專利名稱：治療心肌梗死的方法
技術領域：
本發(fā)明通常涉及醫(yī)學領域，尤其涉及治療哺乳動物的心肌梗死的方法和組合物。
背景由于損傷，疾病或其它對于血管的外傷造成的血管通透性是血管滲漏和與組織損傷相關的水腫的一種主要原因。例如，與腦血管意外(CVA)或其它腦或脊椎組織中的血管損傷有關的腦血管疾病是神經(jīng)障礙的最普遍的原因，并且是殘疾的一種主要原因。典型地，在CVA范圍內(nèi)對腦或脊椎組織的損傷會伴隨血管滲漏和/或水腫。典型地，CVA可以包括由于腦缺血，中斷正常的流向腦的血流所造成的損傷；由于對于血流的短暫的擾亂造成的腦功能不全；由于顱內(nèi)或顱外動脈栓塞或血栓形成造成的梗塞；出血；以及動脈或靜脈的畸形。缺血性中風和腦出血可能突然出現(xiàn)，并且相關的影響通常是反映在大腦損傷的區(qū)域上。(見The Merck Manual，16thed.Chp.123，1992)。
除了CVA，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的感染或疾病也能影響腦和脊柱的血管，并且例如在細菌性腦膜炎，病毒性腦炎和大腦膿腫形成這樣的實施例中可能伴隨發(fā)炎和水腫。(見The Merck Manual，16thed.Chp.125，1992)。全身性疾病這樣的生理狀態(tài)也能夠使血管變?nèi)醪⑶覍е卵軡B漏和水腫，這樣的全身性疾病例如糖尿病，腎病，動脈硬化癥，心肌梗死等。因此，血管滲漏和水腫是嚴重的與癌癥截然不同并且不依賴于癌癥的病狀，這樣的病狀需要與多種損傷，外傷或疾病情況有關的有效的特異的治療方法的介入。
心肌梗死是由于對心臟肌肉供血的堵塞造成的心臟組織的壞死。心肌梗死是在西方國家對就醫(yī)的病人作出的最普遍的診斷之一。已經(jīng)有報道在美國每年有大約一百一十萬人被診斷為急性心肌梗死。心肌梗死的死亡率可能超過53％，而活下來的病人有66％不能夠痊愈。即使讓死亡率降低一個百分點一年就可以挽救3400個生命。心肌梗死和隨之出現(xiàn)的水腫通常是當冠狀動脈被堵塞，原來由被堵塞的動脈供給的心臟組織的氧供應被切斷的時候出現(xiàn)。當血液供應被阻斷，通常由被阻塞的動脈供應血液的組織變得缺血。最后缺氧的心臟組織開始相繼死去(壞死)。Honkanen等在美國專利申請?zhí)枮?,914,242的申請中描述了給予心臟缺血發(fā)作后的病人一定的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的酶抑制劑和相關多肽來減輕心肌梗死的方法。這樣的酶和多肽很昂貴并且當作為藥學上的應用時其制造加工和純化非常復雜。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對于Src家族酪氨酸激酶活性的抑制可以為治療心肌梗死提供一種有用的方法，該方法是通過減少水腫和冠狀組織壞死來起作用的，因此可以減輕由于心肌梗死造成的組織損傷，這種壞死通常由于冠狀動脈堵塞造成的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過抑制Src家族酪氨酸激酶活性來治療心肌梗死(MI)的方法。該方法包括利用有效劑量的一種Src家族酪氨酸激酶的抑制劑來治療患有冠狀動脈堵塞的哺乳動物的心臟組織。該哺乳動物可以是人類病人或非人類哺乳動物。被治療的冠狀組織可以是由于冠狀動脈阻塞而缺血(即，血流的缺失)的心臟的任意一個部分。治療性治療是利用有效劑量的所需的藥物組合物作用于目標冠狀組織，該藥物組合物包含化學(即，非肽類)Src家族酪氨酸激酶的抑制劑。這種方法用于治療正在發(fā)生或已經(jīng)發(fā)生損傷笥的血管阻塞區(qū)域附近的患病心臟組織是有效的。該方法使得通常由于冠狀血管阻塞造成的組織壞死(梗死)得到緩解。
本發(fā)明的進一步的方面是關于制品，該制品包括包裝材料以及包裝材料所包含的藥物組合物，其中該藥物組合物能夠緩解由于冠狀血管阻塞造成的血流缺失所引起的冠狀組織壞死。該包裝材料包括說明該種藥物組合物能夠被用于治療心肌梗死的標簽，并且該藥物組合物包括有效治療劑量的Src家族酪氨酸激酶抑制劑，該抑制劑是存在于藥學上可接受的載體中的。
適合于本發(fā)明目的的Src家族酪氨酸激酶抑制劑包括吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，例如4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑[3，4-d-]嘧啶(AGL1872)，4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑[3，4-d-]嘧啶(AGL1879)等；大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，例如根赤殼菌素R2146，格爾德霉素，Herbimycin A等；吡啶并[2，3-d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，例如PD173955等；4-苯胺基-3-喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，例如SKI-606等；以及這些物質的混合物。
本發(fā)明的方法對于治療心肌梗死是有效的。特別是，本發(fā)明的方法對于改善由于冠狀血管堵塞而造成的心臟組織壞死有效，該血管堵塞可以是由于心臟的疾病，損傷或外傷造成的。
附圖
簡述這些附圖構成本發(fā)明的一部分FIG.1是人類c-Src的cDNA序列(SEQ ID NO1)，該序列最初由Braeuninger等在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，8810411-10415(1991)報導。該序列可通過GenBank Accession Number X59932X71157獲得。該序列含有2187個核苷酸其蛋白編碼部分從134位核苷酸開始到1486位核苷酸截止。
FIG.2是FIG.1中顯示的人c-Src編碼序列編碼的氨基酸殘基序列。(SEQ ID NO2)。
FIG.3描述的是編碼人類c-Yes蛋白的cDNA的核酸序列(SEQ IDNO3)。該序列可通過GenBank Accession Number M15990獲得。該序列含有4517個核苷酸其蛋白編碼區(qū)從208位核苷酸開始至1839位核苷酸截止，翻譯成的氨基酸序列在FIG.4中描述。
FIG.4描述的是c-Yes的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
FIG.5展示的是對Src，F(xiàn)yn或Yes缺失的小鼠的皮膚中的VEGF引起的VP進行改良的Miles分析的結果。FIG.5A是處理過的耳朵的照片。FIG.5B是各種缺失的小鼠刺激的實驗結果的圖表。FIG.5C表示對處理過的組織洗脫的Evan’s藍染料的量。
FIG.6是顯示在Src+/-，Src-/-，野生型(WET)以及AGL1872(即4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑[3，4-d-]嘧啶)處理過的野生型小鼠的腦梗塞的相對大小的圖片。劑量是每千克體重1.5毫克。
FIG.7顯示的是對照小鼠和AGL1872處理的小鼠大腦的連續(xù)MRI掃描，結果顯示利用AGL1872處理的動物(右圖)比對照動物(左圖)腦梗塞要少。
FIG.8描述了本發(fā)明優(yōu)選的吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑的結構。
FIG.9描述了本發(fā)明優(yōu)選的大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑的結構。
FIG.10描述了本發(fā)明優(yōu)選的吡啶并[2，3-d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑的結構。
FIG.11描述了已經(jīng)使其受損來誘導心肌梗死的大鼠心臟組織的活體染色的顯微照相圖片；右側的圖片是對照，顯示了明顯程度的壞死；左側的圖片顯示的是利用化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑(AG1872)處理過的組織，顯示了明顯的壞死程度的減輕。
FIG.12顯示的是在不同抑制劑(AGL1872)濃度作用下心肌梗死的大小的柱狀圖。
FIG13顯示的是利用抑制劑(AGL1872)處理后不同時間心肌梗死的大小的柱狀圖。
FIG.14顯示的是在不同抑制劑(AGL1872)濃度作用下心肌水含量的柱狀圖。
發(fā)明詳述A.定義此處所用的術語“氨基酸殘基”是指氨基酸，該氨基酸的形成是通過將多肽在其肽鍵處進行化學降解(水解)形成的。此處描述的氨基酸殘基優(yōu)選以“L”型異構體的形式存在。然而，只要多肽所需的功能性質得以保留，“D”型異構體的殘基可以替代任何L-氨基酸殘基。NH2是指在多肽的氨基末端出現(xiàn)的游離的氨基基團。COOH是指在多肽的羧基末端出現(xiàn)的游離的羧基基團，這是與標準的多肽命名法保持一致的。(在J.Biol.Chem.，24335552-59(1969)中有所描述并且在37CFR§1.822(b)(2)被采納)。
應該注意到的是此處出現(xiàn)的所有的氨基酸殘基序列其左和右的順序是按照習慣的從氨基末端(N-末端)到羧基末端(C-末端)的方向。此外，應該注意到的是氨基酸殘基序列開始和末尾的破折號表示的是與另一個序列之間的肽鍵，該序列具有一個或更多的氨基酸殘基。
此處所用的術語“多肽”是指氨基酸殘基通過α-氨基基團與相鄰的氨基酸殘基的羧基基團之間的肽鍵彼此相連的線性序列。
此處所用的術語“肽”是指多肽中彼此相連的氨基酸殘基不超過50個的線性序列。
此處所用的術語“蛋白質”是指多肽中彼此相連的氨基酸殘基超過50個的線性序列。
B.總論本發(fā)明通常涉及(1)發(fā)現(xiàn)VEGF誘導的血管滲透性(VP)被例如Src和Yes這樣的酪氨酸激酶蛋白特異性地介導并且VP可以通過抑制Src家族酪氨酸激酶活性來調(diào)節(jié)；以及(2)發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)給予Src家族酪氨酸激酶抑制劑可以緩解由于疾病或損傷相關的血管滲透性增加而引起的組織損傷。
由于血管滲透性在多種疾病進程中所起的作用，所以該發(fā)現(xiàn)是很重要的。本發(fā)明涉及與血管滲透性可以通過抑制Src家族酪氨酸激酶活性來特異性的調(diào)控和改善這一發(fā)現(xiàn)。特別是，本發(fā)明涉及在體內(nèi)給予Src家族酪氨酸激酶抑制劑可以緩解由于血管滲透性增加而引起的組織損傷這一發(fā)現(xiàn)，其中血管滲透性的增加是與疾病或損傷相關而與癌癥或血管發(fā)生無關。
血管滲透性涉及到多種疾病的進程，其中組織損傷是由于血管外傷引起的VP的突然增加而造成的。因此，能夠特異的調(diào)控VP的能力使得新的有效的緩解中風的不利影響的治療方法得以實現(xiàn)。
可以從利用Src家族激酶抑制劑進行特異的抑制調(diào)節(jié)得益的，與疾病或損傷誘導的血管滲漏和/或水腫相關的實施例包括風濕性關節(jié)炎，糖尿病視網(wǎng)膜病，炎癥疾病，血管再狹窄，中風，心肌梗死等。
已經(jīng)有報道在全身利用VEGF受體IgG融合蛋白來中和VEGF蛋白可以減小腦缺血之后的梗塞的大小。這種效應是由于緩解了VEGF介導的血管滲漏產(chǎn)生的。N.van Bruggen等J.Clin.Inves.1041613-1620(1999)。然而，VEGF不是血管滲漏增加的重要的調(diào)控因子，而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Src是其重要的調(diào)控因子。此外，Src可以被除了VEGF之外的其它的刺激激活?？梢娎?，Erpel等，Cell Biology，7176-182(1995)。
本發(fā)明特別與Src家族酪氨酸激酶抑制劑，特別是Src的抑制劑可以用于治療心肌梗死的發(fā)現(xiàn)相關，這是通過改善哺乳動物中由于冠狀血管堵塞而引起的冠狀組織損傷來起作用的。
C.Src家族酪氨酸激酶蛋白此處所用的以及在所附的權利要求中的術語“Src家族酪氨酸激酶蛋白”以及其語法上的變體是專指一種蛋白，該種蛋白與v-Src具有氨基酸序列同源性，其N末端是豆蔻?；?，并且具有N末端多變區(qū)的保守結構域結構，在此之后是SH3結構域，SH2結構域，酪氨酸激酶催化結構域以及C末端調(diào)節(jié)結構域。術語“Src蛋白”和“Src”同指酪氨酸激酶Src蛋白的各種形式，該蛋白具有60kDa分子量，包括2個PKC磷酸化位點和一個PKA磷酸化位點的N末端可變區(qū)，比其它已知的Src家族亞類成員(例如，Yes，F(xiàn)yn，Lck，和Lyn)具有與已知的Src蛋白更高的全氨基酸序列同一性并且該蛋白可以通過磷酸化與在SEQ ID NO2中位于416位的酪氨酸對等的酪氨酸來活化。術語“Yes蛋白”和“Yes”同指酪氨酸激酶Yes蛋白的各種形式，該蛋白具有62kDa分子量，其N末端可變區(qū)沒有任何磷酸化位點，與已知的Yes蛋白的全氨基酸序列同一性比與其它已知的Src家族亞類成員(例如，Src，F(xiàn)yn，Lck，和Lyn)高并且該蛋白可以通過磷酸化與在SEQ IDNO4中位于426位的酪氨酸對等的酪氨酸來活化。
優(yōu)選的檢測冠狀缺血的分析方法包括通過結扎大鼠冠狀動脈誘導缺血然后利用MRI，超聲波心動描記術以及此類的技術來檢測心肌梗死的大小，該種檢測是按照以下詳細描述的方式按時間檢測的。
D.治療和預防心肌梗死的方法本發(fā)明的方法包括對缺血的冠狀組織給予包含至少一種化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑的藥物組合物。
合適于本發(fā)明目的的Src家族酪氨酸激酶抑制劑包括Src的化學抑制劑例如吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，吡啶并[2，3-d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，4-苯胺基-3-喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑。也可以使用這些抑制劑的混合物。
優(yōu)選的吡唑并嘧啶類抑制劑包括，4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(有時也稱為PP1或AGL1872)，4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(有時也稱為PP2或AGL1879)等，這些物質的詳細的制備在Waltenberger等，Circ.Res.，8512-22(1999)中有所描述，相關的報道在此處引入作為參考。AGL1872和AGL1879的化學結構在FIG.8中顯示。AGL1872(PP1)經(jīng)Pfizer，Inc.的許可下可從Biomol獲得。AGL1879(PP2)經(jīng)Pfizer，Inc.的許可下可從Calbiochem獲得。(也可見Hanke等，J.Biol.Chem.271(2)695-701(1996))。
優(yōu)選的大環(huán)二烯酮類抑制劑包括，例如根赤殼菌素R2146，格爾德霉素，Herbimycin A等。根赤殼菌素R2146，格爾德霉素，HerbimycinA的結構在FIG.9中顯示。格爾德霉素可從Life Technologies獲得。Herbinmycin A可從Sigma獲得。根赤殼菌素可通過商業(yè)渠道從不同的公司獲得(例如Calbiochem，RBI，Sigma)，該物質是一種抗真菌的大環(huán)內(nèi)酯抗生素也可作為非特異性的蛋白酪氨酸激酶抑制劑起作用并且能夠抑制Src激酶的活性。大環(huán)二烯酮類抑制劑包括12到20個碳的大環(huán)內(nèi)酰胺或內(nèi)酯環(huán)結構，包括α，β，γ，δ-雙-不飽和酮(即二烯酮)部分以及氧化的芳基部分作為大環(huán)環(huán)狀結構的一部分。
優(yōu)選的吡啶并[2，3-d]嘧啶類抑制劑包括，例如PD173955等。Parke Davis發(fā)現(xiàn)的抑制劑PD173955的結構由Moasser等在CancerRes.596145-6152(1999)中描述，與此相關的報道在此處引入作為參考。PD173955的化學結構在FIG.10中顯示。
優(yōu)選的4-苯胺基3-喹啉甲腈類抑制劑包括，例如可從Wyeth獲得的SKI-606。4-苯胺基-3-喹啉甲腈Src抑制劑的實施例在U.S.PatentPublications No.2001/0051520和No.2002/00260052中有所揭示，相關的報道在此處引入作為參考。
其它的可以用于本發(fā)明的方法和組合物中的特異的Src激酶抑制劑包括PD162531(Owens等，Mol.Biol.Cell 1151-64(2000))，該抑制劑是由Parke Davis發(fā)明的，但是目前無法從文獻中獲得其結構。
優(yōu)選的化學抑制劑是吡唑并嘧啶抑制劑，更加優(yōu)選的是AGL1872和AGL1879，最優(yōu)選的化學抑制劑是AGL1872。另一個優(yōu)選的Src抑制劑是稱為SKI-606的4-苯胺基3-喹啉甲腈。
另外的合適Src家族酪氨酸激酶抑制劑可以通過本領域中已知標準分析方法來鑒別和表征。例如，對于化學化合物進行篩選來尋找作為Src或其它酪氨酸激酶的有效的有選擇性的抑制劑的工作已經(jīng)完成，其結果是鑒定出可以用作Src家族酪氨酸激酶有效的抑制劑的化學部分。
例如，鄰苯二酚已經(jīng)被鑒定出來作為從自然產(chǎn)物衍生出來的許多酪氨酸激酶抑制劑的重要結合元件并且在一些化合物中發(fā)現(xiàn)其存在，這些化合物是通過組合的目標導向挑選c-Src的選擇性抑制劑發(fā)現(xiàn)的?？梢奙aly等“組合的目標導向的配體結合對于有效的選擇性亞類的c-Src抑制劑的鑒定”PNAS(USA)97(6)2419-2424(2000))。利用已知的對于抑制Src重要的部分作為起點基于組合化學來篩選候選抑制劑化合物，是一種有效的有力的分離和鑒定其它的Src家族酪氨酸激酶的化學抑制劑的方法。
但是，即使是對潛在的結合元件進行的謹慎選擇也可被用于進行活性抑制劑的組合篩選，該選擇根據(jù)其模擬多肽和核酸所具有的廣泛功能性的能力而進行。例如，因為O-甲基肟庫尤其適用于這一目的，該庫可以很容易通過將O-甲基羥胺與任何可以大量購買的醛縮合來制備。O-烷基肟構成物適合大范圍的功能性，該構成物在生理pH是穩(wěn)定的?？梢奙aly等，supra。
雖然可以理解本發(fā)明的原理指出本方法即使對于非人類的哺乳動物也是有效的，可是用本發(fā)明所表達的方法來治療的哺乳動物最好是人。在上下文中，哺乳動物被理解成為包括任何需要治療組織損傷相關的血管滲漏或水腫的哺乳動物，農(nóng)業(yè)用以及家養(yǎng)的哺乳動物，也包括人類。
優(yōu)選的治療方法包括給予患有心肌梗死的哺乳動物治療上有效劑量的生理上可以接受的一種組合物，該種組合物含有化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑，特別是Src的化學(即非肽類)抑制劑。
優(yōu)選的預防心肌梗死的方法包括給予具有患心肌梗死風險的哺乳動物預防劑量的生理上可以容忍的一種組合物，該種組合物含有化學的Src家族酪氨酸激酶抑制劑，特別是Src化學(即非肽類)抑制劑。
給予象AGL1872或SKI-606這樣的化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑的劑量范圍可以在大約每千克體重0.1毫克到每千克體重100毫克的范圍之內(nèi)或者到達該活性試劑在該藥物載體中的溶解的限度。優(yōu)選的劑量是大約每千克體重1.5毫克。本發(fā)明所包括的藥物組合物也可以通過口服的方式給予。示例性的口服的藥劑形式包括膠囊，有或沒有腸衣包被的藥片等。
在急性損傷或外傷的實施例中，最好在事故發(fā)生之后盡快給予治療。然而，在急性事件的實施例里，有效地給予Src家族酪氨酸激酶抑制劑的時間可以在損傷或外傷發(fā)生的大約48小時之內(nèi)。優(yōu)選的是在發(fā)生之后24小時之內(nèi)給藥，如果在6小時之內(nèi)則更好。最優(yōu)選的是在損傷發(fā)生大約45分鐘之內(nèi)給予病人Src家族酪氨酸激酶抑制劑。在損傷開始48小時之后給藥可能適合于改善由于進一步血管滲漏或水腫引起的額外的組織損傷；然而，在這樣的實施例中對于最初的組織損傷的有益的作用可能會減弱。
預防性的給藥是用來預防與外科手術程序相關的心肌梗死，或在考慮達到易患病標準時被使用，給藥可以在任何實際的冠狀動脈堵塞之前或在能夠引起這樣的堵塞的事件過程中，例如像血管成形術這樣的經(jīng)皮心血管干涉。對于治療導致冠狀動脈血管堵塞的慢性疾病情況，給予的化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑可以被制成以持續(xù)劑量服用的形式。
通常，劑量可以隨著病人的年齡，身體條件，性別以及損傷的程度的變化而變化，并且可以由在本領域的技術人員來決定。如果出現(xiàn)任何并發(fā)癥，劑量也可以由該病人的醫(yī)生來調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選的是不經(jīng)過消化道而用注射給予，或通過一段時間的逐漸灌注給予。雖然需要治療的組織可以典型地通過全身給藥的方式在體內(nèi)達到并且因此最常用的治療是通過靜脈注射的方式給予治療組合物，但是如果有可能目標組織含有目標分子也可以考慮其它的組織和運送方式。因此，本發(fā)明的組合物可以通過靜脈，腹腔內(nèi)，肌肉，皮下，腔內(nèi)，透皮，口服來給藥并且也可以通過蠕動方式給藥。
例如，靜脈給藥通過注射單位劑量實施。術語“單位劑量”當用在本發(fā)明的關于治療組合物的時候是指作為給予受試者的合適的物理上不連續(xù)的單支的劑量，每個單支藥劑含有一定量的活性成分以及所需的稀釋劑，該活性成分的量是通過計算的可以產(chǎn)生所需治療效果而事先決定的；該稀釋劑即媒介物或載體。
在一個優(yōu)選的實施方案中活性試劑是通過靜脈以單一劑量給予的。局部給藥可以通過直接注射來完成或利用解剖學上分離的區(qū)室，分離目標器官系統(tǒng)的微循環(huán)，在循化系統(tǒng)中進行再灌注，或者以與患病組織相關的脈管系統(tǒng)的目標區(qū)域的以導管為基礎的暫時性阻塞。
藥物組合物通過合適于藥劑類型的方式并且以治療有效的劑量給予。此處用的以及所附權利要求中用的術語“治療有效的劑量”和“預防用的劑量”當涉及到藥物組合物的時候是指藥物組合物的量可以引起受試者生物學或醫(yī)學上的反應，該反應是臨床醫(yī)生所希望的(例如，對于組織壞死的改善或對于心肌梗死的預防)。
給予的量和時間依賴于接受治療的受試者，依賴于受試者的身體系統(tǒng)對于活性成分利用的能力以及治療效果需要達到的程度。給予的活性成分的準確的量依賴于從業(yè)者的意見并且對于每一個個體是不同的。然而，此處公開合適的全身應用的劑量范圍并且該范圍依賴于給藥路徑。合適的給藥的方式和規(guī)律也是可變的，但是典型的是在第一次給藥之后間隔一個或多個小時然后通過后續(xù)的注射或如口服這樣的其它的給藥方法給予重復的劑量?？蛇x擇的是，可以預期持續(xù)的靜脈灌注足以將血液中的濃度維持在適于體內(nèi)治療的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的緩解組織損傷的方法可以減輕疾病的癥狀并且依賴于該疾病可以對治療該疾病起一定的作用，其中該種組織損傷是由于與不同的冠狀動脈疾病或與心臟的損傷或水腫相關的冠狀動脈堵塞引起的。組織中壞死的程度以及因此本發(fā)明方法可以達到的抑制的程度可以通過多種方法來確定。特別是，本發(fā)明的方法不同尋常的適用于治療心肌梗死。
對于由冠狀血管堵塞引起的組織損傷的緩解可以在給予治療組合物很短的一段時間內(nèi)發(fā)生。在急性損傷和水腫的實施例中，大部分的治療效果可以在給藥之后的24小時之內(nèi)觀察到。然而，持續(xù)給藥的效果不會很快的顯現(xiàn)出來。
時間限制因子包括組織吸收的效率，細胞攝取的效率，蛋白轉運或核酸翻譯(根據(jù)治療不同而不同)的效率以及蛋白定位的效率。因此，組織損傷調(diào)節(jié)效應可能在給予抑制劑之后僅僅一個小時之內(nèi)發(fā)生。利用合適的條件心臟組織也可以附加的或延長的暴露于Src家族酪氨酸激酶抑制劑之中。因此，可以通過調(diào)節(jié)這樣的參數(shù)來達到各種需要的治療時間表。
E.治療組合物此處描述的Src家族酪氨酸激酶抑制劑可以被用來制備用于治療心肌梗死的藥物。這些抑制劑可以被包含在用于此處描述的治療和預防方法的藥物組合物中。本發(fā)明的藥劑組合物含有生理可以耐受的載體與溶解或分散于其中的作為活性成分的此處描述的化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑。在優(yōu)選的實施方案中，當為了治療的目的給予哺乳動物患者該藥物組合物的時候該組合物不具有免疫原性，這樣的哺乳動物例如人類。
此處用到的術語“藥學上可接受的”，“生理上可耐受的”及其語法上的變體當它們是指組合物，載體，稀釋劑和試劑的時候是可互換的并且代表該物質可以被給予或用于哺乳動物而不會產(chǎn)生不良的生理反應，這樣的生理反應例如惡心，頭暈，反胃等。
含有溶解或分散于其中的活性成分的藥物組合物的制備在本領域已經(jīng)被人們充分理解并且不需要以劑型為基礎來進行限制。典型的這樣的組合物被制成可注射的液體溶液或懸浮液。也可以制成適合于在使用之前用液體溶解成溶液或懸浮液的固體形式。制劑也可以被乳化或制成脂質體組合物。
活性成分可以與賦形劑混合，該賦形劑是藥學上可接受的并且與活性成分兼容的并且它的量適合于此處所描述的治療方法。合適的賦形劑是例如，水，生理鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇或這些的相似物及其組合。另外，如果需要，該組合物可以包含大量的輔助物質例如潤濕劑的或乳化劑，pH緩沖試劑等能夠增強活性成分效果的物質。
本發(fā)明的治療組合物可以包括活性成分的藥學上可接受的鹽。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與多肽的游離的氨基基團形成的)該鹽是與無機酸例如鹽酸或磷酸形成的或與有機酸例如乙酸，酒石酸，苯基乙醇酸等形成的。與游離的羧基形成的鹽也可以是與無機堿或有機堿形成的，這樣的無機堿例如，氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化胺，氫氧化鈣或氫氧化鐵，這樣的有機堿例如異丙胺，三甲胺，2-乙胺乙醇，組氨酸，普魯卡因等。
生理上可耐受的載體在本領域中是眾所周知的。典型的液態(tài)載體是僅含有水和活性組分的無菌水溶液，或者含有緩沖液例如生理pH值的磷酸鈉，生理鹽水或兩者都有，例如磷酸緩沖的生理鹽水。更進一步，含水的載體可以含有多于一種的緩沖鹽，及鹽類例如氯化鈉和氯化鈣，葡萄糖，聚乙二醇以及其它的溶質。
液體組合物可以包含有或無水的液相。典型的這樣的液相成分是甘油，例如棉花子油這樣的植物油以及水-油乳化物。
本發(fā)明的化學治療組合物包含生理上可耐受的載體與溶解或分散于其中的作為活性成分的Src家族酪氨酸激酶抑制劑。
合適的Src家族酪氨酸激酶抑制劑抑制Src家族酪氨酸激酶的酪氨酸激酶生理活性。一種更適合的Src家族酪氨酸激酶對于抑制Src蛋白活性具有主要的特異性并且次要地抑制最密切相關的Src家族酪氨酸激酶。
F.制品本發(fā)明也關注制品，該物品是一種標記的容器用以提供治療有效量的Src家族酪氨酸激酶抑制劑。該抑制劑可以是單一包裝的Src家族酪氨酸激酶抑制劑或者多于一種抑制劑的組合物。制品包括包裝物質以及在包裝物之中的藥劑。該制品可能也包括兩種或更多種亞治療有效量的藥物組合物，其協(xié)同作用結果是緩解由于冠狀動脈堵塞造成的組織損傷。
此處所用的術語包裝物質是指能夠通過固定的方式保存藥劑的材料，這樣的材料例如玻璃，塑料，紙，金屬箔等。因此，例如，包裝物質可以是塑料或玻璃的小瓶，薄片的包裝膜等容器，該容器是用來承裝包括藥劑在內(nèi)的藥物組合物的。
在優(yōu)選的實施方案中，包裝物質包括標簽，該標簽用切實的表述描述制品的內(nèi)容以及其中所含有的藥物組合物的使用。
在制品中的藥劑可以是本發(fā)明的任意一種組合物，該組合物適合于提供一種Src家族酪氨酸激酶抑制劑，按照此處描述的已經(jīng)公開出來的說明制成藥學上可接受的形式。合適于本發(fā)明目的的Src家族酪氨酸激酶抑制劑包括Src的化學抑制劑，包括吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，例如4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(AGL1872)，4-氨基-5-(4-氯苯)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(AGL1879)等；大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，例如根赤殼菌素R2146，格爾德霉素，Herbimycin A等；吡啶并[2，3-d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，例如PD173955等；4-苯胺基-3-喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑，例如SKI-606等；以及這些物質的混合物。制品包括大量的藥劑無論是單支還是多次劑量都足以用于治療此處指出的病癥。
包裝物質包括標簽，該標簽表明所含有的藥劑的使用，例如通過抑制血管滲漏的增加來幫助治療病癥以及此處描述的相似的病癥。該標簽可以進一步包括使用說明以及市場所需的相關信息。包裝物質可以包括用于儲存藥劑的容器。
實施例以下關于本發(fā)明的實施例是以舉例的方式提出的，當然不應該被解釋成對本發(fā)明的特別的限制。而且，可以被本領域的技術人員所預計的本發(fā)明的現(xiàn)在已知或以后發(fā)展的變動應該被認為屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
實施例1.VEGF-介導的VP活性依賴于Src和Yes，但是不依賴于FynVP對于Src需求的特異性已經(jīng)通過檢驗VEGF誘導的VP活性揭示出來，該VP活性是與例如Fyn或Yes這樣的SFKs相關的，其中Fyn和Yes象Src一樣，已知是在內(nèi)皮細胞中表達(Bull等，F(xiàn)EBSLetters，36141-44(1994)；Kiefer等，Curr.Biol.4100-109(1994))。已經(jīng)確認這三種SFKs在野生型小鼠大動脈中表達量相等。象src-/-小鼠一樣，缺乏Yes的動物在VEGF誘導的VP存在缺陷。然而令人驚奇的是，缺少Fyn的小鼠保持了對于VEGF的高VP反應并且這樣的反應與對照組動物的反應沒有明顯的區(qū)別。在src-/-或yes-/-小鼠中對VEGF誘導的VP的破壞表明特異的SFKs激酶活性對于VEGF介導的導致VP活性的信號事件是重要的但是對于血管發(fā)生則不是。
在src+/-(FIG.5A左邊的圖)或src-/-(FIG.5A右邊的圖)小鼠的皮膚中的VEGF的血管滲漏特性是通過對小鼠皮內(nèi)注射生理鹽水或VEGF(400ng)來決定的，該小鼠已經(jīng)通過靜脈注射Evan’s藍染料。15分鐘之后，對于皮膚斑點進行拍照(刻度圖示為1mm)。星形物表示注射點。VEGF，bFGF或生理鹽水的注射點周圍的區(qū)域被解剖并且通過洗脫的Evan’s藍色染料來對VP進行定量鑒定，該染料的量是通過在甲酰胺中58℃保溫24小時然后在500nm測定吸收值來確定的(FIG.5B，左邊的圖)。在src+/-或src-/-的小鼠中測定已知的能夠誘導炎癥相關的VP的炎癥介導因子(異硫氰酸烯丙酯)的能力(FIG.5B右邊)。
VEGF誘導VP的能力在src-/-，fyn-/-或yes-/-的小鼠中通過Miles分析來比較(FIG.5C)。Miles分析的數(shù)據(jù)是以三個動物的平均值±SD的方式來表示的。src-/-和yes-/-的VP缺陷與對照組比起來有明顯的統(tǒng)計學上的不同(*p＜0.05，成對t檢驗)，然而在VEGF處理的fyn-/-小鼠或異硫氰酸烯丙酯處理的src+/-小鼠中VP的缺陷都沒有明顯的統(tǒng)計學上的不同(**p＜0.05)。
實施例2.Src家族酪氨酸激酶抑制劑處理的小鼠以及src-/-小鼠與未處理的野生型小鼠相比在水腫或血管損傷相關的組織損傷方面有所緩解Src家族酪氨酸激酶抑制劑降低血管損傷或例如中風這樣的失調(diào)之后病理性血管滲漏及透過性。血管內(nèi)皮是一種動態(tài)的細胞類型可以對于許多刺激進行反應來調(diào)節(jié)生理進程，這樣的進程例如腫瘤血管發(fā)生過程中新血管的長出以及對于中風誘導的水腫和組織損傷過程中的血管壁滲透性的調(diào)節(jié)。
通過藥物抑制Src路徑達到的兩個小鼠中風模型中血管滲透性的減少足以通過減少缺血誘導的血管滲漏來抑制腦損傷。此外，在基因缺失Src的小鼠中梗塞的體積也變小了，該小鼠的血管滲漏/通透性降低。綜合合成的Src抑制劑的數(shù)據(jù)與在中風和其它相關的模型中的降低血管滲漏的遺傳學證據(jù)的支持可以證實這種方法在緩解中風之后的腦損傷方面的生理相關性。利用這些信號級聯(lián)的一系列的可得到的Src家族酪氨酸激酶抑制劑來抑制這些通路對于緩解由血管滲漏相關的組織損傷引起的腦損傷是具有治療上的益處的。
我們使用了兩種不同的方法來誘導局部腦缺血。兩種局部腦缺血的動物模型已經(jīng)被很好的建立起來并且在中風研究中被廣泛應用。兩種模型以前被應用于觀察腦缺血的病理生理學以及測試抗中風的新藥。
(a)利用2，2，2-三溴乙醇(AVERTINTM)麻醉小鼠并且將動物放置在加熱墊上保持體溫。在右耳和右眼之間切一切口。通過收縮顳肌使scull暴露出來并且在大腦中動脈(MCA)之上的區(qū)域進行顱骨鉆孔。移除腦膜，利用加熱的細絲形成堵塞物來堵塞右側的MCA?？梢允箘游飶驮⒎呕仄浠\子里。24小時之后腦被灌注，切下來并被切成1mm的橫斷面。這些切片浸入2％的氯化2，3，5-三苯基四唑(TTC)的溶液中并且梗塞的腦區(qū)域可以通過被活(紅色)組織包圍的未染色(白色)組織來鑒定。梗塞的體積通過這些切片未染色區(qū)域的面積的和乘以其厚度來確定。
Src缺陷(Src-/-)的小鼠被用于研究在腦缺血中Src的作用。Src+/-小鼠作為對照。我們發(fā)現(xiàn)在Src-/-小鼠中在損傷之后24個小時梗塞的體積從對照的26±10mm3減小到16±4mm3。當C57B16野生型小鼠血管堵塞之后30分鐘被通過腹腔注射1.5mg/kgAGL1872這樣的效果更加明顯。梗塞的體積從未處理組的31±12mm3減少到AGL1872處理組的8±2mm3。
(b)在第二個病灶性腦缺血模型中是通過將阻塞物放置在MCA的起點來堵塞MCA的。利用修飾的PE-50導管將一個完整的富含纖維蛋白的24小時齡的相應凝塊放到MCA的起點。腦缺血的誘導是通過身體同側半球的腦血流對比對側半球腦血流的減少來證實的。24小時之后腦被切出，然后制備連續(xù)的切片并且用蘇木精-曙紅(HE)染色。梗塞的體積通過將連續(xù)的HE切片中梗塞的面積相加然后乘以每個切片之間的距離得到。
該研究使用的AGL1872的劑量(1.5mg/kgi.p.)是通過經(jīng)驗選擇的。已知VEGF最初是在腦缺血3小時之后表達并且在12到24個小時之后達到最大值。在該研究中AGL1872是在梗塞發(fā)生30分鐘之后給予的以便完全的阻遏VEGF誘導的血管通透性的增加。按照典型的VEGF表達時間進程，可能治療有效的給予Src抑制劑的時間可以是中風之后12個小時。在血管通透性持續(xù)增加相關的疾病中Src抑制類藥物的持續(xù)給藥是很適宜的。
FIG.6是描述在損傷之后小鼠腦中梗塞的平均體積(mm3)的比較的結果，其中的小鼠分別為異源Src(Src+/-)，Src顯性負突變體(Src-/-)，野生型小鼠(WET)或用1.5mg/kg AGL1872處理的野生型小鼠。
FIG.7顯示的是誘導CNS損傷的處理之后分離的灌注的小鼠腦的連續(xù)MRI掃描的樣本，其中AGL1872處理的動物的掃描的結果(右)與對照的未處理的動物的掃描結果(左)相比清楚的顯示出更少的梗塞。
實施例3.Src家族酪氨酸激酶抑制劑處理的大鼠和Src-/-小鼠與未處理野生型的小鼠相比在冠狀血管外傷或損傷相關的組織損傷方面有所緩解心肌缺血是通過對Sprague-Dawley大鼠的冠狀動脈左前降支結扎來誘導的。給予受影響的心臟組織化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑，這是通過在誘導缺血之后腹腔(i.p.)注射吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑AGL1872或SKI-606來完成的。高分辨率核磁共振成像(MRI)，干重測量，梗塞的大小，心臟的體積以及具有風險的區(qū)域是在手術后24小時測定的。存活率，超聲波心動描記術是在手術后四周測定的，并且這些測定是在心肌梗死(MI)后接受劑量為大約1.5mg/kg的抑制劑i.p.注射的大鼠身上做的。
FIG.11顯示的是利用曙紅染料(活體染色)染色的處理過的(左)和對照(右)大鼠心臟組織的顯微照相圖片。對照組織(右上的圖片)顯示了在組織的外圍很大區(qū)域的壞死。對比來看，處理過的組織(左上的圖片)顯示出非常小的壞死組織。
FIG.12顯示的是處理過24小時之后梗塞大小(組織的毫克數(shù))對抑制劑(AGL1872)的濃度所作的柱狀圖。最佳抑制水平是在劑量為大約1.5mg/kg時達到的。大約3mg/kg的劑量并沒有在梗塞大小的縮小方面顯示出任何明顯的差別。
在手術后24小時之內(nèi)利用Src家族酪氨酸激酶抑制劑進行治療可以產(chǎn)生一種劑量依賴方式的梗塞大小和風險區(qū)域面積的減小的結果。對于梗塞大小的減小的最大值是在誘導缺血之后約45分鐘給予抑制劑而抑制劑劑量為大約1.5mg/kg這樣的條件下達到的，這個最大值為大約68％(p＜0.05)(FIG.13)。在誘導缺血6小時之后給予抑制劑仍然是有效的，其結果是梗塞的大小減小約42％(p＜0.05)。對Src的抑制作用并不干擾VEGF在缺血組織中的表達，這是通過免疫組化分析確定的。梗塞大小的減小伴隨著心肌水含量的減少(大約5％+/-1.3％；p＜0.05)以及水腫組織體積的減小，這表明抑制Src所產(chǎn)生的有效的作用是與阻遏VEGF介導的VP相關，其中水腫組織的大小是通過MRI測定的(FIG.14)。利用超聲波心動描記術分析手術后4周的大鼠發(fā)現(xiàn)部分縮短在對照組為約29％而在處理過的大鼠為約34％(p＜0.05)。非常重要地，處理過的大鼠的四周存活率出乎預料的高(100％)相對的對照大鼠的存活率為63％。
為了在體內(nèi)準確測定水腫，我們使用了高分辨率的核磁共振成像(MRI)來評價大鼠的心臟組織，測定的大鼠是在持久的冠狀動脈左前降枝(LAD)堵塞后使用或沒使用Src抑制劑AGL1872或SKI-606處理的。由于其水含量的增加，可以預計水腫區(qū)域比未水腫區(qū)域有更長的T2舒張。為了量化水腫，將T2＞49ms(比正常的灌注心肌的平均值大兩個標準偏差)的區(qū)域畫出來。缺血發(fā)生之后一個小時，T2加權信號顯示Src抑制不影響起始的細胞毒性水腫。然而24小時之后，對于T2圖譜的計算顯示出利用AGL1872處理對比于僅用媒介物處理對于梗塞相關的心肌水腫有47％的減小(n＝2 AGL1872組，n＝1媒介物組)。這個結果與利用非缺血心肌的濕重/干重計算的ex vivo心肌水含量相關。AGL1872使得水腫和梗塞大小劑量依賴性減小，并且減小的最大值在1.5mg/kg達到(每組n＞5，p＜0.001)。在大鼠和小鼠中持久的堵塞之后給予SKI-606也可以使梗塞的大小明顯的減小。為了測定這種反應的動力學，在堵塞后不同的時間給予AGL1872。在堵塞之后45分鐘給藥可以達到最大的作用(梗塞的體積減小50％)，而6小時之后給予治療仍然可以提供25％的保護(每組n＝5，p＜0.05)。
超聲波心動描記術顯示與未處理的大鼠相比，Src抑制在四周之內(nèi)提供了明顯的維持部分縮短和舒張左心室(LV)直徑的作用，這個結果表明受救治的組織的收縮功能能夠維持很長時間。抑制Src也可以提供理想的收縮LV直徑以及局部室壁運動(表1)。利用SKI-606Src抑制劑治療也可以很好的影響局部縮短和局部室壁運動值(每組n＝7，p＜0.01)。為了衡量MI后的存活率，我們使用2歲齡的C57黑小鼠作為模型并用LAD結扎后的相當大的死亡率(＞40％)來表征。MI后45分鐘給予AGL1872(1.5mg/kg)與對照組相比在四周之內(nèi)的存活率升高(分別為91.7％vs.58.3％，每組n＝12)，表明抑制Src具有長時程的治療效果。
表1.MI后的功能性恢復超聲波心動描記術對照 AGL1872 改善百分數(shù) P-值LV直徑，心臟舒張期(mm) 0.93±0.020.82±0.02 11 0.01LV半徑，心臟收縮期(mm) 0.71±0.030.59±0.04 16 0.03局部縮短(％) 23.8±1.7 32.8±3.238 0.03局部室壁運動值 26.9±0.8 24.0±0.59 0.01#每組大鼠的數(shù)目8 8慢性心肌纖維化是在梗塞之后發(fā)生的并且是MI之后組織壞死程度的直接反映。為了衡量抑制Src對于MI后4周大鼠的纖維化的作用，利用可恢復的三色染色方法來進行對纖維組織的組織病理學分析。對比于對照組抑制Src可以使LV纖維化組織降低52％(19.1±2.2％vs.40.0±3.0％，n＝4每組，p＜0.01)。在接受Src抑制劑的樣本中總是可以觀察到對于心肌纖維和LV結構更好的保留，這表明抑制Src在MI之后起到長時間的保護心肌的作用。
為了確定暫時缺血之后抑制Src的效果，大鼠被誘導成堵塞然后被再灌注，在此之后24小時衡量心室膨脹功能以及梗塞的大小。對比于對照組利用AGL1872抑制Src可以保持左心室(LV)部分短縮并且可以減少梗塞大小(n＝4每組，p＜0.05)。缺血再灌注后梗塞的大小會減小18％，對比來看永久的堵塞之后會減小50％其中含氧量過低的刺激會促使VEGF的表達。另外，在缺血再灌注的模型中SKI-606(5mg/kg)可以使梗塞大小減小43％(每組n＝5，p＜0.01)。共同來說，這些數(shù)據(jù)顯示出在短暫缺血之后抑制Src可以提供有益的效果。
實施例4.MI對于血管完整性以及梗塞周圍區(qū)域存活力的影響。
由于VEGF表達主要在梗塞周圍區(qū)域增加，觀察了MI后3-24小時的Src抑制對于在這個區(qū)域小血管的超微結構的影響。表2提供了利用透射電鏡顯微技術檢測的每組250根血管的結果的總結。對照于正常的心肌組織許多的在梗塞周圍區(qū)域的損傷的實施例在梗塞影響的組織中被觀察到。滲出血細胞(RBC，血小板以及嗜中性粒細胞)在間質組織出現(xiàn)，明顯是從附近的血管漏出來的。一些內(nèi)皮細胞(EC)會腫脹并堵塞部分血管內(nèi)腔，經(jīng)常顯示出電子透明并且含有很多空泡。大的圓的空泡出現(xiàn)在內(nèi)膜，經(jīng)常比EC的厚度大幾倍。肌細胞的損傷在MI之后隨時間增加而增加并且在鄰近的細胞間變化，這可以通過線粒體斷裂，線粒體嵴混亂，胞內(nèi)水腫以及肌絲解體來確認。受影響最大的肌細胞經(jīng)常貼近受損血管或游離的血細胞。我們經(jīng)常在MI后24小時觀察到嗜中性粒細胞，該細胞參與到損傷的急性反應中并且可能對VEGF的產(chǎn)生起作用。
表2.MI或VEGF注射后對小鼠心臟組織超微結構的觀察EC屏障 血小板激活功能紊亂 及粘附 EC損傷心臟損傷3hr MI 18 36 31223hr MI+AGL1872 2 11 14224hr MI5 7 344524hr MI+AGL18720 1 159對照 0 0 1 0VEGF，pp60Src+/+ 24 18 3316VEGF，pp60Src+/+ 0 0 0 0
對于每組來說，左心室組織在透射電子顯微鏡上檢測4小時(大約250條微血管)并且觀察按照以下的標準來計算和歸類(a)EC屏障功能紊亂 裂縫，薄膜開口，滲出的血細胞；(b)血小板激活/粘附血小板，脫粒血小板，血小板簇，粘附于ECM的血小板(c)EC損傷 電子透明EC，腫脹EC，大的EC空泡，堵塞的血管腔；以及(d)心臟損傷 線粒體腫脹，嵴紊亂，肌絲解體。
MI之后三個小時經(jīng)?？梢栽谙噜彽腅G之間觀察到裂縫，這種現(xiàn)象可以解釋血細胞滲漏到周圍的間質空隙。令人驚奇的是，許多裂縫被血小板塞住。一些血小板與EC之間暴露的基底層接觸，然而在其它的實施例中基底層看起來也被破壞了。一些血小板被脫粒并且可能增強循環(huán)血小板的進一步激活，粘附以及聚集。盡管這些血小板栓可能防止進一步血管滲漏，這些栓子可能通過微血栓的形成來對降低小血管灌注起作用，這可能引起進一步的與缺血相關的組織疾病。
實施例5.MI和全身VEGF注射產(chǎn)生相似的血管反應為了檢測VEGF對于復合病理或MI的作用，VEGF通過靜脈注射到正常的小鼠并且在30分鐘后在超微結構水平上檢測心臟組織。令人驚奇的是，VEGF誘導的內(nèi)皮屏障功能紊亂以及血管損傷的程度都可以與在MI后在梗塞周圍區(qū)域見到的相當(表2)?？梢杂^察到很多的血小板粘附到EC基底膜還觀察到肌細胞的損傷。全身注射VEGF后也發(fā)現(xiàn)腦損傷的相似的證據(jù)這表明這些效果可能是全身的。這些結果表明VEGF介導的VP平行于許多MI后的血管反應。
為了確定是否VEGF足以介導與MI相關的長時程病理，在2小時的過程中小鼠被注射了四次VEGF。這種處理產(chǎn)生的損傷與MI后24小時產(chǎn)生的相似。我們也發(fā)現(xiàn)血小板粘附，中性粒細胞以及明顯的肌細胞損傷，還發(fā)現(xiàn)許多電子透明的EC，其中許多的EC腫脹并且堵塞血管內(nèi)腔。綜合在一起，暴露于VEGF30分鐘足以誘導與MI后3小時所觀察到的相似超微結構，MI后三個小時是VEGF在梗塞周圍區(qū)域表達明顯增加的時間。長時間的暴露于VEGF會引起與MI后24小時組織內(nèi)引起的相似的血管重造。
Src缺乏的小鼠在MI之后得到保護并且在局部注射VEGF之后皮膚和腦沒有VP出現(xiàn)的事實證實Src缺乏的小鼠得以免于受到心臟內(nèi)VEGF誘導的VP的損害。與Src抑制劑的結果一致，在VEGF注射之后在pp60Src-/-小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)血管反應的征兆(表2)，這是與野生型小鼠中裂縫，血小板活性，受影響的EC以及滲漏出來的血細胞相比較的結果。對于所有反應的完全阻斷證實在缺血性疾病過程中VEGF介導的Src活性起始會導致VP誘導的損傷的級聯(lián)反應。
討論在小鼠中，全身給予VE-鈣粘著蛋白抗體可以導致在心和肺中的VP，組織間隙水腫以及暴露的基底膜的病灶斑，該病灶斑在超微結構水平上看起來與給予VEGF后觀察到的損傷相似。在小鼠胚胎中，β-連環(huán)蛋白無效血管包括變平的有小孔的內(nèi)皮細胞，這與經(jīng)常出血有關。以前的體外研究已經(jīng)推測VEGF能調(diào)節(jié)VE-鈣粘著蛋白的功能。在EC中在有血流的條件下，VE-鈣粘著蛋白與Flk復合。為了在體內(nèi)檢測VE-鈣粘著蛋白-VEGF復合物，從注射或不注射VEGF的小鼠制備心臟裂解液。這些裂解液先利用抗-Flk進行免疫沉淀，然后針對VE-鈣粘著蛋白和β-連環(huán)蛋白進行免疫即記。在對照的小鼠中，在血管內(nèi)觀察到預先存在的Flk，β-連環(huán)蛋白以及VE-鈣粘著蛋白之間的復合物。該復合物在VEGF刺激之后2-5分鐘被很快的破壞了并且在體內(nèi)在血管中15分鐘之內(nèi)重新結合。該復合物的解離的時間表完全平行于Flk，β-連環(huán)蛋白和VE-鈣粘著蛋白的磷酸化也平行于β-連環(huán)蛋白從VE-鈣粘著蛋白上的解離。由于在Src抑制劑預處理的小鼠中VEGF刺激后Flk-鈣粘著蛋白-連環(huán)蛋白信號復合物保持完整并且β-連環(huán)蛋白和VE-鈣粘著蛋白的磷酸化沒有發(fā)生，所以這些VEGF介導的事件是Src依賴的。在注射堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)之后沒有觀察到這些事件，該因子是一種相似的抗原性生長因子并且不會促進血管滲透性。
盡管單一注射VEGF時會產(chǎn)生可逆的，快速的并且短暫的信號反應，該信號反應會在15分鐘之內(nèi)恢復到基線，但是四次VEGF注射(間隔三十分鐘)可以產(chǎn)生長期的信號反應。例如將暴露VEGF的時間延長后Flk-連環(huán)蛋白的解離以及Erk的磷酸化會持續(xù)。這種模型可適用于MI后的生理條件，在該生理條件中由于組織缺氧VEGF的表達增加并且會持續(xù)幾天。
在急性MI或全身給予VEGF后的VP中Src起到生理和分子的作用。MI后的結果很顯然一部分是由于梗塞區(qū)域周圍灌注的心臟微血管的超滲透性。這些血管被VEGF不利影響并且經(jīng)歷一種Src依賴的VP增加并且最終損傷到周圍的肌細胞，該種VP增加會導致血管堵塞或萎陷。排除再灌注中的血管開放，以上的結果與已有報導的MI后不足的組織灌注以及高死亡率是一致的。MI后6小時抑制Src仍然可以提供針對VEGF誘導的VP的明顯保護，這表明本方法很適用于臨床方向。在MI之后給予Src抑制劑看起來是通過阻斷Flk-鈣粘著蛋白-連環(huán)蛋白復合物的解離來限制VP的，該復合物具有內(nèi)皮屏障的功能。
超微結構數(shù)據(jù)表明MI后VEGF開始的作用包括內(nèi)皮連接的打開，內(nèi)皮基底膜的暴露。血小板粘附于這些位點，其中很多血小板脫粒并且活化。這引起我們的興趣由于血小板含有VEGF，當VEGF隨血小板活化釋放的時候會增強VP反應。事實上，很可能抑制Src的一些有益的效果是由于其對于血小板活化的影響。從現(xiàn)在的數(shù)據(jù)可以明顯的看出在MI之后的早期事件開始了一系列的反應，其結果是水腫和組織損傷的積累，然后就是纖維化以及心臟組織的重構。在這里指出纖維化重構的心臟組織在功能上比正常的心臟組織差是很重要的。因此通過早期限制損傷的效果，可以使得需要重構的組織更少，從而可以期望得到長時程的益處。由于對于單一的冠狀血管的堵塞會使急性損傷增強從而導致梗塞區(qū)域的增長，纖維化以及在一些實施例中導致死亡，所以在這種進程中早期的有效的干涉可能會很好的提供長時間的保護和益處。
目前的數(shù)據(jù)顯示Src抑制劑可能很好的起到這樣的作用。抑制Src可以維持Flk-鈣粘著蛋白-連環(huán)蛋白復合物并且使內(nèi)皮結合處對抗VEGF的滲漏性增加的作用。
令人驚奇的是，全身注射VEGF可以產(chǎn)生許多在MI之后可以見到的對于心血管超微結構的影響。在體內(nèi)僅用VEGF就足以誘導內(nèi)皮屏障功能異常以及血管的損傷。同樣地，本發(fā)明的方法不僅抑制MI后的這些現(xiàn)象而且也可以抑制全身VEGF注射之后的現(xiàn)象，該方法包括利用Src家族酪氨酸激酶抑制劑來阻遏Src。即使在VEGF刺激的情況下，抑制Src仍然可以穩(wěn)定Flk-鈣粘著蛋白-連環(huán)蛋白復合物。其它對于VEGF誘導VP起作用的因子可能包括空泡或visiculo-空泡細胞器(VVOs)以及穿孔。由于pp60Src-/-小鼠在VEGF注射之后沒有顯示出通透性的癥狀，所以這些通透性的模式也可以是Src依賴的?？梢赃x擇的是，內(nèi)皮裂縫，滲漏出來的血細胞以及暴露的基底膜可能誘導穿孔以及VVOs。
在體內(nèi)VEGF是反應于多種因子(細胞因子，原癌基因，組織缺氧)而表達的并且起到誘導通透性以及血管發(fā)生還有內(nèi)皮細胞增殖，遷移，和抑制細胞凋亡的作用。腫瘤產(chǎn)生大量的VEGF，這是可以在血流中檢測出來的。事實上，腫瘤中的或接近腫瘤的血管會出現(xiàn)很多與本研究中VEGF注射之后相似的癥狀，例如內(nèi)皮開口，內(nèi)皮間連接開放以及成簇的融合空泡。具有各種癌癥的病人血清中的VEGF水平在100-3000pg/ml的范圍之內(nèi)，然而局部細胞或組織的VEGF水平可以更高10-100倍。已經(jīng)有報導在MI后的病人中血清中VEGF水平在100-400pg/ml的范圍之內(nèi)，并且在急性MI的病人中比穩(wěn)定心絞痛病人中的含量更高。在一些原發(fā)的和轉移的腫瘤中，梗塞周圍區(qū)域的局部的VEGF水平可能大大的超過血清中的水平。由于循環(huán)系統(tǒng)中VEGF聚集的增加會激起VP反應，該反應會吸引血小板并導致血流的喪失，所以現(xiàn)有的數(shù)據(jù)可能可以解釋一些癌癥病人具有更多的血栓形成疾病這一發(fā)現(xiàn)。另外，最近的報道或許可以解釋與晚期癌癥相關的胸膜滲漏以及全身水腫。因此，對Src的阻遏對于癌癥相關的水腫類疾病可能具有重要的作用。
當其抑制Src家族酪氨酸激酶的時候，AGL1872也干擾一定范圍的其它的激酶，然而SKI-606據(jù)報道更加具有選擇性的抑制Src和Yes。這兩種抑制劑都顯示出相似的生物學活性模式，這些模式與Src缺乏的小鼠顯示出來的一致。給予野生型動物藥理學上的Src抑制劑也能對于組織損傷，心血管的生化和超微結構產(chǎn)生與基因敲除小鼠中所見的同樣的影響，該事實證實該影響主要是由于EC介導的滲漏而與這些動物的遺傳素質無關。Src和Yes，但是除了Fyn，對于VEGF介導的VP反應以及腦中缺血損傷之后的梗塞組織的生長是很重要的。綜合在一起，以上數(shù)據(jù)證實在MI之后給予Src家族酪氨酸激酶抑制劑的有效作用實際上是Src激酶抑制的功能，并且可以推測pp60Src和pp62Yes象Src激酶一樣最有可能牽涉其中。
在MI或直接VEGF注射之后可以觀察到重要的相同的超微結構的變化。VEGF主要對于內(nèi)皮細胞而不是其它的細胞類型發(fā)揮作用的事實證實在ECs中阻遏Src可以解釋超微結構觀察的結果。此外，觀察到的大部分的變化是與EC中的細胞-細胞接觸以及血管完整性直接相關，這些變化在Src基因敲除的動物或用Src抑制劑處理的野生型動物中幾乎沒有觀察到。重要的是，Src在VP中的作用可歸因于其磷酸化VE-鈣粘著蛋白和β-連環(huán)蛋白并且促進這些連接蛋白與VEGF受體之間形成的復合物的解離的能力，其中VEGF受體為Flk。
本發(fā)明的方法非常適合于特異的改善VP誘導的組織損傷，特別是由于心肌梗死造成的組織損傷，因為針對于Src家族酪氨酸激酶功能的抑制集中抑制VP而對于VEGF誘導的其它反應不具有長時程的作用，其中VEGF誘導的其它反應可能對于損傷的恢復具有有益的影響。
Src似乎是通過影響VEGF介導的血管通透性來調(diào)節(jié)組織損傷的并且因此代表一種新的在心肌缺血的病理生理學上的治療靶位。冠狀動脈堵塞之后心肌損傷的程度可以通過對Src家族酪氨酸激酶急性的藥理學抑制來得到明顯的減輕。
對于合成的，相對的小分子化學抑制劑的應用比利用相對大的蛋白更安全并且更易于處理。因此，前者更優(yōu)選地作為治療活性劑。
前述的詳細說明使得本領域中的技術人員可以將本發(fā)明付諸實施。實際上，除了這里顯示和描述的那些以外，對于本發(fā)明的各種修飾對于本領域中的技術人員是顯而易見的并且仍在附加的權利要求的范圍之內(nèi)。
序列表<110>The Scripps Research InstituteCheresh，David A.
Paul，RobertEliceiri，Brian<120>治療心肌梗死的方法<130>TSRI-651.6<150>10/298,377-<151>2002-11-18<150>09/538,248<151>2000-03-29<150>09/470,881<151>1999-12-22<150>PCT/US99/11780<151>1999-05-28<150>60/087,220<151>1998-05-29<160>4<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2187<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(134)...(1486)<400>1gcgccgcgtc ccgcaggccg tgatgccgcc cgcgcggagg tggcccggac cgcagtgccc 60caagagagct ctaatggtac caagtgacag gttggcttta ctgtgactcg gggacgccag 120agctcctgag aag atg tca gca ata cag gcc gcc tgg cca tcc ggt aca 169
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<221>CDS<222>(208)...(1839)<400>3gcggagccaa ggcacacggg tctgaccctt gggccggccc ggagcaagtg acacggaccg 60gtcgcctatc ctgaccacag caaagcggcc cggagcccgc ggaggggacc tgacgggggc 120gtaggcgccg gaaggctggg ggccccggag ccgggccggc gtggcccgag ttccggtgag 180cggacggcgg cgcgcgcaga tttgata atg ggc tgc att aaa agt aaa gaa aac 234Met Gly Cys Ile Lys Ser Lys Glu Asn1 5aaa agt cca gcc att aaa tac aga cct gaa aat act cca gag cct gtc282Lys Ser Pro Ala Ile Lys Tyr Arg Pro Glu Asn Thr Pro Glu Pro Val10 15 20 25agt aca agt gtg agc cat tat gga gca gaa ccc act aca gtg tca cca330Ser Thr Ser Val Ser His Tyr Gly Ala Glu Pro Thr Thr Val Ser Pro30 35 40tgt ccg tca tct tca gca aag gga aca gca gtt aat ttc agc agt ctt378Cys Pro Ser Ser Ser Ala Lys Gly Thr Ala Val Asn Phe Ser Ser Leu45 50 55tcc atg aca cca ttt gga gga tcc tca ggg gta acg cct ttt gga ggt 426Ser Met Thr Pro Phe Gly Gly Ser Ser Gly Val Thr Pro Phe Gly Gly60 65 70gca tct tcc tca ttt tca gtg gtg cca agt tca tat cct gct ggt tta 474Ala Ser Ser Ser Phe Ser Val Val Pro Ser Ser Tyr Pro Ala Gly Leu75 80 85aca ggt ggt gtt act ata ttt gtg gcc tta tat gat tat gaa gct aga 522Thr Gly Gly Val Thr Ile Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg90 95 100 105act aca gaa gac ctt tca ttt aag aag ggt gaa aga ttt caa ata att 570Thr Thr Glu Asp Leu Ser Phe Lys Lys Gly Glu Arg Phe Gln Ile Ile110 115 120aac aat acg gaa gga gat tgg tgg gaa gca aga tca atc gct aca gga 618Asn Asn Thr Glu Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Ile Ala Thr Gly125 130 135aag aat ggt tat atc ccg agc aat tat gta gcg cct gca gat tcc att 666Lys Asn Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Ala Asp Ser Ile140 145 150cag gca gaa gaa tgg tat ttt ggc aaa atg ggg aga aaa gat gct gaa 714Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Met Gly Arg Lys Asp Ala Glu155 160 165aga tta ctt ttg aat cct gga aat caa cga ggt att ttc tta gta aga 762Arg Leu Leu Leu Asn Pro Gly Asn Gln Arg Gly Ile Phe Leu Val Arg170 175 180 185gag agt gaa aca act aaa ggt gct tat tcc ctt tct att cgt gat tgg 810Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Ser Leu Ser Ile Arg Asp Trp190 195 200gat gag ata agg ggt gac aat gtg aaa cac tac aaa att agg aaa ctt 858Asp Glu Ile Arg Gly Asp Asn Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu205 210 215gac aat ggt gga tac tat atc aca acc aga gca caa ttt gat act ctg 906
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權利要求
1.一種治療患有心肌梗死的哺乳動物的方法，該方法包括給予該哺乳動物治療有效劑量的藥物組合物，該藥物組合物包括化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑。
2.權利要求1的方法，其中該哺乳動物是人類。
3.權利要求1的方法，其中該哺乳動物是非人類哺乳動物。
4.權利要求1的方法，其中該Src家族酪氨酸激酶抑制劑是Src蛋白的抑制劑。
5.權利要求4的方法，其中該化學抑制劑選自吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、吡啶并[2，3-d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、4-苯胺基-3-喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑及其混合物。
6.權利要求5的方法，其中該吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑是由4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，及其混合物組成的群中的一員。
7.權利要求5的方法，其中該大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑是由格爾德霉素、Herbimycin A、根赤殼菌素R2146及其混合物組成的群中的一員。
8.權利要求5的方法，其中該吡啶并[2，3-d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑是PD173955。
9.權利要求5的方法，其中該4-苯胺基-3-喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑是SKI-606。
10.權利要求1的方法，其中該藥物組合物是通過腹膜腔內(nèi)注射給予哺乳動物的。
11.權利要求1的方法，其中該藥物組合物是通過靜脈注射給予哺乳動物的。
12.權利要求1的方法，其中該藥物組合物是在心肌梗死之后約6小時之內(nèi)給予哺乳動物的。
13.權利要求1的方法，其中該藥物組合物是在心肌梗死之后約24小時之內(nèi)給予哺乳動物的。
14.一種制品，其包括包裝材料以及包含在包裝材料之內(nèi)的藥物組合物，其中該藥物組合物是以能夠緩解由于血液供應受阻造成的冠狀組織壞死的劑量存在的，該包裝材料包括標簽，該標簽說明該藥物組合物可以被用來治療心肌梗死，并且其中該藥物組合物包括化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑以及一種藥學上可接受的載體。
15.權利要求14的制品，其中該Src家族酪氨酸激酶抑制劑是Src蛋白的抑制劑。
16.權利要求15的制品，其中該化學抑制劑選自吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、吡啶并[2，3-d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、4-苯胺基-3-喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑及其混合物。
17.權利要求16的制品，其中該吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑選自由4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，及其混合物組成的群。
18.權利要求15的制品，其中該大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑選自格爾德霉素、Herbimycin A、根赤殼菌素R2146及其混合物。
19.權利要求15的制品，其中該吡啶并[2，3-d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑是PD173955。
20.權利要求15的制品，其中該4-苯胺基-3-喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑是SKI-606。
21.一種用于預防性治療具有心肌梗死風險的哺乳動物的方法，該方法包括給予該哺乳動物預防劑量的藥物組合物，該藥物組合物包含化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑。
22.權利要求21的方法，其中該哺乳動物是非人類哺乳動物。
23.權利要求21的方法，其中該哺乳動物是人類。
24.權利要求21的方法，其中該藥物組合物通過口服給予該哺乳動物。
25.權利要求21的方法，其中該藥物組合物通過胃腸外給予該哺乳動物。
26.權利要求21的方法，其中該Src家族酪氨酸激酶抑制劑是吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑。
27.權利要求26的方法，其中該吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑選自由4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，及其混合物組成的群。
28.權利要求21的方法，其中該Src家族酪氨酸激酶是4-苯胺基-3-喹啉甲腈化合物。
29.化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑在制備治療心肌梗死的藥物中的應用。
30.按照權利要求29的應用，其中該化學抑制劑選自吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、吡啶并[2，3-d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、4-苯胺基-3-喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑及其混合物。
31.按照權利要求30的應用，其中該吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑選自由4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，及其混合物組成的群
32.按照權利要求30的應用，其中該大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑選自格爾德霉素、Herbimycin A、根赤殼菌素R2146及其混合物。
33.按照權利要求30的應用，其中該4-苯胺基-3-喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑是SKI-606。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過給哺乳動物施用治療有效量的化學Src家族酪氨酸激醇蛋白抑制劑治療哺乳動物的以及該抑制劑化合物在制備治療心肌梗死的藥劑中的應用。心肌梗死可通過給哺乳動物施用預防量的抑制劑而得到預防。抑制劑優(yōu)選是選自吡唑并嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、大環(huán)二烯酮類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、吡啶并[2，3－d]嘧啶類Src家族酪氨酸激酶抑制劑、4－苯胺基－3－喹啉甲腈類Src家族酪氨酸激酶抑制劑及其混合物。Src家族酪氨酸激酶抑制劑可用于制備治療心肌梗死的藥劑。還公開了含有化學Src家族酪氨酸激酶抑制劑的制品。
文檔編號A61P43/00GK1738624SQ200380108930
公開日2006年2月22日 申請日期2003年11月18日 優(yōu)先權日2002年11月18日
發(fā)明者D·A·切列什, R·保羅, B·埃利切里 申請人:斯克里普斯研究學院