(cè)試化合物可利用本領(lǐng)域公知的組合文庫(kù)法的眾多途徑的任何一種獲得，包括生物學(xué)文庫(kù)、空間可尋址的并行固相或液相文庫(kù)、需要去卷積(deconvolution)的合成文庫(kù)法、“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文庫(kù)法以及利用親和層析選擇的合成文庫(kù)法。生物學(xué)文庫(kù)途徑限于肽文庫(kù)，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚體或小分子化合物文庫(kù)。
如本文所用的“小分子”意在指具有小于約5kD且最優(yōu)選小于約4kD分子量的組合物。小分子可以是例如雷帕霉素、核酸、肽、多肽、肽模擬物、碳水化合物、脂質(zhì)或其它有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。化學(xué)和/或生物學(xué)混合物文庫(kù)如真菌、細(xì)菌或藻類提取物是本領(lǐng)域公知的，并且可用任何本發(fā)明的測(cè)定進(jìn)行篩選?；衔镂膸?kù)可存在于溶液中、或在珠子上、在芯片、細(xì)菌、孢子、質(zhì)粒上或在噬菌體上。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定是基于細(xì)胞的測(cè)定，其中將在其細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分的細(xì)胞與測(cè)試化合物進(jìn)行接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物結(jié)合BFLP1698蛋白的能力。例如，細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物來(lái)源的或酵母細(xì)胞。例如，測(cè)試化合物結(jié)合BFLP1698蛋白能力的測(cè)定可通過(guò)將測(cè)試化合物與放射性同位素或酶標(biāo)記偶聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而測(cè)試化合物與BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分的結(jié)合可通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物中的標(biāo)記化合物測(cè)定。例如，測(cè)試化合物可直接或間接地由125I、35S、14C或3H標(biāo)記，且放射性同位素可通過(guò)直接計(jì)數(shù)放射性發(fā)射(radioemission)或通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)。備選地，測(cè)試化合物可用例如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶進(jìn)行酶標(biāo)記，且酶標(biāo)記可通過(guò)確定合適底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來(lái)檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定包括將在其細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分的細(xì)胞與已知結(jié)合BFLP1698的化合物進(jìn)行接觸，以形成測(cè)定混合物，將該測(cè)定混合物與測(cè)試化合物進(jìn)行接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物與BFLP1698蛋白相互作用的能力，其中測(cè)試化合物與BFLP1698蛋白相互作用能力的測(cè)定包括測(cè)定測(cè)試化合物與已知化合物相比優(yōu)選結(jié)合BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定是基于細(xì)胞的測(cè)定，包括將在其細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分的細(xì)胞與測(cè)試化合物進(jìn)行接觸，并測(cè)定該測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分活性的能力。例如，測(cè)試化合物調(diào)節(jié)BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分活性能力的測(cè)定可通過(guò)測(cè)定BFLP1698蛋白結(jié)合或與BFLP1698靶分子相互作用的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。如本文所用，“靶分子”是BFLP1698蛋白與之天然地結(jié)合或相互作用的分子，例如，表達(dá)BFLP1698相互作用蛋白的細(xì)胞表面上的分子、第二細(xì)胞表面上的分子、胞外環(huán)境中的分子、與細(xì)胞膜內(nèi)表面結(jié)合的分子或胞質(zhì)分子。BFLP1698靶分子可以是非BFLP1698分子或本發(fā)明的BFLP1698蛋白或多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，BFLP1698靶分子是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組分，其促進(jìn)胞外信號(hào)(如由化合物與膜結(jié)合的BFLP1698分子的結(jié)合所產(chǎn)生的信號(hào))穿過(guò)細(xì)胞膜和進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，靶可以是具有催化活性的第二胞間蛋白或者促進(jìn)下游信號(hào)傳導(dǎo)分子與BFLP1698結(jié)合的蛋白。
BFLP1698蛋白結(jié)合或與BFLP1698靶分子相互作用能力的測(cè)定可通過(guò)上文所述的用于確定直接結(jié)合的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，BFLP1698蛋白結(jié)合或與BFLP1698靶分子相互作用能力的測(cè)定可通過(guò)測(cè)定靶分子的活性實(shí)現(xiàn)。例如，靶分子的活性可通過(guò)如下方法來(lái)測(cè)定，即檢測(cè)靶中細(xì)胞第二信使(即胞內(nèi)Ca2+、二酰甘油、IP3等)的誘導(dǎo)、檢測(cè)靶對(duì)合適底物的催化/酶促活性、檢測(cè)報(bào)告基因(包含可操作地連接于編碼可檢測(cè)標(biāo)記如螢光素酶的核酸的BFLP1698應(yīng)答調(diào)控元件)的誘導(dǎo)、或檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)答如細(xì)胞存活、細(xì)胞分化或細(xì)胞增殖。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的測(cè)定是無(wú)細(xì)胞測(cè)定，包括將BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分與測(cè)試化合物進(jìn)行接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物結(jié)合BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分的能力。測(cè)試化合物與BFLP1698蛋白的結(jié)合可如上所述直接或間接地測(cè)定。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，測(cè)定包括將BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分與結(jié)合BFLP1698的已知化合物進(jìn)行接觸，以形成測(cè)定混合物，將該測(cè)定混合物與測(cè)試化合物進(jìn)行接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物與BFLP1698蛋白相互作用的能力，其中測(cè)試化合物與BFLP1698蛋白相互作用能力的測(cè)定包括測(cè)定測(cè)試化合物與已知化合物相比優(yōu)選結(jié)合BFLP1698或其生物學(xué)活性部分的能力。
又在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定是無(wú)細(xì)胞測(cè)定，包括將BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分與測(cè)試化合物進(jìn)行接觸，并測(cè)定該測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分活性的能力。例如，測(cè)試化合物調(diào)節(jié)BFLP1698蛋白活性能力的測(cè)定可通過(guò)利用上文所述用于確定直接結(jié)合的方法之一測(cè)定BFLP1698蛋白結(jié)合BFLP1698靶分子的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。在備選的實(shí)施方案中，測(cè)試化合物調(diào)節(jié)BFLP1698蛋白活性能力的測(cè)定可通過(guò)測(cè)定BFLP1698蛋白進(jìn)一步調(diào)節(jié)BFLP1698靶分子的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，靶分子對(duì)合適底物的催化/酶促活性可如上所述予以測(cè)定。
在另一實(shí)施方案中，無(wú)細(xì)胞測(cè)定包括將BFLP1698蛋白或其生物學(xué)活性部分與結(jié)合BFLP1698蛋白的已知化合物進(jìn)行接觸，以形成測(cè)定混合物，將該測(cè)定混合物與測(cè)試化合物進(jìn)行接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物與BFLP1698蛋白相互作用的能力，其中測(cè)試化合物與BFLP1698蛋白相互作用能力的測(cè)定包括測(cè)定BFLP1698蛋白優(yōu)選結(jié)合BFLP1698靶分子或調(diào)節(jié)其活性的能力。
本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞測(cè)定可應(yīng)用于可溶形式或膜結(jié)合形式的BFLP1698蛋白。在包含膜結(jié)合形式的BFLP1698蛋白的無(wú)細(xì)胞測(cè)定的情況下，可能期望使用增溶劑，從而膜結(jié)合形式的BFLP1698蛋白得以維持在溶液之中。此類增溶劑的實(shí)例包括非離子去污劑如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麥芽糖苷(maltoside)、辛?；?N-甲基葡糖酰胺(glucamide)、癸?；?N-甲基葡糖酰胺、TritonX-100、TritonX-114、Thesit、異十三烷基聚(乙二醇醚)n、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨-1-丙磺酸鹽、3-(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基-1-丙磺酸鹽(CHAPS)或3-(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)。
在本發(fā)明上述測(cè)定法的多于一個(gè)實(shí)施方案中，可能期望固定BFLP1698蛋白或其靶分子以促進(jìn)復(fù)合形式的與非復(fù)合形式的一種或兩種蛋白分離，以及適應(yīng)測(cè)定的自動(dòng)化。測(cè)試化合物與BFLP1698蛋白的結(jié)合、或存在或不存在候選化合物時(shí)BFLP1698蛋白與靶分子的相互作用，可在適合于容納反應(yīng)物的任何容器中實(shí)現(xiàn)。此類容器的實(shí)例包括微量滴定板、試管以及微量離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可提供添加了允許一個(gè)或兩個(gè)蛋白結(jié)合于基質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。例如，可將GST-BFLP1698融合蛋白或GST-靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后將它們與測(cè)試化合物、或與測(cè)試化合物和未吸附的靶蛋白或BFLP1698蛋白組合，并在有助于復(fù)合物形成的條件下(如在生理?xiàng)l件的鹽和pH下)溫育混合物。溫育后，洗滌珠子或微量滴定板孔以除去任何未結(jié)合的成分，在珠子的情況下固定基質(zhì)，直接或間接地測(cè)定復(fù)合物，例如，如前文所描述的那樣。備選地，復(fù)合物可從基質(zhì)中解離下來(lái)，并利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定BFLP1698蛋白結(jié)合或活性水平。
用于將蛋白固定在基質(zhì)上的其它技術(shù)也可用在本發(fā)明的篩選測(cè)定中。例如，BFLP1698蛋白或其靶分子都可利用生物素和鏈霉抗生物素蛋白的綴合予以固定。生物素化的BFLP1698蛋白或靶分子可由生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)利用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的技術(shù)(如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，III.)制備，并固定在鏈霉抗生物素蛋白涂覆的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。備選地，可將與BFLP1698蛋白或靶分子反應(yīng)、但并不干擾BFLP1698蛋白與其靶分子結(jié)合的抗體衍生化到此板的孔中，并通過(guò)抗體綴合將未結(jié)合的靶或BFLP1698蛋白俘獲到孔中。用于檢測(cè)此類復(fù)合物的方法，除上文所述用于GST-固定化復(fù)合物的那些之外，包括利用與BFLP1698蛋白或靶分子起反應(yīng)的抗體免疫檢測(cè)復(fù)合物，以及有賴于檢測(cè)與BFLP1698蛋白或靶分子相關(guān)的酶活性的酶聯(lián)測(cè)定。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在這樣的方法中鑒定BFLP1698蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，其中將細(xì)胞與候選化合物進(jìn)行接觸，并測(cè)定細(xì)胞中BFLP1698mRNA或蛋白的表達(dá)。將候選化合物存在下BFLP1698mRNA或蛋白的表達(dá)水平與不存在該候選化合物下BFLP1698mRNA或蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較。然后可基于這種比較將候選化合物鑒定為BFLP1698mRNA或蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。例如，若BFLP1698mRNA或蛋白的表達(dá)在候選化合物存在時(shí)比其不存在時(shí)更高(即統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著更高)，則將候選化合物鑒定為BFLP1698mRNA或蛋白表達(dá)的刺激劑。備選地，若BFLP1698mRNA或蛋白的表達(dá)在候選化合物存在時(shí)比其不存在時(shí)更低(統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上顯著更低)，則將候選化合物鑒定為BFLP1698mRNA或蛋白表達(dá)的抑制劑。細(xì)胞中BFLP1698mRNA或蛋白表達(dá)的水平可通過(guò)本文所述的用于檢測(cè)BFLP1698mRNA或蛋白的方法測(cè)定。
在本發(fā)明的另一方面，BFLP1698蛋白可用作為雙雜交測(cè)定或三雜交測(cè)定中的“餌蛋白”，以鑒定結(jié)合或與BFLP1698相互作用(“BFLP1698結(jié)合蛋白”或“BFLP1698-bp”)并調(diào)節(jié)BFLP1698活性的其它蛋白。此類BFLP1698結(jié)合蛋白作為例如BFLP1698途徑的上游或下游元件，也很可能參與通過(guò)BFLP1698蛋白的信號(hào)傳播。
雙雜交系統(tǒng)是以多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)性質(zhì)為基礎(chǔ)的，其由分開的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及激活結(jié)構(gòu)域組成。簡(jiǎn)言之，該測(cè)定利用兩個(gè)不同的DNA構(gòu)建體。在一個(gè)構(gòu)建體中，將編碼BFLP1698的基因融合于編碼已知轉(zhuǎn)錄因子(如GAL-4)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因。在另一個(gè)構(gòu)建體中，將來(lái)自DNA序列文庫(kù)的編碼未鑒定蛋白(“獵物”或“樣品”)的DNA序列融合于編碼已知轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)構(gòu)域的基因。如果“餌”和“獵物”蛋白能夠在體內(nèi)相互作用，形成BFLP1698依賴性復(fù)合物，則使得該轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及激活結(jié)構(gòu)域極為接近。這種接近允許可操作地連接于響應(yīng)于轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)的報(bào)告基因(如LacZ)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。可檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)，分離含功能性轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞群體，并將其用于獲得所克隆的編碼與BFLP1698相互作用的蛋白的基因。
本發(fā)明還涉及由前述篩選測(cè)定鑒定到的新試劑及其用于如本文所述的治療的用途。
本發(fā)明將在如下非限制性的實(shí)施例中舉例說(shuō)明。
實(shí)施例1.無(wú)病、狼瘡性腎炎模擬病及雷帕霉素治療的患病小鼠中鼠BFLP1698序列的表達(dá)模式在NZBXNZW鼠模型中發(fā)展了狼瘡性腎炎樣癥狀的小鼠中研究了鼠BFLP1698序列的表達(dá)。將患病小鼠中的表達(dá)與不同年齡的非患病小鼠中、以及在雷帕霉素或抗-B7抗體治療后其狼瘡性腎炎樣癥狀減輕的小鼠中序列的表達(dá)進(jìn)行了比較。
小鼠在6至8周齡獲自于Jackson Laboratories，并在現(xiàn)場(chǎng)(onsite)變老。數(shù)據(jù)得自于小鼠腎臟，并在所示的時(shí)間點(diǎn)收集C57BL/6雌性小鼠在第8和32周，F(xiàn)1(NZBxNZW)雌性小鼠在第12、25和42周，雷帕霉素治療小鼠在第42和55周，用抗B7.1和B7.2的抗體治療的小鼠在第52周。每組含3只小鼠。
雷帕霉素治療的小鼠自29周齡起8周內(nèi)每周3次接受5mg/kg雷帕霉素皮下注射。對(duì)照小鼠以同樣的日程表接受載體(甲基纖維素)注射。治療效力通過(guò)蛋白尿的標(biāo)準(zhǔn)化和腎臟組織學(xué)來(lái)確定(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)療程結(jié)束時(shí)(36周齡，數(shù)據(jù)未顯示)以及42周(治療后6周)和55周(治療后20周)殺死的小鼠進(jìn)行基因表達(dá)分析。
用抗-B7治療的小鼠自29周齡起2周內(nèi)每周3次接受200μg抗-B7.1(1G10F9單克隆)和200μg抗-B7.2(GL1單克隆)腹膜內(nèi)注射。治療后21周進(jìn)行基因表達(dá)分析。
RNA分離及與寡核苷酸陣列的雜交收集來(lái)自雄性和雌性小鼠的腎臟，并驟凍進(jìn)行RNA分離。每腎利用一半。對(duì)于每一個(gè)體動(dòng)物使用左腎的縱向切片和右腎的橫向切片。
將驟凍的小鼠腎臟組織利用勻漿器懸浮于RLT緩沖液加上2ME中進(jìn)行30到45秒的勻漿。總RNA利用Qiagen Midi試劑盒按照制造商的方案制備。將RNA懸浮于DEPC處理的水中，并由OD 280定量。
cDNA利用Superscript試劑盒(BRL)由5ug總RNA合成。cDNA利用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和Phage lock凝膠管按照Phage lock方案純化。收集上清，并用EtOH清洗。將樣品重懸于DEPC處理的水中。
在體外T7聚合酶驅(qū)動(dòng)用于合成和生物素標(biāo)記反義cRNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用Qiagen RNeasy旋轉(zhuǎn)柱純化來(lái)純化cRNA。GeneChip雜交混合物按照制造商的說(shuō)明，在200ul總體積的1X MES緩沖液中含15ug片段化的cRNA、0.5mg/ml乙?；腂SA、0.1mg/ml鮭精DNA。反應(yīng)混合物于45℃與Affymetrix Mu11 KsubA和Mu11 KsubB寡核苷酸陣列雜交16小時(shí)。除去雜交混合物，洗滌陣列并利用GeneChipFluidics Station 400由鏈霉抗生物素蛋白R(shí)-藻紅蛋白(MolecularProbes)進(jìn)行染色，且用Hewlett Packard GeneArray Scanner按制造商的說(shuō)明進(jìn)行掃描。收集熒光數(shù)據(jù)并利用MicroArray Suite軟件轉(zhuǎn)換為基因特異性差異平均值。
寡核苷酸陣列數(shù)據(jù)的分析將由來(lái)源于克隆的細(xì)菌和噬菌體序列的基因片段組成的11份標(biāo)準(zhǔn)曲線以0.5pM到150pM的濃度范圍摻合(spike)到各雜交混合物中，所述濃度范圍代表了大約3.3到1000百萬(wàn)分率(ppm)的RNA頻率。生物素化的標(biāo)準(zhǔn)曲線片段通過(guò)T7聚合酶驅(qū)動(dòng)的IVT反應(yīng)由基于質(zhì)粒的模板合成。摻合的生物素化RNA片段既可用作評(píng)估芯片靈敏度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，又可用作如Hill等所述的將所測(cè)量的來(lái)自單個(gè)基因的熒光差異平均值轉(zhuǎn)換為以ppm表示的RNA頻率的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)量了來(lái)自每一個(gè)體小鼠腎臟的基因表達(dá)頻率，并對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)由給定組的小鼠的個(gè)別測(cè)量所確定的頻率值進(jìn)行平均。在12和32周齡C57B16腎臟之間頻率顯著差異的基因被歸類為因正常變老過(guò)程而非病程的變化。
顯示了在Affymetrix Murine 11K芯片上由限定器(qualifier)aa002653_s_at鑒定的寡核苷酸序列在年輕(無(wú)病)、老齡(患病)以及有效治療的老齡(無(wú)病)F1(NZBxNZW)小鼠和C57BL6對(duì)照小鼠中的表達(dá)頻率。該序列代表了未知的小鼠基因。
結(jié)果示于圖1。所示為表示來(lái)自所示小鼠腎臟中的基因表達(dá)水平的柱形圖。BFLP1698表達(dá)水平在12周齡的C57BL/6腎臟和32周齡的腎臟之間并不顯著不同，表明在非患病小鼠的腎臟中，該表達(dá)水平并不隨年齡而升高。在(NXBxNZW)F1腎臟中，基因在疾病發(fā)作前(12周齡)以正常水平表達(dá)。隨著小鼠年齡和疾病的發(fā)展，在25周、36周(對(duì)于36周數(shù)據(jù)未顯示)和42周觀察到升高的表達(dá)水平。到55周齡，小鼠由于腎衰竭而死去。自29周齡起用雷帕霉素治療8周的小鼠在55周齡后依然健康。接受有效治療(雷帕霉素治療或抗-B7治療)的小鼠腎臟表達(dá)正常水平的BFLP1698，且這些正常水平在停止雷帕霉素治療后20周以及停止抗-B7治療后15周的無(wú)癥狀腎臟中持續(xù)存在。當(dāng)腎功能正常時(shí)表達(dá)水平回復(fù)正常的觀察現(xiàn)象表明升高的水平與病程有關(guān)且有診斷價(jià)值。阻斷這些基因的功能可能抑制或延緩病程。表達(dá)水平也可用于評(píng)估和比較各種治療干預(yù)的效力。
實(shí)施例2.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列97位上的F已被替換為L(zhǎng)，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFLQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO4)實(shí)施例3.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列192位上的Q已被替換為N，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHNLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGL
KDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO5)實(shí)施例4.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列288位上的S已被替換為G，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVIGAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO6)實(shí)施例5.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列365位上的H已被替換為R，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHA
TGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPRFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSOASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO7)實(shí)施例6.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列481位上的V已被替換為M，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGSGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATMPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPRPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO8)實(shí)施例7.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列556位上的T已被替換為Y，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGS
GGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDYAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO9)實(shí)施例8.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列663位上的G已被替換為P，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALPHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO10)實(shí)施例9.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列733位上的E已被替換為D，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLSFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGDGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSE
ALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO11)實(shí)施例10.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列858位上的T已被替換為A，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNEALSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO12)實(shí)施例11.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列974位上的W已被替換為H，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAHPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPAL
CYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHPDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO13)實(shí)施例12.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列1038位上的P已被替換為T，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHTDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGFLREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNIDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO14)實(shí)施例13.表2所示人BFLP1698多肽序列的變體與表2中所列BFLP1698氨基酸序列有1個(gè)氨基酸變化的多肽序列示于下文。關(guān)于所示序列，表2所示BFLP1698序列1139上位的I已被替換為L(zhǎng)，其以粗體表示。
MALVPGRSKEDGLWTRNSPGSSQHPESPRLPNPLWDRGKIGKVEGHQHIQDFSQKSHLPSIVVESSEVNEESGDLHLPHEELLLLTDGEEEDAEAFFQDQSEEPGAARPHHQARQVEHSTQRGHLEIRELKKKLFKRRRVLNRERRLRHRVVGAVIDQGLITRHHLKKRAAQELSQEIKAFLTGVDPILGHQLSAREHARCGLLLLRSLPPARAAVLDHLRGVFDESVRAHLAALDETPVAGPPHLRPPPPSHVPAGGPGLEDVVQEVQQVLSEFIRANPKAWAPVISAWSIDLMGQLSSTYSGQHQRVPHATGALNELLQLWMGCRATRTLMDIYVQCLSALIGSCPDACVDALLDTSVQHSPHFDWVVAHIGSSFPGTIISRVLSCGLKDFCVHGGAGGGAGSSGGSSSQTPSTDPFPGSPAIPAEKRVPKIASVVGILGHLASRHGDSIRRELLRMFHDSLAGGSGGRSGDPSLQATVPFLLQLAVMSPALLGTVSGELVDCLKPPAVLSQLQQHLQGFPREELDNMLNLAVHLVSQASGAGAYRLLQFLVDTAMPASVITTQGLAVPDTVREACDRLIQLLLLHLQKLVHHRGGSPGEGVLGPPPPPRLVPFLDALKNHVGELCGETLRLERKRFLWQHQLLGLLSVYTRPSCGPEALGHLLSRARSPEELSLATQLYAGLVVSLSGLLPLAFRSCLARVHAGTLQPPFTARFLRNLALLVGWEQQGGEGPAALGAHFGESASAHLSDLAPLLLHPEEEVAEAAASLLAICPFPSEALSPSQLLGLVRAGVHRFFASLRLHGPPGVASACQLLTRLSQTSPAGLKAVLQLLVEGALHRGNTELFGGQVDGDNETLSVVSASLASASLLDTNRRHTAAVPGPGGIWSVFHAGVIGRGLKPPKFVQSRNQQEVIYNTQSLLSLLVHCCSAPGGTECGECWGAPILSPEAAKAVAVTLVESVCPDAAGAELAWPPEEHARATVERDLRIGRRFREQPLLFELLKLVAAAPPALCYCSVLLRGLLAALLGHWEASRHTDTTHSPWHLEASCTLVAVMAEGSLLPPALGNMHEVFSQLAPFEVRLLLLSVWGF
LREHGPLPQKFIFQSERGRFIRDFSREGGGEGGPHLAVLHSVLHRNLDRLGLFSGRFQAPSPSTLLRQGT(SEQ IDNO15)其它實(shí)施方案盡管本發(fā)明已結(jié)合其詳述進(jìn)行了描述，但前述描述旨在舉例說(shuō)明，而并非限制本發(fā)明的范圍，所述范圍是由所附權(quán)利要求書的范圍限定的。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修飾落在如下權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
序列表<110>WyethO’Toole，MargotMounts，William MShojaee，Negin<120>用于治療狼瘡性腎炎的組合和方法<130>22058-581-061<140>PCT/US03/37317<141>2003-11-21<150>60/428,065<151>2002-11-21<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3652<212>DNA<213>智人<400>1atggcccttg tgccagggag aagcaaggag gatgggcttt ggactagaaa tagcccaggc 60tcctcccagc atccagaaag tcccaggctg cccaaccctc tctgggacag aggaaaaatt 120ggcaaggttg aaggtcacca gcacattcag gatttctctc aaaagtccca tctgccgtct 180attgtggtgg aatccagtga ggtgaatgaa gagagtgggg atctccattt gccccatgag 240gagctgctgc tgctcactga tggtgaggaa gaggatgctg aggccttctt ccaagaccaa 300agtgaagagc caggggcggc acgtccccat catcaggctc ggcaagtgga gcattcgacg 360cagcgcggcc atctggagat tcgggagctg aagaagaagc tgttcaaacg ccggcgggtg 420ttgaatcggg agcggcgtct gaggcaccgg gtggtcgggg ctgtgataga ccaagggctg 480atcacgcggc accacctcaa gaagcgggct gctcaggagc tgtcccagga aatcaaggct 540tttctgactg gcgtagaccc cattctgggc caccaactct cagcccggga acatgctcgc 600tgtggtcttc tcctgctccg ttctttgcca cctgctcggg ctgctgtgct tgaccacttg 660agaggtgtct ttgatgagag tgtccgggcc cacctggctg ccctggatga aacccctgtg 720gctggtccac ctcacctccg tccacctcca ccctctcatg tccctgctgg tggacctggt 780ctagaggatg tggttcagga agtgcagcag gtgctgtctg agtttatccg ggccaaccca 840aaggcctggg cacctgtgat tagtgcatgg tccattgacc tcatggggca actgagcagc 900acgtactcag gccagcacca gcgtgttccc cacgctactg gcgctcttaa tgaactgcta 960cagctgtgga tgggttgtag ggccacgcgt acattaatgg acatctatgt gcagtgcctc 1020
tcggctctca ttggtagctg cccagatgcg tgtgtggatg ccttgctgga tacctctgtt 1080cagcattctc cacactttga ctgggttgtg gcacatattg gctcctcttt tcctggcacc 1140atcatttccc gggttctctc ctgtggcctt aaggactttt gtgtccatgg tggggctgga 1200ggtggagctg gcagtagtgg tggaagctct tctcagaccc cctctacaga ccccttccct 1260ggatctcctg ccattcctgc ggagaaacgg gtgcccaaga ttgcctcagt tgtaggcatc 1320ctaggtcacc tggcctcccg ccacggagat agcatccgac gggagctcct gcgaatgttc 1380catgatagcc tggcaggggg atctggaggc cgcagtgggg acccctccct tcaggccacg 1440gttccgttcc tactgcagct ggcagtcatg tcaccagctt tgctgggcac tgtctctgga 1500gagcttgtgg attgcctcaa gcccccagct gtgctgagcc agctgcagca acaccttcaa 1560ggattccccc gagaggagct ggacaacatg ttgaacctgg ctgtgcacct ggtgagccag 1620gcctctgggg caggtgccta ccgcttgctg cagttcctgg tggacacagc tatgcctgct 1680tcggtcatta ccacccaggg cctggctgtg ccagacaccg tgcgtgaggc ttgtgaccgg 1740ctaatccagc tgctgctgct gcacctgcaa aaactggttc atcaccgggg agggtctcct 1800ggggaagggg tgctaggccc gcccccacct ccccgcttgg tgcccttttt agatgcgctc 1860aaaaaccatg ttggagagct gtgtggagag acgttacgat tggaacggaa gcgcttcctc 1920tggcagcacc agctcttggg cctgctgtct gtctataccc ggcctagctg tggacctgag 1980gccttgggcc atctgctgag ccgagcccga agccctgaag agttgagttt ggccacccag 2040ttatatgcag ggctagtggt cagcctctct ggcctcctgc ccctggcttt ccgaagctgt 2100ctggctcggg tgcatgcagg gacattacag cctcccttca cggcccggtt cctgcgcaac 2160ttggcactgc tagtagggtg ggaacagcag ggtggcgagg gccctgcagc cctaggggcg 2220cactttgggg aatctgcctc agcccatctg tctgacctgg ctcctctcct gctacatcct 2280gaggaggaag tagctgaagc tgctgcctct ctcctggcca tttgtccctt tccttctgaa 2340gccttatccc cctcccagct cctgggactg gtaagggctg gggtgcaccg cttctttgcc 2400tctctgaggc tgcatggacc cccaggtgtg gcctcagcct gtcagcttct cacccgcctg 2460tctcagacat ccccagctgg gctcaaggct gtcctgcagc tgctggttga aggagcctta 2520catcgaggca acacagaact gtttggtggg caagtagatg gggacaatga gactctctca 2580gttgtttcag cttctttggc ttctgcctcc ctgttggaca ctaaccggag gcacactgca 2640gctgtgccag gtcctggagg gatttggtca gttttccatg ctggagtcat cggccgtggc 2700ttaaagccac ccaagtttgt ccagtcacga aatcagcagg aagtgatcta taacacccag 2760agcctcctca gcctcctggt tcactgctgc agtgccccag ggggcactga atgtggggaa 2820tgctgggggg cacccatctt gagtccagag gcagccaaag cagtggcagt gaccttggtg 2880gagagtgtgt gtcccgatgc agctggtgca gagctggcct ggccccccga ggaacacgcc 2940cgggccaccg tggagcggga tctccgcatt ggccggcgct tccgcgaaca gcccctgctc 3000tttgagctgt taaagctggt agcagctgca cccccagccc tgtgctactg ttccgtgctg 3060cttcgggggc tgctggccgc cctcttgggc cattgggaag cctctcgcca ccctgacacg 3120acccactccc cctggcacct ggaggcatcc tgcaccttag tggctgtcat ggctgaggga 3180agcctcctgc ctccggccct gggtaatatg catgaagtat ttagccaact ggcacctttc 3240gaggtgcgtc tgctgctgct cagtgtctgg ggttttctcc gggagcatgg gcccttgcct 3300cagaagttca tcttccaatc agagcggggt cgcttcattc gggacttctc cagggagggt 3360ggaggtgagg gtggacccca tctggctgtg ctgcacagtg tcctccaccg caacatcgac 3420cgcctaggtc ttttctctgg ccgtttccag gcaccttcac cgtccactct ccttcgacag 3480gggacgtagc cttttcttgc tctggaagcc cagggaggtt gagcagtgag agagggaagg 3540gactaacgtg ctccggaagg gtggaggttt ctcttctaag tccttggtct aaagagcgct 3600gtcacttttt tctctcccac tttttttttt ctaaataaaa tttgccaact tg 3652
<210>2<211>1162<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Leu Val Pro Gly Arg Ser Lys Glu Asp Gly Leu Trp Thr Arg1 5 10 15Asn Ser Pro Gly Ser Ser Gln His Pro Glu Ser Pro Arg Leu Pro Asn20 25 30Pro Leu Trp Asp Arg Gly Lys Ile Gly Lys Val Glu Gly His Gln His35 40 45Ile Gln Asp Phe Ser Gln Lys Ser His Leu Pro Ser Ile Val Val Glu50 55 60Ser Ser Glu Val Asn Glu Glu Ser Gly Asp Leu His Leu Pro His Glu65 70 75 80Glu Leu Leu Leu Leu Thr Asp Gly Glu Glu Glu Asp Ala Glu Ala Phe85 90 95Phe Gln Asp Gln Ser Glu Glu Pro Gly Ala Ala Arg Pro His His Gln100 105 110Ala Arg Gln Val Glu His Ser Thr Gln Arg Gly His Leu Glu Ile Arg115 120 125Glu Leu Lys Lys Lys Leu Phe Lys Arg Arg Arg Val Leu Asn Arg Glu130 135 140Arg Arg Leu Arg His Arg Val Val Gly Ala Val Ile Asp Gln Gly Leu145 150 155 160Ile Thr Arg His His Leu Lys Lys Arg Ala Ala Gln Glu Leu Ser Gln165 170 175Glu Ile Lys Ala Phe Leu Thr Gly Val Asp Pro Ile Leu Gly His Gln180 185 190
Leu Ser Ala Arg Glu His Ala Arg Cys Gly Leu Leu Leu Leu Arg Ser195 200 205Leu Pro Pro Ala Arg Ala Ala Val Leu Asp His Leu Arg Gly Val Phe210 215 220Asp Glu Ser Val Arg Ala His Leu Ala Ala Leu Asp Glu Thr Pro Val225 230 235 240Ala Gly Pro Pro His Leu Arg Pro Pro Pro Pro Ser His Val Pro Ala245 250 255Gly Gly Pro Gly Leu Glu Asp Val Val Gln Glu Val Gln Gln Val Leu260 265 270Ser Glu Phe Ile Arg Ala Asn Pro Lys Ala Trp Ala Pro Val Ile Ser275 280 285Ala Trp Ser Ile Asp Leu Met Gly Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Ser Gly290 295 300Gln His Gln Arg Val Pro His Ala Thr Gly Ala Leu Asn Glu Leu Leu305 310 315 320Gln Leu Trp Met Gly Cys Arg Ala Thr Arg Thr Leu Met Asp Ile Tyr325 330 335Val Gln Cys Leu Ser Ala Leu Ile Gly Ser Cys Pro Asp Ala Cys Val340 345 350Asp Ala Leu Leu Asp Thr Ser Val Gln His Ser Pro His Phe Asp Trp355 360 365Val Val Ala His Ile Gly Ser Ser Phe Pro Gly Thr Ile Ile Ser Arg370 375 380Val Leu Ser Cys Gly Leu Lys Asp Phe Cys Val His Gly Gly Ala Gly385 390 395 400Gly Gly Ala Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gln Thr Pro Ser Thr405 410 415Asp Pro Phe Pro Gly Ser Pro Ala Ile Pro Ala Glu Lys Arg Val Pro420 425 430
Lys Ile Ala Ser Val Val Gly Ile Leu Gly His Leu Ala Ser Arg His435 440 445Gly Asp Ser Ile Arg Arg Glu Leu Leu Arg Met Phe His Asp Ser Leu450 455 460Ala Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ser Gly Asp Pro Ser Leu Gln Ala Thr465 470 475 480Val Pro Phe Leu Leu Gln Leu Ala Val Met Ser Pro Ala Leu Leu Gly485 490 495Thr Val Ser Gly Glu Leu Val Asp Cys Leu Lys Pro Pro Ala Val Leu500 505 510Ser Gln Leu Gln Gln His Leu Gln Gly Phe Pro Arg Glu Glu Leu Asp515 520 525Asn Met Leu Asn Leu Ala Val His Leu Val Ser Gln Ala Ser Gly Ala530 535 540Gly Ala Tyr Arg Leu Leu Gln Phe Leu Val Asp Thr Ala Met Pro Ala545 550 555 560Ser Val Ile Thr Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Asp Thr Val Arg Glu565 570 575Ala Cys Asp Arg Leu Ile Gln Leu Leu Leu Leu His Leu Gln Lys Leu580 585 590Val His His Arg Gly Gly Ser Pro Gly Glu Gly Val Leu Gly Pro Pro595 600 605Pro Pro Pro Arg Leu Val Pro Phe Leu Asp Ala Leu Lys Asn His Val610 615 620Gly Glu Leu Cys Gly Glu Thr Leu Arg Leu Glu Arg Lys Arg Phe Leu625 630 635 640Trp Gln His Gln Leu Leu Gly Leu Leu Ser Val Tyr Thr Arg Pro Ser645 650 655Cys Gly Pro Glu Ala Leu Gly His Leu Leu Ser Arg Ala Arg Ser Pro
660 665 670Glu Glu Leu Ser Leu Ala Thr Gln Leu Tyr Ala Gly Leu Val Val Ser675 680 685Leu Ser Gly Leu Leu Pro Leu Ala Phe Arg Ser Cys Leu Ala Arg Val690 695 700His Ala Gly Thr Leu Gln Pro Pro Phe Thr Ala Arg Phe Leu Arg Asn705 710 715 720Leu Ala Leu Leu Val Gly Trp Glu Gln Gln Gly Gly Glu Gly Pro Ala725 730 735Ala Leu Gly Ala His Phe Gly Glu Ser Ala Ser Ala His Leu Ser Asp740 745 750Leu Ala Pro Leu Leu Leu His Pro Glu Glu Glu Val Ala Glu Ala Ala755 760 765Ala Ser Leu Leu Ala Ile Cys Pro Phe Pro Ser Glu Ala Leu Ser Pro770 775 780Ser Gln Leu Leu Gly Leu Val Arg Ala Gly Val His Arg Phe Phe Ala785 790 795 800Ser Leu Arg Leu His Gly Pro Pro Gly Val Ala Ser Ala Cys Gln Leu805 810 815Leu Thr Arg Leu Ser Gln Thr Ser Pro Ala Gly Leu Lys Ala Val Leu820 825 830Gln Leu Leu Val Glu Gly Ala Leu His Arg Gly Asn Thr Glu Leu Phe835 840 845Gly Gly Gln Val Asp Gly Asp Asn Glu Thr Leu Ser Val Val Ser Ala850 855 860Ser Leu Ala Ser Ala Ser Leu Leu Asp Thr Asn Arg Arg His Thr Ala865 870 875 880Ala Val Pro Gly Pro Gly Gly Ile Trp Ser Val Phe His Ala Gly Val885 890 895
Ile Gly Arg Gly Leu Lys Pro Pro Lys Phe Val Gln Ser Arg Asn Gln900 905 910Gln Glu Val Ile Tyr Asn Thr Gln Ser Leu Leu Ser Leu Leu Val His915 920 925Cys Cys Ser Ala Pro Gly Gly Thr Glu Cys Gly Glu Cys Trp Gly Ala930 935 940Pro Ile Leu Ser Pro Glu Ala Ala Lys Ala Val Ala Val Thr Leu Val945 950 955 960Glu Ser Val Cys Pro Asp Ala Ala Gly Ala Glu Leu Ala Trp Pro Pro965 970 975Glu Glu His Ala Arg Ala Thr Val Glu Arg Asp Leu Arg Ile Gly Arg980 985 990Arg Phe Arg Glu Gln Pro Leu Leu Phe Glu Leu Leu Lys Leu Val Ala99510001005Ala Ala Pro Pro Ala Leu Cys Tyr Cys Ser Val Leu Leu Arg Gly Leu101010151020Leu Ala Ala Leu Leu Gly His Trp Glu Ala Ser Arg His Pro Asp Thr1025 103010351040Thr His Ser Pro Trp His Leu Glu Ala Ser Cys Thr Leu Val Ala Val104510501055Met Ala Glu Gly Ser Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly Asn Met His Glu106010651070Val Phe Ser Gln Leu Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Leu Leu Leu Ser107510801085Val Trp Gly Phe Leu Arg Glu His Gly Pro Leu Pro Gln Lys Phe Ile109010951100Phe Gln Ser Glu Arg Gly Arg Phe Ile Arg Asp Phe Ser Arg Glu Gly1105 111011151120Gly Gly Glu Gly Gly Pro His Leu Ala Val Leu His Ser Val Leu His112511301135
Arg Asn Ile Asp Arg Leu Gly Leu Phe Ser Gly Arg Phe Gln Ala Pro114011451150Ser Pro Ser Thr Leu Leu Arg Gln Gly Thr11551160<210>3<400>3000<210>4<211>1162<212>PRT<213>智人<400>4Met Ala Leu Val Pro Gly Arg Ser Lys Glu Asp Gly Leu Trp Thr Arg1 5 10 15Asn Ser Pro Gly Ser Ser Gln His Pro Glu Ser Pro Arg Leu Pro Asn20 25 30Pro Leu Trp Asp Arg Gly Lys Ile Gly Lys Val Glu Gly His Gln His35 40 45Ile Gln Asp Phe Ser Gln Lys Ser His Leu Pro Ser Ile Val Val Glu50 55 60Ser Ser Glu Val Asn Glu Glu Ser Gly Asp Leu His Leu Pro His Glu65 70 75 80Glu Leu Leu Leu Leu Thr Asp Gly Glu Glu Glu Asp Ala Glu Ala Phe85 90 95Leu Gln Asp Gln Ser Glu Glu Pro Gly Ala Ala Arg Pro His His Gln100 105 110Ala Arg Gln Val Glu His Ser Thr Gln Arg Gly His Leu Glu Ile Arg115 120 125
Glu Leu Lys Lys Lys Leu Phe Lys Arg Arg Arg Val Leu Asn Arg Glu130 135 140Arg Arg Leu Arg His Arg Val Val Gly Ala Val Ile Asp Gln Gly Leu145 150 155 160Ile Thr Arg His His Leu Lys Lys Arg Ala Ala Gln Glu Leu Ser Gln165 170 175Glu Ile Lys Ala Phe Leu Thr Gly Val Asp Pro Ile Leu Gly His Gln180 185 190Leu Ser Ala Arg Glu His Ala Arg Cys Gly Leu Leu Leu Leu Arg Ser195 200 205Leu Pro Pro Ala Arg Ala Ala Val Leu Asp His Leu Arg Gly Val Phe210 215 220Asp Glu Ser Val Arg Ala His Leu Ala Ala Leu Asp Glu Thr Pro Val225 230 235 240Ala Gly Pro Pro His Leu Arg Pro Pro Pro Pro Ser His Val Pro Ala245 250 255Gly Gly Pro Gly Leu Glu Asp Val Val Gln Glu Val Gln Gln Val Leu260 265 270Ser Glu Phe Ile Arg Ala Asn Pro Lys Ala Trp Ala Pro Val Ile Ser275 280 285Ala Trp Ser Ile Asp Leu Met Gly Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Ser Gly290 295 300Gln His Gln Arg Val Pro His Ala Thr Gly Ala Leu Asn Glu Leu Leu305 310 315 320Gln Leu Trp Met Gly Cys Arg Ala Thr Arg Thr Leu Met Asp Ile Tyr325 330 335Val Gln Cys Leu Ser Ala Leu Ile Gly Ser Cys Pro Asp Ala Cys Val340 345 350Asp Ala Leu Leu Asp Thr Ser Val Gln His Ser Pro His Phe Asp Trp
355 360 365Val Val Ala His Ile Gly Ser Ser Phe Pro Gly Thr Ile Ile Ser Arg370 375 380Val Leu Ser Cys Gly Leu Lys Asp Phe Cys Val His Gly Gly Ala Gly385 390 395 400Gly Gly Ala Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gln Thr Pro Ser Thr405 410 415Asp Pro Phe Pro Gly Ser Pro Ala Ile Pro Ala Glu Lys Arg Val Pro420 425 430Lys Ile Ala Ser Val Val Gly Ile Leu Gly His Leu Ala Ser Arg His435 440 445Gly Asp Ser Ile Arg Arg Glu Leu Leu Arg Met Phe His Asp Ser Leu450 455 460Ala Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ser Gly Asp Pro Ser Leu Gln Ala Thr465 470 475 480Val Pro Phe Leu Leu Gln Leu Ala Val Met Ser Pro Ala Leu Leu Gly485 490 495Thr Val Ser Gly Glu Leu Val Asp Cys Leu Lys Pro Pro Ala Val Leu500 505 510Ser Gln Leu Gln Gln His Leu Gln Gly Phe Pro Arg Glu Glu Leu Asp515 520 525Asn Met Leu Asn Leu Ala Val His Leu Val Ser Gln Ala Ser Gly Ala530 535 540Gly Ala Tyr Arg Leu Leu Gln Phe Leu Val Asp Thr Ala Met Pro Ala545 550 555 560Ser Val Ile Thr Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Asp Thr Val Arg Glu565 570 575Ala Cys Asp Arg Leu Ile Gln Leu Leu Leu Leu His Leu Gln Lys Leu580 585 590
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Cys Ala Cys Phe Met Ile Val Trp Gln Arg Phe Leu Val Asp Thr Ala625 630 635 640Met Pro Ala Ala Val Ile Thr Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Asp Thr645 650 655Met Arg Glu Ala Tyr Asp Arg Leu Ile Gln Leu Leu Leu Leu His Leu660 665 670Gln Lys Leu Val His His Arg Gly Gly Ala Pro Gly Glu Gly Val Leu675 680 685Gly Pro Pro Ser Pro Pro Leu Pro Val Pro Phe Leu Asp Ala Leu Arg690 695 700Asn His Val Gly Glu Leu Cys Gly Lys Thr Leu Arg Leu Glu Arg Lys705 710 715 720Arg Phe Leu Trp Gln His Gln Leu Leu Ala Tyr Ser Trp Phe Leu Arg725 730 735Lys Leu Ala Leu Leu Val Gly Trp Glu Gln Gln Gly Asp Glu Gly Pro740 745 750Ser Ala Leu Gly Ala Arg Phe Gly Glu Ser Ala Ser Ala His Leu Ser755 760 765Asp Leu Ala Pro Leu Leu Leu His Pro Glu Glu Glu Val Ala Glu Ala770 775 780Ala Ala Ser Leu Leu Ala Val Cys Pro Phe Pro Ser Glu Ala Leu Ser785 790 795 800Pro Ser Gln Leu Leu Gly Leu Val Arg Ala Gly Val His His Phe Phe805 810 815Asn Ser Leu Arg Leu His Gly Pro Pro Gly Val Ala Ser Ala Ser Gln820 825 830Leu Leu Thr Arg Leu Ser Gln Thr Ser Pro Ala Gly Leu Lys Ala Val835 840 845Leu Gln Leu Leu Val Glu Val Ala Leu His Arg Gly Asn Thr Glu Leu
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權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其編碼包括與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少95％同一性的氨基酸序列的多肽。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼結(jié)合雷帕霉素的多肽。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼與SEQID NO2的氨基酸序列有至少98％同一性的多肽。
4.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述分子在嚴(yán)格條件下與互補(bǔ)于包括SEQ ID NO1的核苷酸1-3486的核酸分子的核酸序列雜交。
5.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸分子編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
6.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包括SEQID NO1的核苷酸1-3486。
7.包含權(quán)利要求1的核酸分子的載體。
8.包括權(quán)利要求7的載體的細(xì)胞。
9.基本上純化的多肽，其包括與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少95％同一性的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的多肽，其中所述多肽結(jié)合雷帕霉素。
11.權(quán)利要求9的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ IDNO2的氨基酸序列有至少98％的同一性。
12.權(quán)利要求9的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ IDNO2的氨基酸序列具有至少99％的同一性。
13.權(quán)利要求9的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO2的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求9的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列由SEQ IDNO2的氨基酸序列組成。
15.融合多肽，其包括與非BFLP1698多肽可操作地連接的權(quán)利要求9的多肽。
16.權(quán)利要求9的融合多肽，其中所述非BFLP1698多肽包括選自免疫球蛋白分子Fc區(qū)或FLAG表位、HIS標(biāo)簽及MYC標(biāo)簽的至少一個(gè)成員。
17.包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。
18.長(zhǎng)度至少為993個(gè)氨基酸的多肽，其包括SEQ ID NO2的至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸，前提是所述多肽包括除SEQ ID NO22之外的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求18的多肽，其中所述多肽包含雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
20.包括SEQ ID NO16的至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸的多肽。
21.權(quán)利要求20的多肽，其中所述多肽包含雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
22.權(quán)利要求20的多肽，其中所述多肽的長(zhǎng)度至少為50個(gè)氨基酸。
23.權(quán)利要求20的多肽，其中所述多肽的長(zhǎng)度至少為100個(gè)氨基酸。
24.權(quán)利要求20的多肽，其中所述多肽的長(zhǎng)度至少為220個(gè)氨基酸。
25.藥物組合物，其包括權(quán)利要求17的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
26.融合多肽，其包括與非BFLP1698多肽可操作地連接的BFLP1698多肽的雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
27.權(quán)利要求26的融合多肽，其中所述非BFLP1698多肽包括選自免疫球蛋白分子Fc區(qū)或FLAG表位、HIS標(biāo)簽及MYC標(biāo)簽中的至少一個(gè)成員。
28.藥物組合物，其包括權(quán)利要求26的融合多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
29.與權(quán)利要求9的多肽選擇性地結(jié)合的抗體。
30.權(quán)利要求29的抗體，其中所述抗體抑制 BFLP1698多肽與雷帕霉素的結(jié)合。
31.權(quán)利要求29的抗體，其中所述抗體為多克隆抗體。
32.權(quán)利要求29的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
33.權(quán)利要求32的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體選自鼠單克隆抗體以及人源化單克隆抗體。
34.生產(chǎn)BFLP1698多肽的方法，所述方法包括在允許由所述核酸分子編碼的BFLP1698多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)包括權(quán)利要求1的核酸分子的細(xì)胞。
35.檢測(cè)生物學(xué)樣品中BFLP1698核酸分子的存在的方法，所述方法包括使樣品同與BFLP1698核酸特異性結(jié)合的核酸探針進(jìn)行接觸；和如果存在的話，鑒定結(jié)合的探針，由此檢測(cè)所述樣品中BFLP1698核酸分子的存在。
36.檢測(cè)樣品中BFLP1698多肽的存在的方法，所述方法包括使樣品同與所述多肽選擇性結(jié)合的化合物在允許所述多肽和所述化合物之間形成復(fù)合物的條件下進(jìn)行接觸；和如果存在的話，檢測(cè)所述復(fù)合物，由此鑒定所述樣品中的所述多肽。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物為雷帕霉素。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物為抗-BFLP1698抗體。
39.用于確定受試者中狼瘡性腎炎的存在或易感性的方法，所述方法包括a)測(cè)量來(lái)自所述受試者的樣品中BFLP1698核酸分子的量；和b)將步驟(a)中所述核酸的量與來(lái)自沒(méi)有狼瘡性腎炎的受試者的對(duì)照樣品中存在的核酸的量進(jìn)行比較，其中步驟(a)中所述BLP1698核酸水平較之于對(duì)照樣品中核酸水平的提高表明所述受試者中狼瘡性腎炎的存在或易感性。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述受試者為人。
41.用于確定受試者中狼瘡性腎炎的存在或易感性的方法，所述方法包括a)測(cè)量來(lái)自所述受試者的樣品中BFLP1698多肽的量；和b)將所述多肽的量與來(lái)自沒(méi)有狼瘡性腎炎的受試者的對(duì)照樣品中存在的核酸的量進(jìn)行比較，其中所述BLP1698多肽的水平較之于對(duì)照樣品中多肽水平的提高表明所述受試者中狼瘡性腎炎的存在或易感性。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述受試者為人。
43.用于篩選用以治療自身免疫紊亂的治療劑的方法，所述方法包括使測(cè)試化合物與BFLP1698多肽進(jìn)行接觸；和確定所述測(cè)試化合物是否與所述BFLP1698多肽結(jié)合，其中所述測(cè)試化合物與所述多肽的結(jié)合表明該測(cè)試化合物為自身免疫紊亂的治療劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述免疫紊亂為自身免疫紊亂。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述自身免疫紊亂為狼瘡。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述自身免疫紊亂為狼瘡性腎炎。
47.權(quán)利要求43的方法，其中所述BFLP1698在無(wú)細(xì)胞提取物中提供。
48.權(quán)利要求43的方法，其中所述BFLP1069在細(xì)胞中提供。
49.治療受試者的狼瘡性腎炎的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的抑制所述受試者中BFLP1698多肽活性的試劑。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述受試者為人。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述試劑為抗-BFLP1698抗體。
52.藥物組合物，其包括抑制受試者中BFLP1698多肽活性的試劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
53.權(quán)利要求52的藥物組合物，其中所述試劑為抗-BFLP1698抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的分離的BFLP1698多核苷酸以及由該BFLP1698多核苷酸編碼的多肽。同樣提供的有與BFLP1698多肽免疫特異性地結(jié)合的抗體，或者所述BFLP1698多肽、多核苷酸或抗體的任何衍生物(包括融合衍生物)、變體、突變體或片段。本發(fā)明另外提供了將所述BFLP1698多肽、多核苷酸及抗體用于檢測(cè)和治療廣泛的病理學(xué)狀態(tài)以及其它用途的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1738896SQ200380109008
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月21日
發(fā)明者M·奧托爾, W·M·穆恩茨, N·肖耶 申請(qǐng)人:惠氏公司