專利名稱：骨質(zhì)疏松癥的聯(lián)合療法的制作方法
本申請是發(fā)明名稱為“骨質(zhì)疏松癥的聯(lián)合療法”申請(申請?zhí)?6180058.5；申請日1996年12月23日)的分案申請。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及雌激素激動劑/拮抗劑和能促進(jìn)骨骼形成并增加骨質(zhì)的制劑的藥物組合物，含有這種組合物的試劑盒以及這種組合物治療哺乳動物包括人中存在的低骨質(zhì)疾病的用途。
骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨骼疾病，特征為骨密度低和骨組織退化，結(jié)果使骨的脆性增加而易發(fā)生骨折。在美國，受此疾病影響的人超過25百萬，每年會有1.3百萬以上的人發(fā)生骨折，其中包括500,000人是脊柱骨折，250,000人是髖部骨折，240,000人是腕部骨折。髖部骨折是最嚴(yán)重的，一年中有5-20％的患者死亡，有50％以上的幸存者喪失勞動能力。
老年人發(fā)生骨質(zhì)疏松的危險最大，因此預(yù)計隨著人口老齡化這一問題將顯著增加。預(yù)計全世界骨折的發(fā)生率在未來60年內(nèi)將增加三倍，一項研究估計到2050年全世界將有4.5百萬髖部骨折患者。
婦女比男子發(fā)生骨質(zhì)疏松的危險更大。婦女在絕經(jīng)后骨損失立即急劇加速。其他增加骨損失而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的因素包括吸煙，酗酒，久坐型生活方式和低鈣攝取。
雌激素是在預(yù)防婦女發(fā)生骨質(zhì)疏松或絕經(jīng)后骨損失中選用的制劑。另外，Black等人在EP 0605193A中報道雌激素，特別是當(dāng)口服時，降低了LDL的血漿濃度而升高了有益的高密度脂蛋白(HDL)的血漿濃度。然而，長期雌激素治療已牽連出多種疾病，包括子宮癌、子宮內(nèi)膜癌和可能的乳腺癌的危險增加，使得許多婦女或者要避免這種治療或僅能短期用藥。盡管認(rèn)為通過同時使用孕酮可減少子宮內(nèi)膜癌的危險，但仍擔(dān)心使用雌激素有可能增加乳腺癌的危險。近期為了減小癌癥危險而提出的治療方案如孕酮和雌激素聯(lián)合給藥使患者出現(xiàn)了難以承受的出血。另外，孕酮與雌激素聯(lián)合似乎會鈍化雌激素降低血清膽固醇的作用。與雌激素療法相關(guān)的顯著的不良副作用而提出需要研制另外的治療骨質(zhì)疏松癥方法，這些方法對血清LDL應(yīng)具有所期望的有益作用而不會導(dǎo)致不期望的副作用。
最近，已提出用一些雌激素激動劑/拮抗劑來治療骨質(zhì)疏松。已報道(骨質(zhì)疏松癥會議記要No.1812/13，4月16/20，1993，p.29)雷洛昔芬，6-羥基-2-(4-羥苯基)-3-[4-(2-哌啶乙氧基)苯甲?；鵠苯并(b)噻吩，它模擬了雌激素對骨和脂質(zhì)的有利作用，但卻不象雌激素，對子宮的刺激作用很小?！睟lack，L.J.等人，雷洛昔芬(LY139481 Hcl)在卵巢切除的大鼠中防止了骨損失并降低了血清膽固醇而沒有引起子宮肥大，臨床研究雜志，1994，9363-69〕。
另外，他莫昔芬，1-(4-β-二甲氨基乙氧苯基)-1，2-二苯基-丁-1-烯，是抗雌激素劑，提出用它作為對乳腺癌具有緩解作用的骨質(zhì)疏松藥，但據(jù)報道其在子宮中有一些雌激素活性。Gill-sharma等人在生殖與生育力雜志(1993)99，395中公開了200和400mg/kg/天的他莫昔芬使雄性大鼠的體重和第二性器官重量減輕。
另外，美國專利No.5,254,594(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了屈洛昔芬治療骨疾病包括骨質(zhì)疏松的用途。
象屈洛昔芬這樣的制劑防止了骨損失并由此降低了發(fā)生骨折的危險而沒有雌激素的副作用。然而，單獨的雌激素和雌激素激動劑僅能減少約50％的骨折危險，而剩下的約50％的骨質(zhì)稀少的婦女仍有骨質(zhì)疏松性骨折的危險。
還提出用非雌激素激動劑/拮抗劑如雙磷酸酯來治療骨質(zhì)疏松。例如，F(xiàn)osamax是目前市售用于治療骨質(zhì)疏松的一種雙磷酸酯。目前經(jīng)過管理部門審查的其他雙磷酸酯包括risedronate，tiludronate和ibandronate。
Frost等人在“通過控制粘著骨細(xì)胞群來治療骨質(zhì)疏松”臨床矯形外科學(xué)及相關(guān)研究143，227(1979)中公開了一種理論模型，提出通過先使用骨細(xì)胞活化劑，接著再用骨吸收抑制劑而使骨細(xì)胞的活化和代謝同步化，由此形成正常骨骼應(yīng)該是可能的。
Tang等人在成骨的雌性大鼠骨骼的骨質(zhì)恢復(fù)和維持1.骨質(zhì)和結(jié)構(gòu)的變化，骨礦物研究雜志7(9)，P.1093-1104，1992中公開了關(guān)于損失、恢復(fù)和維持(LRM)原理的信息，骨質(zhì)疏松逆轉(zhuǎn)的實施方法。LRM原理是利用合成代謝劑來修復(fù)骨質(zhì)和結(jié)構(gòu)(+期)，然后轉(zhuǎn)換為能維持骨質(zhì)產(chǎn)生能力的試劑以保持新骨(+/-期)。利用PGE2和risedronate(一種雙磷酸酯)研究大鼠，結(jié)果表明由PGE2誘導(dǎo)的大多數(shù)新的網(wǎng)狀骨質(zhì)的和皮質(zhì)的骨在使用risedronate而中止PGE2后可維持至少60天。
聯(lián)合使用雙磷酸酯和前列腺素來治療骨質(zhì)疏松也有報導(dǎo)。EP申請No.0381296提出使用一種試劑盒，其中在骨活化期或治療階段后再接著進(jìn)行骨吸收抑制方案。在該參考文獻(xiàn)中提到的骨活化化合物的實例包括甲狀旁腺激素(PTH)，無機(jī)磷酸鹽，生長激素，氟化物，甲狀腺激素(例如甲狀腺素)，某種維生素D代謝物和前列腺素(PGE2的給藥方案為10mg/kg/天)。公開了多磷酸酯作為骨吸收抑制劑。
PCT/US93/08529公開了與骨吸收抑制劑化合物化學(xué)偶合的骨活化劑(如前列腺素)的同時釋放，將骨活化劑選擇性地釋放到靶區(qū)域。隨著新化合物的逐漸水解，水解產(chǎn)物能提供骨吸收抑制活性(經(jīng)雙磷酸酯)和骨生長或刺激活性(經(jīng)PGE2)。
Lin等人研究了前列腺素E2和risedronate(一種雙磷酸酯)的聯(lián)合作用，見前列腺素E2和risedronate使用在老齡雌性大鼠的網(wǎng)狀骨質(zhì)上的作用，骨15(5)，P489-496，1994。
Oiu等人在PGE2與維生素E和雌二醇結(jié)合進(jìn)行抗動脈粥樣硬化治療的實驗研究，中國醫(yī)學(xué)雜志，108(1)，P33-36，1995中公開了PGE2與維生素E結(jié)合以及與雌二醇結(jié)合，其比PGE2單劑能更協(xié)同地抑制主動脈與冠狀動脈粥樣硬化損害，以及血小板凝集，平滑肌細(xì)胞增殖和類脂的過氧化作用。
“治療患乳腺癌的年輕婦女的早期絕經(jīng)的非激素替代法”，國立癌癥研究所專論(16)，161-167，1994，摘要中陳述“已有希望用幾種非雌激素方法來預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松。傳統(tǒng)的保持骨骼完整(如承重鍛煉；富含鈣的飲食和限制咖啡因、酒精和蛋白質(zhì)；避免吸煙；和減少創(chuàng)傷)的方法現(xiàn)已發(fā)展到包括藥物的使用或研究(單獨或結(jié)合)。這些藥物包括孕酮、維生素D代謝物、可注射和鼻內(nèi)給藥的合成鮭降鈣素、雙磷酸酯、氟化鈉、甲狀旁腺激素、生長因子、他莫昔芬等。”因此盡管已有各種骨質(zhì)疏松療法，但由于目前的方法在降低骨質(zhì)疏松性骨折方面的成功率有限，所以在該技術(shù)領(lǐng)域中仍然需要并在繼續(xù)研究另外的療法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包括雌激素激動劑/拮抗劑和合成代謝劑的藥物組合物以及這種組合物用于治療低骨質(zhì)癥狀，包括哺乳動物(例如人，特別是婦女)骨質(zhì)疏松的用途。
該組合物包含治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是雌激素激動劑/拮抗劑；和治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是前列腺素或前列腺素激動劑/拮抗劑。
優(yōu)選的雌激素激動劑/拮抗劑包括屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬，4-羥基-他莫昔芬，順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；和1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉。
優(yōu)選的合成代謝劑包括PGD1，PGD2，PGE2，PGE1，PGF2，PGF2α和3S-(3-羥基-4-苯基-丁基)-2R-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-環(huán)戊酮。
本發(fā)明的另一方面是治療哺乳動物低骨質(zhì)的方法，包含給有低骨質(zhì)病癥的哺乳動物使用a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是雌激素激動劑/拮抗劑；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是前列腺素或前列腺素激動劑/拮抗劑。
在該方法中優(yōu)選的雌激素激動劑/拮抗劑包括屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬，4-羥基-他莫昔芬，順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；和1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉。
在該方法中優(yōu)選的合成代謝劑包括PGD1，PGD2，PGE2，PGE1，PGF2，PGF2α和3S-(3-羥基-4-苯基-丁基)-2R-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-環(huán)戊酮。
該方法的優(yōu)選情況是其中所患低骨質(zhì)病為骨質(zhì)疏松。
該方法的另一種優(yōu)選情況是其中第一種化合物和第二種化合物是同時給藥的。
也可以在第二種化合物給藥之后接著在約3個月到約3年時間內(nèi)給予第一種化合物，在這約3個月到約3年期間不給第二種化合物。
該方法的另一種優(yōu)選情況是其中第二種化合物給藥時間為約3個月到約3年。
或者，第二種化合物給藥后接著在約3年以上的時間內(nèi)給予第一種化合物，在這約3年以上的期間不給第二種化合物。
本發(fā)明的另一方面是有協(xié)同作用的藥物組合物，它包含以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是雌激素激動劑/拮抗劑；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是前列腺素和前列腺素激動劑/拮抗劑其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的聯(lián)合作用大于單獨第一種和第二種化合物的量可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明的另一方面是治療哺乳動物低骨質(zhì)癥的有協(xié)同作用的方法，包含給予有低骨質(zhì)癥的哺乳動物以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是雌激素激動劑/拮抗劑；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是前列腺素和前列腺素激動劑/拮抗劑其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨第一種和第二種化合物的量可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明的另一方面是含有治療低骨質(zhì)癥用的試劑盒，它包含a.在第一種單位劑型中的治療有效量的雌激素激動劑/拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體；b.在第二種單位劑型中的治療有效量的前列腺素或前列腺素激動劑/拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體；和c.用于包含所述第一種和第二種劑型的容器。
本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物，它包含a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬(idoxifene)；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677。
優(yōu)選的該組合物是其中第一種化合物為屈洛昔芬。
本發(fā)明的另一方面涉及治療哺乳動物低骨質(zhì)癥的的方法，包含給予有低骨質(zhì)狀況的哺乳動物以下a、b化合物a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬(idoxifene)；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677。
優(yōu)選的該方法是其中第一種化合物為屈洛昔芬。
該方法的另一種優(yōu)選情況是其中低骨質(zhì)癥狀是骨質(zhì)疏松。
該方法的另一種優(yōu)選情況是其中第一種化合物和第二種化合物是同時給藥的。
該方法的另一種優(yōu)選情況是其中第二種化合物給藥期約3個月到約3年。
也可以是第二種化合物給藥后接著用第一種化合物約3個月到約3年，而在這約3個月到約3年的期間內(nèi)不用第二種化合物。
另外，第二種化合物給藥后接著用第一種化合物約3年以上，而在這約3年以上的期間內(nèi)不用第二種化合物。
本發(fā)明的另一方面是有協(xié)同作用的藥物組合物，它包含以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677其中單獨第一種化合物的量和單獨第二種化合物的量同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的聯(lián)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
該協(xié)同組合物的優(yōu)選情況是其中第一種化合物為屈洛昔芬。
本發(fā)明的另一方面是治療哺乳動物低骨質(zhì)癥的有協(xié)同作用的方法，包含給予有低骨質(zhì)癥的哺乳動物以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑和載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的聯(lián)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
該協(xié)同方法的優(yōu)選情況是其中第一種化合物是屈洛昔芬。
本發(fā)明的另一方面是含有治療低骨質(zhì)癥的試劑盒，它包含a.在第一種單位劑型中的治療有效量的屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬和藥學(xué)上可接受的載體；b.在第二種單位劑型中的治療有效量的氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677和藥學(xué)上可接受的載體；和c.用于包含所述第一種和第二種劑型的容器。
該試劑盒的優(yōu)選情況是其中第一種化合物為屈洛昔芬。
本發(fā)明的另一方面是藥物組合物，它包含a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物為順式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素。
本發(fā)明的另一方面是治療哺乳動物低骨質(zhì)癥的方法，包含給予有低骨質(zhì)癥的哺乳動物a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物為順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素。
該方法的優(yōu)選情況是其中低骨質(zhì)癥是骨質(zhì)疏松。
該方法的另一種優(yōu)選情況是其中第一種化合物和第二種化合物是同時給藥的。
該方法的另一種優(yōu)選情況是其中第二種化合物給藥時間約3個月到約3年。
也可以在第二種化合物給藥后接著給予第一種化合物約3個月到約3年，而在這約3個月到約3年的期間不給予第二種化合物。
或者，第二種化合物給藥后接著給予第一種化合物約3年以上，而在約3年以上的期間不給予第二種化合物。
本發(fā)明的另一方面是有協(xié)同作用的藥物組合物，它包含以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑和載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的聯(lián)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明的另一方面是治療哺乳動物低骨質(zhì)癥的的有協(xié)同作用的方法，包含給予有低骨質(zhì)的哺乳動物以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量如果同時給藥則是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的聯(lián)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明的另一方面是含有治療低骨質(zhì)癥的試劑盒，它包含a.在第一種單位劑型中的治療有效量的順式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和藥學(xué)上可接受的載體；b.在第二種單位劑型中的治療有效量的氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素和藥學(xué)上可接受的載體；和c.用于包含所述第一種和第二種劑型的容器。
本發(fā)明的另一方面是藥物組合物，它包含a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬，和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素。
本發(fā)明的另一方面是有協(xié)同作用的組合物和即時進(jìn)行組合的試劑盒的處理方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，在本發(fā)明中以類似的方式，其他抗吸收劑(雙磷酸酯，雌激素，雌二醇，結(jié)合雌激素，雌酮，雌三醇或17α-或17β-乙炔基雌二醇)和其他骨合成代謝劑(雄激素，雄激素激動劑/拮抗劑)可以一起使用或與本文中描述的任何試劑一起使用。
例如，抗吸收劑屈洛昔芬可以與單獨的骨合成代謝劑如甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素聯(lián)合。
詞組“低骨質(zhì)癥”是指某種疾病，其中骨質(zhì)的密度低于世界衛(wèi)生組織“骨折危險的評定及其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的普查中的應(yīng)用(1994)，世界衛(wèi)生組織研究組報告，世界衛(wèi)生組織技術(shù)系列843”中定義的特定年齡正常標(biāo)準(zhǔn)值。還包括兒童期自發(fā)的和初期骨質(zhì)疏松。包括在骨質(zhì)疏松治療中的是預(yù)防或減弱長期并發(fā)癥如脊柱彎曲、高度降低，修復(fù)外科，和預(yù)防前列腺功能障礙。還包括增加骨折愈合速率和提高骨移植的成功率。還包括牙周疾病和牙槽骨損失。
詞組“低骨質(zhì)癥”還指哺乳動物中已知發(fā)生如上所述的疾病(包括骨質(zhì)疏松)的機(jī)會要顯著高于平均值的情況(例如，絕經(jīng)后的婦女，60歲以上的男子，和用已知會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松副作用的藥物(如糖皮質(zhì)激素)進(jìn)行治療的人)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到術(shù)語骨質(zhì)實際上是指每單位面積的骨質(zhì)，它有時(盡管并不精確)指的是骨礦物質(zhì)密度。
本文中所用的術(shù)語“治療”包括防止(例如預(yù)防)和緩解性治療。
鹵素是指氯、溴、碘或氟。
烷基是指直鏈或支鏈飽和烴。這樣的烷基的實例(假定指明的長度包括特定實例)是甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，異戊基，己基和異己基。
烷氧基是指通過氧鍵合的直鏈或支鏈飽和烷基。這樣的烷氧基的實例(假定指明的長度包括特定實例)是甲氧基，乙氧基，丙氧基，異丙氧基，丁氧基，異丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，異戊氧基，己氧基和異己氧基。
詞組“藥學(xué)上可接受的陰離子鹽”是指含有陰離子的無毒的陰離子鹽，例如(但不限于)氯化物，溴化物，碘化物，硫酸鹽，硫酸氫鹽，磷酸鹽，乙酸鹽，馬來酸鹽，富馬酸鹽，草酸鹽，乳酸鹽，酒石酸鹽，檸檬酸鹽，葡糖酸鹽，甲磺酸鹽和4-甲苯-磺酸鹽。
詞組“藥學(xué)上可接受的陽離子鹽”是指無毒的陽離子鹽如(但不限于)鈉，鉀，鈣，鎂，銨或質(zhì)子化芐星(N，N′-二芐基-1，2-乙二胺)，膽堿，乙醇胺，二乙醇胺，1，2-乙二胺，meglamine(N-甲基-葡糖胺)，芐胺(N-芐基苯乙胺)，哌嗪或氨丁三醇(2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇)。
本文在命名中所用的括號中的負(fù)號或正號代表平面方向的極化光是通過特定立體異構(gòu)體旋轉(zhuǎn)的。
本文中所用的術(shù)語“反應(yīng)惰性溶劑”和“惰性溶劑”是指該溶劑不會與起始物，試劑，中間體或產(chǎn)物以對產(chǎn)物的收率起負(fù)作用的方式相互作用。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到本發(fā)明的某些化合物將含有一個或多個原子可以是特定立體化學(xué)的或幾何構(gòu)型，從而產(chǎn)生立體異構(gòu)體和構(gòu)型異構(gòu)體。本發(fā)明包括所有的這些異構(gòu)體及其混合物，還包括本發(fā)明化合物的水合物。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到本發(fā)明中列出的含有雜原子取代基的結(jié)合物決定了該化合物在生理學(xué)條件下將是不穩(wěn)定的(例如含有醛或胺鍵的那些)。因此，這樣的化合物不是優(yōu)選的。
本發(fā)明的藥物組合物與上述的單獨的相同劑量的雌激素激動劑/拮抗劑或上述的單獨的刺激骨礦質(zhì)密度增加的試劑相比，可以更迅速且更高幅度地增加骨質(zhì)。因此，這些聯(lián)合藥物具有協(xié)同作用，可以比單獨使用任何一種藥劑更大程度地增加骨質(zhì)和降低骨折率。本發(fā)明通過提供能增加和維持骨質(zhì)的組合物及方法而預(yù)防、抑制和/或消退了骨質(zhì)疏松和相關(guān)的骨疾病從而對該領(lǐng)域作出了顯著的貢獻(xiàn)。
從描述本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中將清楚地看出本發(fā)明的其他特性及優(yōu)點。
發(fā)明詳述本發(fā)明一方面提供了一種藥物組合物，它包含a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是雌激素激動劑/拮抗劑；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是前列腺素或前列腺素激動劑/拮抗劑。
本發(fā)明所述的藥物組合物中還包含藥物載體。
在所述的藥物組合物中，雌激素激動劑/拮抗劑是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬，4-羥基-他莫昔芬，順式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；
(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉。
根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物中，第二種化合物是PGD1，PGD2，PGE2，PGE1，PGF2，PGF2α和3S-(3-羥基-4-苯基-丁基)-2R-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-環(huán)戊酮。
根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物，其中雌激素激動劑/拮抗劑優(yōu)選屈洛昔芬。
根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物，其中第二種化合物優(yōu)選為PGE2。
根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物，其中第二種化合物優(yōu)選為3S-(3-羥基-4-苯基-丁基)-2R-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-環(huán)戊酮。
根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物，其中雌激素激動劑/拮抗劑是順式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉。
在所述的藥物組合物中，第二種化合物是PGE2。
在本發(fā)明所述的藥物組合物，第二種化合物是3S-(3-羥基-4-苯基-丁基)-2R-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-環(huán)戊酮。
本發(fā)明另一方面提供了一種治療哺乳動物低骨質(zhì)癥的方法，包含給予存在低骨質(zhì)癥的哺乳動物a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是雌激素激動劑/拮抗劑；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是前列腺素或前列腺素激動劑/拮抗劑。
根據(jù)本發(fā)明提供的所述方法，其中雌激素激動劑/拮抗劑是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬，4-羥基-他莫昔芬，碘昔芬，星克羅曼，順式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法，其中第二種化合物是PGD1，PGD2，PGE2，PGE1，PGF2，PGF2α和3S-(3-羥基-4-苯基-丁基)-2R-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-環(huán)戊酮。
在本發(fā)明提供的所述的方法中，其中雌激素激動劑/拮抗劑優(yōu)選屈洛昔芬。
在本發(fā)明提供的所述的方法中，其中第二種化合物是PGE2。
在本發(fā)明提供的所述的方法中，其中第二種化合物是3S-(3-羥基-4-苯基-丁基)-2R-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-環(huán)戊酮。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法，其中低骨質(zhì)癥狀是骨質(zhì)疏松。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法，其中雌激素激動劑/拮抗劑是順式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中第二種化合物是PGE2。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中第二種化合物是3S-(3-羥基-4-苯基-丁基)-2R-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-環(huán)戊酮。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中低骨質(zhì)癥狀是骨質(zhì)疏松。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中第一種化合物和第二種化合物是同時給藥的。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中第二種化合物給藥期約3個月到約3年。
根據(jù)本發(fā)明的方法，接著再給予第一種化合物約3個月到約3年，在這約3個月到約3年的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
根據(jù)本發(fā)明的方法，接著再給予第一種化合物約3年以上，在這約3年以上的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中第一種化合物和第二種化合物是同時給藥的。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中第二種化合物給藥期約3個月到約3年。
根據(jù)本發(fā)明的方法，接著再給予第一種化合物約3個月到約3年，在這約3個月到約3年的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
根據(jù)本發(fā)明的方法，接著再給予第一種化合物約3年以上，在這約3年以上的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動物的低骨質(zhì)癥的方法，包含給有低骨質(zhì)癥的哺乳動物用本發(fā)明所述的藥物組合物。
本發(fā)明一方面提供了一種藥物組合物，它包含以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是雌激素激動劑/拮抗劑；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是前列腺素或前列腺素激動劑/拮抗劑其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量如果同時給藥則是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明一方面提供了一種治療哺乳動物的低骨質(zhì)癥狀的方法，包含給予低骨質(zhì)癥狀的哺乳動物以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是雌激素激動劑/拮抗劑；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是前列腺素或前列腺素激動劑/拮抗劑，其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明另一方面提供了一種含有治療低骨質(zhì)癥狀的試劑盒，它包含a.在第一種單位劑型中的治療有效量的雌激素激動劑/拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體；b.在第二種單位劑型中的治療有效量的前列腺素或前列腺素激動劑/拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體；和c.用于包含所述第一種和第二種劑型的容器。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它包含a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677。
在本發(fā)明提供是所述藥物組合物中，還包含藥物載體。
本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動物低骨質(zhì)癥狀的方法，包含給予有低骨質(zhì)癥的哺乳動物a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中的低骨質(zhì)癥是骨質(zhì)疏松。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中第一種化合物和第二種化合物是同時給藥的。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中第二種化合物給藥期約3個月到約3年。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，接著再給予第一種化合物約3個月到約3年，在這約3個月到約3年的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，接著再給予第一種化合物約3年以上，在這約3年以上的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動物的低骨質(zhì)狀的方法，包含給予有低骨質(zhì)癥的哺乳動物本發(fā)明作數(shù)的藥物組合物。
本發(fā)明另外提供了一種藥物組合物，它包含以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677如果同時給藥則其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動物低骨質(zhì)癥的方法，包含給予有低骨質(zhì)癥狀的哺乳動物以下a、b化學(xué)物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677如果同時給藥則其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明另外還提供了一種含有治療低骨質(zhì)癥狀的試劑盒，它包含a.在第一種單位劑型中的治療有效量的屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬和藥學(xué)上可接受的載體；b.在第二種單位劑型中的治療有效量的氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677和藥學(xué)上可接受的載體；和c.用于包含所述第一種和第二種劑型的容器。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它包含a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；和
b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，它還包含藥物載體。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中第二種化合物是氟化鈉。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中第二種化合物是甲狀旁腺激素。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中第二種化合物是生長激素。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中第二種化合物是生長激素促分泌素。
本發(fā)明還提供了一種治療存在低骨質(zhì)狀況的哺乳動物的方法，包含給予存在低骨質(zhì)狀況的哺乳動物a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是順式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中第二種化合物是氟化鈉。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中第二種化合物是甲狀旁腺激素。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中第二種化合物是生長激素。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中第二種化合物是生長激素促分泌素。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中存在低骨質(zhì)的狀況是骨質(zhì)疏松。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中第一種化合物和第二種化合物是同時給藥的。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中第二種化合物給藥期約3個月到約3年。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，接著再給予第一種化合物約3個月到約3年，在這約3個月到約3年的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，接著再給予第一種化合物約3年以上，在這約3年以上的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
本發(fā)明另外還提供了一種治療哺乳動物低骨質(zhì)癥狀的方法，包含給予存在低骨質(zhì)癥的哺乳動物本發(fā)明所述的藥物組合物。
本發(fā)明另一方面還提供了一種藥物組合物，它包含以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素如果同時給藥則其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動物低骨質(zhì)癥狀的方法，包含給予存在低骨質(zhì)癥狀的哺乳動物以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是順式-6-(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
本發(fā)明還提供了一種含有治療低骨質(zhì)癥狀的試劑盒，它包含a.在第一種單位劑型中的治療有效量的順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或
1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和藥學(xué)上可接受的載體；b.在第二種單位劑型中的治療有效量的氟化鈉，甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素和藥學(xué)上可接受的載體；和c.用于包含所述第一種和第二種劑型的容器。
在本發(fā)明提供的藥物組合物中，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
在本發(fā)明所述的方法中，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
在本發(fā)明所提供的試劑盒中，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它包含a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬，和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素，條件是當(dāng)?shù)谝环N化合物是雷洛昔芬時，第二種化合物不是甲狀旁腺激素。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，它還包含藥物載體。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中第一種化合物是雷洛昔芬。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中第二種化合物是甲狀旁腺激素。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中第二種化合物是生長激素。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中第二種化合物是生長激素促分泌素。
本發(fā)明還提供了以下a、b兩種化合物在制備用于治療哺乳動物低骨質(zhì)癥狀的藥物中的用途，a.第一種化合物是雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬，和b.第二種化合物是甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素，條件是當(dāng)?shù)谝环N化合物是雷洛昔芬時，第二種化合物不是甲狀旁腺激素。
根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中第一種化合物是雷洛昔芬。
根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中第二種化合物是甲狀旁腺激素。
根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中第二種化合物是生長激素。
根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中第二種化合物是生長激素促分泌素。
根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中低骨質(zhì)癥是骨質(zhì)疏松。
根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中第一種化合物和第二種化合物是同時給藥的。
根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中第二種化合物給藥持續(xù)約3個月到約3年。
根據(jù)本發(fā)明所述的用途，接著再給予第一種化合物約3個月到約3年，在這約3個月到約3年的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
根據(jù)本發(fā)明所述的用途，接著再給予第一種化合物約3年以上，在這約3年以上的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
本發(fā)明所述的藥物組合物在制備用于治療哺乳動物低骨質(zhì)癥狀的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它包含以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.第一種化合物是雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬，或b.第二種化合物是甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量在同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和；條件是當(dāng)?shù)谝环N化合物是雷洛昔芬時，第二種化合物不是甲狀旁腺激素。
本發(fā)明另外提供了以下a、b兩種化合物在制備用于治療哺乳動物低骨質(zhì)癥的藥物中的用途，a.第一種化合物是雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬，和b.第二種化合物是甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量在同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和；條件是當(dāng)?shù)谝环N化合物是雷洛昔芬時，第二種化合物不是甲狀旁腺激素。
本發(fā)明還提供了一種含有治療低骨質(zhì)癥狀的試劑盒，它包含a.在第一種單位劑型中的治療有效量的雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬和藥學(xué)上可接受的載體；
b.在第二種單位劑型中的治療有效量的甲狀旁腺激素，生長激素或生長激素促分泌素和藥學(xué)上可接受的載體；和c.用于包含所述第一種和第二種劑型的容器；條件是當(dāng)?shù)谝环N化合物是雷洛昔芬時，第二種化合物不是甲狀旁腺激素。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有雌激素激動劑/拮抗劑和生長激素促分泌素。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中生長激素促分泌素是2-氨基-N-[2-(3a-(R)-芐基-2-甲基-3-氧-2，3，3a，4，6，7-六氫-吡唑并[4，3-c]吡啶-5-基)-1-(R)-芐氧甲基-2-氧-乙基]-異丁酰胺或其酒石酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中雌激素激動劑/拮抗劑是雷洛昔芬或其藥學(xué)上可接受的鹽。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中雌激素激動劑/拮抗劑(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇或其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的藥物組合物在制備用于治療低骨質(zhì)癥的藥物中的用途。
本發(fā)明提供藥物組合物用途中的疾病是骨質(zhì)疏松癥。
本發(fā)明的第一種化合物是哺乳動物雌激素激動劑/拮抗劑。任何雌激素激動劑/拮抗劑都可用作本發(fā)明的第一種化合物。術(shù)語雌激素激動劑/拮抗劑是指與雌激素受體結(jié)合、抑制骨轉(zhuǎn)化和阻止骨損失的化合物。這樣的活性可由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照標(biāo)準(zhǔn)測定法包括雌激素受體結(jié)合測定法(參見下文中的體外雌激素受體結(jié)合測定法)、標(biāo)準(zhǔn)骨組織形態(tài)測定法和密度計法(參見下文中的雌激素激動劑/拮抗劑草案，和Eriksen E.F.等人，骨組織形態(tài)測定法，Raven Press，紐約，1994，1-74頁；Grier S.J.等人，雙能X線吸光測定法在動物上的應(yīng)用，放射學(xué)研究，1996，31(1)50-62；Wahner H.W.和Fogeiman I.，骨質(zhì)疏松的評定雙能X線吸光測定法的臨床實踐，MartinDunitz Ltd.，倫敦1994，1-296頁)而容易地測定。下面描述和提及了大量這些化合物，不過，其他雌激素激動劑/拮抗劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是已知的。
優(yōu)選的雌激素激動劑/拮抗劑是屈洛昔芬(酚，3-[1-[4[2-(二甲氨基)乙氧基]苯基]-2-苯基-1-丁烯基]-，(E)-)和相關(guān)的化合物，它們公開在美國專利5,047,431中(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)。
另一種優(yōu)選的雌激素激動劑/拮抗劑是他莫昔芬(乙胺，2-[-4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基，(Z)-2-，2-羥基-1，2，3-三羧酸丙酯(1∶1))和相關(guān)化合物，它們公開在美國專利4,536,516中(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)。另一種相關(guān)的化合物是美國專利4,623,660(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)中公開的4-羥基他莫昔芬。
另一種優(yōu)選的雌激素激動劑/拮抗劑是雷洛昔芬(甲酮，[6-羥基-2-(4-羥基苯基)苯并(b)噻吩-3-基][4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-，鹽酸化物)和相關(guān)化合物，它們公開在美國專利4,418,068中(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)。
另一種優(yōu)選的雌激素激動劑/拮抗劑是托瑞米芬(乙胺，2-[4-(4-氯-1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基，(Z)-，2-羥基-1，2，3-三羧酸丙酯(1∶1))和相關(guān)化合物，它們公開在美國專利4,996,225中(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)。
另一種優(yōu)選的雌激素激動劑/拮抗劑是星克羅曼1-[2-[[4-(-甲氧基-2，2，二甲基-3-苯基-苯并二氫吡喃-4-基)-苯氧基]-乙基]-吡咯烷，和相關(guān)化合物，它們公開在美國專利3,822,287中(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)。
另一種優(yōu)選的雌激素激動劑/拮抗劑是碘昔芬吡咯烷，1-[-[4-[[1-(4-碘苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]乙基]和相關(guān)化合物，它們公開在美國專利4,839,155中(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)。
其他優(yōu)選的雌激素激動劑/拮抗劑包括下式化合物 其中A選自CH2和NR；B，D和E獨立地選自CH和N；
Y是(a)苯基，可被1-3個各自選自R4的取代基取代或不取代；(b)萘基，可被1-3個各自選自R4的取代基取代或不取代；(c)C3-C8環(huán)烷基，可被1-2個各自選自R4的取代基取代或不取代；(d)C3-C8環(huán)烯基，可被1-2個各自選自R4的取代基取代或不取代；(e)五元雜環(huán)，含有不超過選自下列成員的兩個雜原子-O-，-NR2-和-S(O)n-，可被1-3個各自選自R4的取代基取代或不取代；(f)六元雜環(huán)，含有不超過選自下列成員的兩個雜原子-O-，-NR2-和-S(O)n-，可被1-3個各自選自R4的取代基取代或不取代；或(g)雙環(huán)系統(tǒng)，由五或六元雜環(huán)與苯環(huán)稠合組成，所述雜環(huán)含有不超過選自下列成員的兩個雜原子-O-，-NR2-和-S(O)n-，可被1-3個各自選自R4的取代基取代或不取代；Z1是(a)-(CH2)pW(CH2)q-；(b)-O(CH2)pCR5R6-；(c)-O(CH2)pW(CH2)q；(d)-OCHR2CHR3-；或(e)-SCHR2CHR3-；G是(a)-NR7R8； 其中n為0，1或2；m為1，2或3；Z2為-NH-，-O-，-S-，或CH2-；可與一個或兩個苯環(huán)在相鄰碳原子上稠合或不稠合，和可各自被1-3個取代基在碳原子上取代或不取代，和可各自被選自R4的化學(xué)上合適的取代基在氮原子上取代或不取代；或(c)含有5-12個碳原子的雙環(huán)胺，橋連或稠合的，并可被1-3個各自被選自R4的取代基取代或不取代；或者Z1和G結(jié)合可成
W是(a)-CH2-；(b)-CH＝CH-；(c)-O-；(d)-NR2-；(e)-S(O)n-；(f) (g)-CR2(OH)-；(h)-CONR2-；(i)-NR2CO-；(j) 或者(k)-C≡C-；R是氫或C1-C6烷基；R2和R3各自為(a)氫；或(b)C1-C4烷基；R4是(a)氫；(b)鹵素；(c)C1-C6烷基；(d)C1-C4烷氧基；(e)C1-C4酸基；(f)C1-C4烷硫基；(g)C1-C4烷基亞硫?；?h)C1-C4烷基磺?；?br> (i)羥基(C1-C4)烷基；(j)芳基(C1-C4)烷基；(k)-CO2H-；(l)-CH；(m)-CONHOR-；(n)-SO2NHR；(o)-NH2；(p)C1-C4烷基氨基；(q)C1-C4二烷基氨基；(r)-NHSO2R；(s)-NO2；(t)芳基；或(u)-OH；R5和R6各自為C1-C8烷基或一起形成C3-C10碳環(huán)；R7和R8各自為(a)苯基；(b)飽和或不飽和的C3-C10碳環(huán)；(c)含有選自-O-，-N-和-S-的不超過兩個雜原子的C3-C10雜環(huán)；(d)H；(e)C1-C6烷基；或(f)與R5或R6形成3-8元含氮環(huán)；線性的或者成環(huán)的R7和R8可被各自選自C1-C6烷基、鹵素、烷氧基、羥基和羧基的最多三個取代基所取代；由R7和R8形成的環(huán)可以稠合或不稠合到苯環(huán)上；e是0，1或2；m是1，2或3；n是0，1或2；p是0，1，2或3；q是0，1，2或3；及其光學(xué)和幾何異構(gòu)體；和其無毒的藥理學(xué)上可接受的酸加成鹽，N-氧化物，酯和季銨鹽。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物是 其中G為 或 和R4是H，OH，F(xiàn)或Cl；B和E各自選自CH和N。
特別優(yōu)選的化合物是順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；和1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉。
上述本發(fā)明化合物可以利用下面的流程所說明的反應(yīng)而容易地制備。
利用重金屬催化劑在反應(yīng)惰性溶劑中進(jìn)行氫化，可從不飽和的中間體II按常規(guī)制得某些式I化合物
壓力和溫度不是關(guān)鍵性的，氫化作用一般在幾小時內(nèi)，在室溫和20-80psi的氫氣壓力下完成。
將氫化產(chǎn)物分離，如果需要，進(jìn)行純化，用酸性催化劑在反應(yīng)惰性溶劑中在0℃-100℃(根據(jù)所用的酸性催化劑而定)的溫度下使醚基裂開。已發(fā)現(xiàn)在高溫下的溴化氫、在0℃至室溫下的三溴化硼和氯化鋁對該反應(yīng)將是有效的。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法將產(chǎn)物式I分離并純化。
美國專利3,274,213；醫(yī)藥化學(xué)雜志10，78(1967)；醫(yī)藥化學(xué)雜志10，138(1967)；和醫(yī)藥化學(xué)雜志12，881(1969)中描述了式II的中間體，其中A為CH2，B、D和E為CH；這些文獻(xiàn)公開的內(nèi)容結(jié)合在此作為參考。它們也可以利用下述方法制備。
流程1顯示了式I化合物的制備過程，式中e＝1，A＝CH2，Z1＝OCH2CH2，G＝環(huán)烷基胺，B＝CH。利用碳酸鉀作為堿，在極性非質(zhì)子傳遞溶劑如二甲基甲酰胺中，在高的溫度下，用相應(yīng)的N-氯乙胺將4-溴苯酚烷基化制成化合物1-2，其中D和E為CH。優(yōu)選溫度為100℃。利用親核排代反應(yīng)在二溴化物(1-1)上合成化合物1-2其中D或E或二者均為N，在相轉(zhuǎn)移條件下利用羥基乙基環(huán)烷基胺得到溴胺(1-2)。見“合成”77，573(1980)。接著利用正丁基鋰或鎂金屬進(jìn)行鹵素金屬置換，溴胺(1-2)產(chǎn)生相應(yīng)的鋰或鎂試劑，它們在低溫下優(yōu)選在氯化銫存在下(沒有氯化銫該反應(yīng)也可進(jìn)行)與6-甲氧基-1-四氫萘酮反應(yīng)，酸化完成后得到甲醇(1-3)或苯乙烯(1-4)。用溴化劑如過溴化溴化吡啶鎓處理甲醇(1-3)或苯乙烯(1-4)得到溴代苯乙烯(1-5)。芳基或雜芳基氯化鋅或芳基或雜芳基硼酸與溴化物(1-5)在鈀金屬催化劑如如四重三苯基膦鈀(O)存在下反應(yīng)得到二芳基苯乙烯(1-6)。[純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)63，419(1991)和日本化學(xué)會通報61，3008-3010(1988)]。為了制備優(yōu)選的化合物，在該反應(yīng)中使用取代的苯基氯化鋅或取代的苯基硼酸。相應(yīng)的鋰試劑用無水氯化鋅淬冷制備該芳基氯化鋅。芳基硼酸不是商業(yè)上可獲得的，是通過用硼酸三烷基酯，優(yōu)選硼酸三甲酯或硼酸三異丙基酯淬冷相應(yīng)的芳基鋰試劑，接著用無水酸處理可制得。見斯堪的納維亞化學(xué)學(xué)報47，221-230(1993)。商業(yè)上不能獲得的鋰試劑可通過相應(yīng)的溴化物或鹵化物與正丁基或叔丁基鋰進(jìn)行鹵素金屬置換而制得。或者，鋰試劑可利用“有機(jī)反應(yīng)”27卷第1章中描述的雜原子促進(jìn)的鋰化作用制得。1-6在活性炭上的氫氧化鈀存在下的催化氫化，例如，可得到相應(yīng)的二氫甲氧基中間體，然后利用三溴化硼在0℃下在二氯甲烷中或者48％溴化氫在乙酸中在80-100℃下進(jìn)行脫甲基作用得到目標(biāo)結(jié)構(gòu)的化合物(1-7)。這些化合物是外消旋的并可經(jīng)高壓液相色譜利用填充手性固定相的柱子如Chiralcel OD柱而拆分成對映體。另一方面，光學(xué)拆分可利用與光學(xué)純酸形成的非對映體鹽如1，1′-二萘基-2，2′-二基磷酸氫鹽的重結(jié)晶來進(jìn)行。
用堿處理可將順式化合物(1-7)異構(gòu)化為反式化合物。
如流程1所述，當(dāng)D和/或E為氮時，中間體(式II)和式I化合物可從相應(yīng)的二鹵代吡啶或嘧啶制得。
其中e＝1，A＝CH2，Z1＝OCH2CH2，G＝吡咯烷，D，E，B＝CH，Y＝Ph的式I化合物的甲基醚也可利用萘福昔定(Upjohn & Co.，700 Portage Road，Kalamazoo，MI 49001)在反應(yīng)惰性溶劑中在重金屬催化劑存在下的氫化作用的第一步而常規(guī)地制得。壓力和溫度不是關(guān)鍵性的；該反應(yīng)一般在乙醇中在室溫下在50psi下進(jìn)行約20小時。
第二步是甲氧基的裂解，這是在室溫下用酸性催化劑如三溴化硼在反應(yīng)惰性溶劑中，或者在80-100℃下用溴化氫在乙酸中完成的。然后用常規(guī)方法將產(chǎn)物分離，如果需要，則轉(zhuǎn)化為酸式鹽。
流程1
其中B為氮原子的式1化合物是通過流程2和3說明的方法制備的。
流程2顯示了B＝N的式1化合物的合成。芳酰氯(2-1)用伯胺處理得到芳基仲酰胺(2-2)，繼而被溶于醚溶劑的氫化鋰鋁還原得到叔胺(2-3)。隨后(2-3)與芳酰氯進(jìn)行乙酰化反應(yīng)產(chǎn)生叔胺(2-4)，其在熱磷酰氯中環(huán)化產(chǎn)生二氫異喹啉鎓鹽(2-5)。被硼氫化鈉還原為烷氧基四氫異喹啉，接著在二氯甲烷中經(jīng)三溴化硼脫甲基得到預(yù)期結(jié)構(gòu)的化合物。
流程2 流程3也描述了B＝N的式1化合物的合成。仲胺(3-1)與芐氧芳酰氯(3-2)的乙?；玫绞艴０?3-3)，其在熱磷酰氯中環(huán)化產(chǎn)生二氫異喹啉鹽(3-4)。(3-4)經(jīng)硼氫化鈉還原，并經(jīng)含水鹽酸脫芐基得到異喹啉(3-5)。(3-5)與適宜的氯化物官能團(tuán)進(jìn)行烷化反應(yīng)，并經(jīng)三溴化硼脫甲基得到預(yù)期結(jié)構(gòu)的化合物。
流程3
美國專利4,133,814公開了其他雌激素激動劑/拮抗劑(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)。美國專利4,133,814公開了2-苯基-3-芳酰-苯并噻吩和2-苯基-3-芳酰苯并噻吩-1-氧化物的衍生物。
Lednicer等人在醫(yī)藥化學(xué)雜志，12，881(1969)中公開了下述結(jié)構(gòu)的雌激素拮抗劑 其中R2為苯基或環(huán)戊基，R3為H、 或-CH2CHOHCH2OH。
美國專利3,234,090(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了下式所示的雌激素激動劑/拮抗劑 其中Ph為1，2-亞苯基，Ar為被叔氨基低級烷氧基取代的單碳環(huán)芳基，其中叔氨基與氧原子之間至少間隔兩個碳原子，R為氫、脂族基、碳環(huán)芳基、碳環(huán)芳基-脂族基、雜環(huán)芳基或雜環(huán)芳基-脂族基，式-(CnH2n-2)-基團(tuán)代表不分支的具有3至5個碳原子的亞烷基并帶有基團(tuán)Ar和R，其鹽，氮氧化物，氮氧化物鹽或季銨鹽化合物，以及制備這些化合物的方法。
美國專利3,277,106(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有下式結(jié)構(gòu)的具有雌激素激動劑/拮抗劑作用的堿式醚
其中Ph為1，2-亞苯基，Ar為被至少一個氨基-低級烷基-氧基取代的單環(huán)芳基，其中氮原子與氧原子之間至少間隔兩個碳原子，R為芳基，-(CnH2n-2)-片段代表低級亞烷基，它與Ph結(jié)合形成一個六元或七元環(huán)，其中的兩個環(huán)碳原子帶有基團(tuán)Ar和R，其鹽，氮氧化物，氮氧化物鹽和季銨鹽化合物。
美國專利3,274,213(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有下式結(jié)構(gòu)的雌激素激動劑/拮抗劑化合物 其中R1、R2選自低級烷基和相互連接形成五至七元飽和雜環(huán)的低級烷基。
本發(fā)明的第二種化合物可以是以下所述的能將骨質(zhì)濃度增加到骨折閾值以上的任一化合物(見發(fā)表于世界衛(wèi)生組織主辦的《世界衛(wèi)生組織研究》上的世界衛(wèi)生組織研究組的報告“骨折危險的評定及其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥普查中的應(yīng)用(1994)，世界衛(wèi)生組織技術(shù)系列843”)。
任何前列腺素或前列腺素激動劑/拮抗劑均可用作本發(fā)明的第二種化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到還可以使用氟化鈉、甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀旁腺激素的活性片段、生長激素或生長激素促分泌素。下文中將更詳細(xì)地舉例描述本發(fā)明的第二種化合物。
任何前列腺素均可用作本發(fā)明的第二種化合物。前列腺素這一術(shù)語指用于治療骨質(zhì)疏松的天然前列腺素PGD1、PGD2、PGE2、PGE1和PGF2α的類似化合物。這些化合物與前列腺素受體結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按標(biāo)準(zhǔn)測定法(如An S.等人 前列腺素E2人受體EP2亞型的克隆和表達(dá)，生物化學(xué)和生物物理研究通訊，1993，197(1)263-270)容易地測定這種結(jié)合。
前列腺素是與母體化合物前列腺烷酸相關(guān)的脂環(huán)化合物。從羧基碳開始，經(jīng)戊環(huán)至相鄰側(cè)鏈末端碳原子連續(xù)計算前列腺素母體的碳原子數(shù)。通常相鄰側(cè)鏈具有反式結(jié)構(gòu)。在環(huán)戊基部分的C-9有一含氧基團(tuán)，是E型前列腺素的特征，而PGE2在C13-C14具有反式不飽和雙鍵，并在C5-C6具有順式雙鍵。
以下描述并提到了大量前列腺素，而其他一些也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在兩篇美國專利4,171,331和3,927,197(其公開內(nèi)容結(jié)合于此作為參考)中舉例公開了一些前列腺素。
Norrdin等人的體內(nèi)骨骼中前列腺素的作用，前列腺素白細(xì)胞三烯基本的脂肪酸41，139-150，1990，是一篇關(guān)于骨骼中活性前列腺素的綜述。
任何前列腺素激動劑/拮抗劑均可用作本發(fā)明的第二種化合物。術(shù)語前列腺素激動劑/拮抗劑是指這樣的一些化合物，它們與前列腺素受體結(jié)合(如An S.等人，前列腺素E2人受體EP2亞型的克隆和表達(dá)，生物化學(xué)和生物物理研究通訊，1993，197(1)263-270)并具有體內(nèi)前列腺素的類似作用(如刺激骨骼形成和增加骨質(zhì))。這些作用是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按標(biāo)準(zhǔn)測定法(如參照下文中記載的合成代謝劑草案，和Eriksen E.F.等人，骨組織形態(tài)學(xué)測定，Raven Press New York，1994，pages 1-74；Grier S.J.等人.，動物的雙能量X-射線吸光測定法，放射學(xué)研究，1996，31(1)50-62；Wahner H.W.和FogelmanI.，骨質(zhì)疏松的測定雙能量X-射線吸光測定法的臨床實踐.，Martin DunitzLtd.，倫敦1994，1-296頁)容易測定的。以下記載并提出了許多此類化合物，而其他一些前列腺素激動劑/拮抗劑也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。以下記載了前列腺素激動劑/拮抗劑的例子。
共同轉(zhuǎn)讓的(Commonly assigned)美國專利3,932,389(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有骨形成活性的2-脫羧基-2-(四唑-5-基)-11-脫氧-15-取代-ω-戊醇前列腺素。
共同轉(zhuǎn)讓的美國專利4,018,892(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有骨形成活性的16-芳基-13，14-二氫-PEG2對-雙苯基酯。
共同轉(zhuǎn)讓的美國專利4,219,483(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有骨形成活性的2，3，6-取代-4-吡喃酮。
共同轉(zhuǎn)讓的美國專利4,132,847(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有骨形成活性的2，3，6-取代-4-吡喃酮。
美國專利4,000,309(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有骨形成活性的16-芳基-13，14-二氫-PEG2對-雙苯基酯。
美國專利3,982,016(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有骨形成活性的16-芳基-13，14-二氫-PEG2對-雙苯基酯。
美國專利4,621,100(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有骨形成活性的取代環(huán)戊烷。
美國專利5,216,183(其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考)公開了具有骨形成活性的取代環(huán)戊烷。
氟化鈉可用作本發(fā)明的第二種化合物。術(shù)語氟化鈉是指所有形式的氟化鈉(如緩釋氟化鈉，持續(xù)釋放的氟化鈉)。美國專利4,904,478公開了持續(xù)釋放的氟化鈉，其公開內(nèi)容結(jié)合在此作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員按生物學(xué)方法(如參照下文中記載的合成代謝劑草案，和Eriksen E.F.等人，骨組織形態(tài)學(xué)測定法，Raven Press New York，1994，pages 1-74；Grier S.J.等人.，動物的雙能量X-射線吸光測定法，放射學(xué)研究，1996，31(1)50-62；Wahner H.W.和Fogelman I.，骨質(zhì)疏松的測定臨床雙能量X-射線吸光測定法.，MartinDunitz Ltd.，倫敦1994，1-296頁)可容易地測定氟化鈉的活性。
任何甲狀旁腺激素(PTH)均可作為本發(fā)明的第二種化合物。術(shù)語甲狀旁腺激素指可以促進(jìn)骨形成和增加骨質(zhì)的甲狀旁腺激素、甲狀旁腺激素的片段或代謝物，及其結(jié)構(gòu)類似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員按標(biāo)準(zhǔn)測定法(如參照下文中記載的合成代謝劑草案，和Eriksen E.F.等人.，骨組織形態(tài)學(xué)測定法，RavenPress New York，1994，pages 1-74；Grier S.J.等人.，動物的雙能量X-射線吸光測定法，放射學(xué)研究，1996，31(1)50-62；Wahner H.W.和Fogelman I.，骨質(zhì)疏松的測定臨床雙能量X-射線吸光測定法.，Martin Dunitz Ltd.，倫敦1994，1-296頁)可以容易地測定其功能活性。以下記載并提出了大量此類化合物，而其他一些甲狀旁腺激素也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。以下的參考文獻(xiàn)公開了甲狀旁腺激素的例子。
“脊椎骨質(zhì)疏松的人甲狀旁腺肽療法”國際骨質(zhì)疏松雜志(增刊1)199-203。
“與激素替代療法聯(lián)合的骨質(zhì)疏松癥的甲狀旁腺激素1-34治療生物化學(xué)，動力學(xué)和組織應(yīng)答”國際骨質(zhì)疏松雜志1162-170。
任何生長激素或生長激素促分泌素均可作為本發(fā)明的第二種化合物。術(shù)語生長激素促分泌素是指促進(jìn)生長激素釋放或模擬生長激素的作用(如促進(jìn)骨形成以增加骨質(zhì))的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按標(biāo)準(zhǔn)測定法(如下文中描述的)快速地測定這些作用。下述公開的PCT申請WO95/14666、WO95/13069、WO94/19367、WO94/13696、WO95/34311中包括大量此類化合物。其他生長激素或生長激素促分泌素對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將是已知的。
特別優(yōu)選的生長激素促分泌素是N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺酰螺[3H-吲哚-3，4’-哌啶]-1’-基)羰基]-2-(甲氧苯基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677。
其他優(yōu)選的生長激素促分泌素包括2-氨基-N-[2-(3a-(R)-芐基-2-甲基-3-氧-2，3，3a，4，6，7-六氫-吡唑并-[4，3-c]吡啶-5-基)-1-(R)-芐氧甲基-2-氧-乙基]-異丁酰胺或其L-酒石酸鹽。
2-氨基-N-[1-(R)-芐氧基甲基-2[3a-(R)-(4-氟代芐基)-2-甲基-3-氧-2，3，3a，4，6，7-六氫-吡唑并-[4，3-c]吡啶-5-基]-2-氧-乙基]-異丁酰胺，和2-氨基-N-[2-(3a-(R)-芐基-3-氧-2，3，3a，4，6，7-六氫-吡唑并-[4，3-c]吡啶-5-基)-1-(R)-芐氧甲基-2-氧-乙基]-異丁酰胺。
一般說來，本發(fā)明化合物可以通過包括化學(xué)領(lǐng)域已知方法制得，尤其按照在此所述的方法。
一些用于制備本發(fā)明化合物的制備方法需要外界官能度的保護(hù)(如伯胺、仲胺、羧基)。對于這樣的保護(hù)需要根據(jù)外界官能度的性質(zhì)和該制備方法的條件而定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地測定這種保護(hù)是否需要。這些保護(hù)/去保護(hù)方法的應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。對于保護(hù)基及其用途的描述，參見T.W.Greene，有機(jī)合成中的保護(hù)基，John Wiley& Sons，NewYork，1991。本發(fā)明化合物的起始物和試劑是容易得到的，或可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)的有機(jī)合成法合成。如，這里所用的許多化合物涉及天然存在的化合物或從它們衍生而來。這些天然化合物具有很高的科學(xué)價值和經(jīng)濟(jì)價值，因此許多這些化合物可以從商業(yè)上得到或在文獻(xiàn)中有記載，或從其他商業(yè)上可得到的物質(zhì)利用文獻(xiàn)記載的方法容易制得。這樣的化合物包括前列腺素。
本發(fā)明的一些化合物含有不對稱碳原子，因此分為對映體或非對映體。非對映體混合物可以按其物理化學(xué)方面的差異通過已知方法分離成各自的非對映體。例如，通過色譜法和/或分步結(jié)晶。對映體的分離可以通過將該對映異構(gòu)體混合物與適宜的光學(xué)活性化合物(如醇)反應(yīng)使之轉(zhuǎn)化為非對映異構(gòu)體，分離非對映異構(gòu)體，并將各自的非對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化(如水解)成相應(yīng)的純對映異構(gòu)體，由此而分離開。所有這些異構(gòu)體包括非對映異構(gòu)體、對映異構(gòu)體及其混合物都屬于本發(fā)明的一部分。
雖然本發(fā)明的許多化合物在生理條件下不會電離，然而有一些在生理條件下是可以電離的。因此，例如本發(fā)明的一些化合物是酸性的，它們與藥學(xué)上可接受的陽離子形成鹽。所有這樣的鹽都屬于本發(fā)明的范圍，它們可用常規(guī)方法制備。如，可以將酸、堿物質(zhì)按化學(xué)計量配比簡單地混合而制備，可以在水、非水介質(zhì)中或部分含水的介質(zhì)中制備。所得的鹽的回收或者可以經(jīng)過濾、用非溶劑沉淀、再過濾、蒸發(fā)除去溶劑，或者在水溶液中冷凍干燥而分離。
另外，本發(fā)明的一些化合物是堿性的，它們可以與藥學(xué)上可接受的陰離子形成鹽。所有這些鹽均在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以通過常規(guī)方法分離。如，可以將酸、堿物質(zhì)按化學(xué)計量配比簡單地混合而制備，可以在水中、非水介質(zhì)中或部分含水的介質(zhì)中制備。所得的鹽的回收或者可以經(jīng)過濾、用非溶劑沉淀、再過濾、蒸發(fā)除去溶劑、或在水溶液中冷凍干燥而分離。
另外，當(dāng)本發(fā)明的化合物形成水合物或溶劑化物時，仍屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的藥物組合物和方法均可作為治療劑用于激活哺乳動物尤其是人的骨質(zhì)更新、阻止骨吸收、或促進(jìn)骨形成。由于這些功能與骨質(zhì)疏松及和骨有關(guān)的疾病的發(fā)展密切相關(guān)，因此這些組合物憑其對骨的這種作用可防止、抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松。
本發(fā)明化合物作為醫(yī)藥在治療哺乳動物(如人，尤其是婦女)低骨質(zhì)(如骨質(zhì)疏松)疾病方面的實用性，已在以下所述的常規(guī)測定和體外、體內(nèi)測定(化合和連續(xù)處理方案；雌激素激動劑/拮抗劑方案；合成代謝劑劑方案；體外雌激素受體結(jié)合測定；和生長激素/生長激素促分泌素方案)的活性得到證實。這些檢驗方法也提供了一種方法用以進(jìn)行本發(fā)明化合物之間的活性及與其他已知化合物活性的比較。這些比較結(jié)果用于確定治療這些疾病時哺乳動物，包括人的使用劑量濃度。
聯(lián)合和相繼治療方案本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對下述方案進(jìn)行改動。如，可以使用完整的雄性或雌性大鼠，性激素缺乏雄性(去睪丸)或雌性(去卵巢)大鼠。另外，在本研究中可以使用不同年齡的雄性或雌性大鼠(如12月齡)。既可以是完整大鼠，也可以是去生殖腺大鼠(去除睪丸或卵巢)，在一定期間內(nèi)(如兩周至兩個月)給予不同劑量(如1、3或6mg/kg/天)的合成代謝劑如前列腺素E2，然后在一定期間內(nèi)(如兩周至兩個月)給予不同劑量(如1、5、10mg/kg/天)的抗吸收劑如屈洛昔芬，或在一定期間內(nèi)(如兩周至兩個月)用不同劑量的合成代謝劑和抗吸收劑聯(lián)合治療。對于去生殖腺大鼠，可以在手術(shù)后次日開始治療(為防止骨損失的目的)或在已發(fā)生骨損失后進(jìn)行治療(為恢復(fù)骨質(zhì)的目的)。
以下方案使用PGE2作為骨合成代謝劑，屈洛昔芬作為抗吸收劑，不過在本方案中也可以使用其他合成代謝劑和抗吸收劑。
104只12月齡的Sprague-Dawiey雌性大鼠(Charles River，Wilmington，MA)在0月進(jìn)行假性手術(shù)或卵巢切除術(shù)(OVX)。術(shù)后3個月，OVX大鼠接受已知的骨合成代謝劑PGE2，劑量為3mg/kg/天(皮下注射)，或者3mg/kg/天PGE2(皮下注射)與10mg/kg/天(口服)的屈洛昔芬(DRO)聯(lián)合給藥兩個月。隨后停止PGE2治療，這些大鼠用屈洛昔芬(10mg/kg/天，口服)或賦形劑(10％醇的鹽水溶液)按下述方案繼續(xù)治療1.5月。
組I8只大鼠在0月時剖檢作為基準(zhǔn)對照，組II8只假性手術(shù)大鼠在3個月時剖檢作為治療前對照組III8只假性手術(shù)大鼠在3-5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在5個月時剖檢，組IV8只假性手術(shù)大鼠在3-6.5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在6.5個月時剖檢，組V8只OVX大鼠在3個月時剖檢作為治療前對照，組VI8只OVX大鼠在3-5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在5個月時剖檢，組VII8只OVX大鼠在3-6.5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在6.5個月時剖檢，組VIII8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，在5個月時剖檢，組IX8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，在5-6.5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在6.5個月時剖檢，
組X8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，在5-6.5個月口服屈洛昔芬(DRO)10mg/kg/天，在6.5個月時剖檢，組XI8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，并口服屈洛昔芬(DRO)10mg/kg/天，在5個月時剖檢，組XII8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，并口服屈洛昔芬(DRO)10mg/kg/天，在5-6.5個月口服賦形劑，在6.5個月時剖檢，組XIII從第3個月到第5個月，給八只OVX大鼠皮下注射3mg/kg/天的PGE2并口服10mg/kg/天的DRO，從第5個月到第6.5個月，單獨使用DRO，然后在第6.5個月進(jìn)行剖檢。
無論PGE2(Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI)還是屈洛昔芬(PfizerInc.Groton，CT)粉末都首先溶解在100％乙醇中，進(jìn)而用鹽水稀釋到所需濃度(乙醇終濃度為10％)。PGE溶液每日在背部皮下注射1ml/kg，屈洛昔芬溶液每日口服1ml/只(鼠)。在處死前12天和2天時給所有的鼠皮下注射10mg/kg的鈣黃綠素(熒光骨標(biāo)記物，Sigma Chemical Co.St.Louis MO)，以檢測骨組織的動態(tài)學(xué)變化。
這些鼠在氯胺酮麻醉下處死，測定以下終點數(shù)據(jù)股骨礦物測定在尸解時取出每只鼠的右股骨并用裝備有“局部高分辨率掃描”軟件(Hologic Inc.，Whltham，MA)的雙能量X-射線吸光測定儀(DXA，QDR 1000/W，Hologic Inc.，Whltham，MA)進(jìn)行掃描。掃描面積為5.08×1.902cm，分辨率為0.0254×0.0127cm，掃描速度為7.25mm/秒。分析股骨掃描圖象，測定整個股骨(WF)的骨面積、骨礦物含量(BMC)和骨礦物密度(BMD)、末梢股骨干骺端(DFM)、股骨體(FS)和近端股骨(PF)。
腰椎骨礦物測定用裝有“局部高分辨率掃描”軟件(Hologic Inc.，Whltham，MA)的雙能量X-射線吸光測定法(DXA，QDR 1000/W，Hologic Inc.，Whltham，MA)測定麻醉鼠的整個腰部脊柱和六根腰椎骨(LV1-6)中每一根的骨面積、骨礦物含量(BMC)和骨礦物密度(BMD)。(腹腔)注射1ml/kg氯胺酮/甲苯噻嗪(比率為4∶3)的混合液將鼠麻醉，然后將其放在實驗臺上。掃描面積是6×1.9cm，分辨率為0.0254×0.0127cm，掃描速率為7.25mm/秒。得到了整個腰部脊柱的圖象并加以分析。測定整個腰部脊柱和六根腰椎骨(LV1-6)中每一根的骨面積(BA)、骨礦物含量(BMC)并計算出骨礦物密度(BMC除以BA)。
近端脛骨干骺端網(wǎng)狀骨質(zhì)骨的組織形態(tài)學(xué)分析在尸體解剖時取出右脛骨，分離肌肉并切成3部分。將近端脛骨置于70％乙醇中，在梯度濃度的乙醇中脫水，在丙酮中脫脂，然后嵌入甲基丙烯酸甲酯(Eastman OrganicChemicals，Rochester，NY)。用Reichert-Jung Polycut S切片機(jī)切下厚度為4和10μm的近端脛骨干骺端的前部分。用每只鼠的一個4μm和一個10μm的切片進(jìn)行網(wǎng)狀骨質(zhì)骨的組織形態(tài)學(xué)分析。4μm的切片被改進(jìn)的Masson‘s Trichrome染劑染色，而10μm的切片未染色。
利用生物定量OS/2組織形態(tài)學(xué)測定系統(tǒng)(R&Mbiometrics，Inc，Nashville，TN)進(jìn)行生長板-骨骺接合處遠(yuǎn)端1.2-3.6mm間的近端脛骨干骺端的次生松質(zhì)的靜態(tài)和動態(tài)學(xué)組織形態(tài)測定。脛骨干骺端區(qū)的前1.2mm需要去除以限定測量在次生松質(zhì)中進(jìn)行。利用4μm切片測定與骨骼體積、骨結(jié)構(gòu)和骨吸收有關(guān)的指數(shù)，而10μm的切片用于測定與骨形成和骨更新有關(guān)的指數(shù)。
I.與小梁骨體積和結(jié)構(gòu)有關(guān)的測量和計算1.干骺端總面積(TV，mm2)生長點-骨骺接合處遠(yuǎn)端1.2-3.6mm間的干骺端面積。
2.小梁骨面積(BV，mm2)TV中小梁總面積。
3.小梁骨周長(BS，mm)小梁總周長的長度。
4.小梁骨體積(BV/TV，％)BV/TV×1005.小梁骨數(shù)(TBN，#/mm)1.199/2×BS/TV6.小梁骨厚度(TBT，μm)(2000/1.199)×(BV/BS)7.小梁骨分離度(TBS，μm)(2000/1.199)×(TV-BV)II.骨吸收的測量和計算1.破骨細(xì)胞數(shù)(OCN，#)總干骺端面積內(nèi)的破骨細(xì)胞總數(shù)。
2.破骨細(xì)胞周長(OCP，mm)被破骨細(xì)胞覆蓋的小梁骨周長的長度。
3.破骨細(xì)胞數(shù)/mm(OCN/mm，#/mm)OCN/BS。
4.破骨細(xì)胞周長百分?jǐn)?shù)(％OCP，％)OCP/BS×100。
III.骨形成和骨更新的測量和計算1.單鈣黃綠素標(biāo)記的周長(SLS，mm)以一個鈣黃綠素標(biāo)記物標(biāo)記的骨小梁周長的總長度。
2.雙鈣黃綠素標(biāo)記的周長(DLS，mm)以兩個鈣黃綠素標(biāo)記物標(biāo)記的骨小梁周長的總長度。
3.內(nèi)標(biāo)寬度(ILW，μm)兩個鈣黃綠素標(biāo)記物之間的平均距離。
4.礦化周長百分率(PMS，％)(SLS/2+DLS)/BS×1005.礦物聚集率(MAR，μm/day)ILW/標(biāo)記物間隔6.骨形成率/重新形成的骨表面(BFR/BS，μm2/d/μm)(SLS/2+DLS)×MAR/BS7.骨更新率(BTR，％/y)(SLS/2+DLS)×MAR/BV×100統(tǒng)計學(xué)處理可以使用統(tǒng)計檢驗4.0方案(Stat View4.0 package)(曲線原理，Int.，Berkeley，CA)進(jìn)行統(tǒng)計計算?？梢圆捎梅讲罘治?ANOVA)及Fisher'sPLSD進(jìn)行組間差異的比較。
雌激素激動劑/拮抗劑方案雌激素激動劑/拮抗劑是一組抑制骨更新并防止雌激素缺乏引起的骨損失的化合物。去卵巢大鼠骨損失模型已經(jīng)廣泛用作為絕經(jīng)后骨損失模型。使用這種模型，可以測試雌激素激動劑/拮抗劑化合物在防止骨損失和促進(jìn)骨吸收方面的功效。
在研究中使用不同齡的(如5月齡)Sprague-Dawley雌性大鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)。在實驗過程中大鼠分別置于20cm×32cm×20cm鼠籠中。所有大鼠可自由進(jìn)食水和含有0.97％Ca、0.85％P和1.05IU/g維生素D3的商品飼料丸(Agway Prolab 3000，Agway County Food，Int.，Syracuse，NY)。
一組大鼠(8-10)進(jìn)行假手術(shù)，并口服賦形劑(10％乙醇和90％鹽水，1ml/天)，其他大鼠切除雙側(cè)卵巢(OVX)，并給予賦形劑(口服)，17β-雌二醇(Sigma，E-8876，E2，30μg/kg，每日皮下注射)，或雌激素激動劑/拮抗劑(如屈洛昔芬，5、10或20mg/kg，每日口服)一定時間(如4周)。所有大鼠在處死前12天和2天皮下注射10mg/kg鈣黃綠素(熒光骨標(biāo)記物)以測定骨組織中的動態(tài)變化。治療4周后，尸解大鼠。測定以下終點值體重增加尸解時體重減去手術(shù)時體重。
子宮重量和組織形態(tài)尸解時摘除大鼠子宮，立即稱重。隨后對子宮進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)測定，如子宮橫切面組織面積、子宮基質(zhì)厚度、子宮腔上皮厚度。
總血清膽甾醇心臟穿刺得到血液并使之在4℃凝固，在2000g條件下離心10分鐘。采用高效膽甾醇熱量計測定法(Boehringer Mannheim生物化學(xué)，Indianapolis，IN.)分析血清樣品中的總血清膽固醇。
股骨中礦物質(zhì)測定在尸解時取下每只大鼠的右股骨，采用安裝有“局部高清晰度掃描”軟件(Hologic Inc.，Waltham，MA)的雙能量X-射線吸光測定法(DEXA，QDR1000/W，Hologic Inc.，Waltham，MA)掃描。掃描面積為5.08×1.902cm，分辨率為0.0254×0.0127cm，掃描速度為7.25mm/秒。分析股骨掃描影像，測定整個股骨的骨面積、骨礦物質(zhì)含量、骨礦物質(zhì)密度、遠(yuǎn)端骨干骺端、股骨體、和近端股骨。
近端脛骨干骺端網(wǎng)狀骨質(zhì)的骨組織形態(tài)測定尸解時取下每只大鼠的右脛骨，除去肌肉，切成3段。近端脛骨在70％乙醇中固定，在梯度濃度的乙醇中脫水，在丙酮中脫脂，在甲基丙烯酸甲酯中包埋(Eastman有機(jī)化學(xué)，Rochester，NY)。使用Reichert Jung Polycut組織切片術(shù)切取近端脛骨干骺端的前部4和10μm厚度的部分。每只大鼠4μm和10μm的切片用于網(wǎng)狀骨質(zhì)的骨組織形態(tài)測定。4μm的切片用改良的Masson's Trichrome染色法染色，10μm的部分不染色。
生物定量的OS/2組織形態(tài)測定系統(tǒng)(R & Mbiometrics，Inc.，Nashville，TN)用于近端脛骨干骺端1.2和3.6mm遠(yuǎn)端至生長點-骨骺接合處的次生骨松質(zhì)的組織形態(tài)測定。忽略脛骨干骺端的前1.2mm以將測定范圍限定在次生骨松質(zhì)處。4μm切片用于測定骨體積、骨結(jié)構(gòu)、骨吸收，10μm切片用于測定骨形成和骨更新。
I.骨小梁體積和結(jié)構(gòu)的測定和計算1.干骺端的總面積(TV，mm2)生長點-骨骺接合處遠(yuǎn)端1.2和3.6mm之間的干骺端面積2.小梁骨面積(BV，mm2)TV中骨小梁的總面積3.小梁骨周長(BS，mm)骨小梁的總周長4.小梁骨體積(BV/TV，％)BV/TV×1005.小梁骨數(shù)(TBN，#/mm)1.199/2×BS/TV6.小梁骨厚度(TBT，μm)(2000/1.199)×(BV/BS)7.小梁骨分離度(TBS，μm)(2000×1.199)×(TV-BV)II.骨吸收的測定和計算
1.破骨細(xì)胞數(shù)(OCN，#)干骺端總面積中破骨細(xì)胞總數(shù)2.破骨細(xì)胞周長(OCP，mm)被破骨細(xì)胞覆蓋的骨小梁周長的長度3.破骨細(xì)胞數(shù)/mm(OCN/mm，#/mm)OCN/BS4.破骨細(xì)胞周長百分比(％OCP，％)OCP/BS×100III.骨形成和骨更新的測定和計算1.單鈣黃綠素標(biāo)記的周長(SLS，mm)以一個鈣黃綠素標(biāo)記物標(biāo)記的骨小梁周長的總長度。
2.雙鈣黃綠素標(biāo)記的周長(DLS，mm)以兩個鈣黃綠素標(biāo)記物標(biāo)記的骨小梁周長的總長度。
3.內(nèi)標(biāo)寬度(ILW，μm)兩個鈣黃綠素標(biāo)記物之間的距離。
4.礦化周長百分率(PMS，％)(SLS/2+DLS)/BS×1005.礦化聚集率(MAR，μm/day)ILW/標(biāo)記物間隔6.骨形成率/重新形成的骨表面(BFR/BS，μm2/d/μm)(SLS/2+DLS)×MAR/BS7.骨更新率(BTR，％/y)(SLS/2+DLS)×MAR/BV×100統(tǒng)計學(xué)處理可以使用統(tǒng)計檢驗4.0方案(Stat View4.0 package)(曲線原理，Int.，Berkeley，CA)進(jìn)行統(tǒng)計計算。可以采用方差分析(ANOVA)及Fisher'sPLSD進(jìn)行組間差異的比較。
合成代謝劑方案骨合成代謝劑在促進(jìn)骨形成和增加骨質(zhì)方面的活性可以用完整的雄性或雌性大鼠、性激素缺乏雄性大鼠(去睪丸)或性激素缺乏雌性大鼠(去卵巢)進(jìn)行測試。
在研究中使用不同年齡的(如3月齡)雄性或雌性大鼠?？梢允峭暾笫蠡蛉ド诚俅笫?切除睪丸或卵巢)。皮下注射或口服不同劑量的(1、3、6mg/kg/天)如前列腺素E2(PGE2)等合成代謝劑一定時間(如2周至兩個月)。去生殖腺大鼠在術(shù)后第二天開始治療(為防止骨損失的目的)或在已發(fā)生骨損失后(為恢復(fù)骨質(zhì)的目的)進(jìn)行治療。實驗過程中所有大鼠可自由進(jìn)食水和含有1.46％Ca、0.99％P和4.96IU/g維生素D3的商品飼料丸(Teklad RodentDiet 8064，Harlan Teklad，Madison，WI)。所有大鼠在處死前12天和2天時皮下注射10mg/kg鈣黃綠素(熒光骨標(biāo)記物)。
處死大鼠。測定以下結(jié)果股骨中礦物質(zhì)測定在尸解時取下每只大鼠的右股骨，采用安裝有“局部高清晰度掃描”軟件(Hologic Inc.，Waltham，MA)的雙能量X-射線吸光測定法(DEXA，QDR1000/W，Hologic Inc.，Waltham，MA)掃描。掃描面積為5.08×1.902cm，分辨率為0.0254×0.0127cm，掃描速度為7.25mm/秒。分析股骨掃描影像，測定整個股骨的骨面積、骨礦物質(zhì)含量(BMC)、骨礦物質(zhì)密度(BMD)、遠(yuǎn)端股骨干骺端(DFM)，股骨體(FS)、和近端股骨(PF)。
近端脛骨干骺端網(wǎng)狀骨質(zhì)的骨組織形態(tài)測定尸解時取下每只大鼠的右脛骨，除去肌肉，切成3段。近端脛骨在70％乙醇中固定，在梯度濃度的乙醇中脫水，在丙酮中脫脂，在甲基丙烯酸甲酯中包埋(Eastman有機(jī)化學(xué)，Rochester，NY)。使用Reichert Jung Polycut組織切片術(shù)切取近端脛骨干骺端的前部4和10μm厚度的部分。每只大鼠4μm和10μm的切片用于網(wǎng)狀骨質(zhì)的骨組織形態(tài)測定。4μm的切片用改良的Masson's Trichrome染色法染色，10μm的切片不染色。
生物定量OS/2組織形態(tài)測定系統(tǒng)(T&M biometrics，Inc.，Nashville，TN)用于近端脛骨干骺端1.2和3.6mm遠(yuǎn)端至生長點-骨骺接合處的次生骨松質(zhì)的組織形態(tài)測定。忽略脛骨干骺端的前1.2mm以將測定范圍限定在次生骨松質(zhì)處。4μm切片用于測定骨體積、骨結(jié)構(gòu)、骨吸收，10μm切片用于測定骨形成和骨更新。
I.骨小梁體積和結(jié)構(gòu)的測定和計算1.干骺端的總面積(TV，mm2)生長點-骨骺接合處遠(yuǎn)端1.2和3.6mm之間的干骺端面積2.小梁骨面積(BV，mm2)TV中骨小梁的總面積3.小梁骨周長(BS，mm)骨小梁的總周長4.小梁骨體積(BV/TV，％)BV/TV×1005.小梁骨數(shù)(TBN，#/mm)1.199/2×BS/TV6.小梁骨厚度(TBT，μm)(2000/1.199)×(BV/BS)7.小梁骨分離度(TBS，μm)(2000×1.199)×(TV-BV)II.骨吸收的測定和計算1.破骨細(xì)胞數(shù)(OCN，#)干骺端總面積中破骨細(xì)胞總數(shù)
2.破骨細(xì)胞周長(OCP，mm)被破骨細(xì)胞覆蓋的骨小梁周長的長度3.破骨細(xì)胞數(shù)/mm(OCN/mm，#/mm)OCN/BS4.破骨細(xì)胞周長百分比(％OCP，％)OCP/BS×100III.骨形成和骨更新的測定和計算1.單鈣黃綠素標(biāo)記的周長(SLS，mm)以一個鈣黃綠素標(biāo)記物標(biāo)記的骨小梁周長的總長度。
2.雙鈣黃綠素標(biāo)記的周長(DLS，mm)以兩個鈣黃綠素標(biāo)記物標(biāo)記的骨小梁周長的總長度。
3.內(nèi)標(biāo)寬度(ILW，μm)兩個鈣黃綠素標(biāo)記物之間的距離。
4.礦化周長百分率(PMS，％)(SLS/2+DLS)/BS×1005.礦物聚集率(MAR，μm/day)ILW/標(biāo)記物間隔6.骨形成率/重新形成的骨表面(BFR/BS，μm2/d/μm)(SLS/2+DLS)×MAR/BS7.骨更新率(BTR，％/y)(SLS/2+DLS)×MAR/BV×100統(tǒng)計學(xué)處理可以使用統(tǒng)計檢驗4.0方案(StatView4.0 package)(曲線原理，Int.，Berkeley，CA)進(jìn)行統(tǒng)計計算?？梢圆捎梅讲罘治?ANOVA)及Fisher'sPLSD進(jìn)行組間差異的比較。
體外雌激素受體結(jié)合測定體外雌激素受體結(jié)合測定，是測定本發(fā)明的雌激素激動劑/拮抗劑化合物從由酵母重組細(xì)胞法得到的人雌二醇受體取代[3H]-雌二醇的能力，用于測定本發(fā)明的化合物與雌激素受體的結(jié)合親和力。用于此測定的物質(zhì)為(1)測定緩沖液，TD-0.3(含有10Mn Tris，pH7.6，0.3M氯化鉀和5mM二硫蘇糖醇(DTT)(Sigma Co.)，pH7.6)，(2)所用的放射配體為從New England Nuclear得到的[3H]-雌二醇；(3)所用的冷配體為從Sigma得到的雌二醇；(4)重組人雌二醇受體，hER。
測試化合物的溶液的制備在TD-0.3中加入4％DMSO和16％乙醇。將氚化雌二醇溶于TD-0.3，使測定中終濃度為5nM。以TD-0.3稀釋hER，使每個測定槽中還含有4-10μg總蛋白。使用微量滴定盤，每個培養(yǎng)槽有50ul冷雌二醇(非特異結(jié)合)或化合物溶液，20ul氚化雌二醇和30ulhER溶液。每盤含有一式三份的總結(jié)合和不同濃度的化合物。這些盤在4℃培養(yǎng)過夜。然后加入在10mM tris，pH7.6中的100mL3％氫氧化磷灰石并混合以終止結(jié)合反應(yīng)，在4℃孵化15分鐘。該混合物離心，顆粒用10mM Tris，pH7.6中的1％Tritonx100洗滌4次。將氫氧化磷灰石顆粒懸浮于Ecoscint A中，用β-閃爍法測定放射活性。測定所有一式三份數(shù)據(jù)點的均值(每分鐘計數(shù)，cpm’s)。從總結(jié)合cpm’s(定義為反應(yīng)混合物分離后僅含有重組受體、放射配體的剩余數(shù))減去非特異結(jié)合cpm’s(定義為反應(yīng)混合物分離后含有重組受體，放射配體和過量的未標(biāo)記配體的剩余數(shù))計算出特異性結(jié)合。利用IC50測定(抑制50％總特異氚化雌二醇結(jié)合所需的化合物濃度)來測定化合物效價。測定不同濃度化合物的特異結(jié)合，并計算總特異放射配體偶合的特異結(jié)合百分?jǐn)?shù)。將數(shù)據(jù)作圖，成為化合物抑制百分率(線性比例)與化合物濃度(log比例)的函數(shù)。
生長激素素/生長激素促分泌素方案用下述方案鑒定能夠刺激大鼠垂體的培養(yǎng)細(xì)胞分泌GH的化合物。此實驗也用于與標(biāo)準(zhǔn)物對比以確定劑量水平。從6周大的雄性大鼠的垂體分離細(xì)胞。斷頭后，分離垂體前葉置于冷的、無菌的、不含鈣或鎂的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)中。將組織精細(xì)研碎，將其加入到使用10U/mL溶于HBSS液的生物蛋白酶(EC3.4.24.4，Sigma P-6141)的兩個機(jī)械助動酶促分散循環(huán)中。組織-酶混合物在旋轉(zhuǎn)燒瓶中在5％CO2分壓條件下，在約37℃以30rpm轉(zhuǎn)速攪拌約30分鐘，在約15分鐘和約30分鐘后使用一支10mL移液管手動研磨。此混合物在200×g離心5分鐘。在上清液中加入馬血清以中和過量的蛋白酶。將顆粒重新懸浮在新鮮蛋白酶中，在前述條件下攪拌30分鐘以上，然后手動研磨，最后使之通過一23-計量針。再次加入馬血清，將從兩次消化物得到的細(xì)胞合并，顆?；?200×g約5分鐘)，清洗，重新懸浮在培養(yǎng)基中并計數(shù)。將細(xì)胞在48-孔Costar平皿中以每平方厘米6.0-6.5×104個細(xì)胞排列，補(bǔ)充4.5g/L葡萄糖、10％馬血清、2.5％胎牛血清、1％非必需氨基酸、100U/mL制霉菌素和50mg/mL硫酸慶大霉素，在dulbecco’s改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)中培養(yǎng)3至4天，然后測定GH分泌。
測定之前，沖洗培養(yǎng)槽兩次，然后在釋放培養(yǎng)基(用25mMHepes緩沖的D-MEM，pH7.4含有37℃的0.5％牛血清白蛋白)中平衡30分鐘。將受試化合物溶于DMSO，然后稀釋到預(yù)熱的釋放培養(yǎng)基中。每個試樣測定4份。在每個培養(yǎng)槽中加入0.5ml釋放培養(yǎng)基(有賦形劑或受試化合物)開始測定。在37℃培養(yǎng)15分鐘，然后除去培養(yǎng)培養(yǎng)基以終止此過程，在2000×g離心約15分鐘除去微孔材料。以采用大鼠生長激素參比制劑(NIDDK-rGH-RP-2)和從Dr.A.Parlow(Harbor-UCLA Medical Center，Torrence，CA)得到的猴中培養(yǎng)(NIDDK-anti-rGH-S-5)的大鼠生長激素抗血清的標(biāo)準(zhǔn)放射免疫測定法測定上清液中的大鼠生長激素濃度。用氯胺T法將另外的生長激素1.5U/mg，#G2414，Scripps Labs，San Diego，CA)碘化，使之產(chǎn)生大約30μCi/μg的特異活性作為示蹤物。在猴IgG(Organon Teknika，Durham，NC)中加入山羊抗血清，并加入聚乙二醇MW10,000-20,000至終濃度為4.3％，得到免疫復(fù)合物，離心回收。此測定法的操作范圍為在基準(zhǔn)之上每管0.08-2.5μg大鼠生長激素?；钚曰衔镆愿哂?.4倍的能力特異地刺激生長激素釋放。參考文獻(xiàn)Cheng，K.，Chan，W.-S.，Barreto，jr.，a.，convey，e.m.，Smith，R.G.1989。
大鼠靜脈注射測試化合物后外源性刺激生長激素釋放的測定在進(jìn)行化合物測試之前約1周讓21日齡的Sprague-Dawley雌性大鼠(Charles River Laboratory，Wilmington，MA)逐步適應(yīng)局部自然棲息的飼養(yǎng)條件(24℃，12小時光，12小時黑暗循環(huán))。所有的大鼠都可隨意地飲用水和商品食物丸(Agway Country Food，Syracuse NY)。
實驗當(dāng)天，將測試化合物溶于含有1％乙醇，1mM乙酸和0.1％牛血清白蛋白的鹽水液的賦型劑中。每種化合物測試時n＝3。將大鼠稱重并經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(戊巴比妥，50mg/kg體重)進(jìn)行麻醉。麻醉后第14分鐘從尾尖切口采集血樣并使血液滴入微量離心管中(基準(zhǔn)血樣，約100μl)。麻醉后第15分鐘，通過靜脈注射將測試化合物釋放到尾靜脈中，總注射量為1ml/kg體重。另外在化合物給藥后第5，10和15分鐘時從尾部采集血樣。血樣保存在冰上直到通過離心(1430×g，10分鐘，在10℃下)進(jìn)行血清分離。該血清儲存于-80℃下直到利用上述和下述的放射免疫測定法進(jìn)行血清生長激素測定。
狗口服給藥后外源性刺激生長激素釋放的評定實驗當(dāng)天，稱取合適劑量的測試化合物并將其溶于水中。在每種給藥方案情況下，通過管飼法給4只狗0.5ml/kg量的測試化合物。給藥后第0.08，0.17，0.25，0.5，0.75，1，2，4，6和8小時，利用2ml含有肝素鋰的采樣器(vacutainer)通過直接靜脈穿刺預(yù)劑量從頸靜脈采集血樣(2ml)。制得的血漿儲存于-20℃下直到進(jìn)行分析測定。
犬生長激素的測定利用從Dr.A.Parlow(Harbor-UCLA Medical Center，Torrence，CA)得到的犬生長激素(用于碘化作用的抗原和參考制劑AFP-1983B)和在猴子中培養(yǎng)的犬生長激素抗血清(AFP-21452578)通過標(biāo)準(zhǔn)放射免疫測定方案來測定犬生長激素的濃度。將犬生長激素進(jìn)行氯胺T碘化到特定活性20-40μCi/μg而制備示蹤物。將山羊抗血清加入到加有聚乙二醇，MW10,000-20,000的猴IgG(Organon Teknika，Durham，NC)中到終濃度為4.3％而得到免疫復(fù)合物；通過離心完成回收。該測定的操作范圍是0.08-2.5μg犬GH/管。
本發(fā)明化合物可以經(jīng)將本發(fā)明化合物系統(tǒng)性和/或局部釋放的任何方法給藥。這些方法包括口服途徑，胃腸外，十二指腸內(nèi)途徑等。一般來說，本發(fā)明化合物是口服給藥，不過，例如當(dāng)口服給藥對直接目標(biāo)是不合適的或者當(dāng)患者不能消化藥物時，也可通過胃腸外給藥(例如靜脈，肌內(nèi)，皮下或髓內(nèi))。本發(fā)明的兩種不同的化合物可以同時給藥或者以任何順序連續(xù)給藥，或者用包含在藥學(xué)上可接受的載體中的上述第一種化合物和上述第二種化合物的單一藥物組合物給藥。
例如，骨合成代謝劑可以單獨使用或與抗吸收劑結(jié)合使用3個月到3年，之后單獨使用抗吸收劑3個月到3年，任意地重復(fù)整個治療周期。另一方面，例如，骨合成代謝劑可以單獨使用或與抗吸收劑結(jié)合使用3個月到3年，之后在患者的剩余生命期間單獨使用抗吸收劑。例如，在優(yōu)選的一個給藥方式中，可以每天給予一次上述的第二種化合物(例如PGE2)，上述第一種化合物(例如雌激素激動劑/拮抗劑)可以單劑量或多劑量每日給藥。另外，例如，在另一個優(yōu)選的給藥方式中，兩種化合物可以順序給藥，其中上述第二種化合物(例如PGE2)可以每日給藥一次，持續(xù)足以將骨質(zhì)濃度增加到骨折閾以上的時間(世界衛(wèi)生組織研究“骨折危險的評定及其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥普查中的應(yīng)用(1994)。世界衛(wèi)生組織研究組報告。世界衛(wèi)生組織技術(shù)系列843”)，接著再以單劑量或多劑量每日給予上述的第一種化合物(例如雌激素激動劑/拮抗劑)。優(yōu)選上述第二種化合物(例如PGE2)以迅速釋放方式如口服每日給藥一次(例如，優(yōu)選避免使用持續(xù)釋放方式)。
當(dāng)然，在任何情況下給藥化合物的量和時間將根據(jù)所治療的主體，疾病的嚴(yán)重程度，給藥方式和處方醫(yī)師的判斷來確定。因此，由于患者與患者間的變異性，下面所給出的劑量是一個準(zhǔn)則，醫(yī)師可以調(diào)整藥物的劑量以達(dá)到醫(yī)師認(rèn)為對具體患者來說合適的活性(例如骨質(zhì)增加)。在考慮預(yù)期的活性程度時，醫(yī)師必須平衡各種因素如骨質(zhì)起始濃度，患者的年齡，事先存在的疾病，以及存在的其他疾病(例如心血管病)。例如，雌激素激動劑/拮抗劑的給藥可能提供心血管益處，特別是對絕經(jīng)后婦女。下文中給出了本發(fā)明各種成分的優(yōu)選劑量范圍。
抗吸收劑的使用量是通過其作為骨損失抑制劑的活性而確定的。用個體化合物藥物動力學(xué)方法測定其活性，用前述方法(雌激素激動劑/拮抗劑方案)測定它抑制骨損失的最小和最大有效劑量。
一般地，本發(fā)明活性物質(zhì)的有效劑量，如本發(fā)明第一種化合物的骨吸收活性的有效劑量在0.01-200mg/kg/天，優(yōu)選在0.5-100mg/kg/天。
尤其，屈洛昔芬的有效劑量在0.1-40mg/kg/天，優(yōu)選在0.1-5mg/kg/天。
尤其，雷洛昔芬的有效劑量在0.1-100mg/kg/天，優(yōu)選在0.1-10mg/kg/天。
尤其，他莫昔芬的有效劑量在0.1-100mg/kg/天，優(yōu)選在0.1-5mg/kg/天。
尤其，以下化合物有效劑量在0.0001-100mg/kg/天，優(yōu)選在0.001-10mg/kg/天順式-6(4-氟-苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；(-)-順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；順式-1-[6′-吡咯烷基乙氧基-3′-吡啶基]-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘；1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-(4″-氟苯基)-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉；順式-6-(4-羥基苯基)-5-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]-5，6，7，8-四氫化萘-2-醇；或1-(4′-吡咯烷基乙氧基苯基)-2-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉。
尤其，4-羥基他莫昔芬的有效劑量在0.0001-100mg/kg/天，優(yōu)選在0.001-10mg/kg/天。
一般說來應(yīng)使用足以將骨質(zhì)濃度增加到骨折閾值(如前述世界衛(wèi)生組織研究中詳細(xì)記載的)以上的量的骨合成代謝劑(如PGE2)。
一般地，上述骨合成代謝劑的有效劑量為0.001-100mg/kg/天，優(yōu)選為0.1-10mg/kg/天。
尤其，PGE2的有效劑量在0.001-10mg/kg/天，優(yōu)選在0.01-1mg/kg/天。
尤其，3S-(3-羥基-4-苯基-丁基)-2R-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-環(huán)戊酮的有效劑量在0.001-20mg/kg/天，優(yōu)選在0.01-10mg/kg/天。
尤其，氟化鈉的有效劑量在0.01-50mg/kg/天，優(yōu)選在0.2-10mg/kg/天。
尤其，甲狀旁腺激素及其代謝物和片段的有效劑量在0.00001-1mg/kg/天，優(yōu)選在0.001-0.5mg/kg/天。
尤其，生長激素或生長激素促分泌素的有效劑量在0.0001-100mg/kg/天，優(yōu)選在0.01-5mg/kg/天。
本發(fā)明化合物一般以藥物組合物的形式給藥，這些藥物組合物含有至少一種本發(fā)明的化合物及藥學(xué)可接受的賦形劑和稀釋劑。因此本發(fā)明的化合物可以以慣用的口服、胃腸外或經(jīng)皮劑型單獨或聯(lián)合給藥。
口服的藥物組合物可以是溶液劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑及類似劑型。含有檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣等賦形劑的片劑可同時使用各種崩解劑，如淀粉，優(yōu)選馬鈴薯淀粉或木薯淀粉，還含有一些復(fù)合硅酸鹽，及黏合劑如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠、阿拉伯膠。另外，制備片劑還經(jīng)常使用硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石。軟膠囊和硬膠囊也使用類似的固體物質(zhì)作為填充劑；在這方面優(yōu)選的物質(zhì)還包括乳糖及高分子量的聚乙二醇?？诜┬筒捎盟詰腋┖?或酏劑時，本發(fā)明的化合物可以與各種甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、乳化劑和/或懸浮劑，及如水、乙醇、丙二醇、丙三醇等稀釋劑配伍，或采用各種類似的配伍。
采用胃腸外給藥時，可以使用麻油或花生油或水溶性丙二醇溶液，及相應(yīng)的水溶性鹽的無菌水溶液。如果必要，可以以緩沖液調(diào)節(jié)這些水溶液，液體稀釋劑首先以充足的鹽或葡萄糖調(diào)節(jié)等滲透壓。這些水溶液尤其適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)注射給藥。在這方面，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的規(guī)范的技術(shù)快速得到所需的無菌水性介質(zhì)。
經(jīng)皮給藥(表面的)時，制備成水溶性或部分水溶性(經(jīng)常約0.1％-5％濃度)的無菌稀釋劑，及與以上胃腸外溶液類似的制劑。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，用一定量的活性成分制備各種藥物組合物的方法是已知的，或參照本申請公開的內(nèi)容后是顯而易見的。例如，參見Remington’s藥物學(xué)，Mark出版公司，Easter，Pa.，15th Edition(1975)。
本發(fā)明的藥物組合物可以含有0.1％-95％本發(fā)明的化合物，優(yōu)選在1％-70％。在任何情況下，所用組合物或劑型所含本發(fā)明化合物的量將有效地治療受治對象的疾病/狀況。
因為本發(fā)明涉及使用可以分別給藥的活性成分聯(lián)合治療使骨質(zhì)增長并得以保持，本發(fā)明也涉及以試劑盒形式將獨立的藥物成分結(jié)合。此試劑盒包括兩個獨立的藥物成分雌激素激動劑/拮抗劑和合成代謝劑。此試劑盒包括盛有單獨的藥物成分的容器，如分隔的瓶或箔質(zhì)小包。一般地，此試劑盒有服用各獨立藥物成分的說明。在各成分優(yōu)選以不同劑型(如口服和胃腸外服用)服用，按不同的劑量間隔服用，或處方醫(yī)師決定調(diào)整組合物各個成分的用量時，此試劑盒尤其便利。
此試劑盒的一個例子是所謂的囊狀包裝。囊狀包裝對于包裝工業(yè)是熟知的，并正在廣泛用于藥物單劑量劑型(片劑、膠囊及類似劑型)包裝。囊狀包裝一般含有一個相對剛性材料制成的片，此片優(yōu)選被透明的塑料材料薄膜覆蓋。在包裝工藝中，在塑料薄膜上形成凹陷。此凹陷具有將被包裝的片劑或膠囊的形狀和體積。然后，將片劑或膠囊置于凹陷中，將相對的剛性材料制成的片密封在塑料薄膜與形成的凹陷相反的表面。結(jié)果，片劑或膠囊劑被密封在塑料薄膜與剛性片之間的凹陷中。片的強(qiáng)度優(yōu)選在這樣的程度手對片施加壓力，在片與凹陷對應(yīng)的位置形成開口，使片劑和膠囊從囊狀包裝中脫離。然后片劑或膠囊可以經(jīng)此開口取出。
優(yōu)選在刻度板上提供一個記憶裝置，如在片劑或膠囊旁有依照每日治療方案片劑或膠囊應(yīng)攝入的量。另一記憶裝置的例子是在刻度板上印有日歷，如“第一周，星期一，星期二，等...第二周，星期一，星期二......”。其他記憶裝置是顯而易見的。“每日劑量”可以是在一天服用的單片劑或膠囊，或一些丸劑或膠囊。骨合成代謝劑的每日劑量可以含有一個片或膠囊，同時抗吸收劑可以含有多片或膠囊。記憶裝置將反映這些內(nèi)容。
本發(fā)明另一具體的實施方案中，調(diào)劑師設(shè)計按藥物所提供的使用方法在同一時間發(fā)放每日劑量。優(yōu)選的，此發(fā)放裝置安裝有記憶裝置，以促使進(jìn)一步符合治療方案。此記憶裝置的一個例子是顯示已被發(fā)放的每日劑量數(shù)量的機(jī)械計數(shù)器。此記憶裝置的另一個例子是電池供能的連接有液晶顯示器或聽力信號提示器的微型芯片記憶器，它可以讀出上次服用的劑量和/或提醒病人何時服用下一劑量。
實施例104只12月齡的Sprague-Dawiey雌性大鼠(CharlesRiver，Wilmington，MA)在0月進(jìn)行假性手術(shù)或去卵巢手術(shù)(OVX)。術(shù)后3個月，OVX大鼠接受已知骨代謝同化劑PGE2，劑量為3mg/kg/天(皮下注射)，或用3mg/kg/天PGE2(皮下注射)與屈洛昔芬(DRO)10mg/kg/天(口服)聯(lián)合治療兩個月。隨后去除PGE2治療，以屈洛昔芬(10mg/kg/天，口服)或賦形劑(10％醇的鹽水溶液)按下述方案繼續(xù)治療1.5月。
組I8只大鼠在0月時尸解作為基準(zhǔn)對照，組II8只假性手術(shù)大鼠在3個月時尸解作為治療前對照組III8只假性手術(shù)大鼠在3-5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在5個月時尸解，組IV8只假性手術(shù)大鼠在3-6.5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在6.5個月時尸解，組V8只OVX大鼠在3個月時尸解作為治療前對照組VI8只OVX大鼠在3-5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在5個月時尸解，組VII8只OVX大鼠在3-6.5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在6.5個月時尸解，組VIII8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，在5個月時尸解，組IX8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，在5-6.5個月口服賦形劑(10％醇的鹽水溶液)，在6.5個月時尸解，組X8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，在5-6.5個月口服屈洛昔芬(DRO)10mg/kg/天，在6.5個月時尸解，組XI8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，并口服屈洛昔芬(DRO)10mg/kg/天，在5個月時尸解，
組XII8只OVX大鼠在3-5個月皮下注射3mg/kg/天PGE2，并口服屈洛昔芬(DRO)10mg/kg/天，在5-6.5個月口服賦形劑，在6.5個月時尸解，組XIII從第3個月到第5個月，給八只OVX大鼠皮下注射3mg/kg/天的PGE2和口服10mg/kg/天的DRO，從第5個月到第6.5個月，單獨使用DRO，然后在第6.5個月進(jìn)行尸解。
無論PGE2(Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI)還是屈洛昔芬(PfizerInc.Groton，CT)粉末都首先溶解在100％乙醇中，進(jìn)而用鹽水稀釋到所需濃度(乙醇終濃度為10％)。PGE溶液每日在背部皮下注射1ml/kg，屈洛昔芬溶液每日口服1ml/只(鼠)。
腰椎骨礦物測定用裝有“局部高分辨率掃描”軟件(Hologic Inc.，Whltham，MA)的雙能量X-射線吸光測定法(QDR 1000/W，Hologic Inc.，Whltham，MA)測定麻醉鼠的整個腰部脊柱和六根腰椎骨(LV1-6)中每一根的骨面積、骨礦物含量(BMC)和骨礦物密度(BMD)。(腹腔)注射1ml/kg氯胺酮/甲苯噻嗪(比率為4∶3)的混合液將鼠麻醉，然后將其放在實驗臺上。掃描面積是6×1.9cm，分辨率為0.0254×0.0127cm，掃描速率為7.25mm/秒。得到了整個腰部脊柱的圖象并加以分析。測定整個腰部脊柱和六根腰椎骨(LV1-6)中每一根的骨面積(BA)、骨礦物含量(BMC)并計算出骨礦物密度(BMC除以BA)。
在術(shù)后3、5或6.5月，與陰性對照組比較，OVX大鼠整個腰部脊柱和腰椎骨的BMC和BMD明顯降低15％到27％。OVX術(shù)后3個月單獨施以PGE2或聯(lián)合施以DRO 2個月的大鼠，BMC和BMD完全恢復(fù)到陰性對照組水平。單獨施以PGE2與聯(lián)合施以PGE2和DRO的去卵巢大鼠的BMC和BMD沒有差異，提示DRO不會抑制PGE2的同化作用。停止PGE2治療，可以觀察到LV1、LV2、LV3的BMD和LV2D的BMC的明顯降低。另一方面，OVX大鼠停用PGE2后施以DRO時，完全保持PGE2對骨的恢復(fù)作用。類似地，停用PGE2和DRO 1.5個月，這些OVX大鼠不會發(fā)現(xiàn)腰部脊柱的骨損失。我們得出結(jié)論，抗吸收劑DRO不會抑制PGE2對于成骨大鼠的同化作用。進(jìn)一步，DRO在停用PGE2后可以有效地保持PGE2對骨的恢復(fù)作用。這些數(shù)據(jù)支持使用合成代謝劑恢復(fù)骨質(zhì)疏松骨骼的骨質(zhì)，并隨后使用抗吸收劑保持骨質(zhì)恢復(fù)。
應(yīng)認(rèn)識到本發(fā)明并不局限于本文中特別提到的實施方式，一些變化和改進(jìn)不會脫離以下權(quán)利要求定義的新概念的實質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，它包含a.治療有效量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.治療有效量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，它還包含藥物載體。
3.以下a、b兩種化合物在制備用于治療哺乳動物低骨質(zhì)癥狀的藥物中的用途，a.第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其中的低骨質(zhì)癥是骨質(zhì)疏松。
5.如權(quán)利要求3所述的用途，其中第一種化合物和第二種化合物是同時給藥的。
6.如權(quán)利要求3所述的用途，其中第二種化合物給藥期約3個月到約3年。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，接著再給予第一種化合物約3個月到約3年，在這約3個月到約3年的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
8.如權(quán)利要求6所述的用途，接著再給予第一種化合物約3年以上，在這約3年以上的期間內(nèi)不給予第二種化合物。
9.權(quán)利要求1的藥物組合物在制備用于治療哺乳動物的低骨質(zhì)狀的藥物中的用途。
10.一種藥物組合物，它包含以下a、b化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，a.適量的第一種化合物，所述第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.適量的第二種化合物，所述第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量在同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
11.以下a、b兩種化學(xué)物在制備用于治療哺乳動物低骨質(zhì)癥的藥物中的用途，a.第一種化合物是屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬；和b.第二種化合物是氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺酰基螺[3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677其中單獨的第一種化合物的量和單獨的第二種化合物的量在同時給藥時是不足以達(dá)到增加骨形成和減少骨吸收的治療作用的，且其中適量的第一種和第二種化合物的結(jié)合作用大于單獨量的第一種和第二種化合物可達(dá)到的治療作用之和。
12.含有治療低骨質(zhì)癥狀的試劑盒，它包含a.在第一種單位劑型中的治療有效量的屈洛昔芬，雷洛昔芬，他莫昔芬或碘昔芬和藥學(xué)上可接受的載體；b.在第二種單位劑型中的治療有效量的氟化鈉或N-[1(R)-[1，2-二氫-1-甲磺?；輀3H-吲哚-3，4′-哌啶]-1′-基)羰基]-2-(苯基甲氧基)乙基]-2-氨基-2-甲基丙酰胺MK-677和藥學(xué)上可接受的載體；和c.用于包含所述第一種和第二種劑型的容器。
13.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
14.如權(quán)利要求3所述的用途，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
15.如權(quán)利要求7所述的用途，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
16.如權(quán)利要求8所述的用途，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
17.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
18.如權(quán)利要求11所述的用途，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
19.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其中第一種化合物是屈洛昔芬。
全文摘要
包括某種雌激素激動劑/拮抗劑和氟化鈉或MK－677的藥物聯(lián)合組合物。該組合物用于治療骨疾病包括骨質(zhì)疏松。
文檔編號A61P19/10GK1515258SQ20031012023
公開日2004年7月28日 申請日期1996年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月28日
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