專利名稱:抗銅綠假單胞菌鞭毛的單克隆抗體的制作方法
本申請(qǐng)是1986年12月24日提交的美國(guó)專利序列號(hào)946554的部分繼續(xù)申請(qǐng)，而946554號(hào)是在1986年7月3日提交的美國(guó)專利序列號(hào)881984的部分繼續(xù)申請(qǐng)，這兩份申請(qǐng)都通過在此引述而合并于本申請(qǐng)中。
本發(fā)明涉及用免疫技術(shù)提供用于診斷和治療細(xì)菌感染的新物質(zhì)，具體而言，是生產(chǎn)和應(yīng)用能識(shí)別銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)鞭毛的單克隆抗體。
革蘭氏陰性疾病及其大多數(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥，如敗血癥和內(nèi)毒素血癥，是人類患者嚴(yán)重發(fā)病和死亡的原因。革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌更是如此，在過去的五十年中，它與細(xì)菌感染，特別是醫(yī)院感染的伴隨日漸增長(zhǎng)。
在過去的幾十年中，抗菌素被選來(lái)控制革蘭氏陰性疾病。但是，革蘭氏陰性細(xì)菌疾病的高發(fā)病率以及高死亡率表明抗菌素的治療作用是有限制的，對(duì)銅綠假單胞菌更是如此。[參見Andriole，V，G.“Pseudomonas BacteremiaCan Antibiotic Therapy Improve Survival？”，J.Lab.Clin.Med.(1978)94196-199]這就促進(jìn)了尋找另外的預(yù)防和治療方法。
已被研究的一種方法是用主動(dòng)或被動(dòng)免疫使宿主的免疫系統(tǒng)得到增強(qiáng)的方法。例如，已經(jīng)觀察到的是，利用銅綠假單胞菌的全細(xì)菌疫苗或其純化的細(xì)菌性內(nèi)毒素對(duì)人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物進(jìn)行主動(dòng)免疫，則導(dǎo)致產(chǎn)生一種特異性的調(diào)理抗體，該抗體主要抵抗銅綠假單胞菌外層細(xì)胞膜上脂多糖(LPS)的重復(fù)寡糖的決定族[見Pollack，M.，ImmunoglobulinsCharacteristics and Uses of Intravenous Preparations，Alving，B.M.，and Finlayson，J.S.des.，pp.73-79，U.S.Department of Healthy and Human Servises，1979]。這些抗體，不論是主動(dòng)產(chǎn)生的或是被動(dòng)輸入的，均在各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中顯示出抵抗由銅綠假單胞菌引起的致死效應(yīng)(Pollack，同上)，而且在某些對(duì)人的初步試驗(yàn)中也是如此(見Young，L.S.and Pollack，M.，Pseudomonas aeruginosa，Sabath，L.，ed.，pp 119-112，Hans Huber，1980)。
上述報(bào)道提出，免疫治療方法可以用來(lái)預(yù)防和治療由銅綠假單胞菌引起的細(xì)菌性疾病，如施用被收集來(lái)的那些含抗侵染菌的抗體的人免疫球蛋白。此處所說(shuō)的免疫球蛋白指的是人血漿中富含抗體的部分或組分，其中的代表是抗銅綠假單胞菌的特異性抗體。然而，由于在使用人免疫球蛋白成分時(shí)所遇到的種種限制，因而使用這種方法治療由銅綠假單胞菌引起的疾病仍處于研究探索階段[見Collins，M.S.and Roby，R.E.Am.J.Med.，76(3a)168-174，(1984)]，而且目前也沒有這些成分的市售商品可用。
與免疫球蛋白組分相關(guān)的一種限制是，它們收集自成千上萬(wàn)的供血者的樣品中，這些樣品預(yù)先對(duì)是否存在抗銅綠假單胞菌抗體進(jìn)行了篩選。這種收集方式導(dǎo)致各個(gè)抗體效價(jià)被平均化，這樣就至多使所需抗體的最終效價(jià)得到有限的提高。
另一個(gè)限制是，這種通過預(yù)先篩選的方式使要保證產(chǎn)物的一致性就必須廣泛地，連續(xù)地篩選供者。盡管做了上述各種努力，但免疫球蛋白在每一批之間，以及在各不同地理區(qū)域內(nèi)得到的產(chǎn)物之間均仍有相當(dāng)大的差異。
免疫球蛋白組合物所固有的另一限制是在使用的同時(shí)也帶有大量外源蛋白性物質(zhì)(它可能包括病毒，如那些近來(lái)被發(fā)現(xiàn)與獲得性免疫缺乏綜合癥相關(guān)的病毒)，可能會(huì)引起生物學(xué)副作用。所需抗體的低效價(jià)與大量外源物質(zhì)相結(jié)合，經(jīng)常使特異性被限制在最適水平以下，因而也限制了給患者施用免疫球蛋白的效益。
1975年，Kohler和Milstein報(bào)道了他們的初期發(fā)現(xiàn)，即某些鼠細(xì)胞株可與鼠脾細(xì)胞融合而產(chǎn)生雜交瘤，雜交瘤能產(chǎn)生單一特異性的抗體，也就是單克隆抗體[Kohler，G.，and Milstein，C.，Nature，256495-497(1975)]。自從這項(xiàng)技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，在某些情況下，就使得大量生產(chǎn)對(duì)特殊決定簇或抗原上的決定簇具有專門特異性的鼠抗體成為可能。隨后應(yīng)用以后發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，使生產(chǎn)人單克隆抗體也成為可能(見美國(guó)專利第4464465號(hào)，該文通過在此引述而合并于本文)。
應(yīng)當(dāng)承認(rèn)的是，在某些情況下，鼠單克隆抗體或這些抗體的組合物在用于人類時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些問題。例如，已經(jīng)報(bào)道說(shuō)，在用鼠單克隆抗體治療某些人類疾病的試驗(yàn)研究中會(huì)激發(fā)使它們無(wú)效的免疫應(yīng)答[Levy，R.L.，and Miller，R.A.，Ann.Rev.Med，34107-116(1983)]。然而，隨著重組DNA技術(shù)的最近發(fā)展，如生產(chǎn)鼠/人嵌合單克隆抗體，這些問題可被排除。此外，現(xiàn)在已經(jīng)有了生產(chǎn)人單克隆抗體的方法[見Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies，Engleman，E.G.，et al.，eds.，Plenum Publishing Corp.(1985)，通過在此引述將該文合并于本文]。
在用雜交瘤和(或)細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)抗銅綠假單胞菌侵染的單克隆抗體方面已經(jīng)有了一些報(bào)道。已經(jīng)被生產(chǎn)出的單克隆抗體與銅綠假單胞菌的各種抗原決定簇起反應(yīng)，包括單一的和多種血清型特異性表面抗原決定簇，如在細(xì)菌的LPS分子中發(fā)現(xiàn)的那些(見序列號(hào)為734 624和807394的未決美國(guó)專利申請(qǐng)，通過在此引述將這兩份文獻(xiàn)合并于本文)。對(duì)銅綠假單胞菌內(nèi)毒素A為特異性的保護(hù)性單克隆抗體也被生產(chǎn)出來(lái)[見序列號(hào)為742170的美國(guó)專利申請(qǐng)，通過在此引述將該文合并于本文]。
雖然使用對(duì)銅綠假單胞菌LPS區(qū)或其細(xì)菌性內(nèi)毒素為特異性的單克隆抗體在某些情況下能提供足夠的保護(hù)，但通常應(yīng)提供更寬的保護(hù)。例如，隆抗體在某些情況下能提供足夠的保護(hù)，但通常應(yīng)提供更寬的保護(hù)。例如，在預(yù)防人類潛在的侵染時(shí)，則以使用抗多種銅綠假單胞菌的一種抗體或眾多抗體為更好。同樣，在治療時(shí)，如果不知道侵染菌的血清型，則以使用抗大多數(shù)(如果不是全部的話)在醫(yī)學(xué)上為重要的銅綠假單胞菌血清型的抗體或多種抗體相結(jié)合為更好，理想的是提供與傳統(tǒng)血清圖譜中各類均有交叉反應(yīng)的抗體。
已經(jīng)顯示出對(duì)生物體致病有關(guān)的銅綠假單胞菌生理學(xué)上的一個(gè)方面是其游動(dòng)性，這種能力主要是因?yàn)橛斜廾嬖赱見Montie，T.，et al.(1982)Infect，and Immun.，381296-1298]。銅綠假單胞菌的特征是在桿狀結(jié)構(gòu)的一端有一根鞭毛。對(duì)灼傷小鼠研究顯示出，當(dāng)給實(shí)驗(yàn)灼傷的小鼠接種非游動(dòng)性銅綠假單胞菌時(shí)，存活小鼠的百分比要大大高于接種游動(dòng)性銅綠假單胞菌的小鼠[Mc Manus，A.，et al.，(1980)，Burns，6235-239 and Mentie，T.，et al.(1982)，Infect.and Immun.，381 J96-1298]。其他對(duì)銅綠假單胞菌致病機(jī)理的研究已經(jīng)宣稱，用鞭毛抗原制劑免疫過的動(dòng)物當(dāng)被灼傷并感染以游動(dòng)細(xì)菌時(shí)則受到了防護(hù)[見Holder，I.，et al.(1982)，Infect.and Immun.，35276-280]。
重要的是，已用血清學(xué)的方法對(duì)銅綠假單胞菌的鞭毛進(jìn)行了研究，并且報(bào)道說(shuō)主要屬于兩個(gè)抗原組，即由B.Lanyi確定的H1和H2組[見1970，Acta Microbiol.Acad.Sci，Hung.，1735-48]，由Ansorg，R.確定的a型和b型[見1978，Zbl，Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.A，242-238]。這兩者的實(shí)驗(yàn)室對(duì)鞭毛的血清學(xué)定型均表明H1鞭毛[Lanyi，同上]或b型鞭毛[Ansorg，R.，同上]在血清學(xué)上是一致的，即還沒有發(fā)現(xiàn)亞型。這種血清學(xué)上一致的鞭毛被稱作b型。另一主要抗原H2[Lanyi，同上]或a型鞭毛[Ansorg，R.，同上]含有5個(gè)亞型。這種抗原被稱作a型鞭毛，5個(gè)亞型分別稱作a，a，a，a，a。在a型銅綠假單胞菌各不同菌株上所帶的亞型顯示出不同的組合，但抗原a的情形則是例外。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在所有的鞭毛上均有a抗原，雖然在各種菌株中所表現(xiàn)出的程度有所不同。
基于銅綠假單胞菌的熱穩(wěn)定主體抗原的血清型圖譜被稱作Habs圖譜，并在最近被收入到國(guó)際抗原分型系統(tǒng)圖譜中[見Liu，Int.J.Syst.Bacteriol.，33256(1983)]。Habs參考菌株的銅綠假單胞菌的鞭毛類型已被R.Ansorg用多克隆血清以免疫熒光法特征化了[1987，Zbl.Bakt.Hyg.，I，Abt.Orig.A，242228-238]或被用載片凝聚法特征化了[Ansorg，R.，et al.，1984，J.Clin.Microbiol.，2084-88]。Habs2，3，4，5，7，10，11和12號(hào)菌株是帶b型鞭毛的菌株，而Habsl，6，8和9號(hào)菌株帶有a型鞭毛。因此，大多數(shù)的銅綠假單胞菌的菌株可用很小數(shù)量的抗鞭毛蛋白單克隆抗體識(shí)別。因而，急需的是能夠與鞭毛蛋白上的抗原決定簇起反應(yīng)并在某些情況下還能抵抗多種血清型銅綠假單胞菌的單克隆抗體。進(jìn)而，這些抗體中的一部分應(yīng)適用于預(yù)防和治療銅綠假單胞菌侵染，以及診斷這些侵染。而本發(fā)明則滿足了這些需要。
本發(fā)明提供了新的細(xì)胞株，它們能生產(chǎn)出能夠結(jié)合大多數(shù)假單胞菌菌株上的鞭毛的單克隆抗體。這些單克隆抗體能夠與銅綠假單胞菌的鞭毛蛋白上的抗原決定簇起特異性反應(yīng)，并能辯別a型與b型鞭毛。此外，還提供了一種治療已被銅綠假單胞菌侵染或懷疑被其侵染的患者的方法，即施用預(yù)防量或治療量的一種組合物，該組合物包括至少一種與銅綠假單胞菌的鞭毛起反應(yīng)的單克隆抗體或其結(jié)合片段，該組合物中含有生理上可接受的載體則更好。該組合物中還可以含有一種或一種以上的下述成分另外的能與銅綠假單胞菌內(nèi)毒素A反應(yīng)的單克隆抗體;能與銅綠假單胞菌的LPS上的血清型抗原決定簇反應(yīng)的單克隆抗體;人血漿的γ球蛋白組分;從顯示出對(duì)銅綠假單胞菌起反應(yīng)的免疫球蛋白水平被提高了的人的血漿中得到的γ球蛋白組分;一種或多種抗菌劑。進(jìn)而，提供了這些單克隆抗體的醫(yī)療用途，包括生產(chǎn)診斷實(shí)驗(yàn)藥盒。
本發(fā)明提供了能產(chǎn)生單克隆抗體的新細(xì)胞株和包含這些抗體的組合物，這種組合物能選擇性地識(shí)別多數(shù)銅綠假單胞菌的鞭毛，某一種抗體專門識(shí)別某一種類型的銅綠假單胞菌鞭毛。所述細(xì)胞具有可視為同一的染色體，其中從自身所來(lái)的或從前體細(xì)胞所來(lái)的種系DNA被重排以編碼具有某些銅綠假單胞菌菌株共有的鞭毛蛋白上的抗原決定簇的結(jié)合位點(diǎn)的抗體。對(duì)a型鞭毛蛋白，可以生產(chǎn)出泛-反應(yīng)性單克隆抗體;對(duì)b型鞭毛蛋白，則包括泛-反應(yīng)性抗體及與至少70%的具鞭毛菌株反應(yīng)的抗體。這些單克隆抗體能以多種方式使用，包括診斷和治療。
如此提供的單克隆抗體在治療和預(yù)防由銅綠假單胞菌引起的嚴(yán)重疾病中特別有用。這些抗體分子可以與銅綠假單胞菌的鞭毛上的表面蛋白直接接觸，因此能抑制其游動(dòng)性和(或)對(duì)被侵染的宿主產(chǎn)生其它有益的效應(yīng)。
這些單克隆抗體的制備可用能表達(dá)核酸序列的活細(xì)胞株來(lái)完成，該核酸序列編碼對(duì)多數(shù)銅綠假單胞菌鞭毛蛋白上的抗原決定簇有特異性的抗體。活細(xì)胞株可以是通過腫瘤生成轉(zhuǎn)化的，或被轉(zhuǎn)染的、突變的等等哺乳動(dòng)物細(xì)胞株。這些細(xì)胞包括骨髓瘤細(xì)胞株，淋巴瘤細(xì)胞株，或其它在活體中能有助于表達(dá)和分泌免疫球蛋白或其結(jié)合片段的細(xì)胞株。免疫球蛋白或其片段除了可以是用病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，特別是脾細(xì)胞，或是淋巴細(xì)胞與贅生性細(xì)胞即骨髓瘤細(xì)胞相隔合而得到雜交細(xì)胞株而產(chǎn)生的優(yōu)選的鼠源或人源的免疫球蛋白或其片段，也可以是哺乳動(dòng)物的天然免疫球蛋白或其片段。典型的脾細(xì)胞得自于對(duì)含抗原決定簇位點(diǎn)的鞭毛抗原或其片段進(jìn)行免疫的動(dòng)物。免疫的方法是眾所周知的，而且可以有較大的不同但仍為有效[見Golding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，N.Y.(1983)，該文通過在此引述而合并于本文]可按常規(guī)技術(shù)對(duì)雜交細(xì)胞株進(jìn)行篩選和克隆化，并且在細(xì)胞上清液中檢測(cè)到的抗體是能夠結(jié)合銅綠假單胞菌鞭毛抗原決定簇的。合適的雜交細(xì)胞株可以大規(guī)模培養(yǎng)，或注射到適宜宿主的腹膜腔中以生產(chǎn)腹水。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所用細(xì)胞是被轉(zhuǎn)化的人淋巴細(xì)胞，它能在活體中生產(chǎn)人單克隆抗體(優(yōu)選保護(hù)性人單克隆抗體)，該抗體易于接觸對(duì)至少一種鞭毛蛋白為特異性的抗原決定簇。所述淋巴細(xì)胞可以得自那些可受或已受適合的帶有鞭毛的銅綠假單胞菌感染的供者。優(yōu)選的細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法詳見美國(guó)專利第4464465號(hào)，該文獻(xiàn)通過在此引述而合并于本文。
由于有了本發(fā)明的已知對(duì)鞭毛蛋白為特異性的抗體，則在某些情況下就可用本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)隨后各實(shí)驗(yàn)的上清液以競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)法進(jìn)行篩選，作為一種確定其它抗鞭毛單克隆的方法。因此，由于有了本發(fā)明的對(duì)于某一鞭毛抗原為特異性的抗體存在，就能很容易地從其它來(lái)源生產(chǎn)雜交細(xì)胞株。
此外，由于有能產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)抗原決定簇位點(diǎn)為特異性的抗體的雜交細(xì)胞株，因而，這些雜交細(xì)胞可與其它贅生性B-細(xì)胞相融合，而這些另外的B-細(xì)胞可以作為編碼受體的基因組DNA的接受體。最常用的是嚙齒類特別是鼠類的贅生性B-細(xì)胞，但也可用其它哺乳動(dòng)物的如兔、牛、羊、馬、豬、鳥等等的。
單克隆抗體可以具有任何一類或亞類的免疫球蛋白，如IgM、IgD、IgA、IgE、或已知的各種動(dòng)物的IgG亞類。一般來(lái)說(shuō)，單克隆抗體可以完整地使用，或作為結(jié)合片段如Fv、Fab、F(ab′)2等等來(lái)使用，但通常均完整地使用。
本發(fā)明的細(xì)胞株除了直接生產(chǎn)單克隆體之外，還可以有其它的用途。這些細(xì)胞株可與其它細(xì)胞(如用藥物適當(dāng)標(biāo)記的人骨髓瘤細(xì)胞、鼠骨髓瘤細(xì)胞、或人淋巴母細(xì)胞)融合以產(chǎn)生雜交瘤，以供轉(zhuǎn)移編碼單克隆抗體的基因所用，此外，這些細(xì)胞株可用作編碼免疫球蛋白的染色體來(lái)源，可用除融合以外的技術(shù)將染色體分離出來(lái)并轉(zhuǎn)移到其它細(xì)胞中。另外，可按重組DNA技術(shù)將編碼單克隆抗體的基因分離出來(lái)，用于在各種宿主中生產(chǎn)特異性的免疫球蛋白。特別是，通過信使RNA建立起cDNA文庫(kù)，則可分離出編碼免疫球蛋白但不含基因內(nèi)區(qū)的單一的cDNA克隆，放入到適宜的原核或真核表達(dá)載體中，隨后轉(zhuǎn)化到宿主中進(jìn)行大量生產(chǎn)[見美國(guó)專利第4172124，4350683，4363799，4381292和4423147號(hào)，以及Kennettet al.，Monoclonal Antibodies，Plenum，New York(1980)，以及其中所述的參考文獻(xiàn)，所有這些文獻(xiàn)都通過在此引述而合并于本文]。
更具體地講，按照雜交DNA技術(shù)，可在細(xì)菌和酵母中生產(chǎn)本發(fā)明的免疫球蛋白或其片段[見Boss，et al.，Ncul.Acid.Res.，12∶3791 and Wood et al.，Nature 314∶446，這兩篇文獻(xiàn)均通過在此引述而合并于本文]。例如，除了本發(fā)明的克隆之外，還可用來(lái)自BALB/C淋巴細(xì)胞的cDNA以不同的cDNA雜交技術(shù)分離出本發(fā)明細(xì)胞株所產(chǎn)生的單克隆抗體的輕鏈和重鏈的編碼基因所轉(zhuǎn)譯的信使RNA。未雜交的mRNA將富含所需免疫球蛋白鏈的編碼信息。如果需要，可重復(fù)這一過程以進(jìn)一步提高所需mRNA水平。被減去的mRNA組合物可被反轉(zhuǎn)譯以提供富含所需序列的cDNA混合物。RNA可用適當(dāng)?shù)腞NA酶水解，ssDNA則用DNA聚合酶I和隨機(jī)引物例如隨機(jī)成片段的牛胸腺DNA使之成為雙鏈。所獲的雙鏈DNA可通過插入到適當(dāng)?shù)妮d體，例如λ-載體或質(zhì)粒載體(如p BR322，pACYC184等)中而被克隆化?；谳p鏈和重鏈的恒定區(qū)已知序列而建立的探針，可用雜交技術(shù)鑒定出來(lái)具有所需輕鏈和重鏈編碼基因的cDNA克隆。此后，可從質(zhì)粒上剪切下這些基因，經(jīng)處理去除起始密碼子或恒定DNA區(qū)域上游的多余的DNA，然后引入到適宜的載體中，用于轉(zhuǎn)化宿主，最后進(jìn)行基因表達(dá)。
如果合宜的話，哺乳動(dòng)物宿主(如小鼠細(xì)胞)也可用來(lái)加工鏈(如參加重鏈和輕鏈)以生產(chǎn)完整的免疫球蛋白，而且如果需要的話，還可進(jìn)而分泌不含引導(dǎo)序列的免疫球蛋白。此外，也可以用單細(xì)胞微生物生產(chǎn)這兩種鏈，其中也許需要進(jìn)一步處理去除編碼分泌性引導(dǎo)子的DNA序列和加工信號(hào)子，從而使在重鏈編碼序列的5′末端具有起始密碼子。這樣，就可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外的其它細(xì)胞中使免疫球蛋白制備出來(lái)，并被加工成為可在這些細(xì)胞中聚集和被糖化的形式。如果需要的話，每條鏈均可被剪切以保留至少有可變區(qū)，然后，經(jīng)過加工，這些可變區(qū)可用于其它對(duì)鞭毛抗原決定簇為特異性的免疫球蛋白或其片段。
本發(fā)明的單克隆抗體特別有用，因?yàn)樗鼈儗?duì)于與現(xiàn)在已知的幾乎所有銅綠假單胞菌變種的抗原都具有特異性。而且，有些單克隆抗體在體內(nèi)是保護(hù)性的，允許整合到治療產(chǎn)物中，如用于細(xì)菌感染的抗體結(jié)合物。
還發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的單克隆抗體在體外具有各種廣泛應(yīng)用。例如，該單克隆抗體可用于微生物分類，用于分離特定的銅綠假單胞菌，用于從異源細(xì)胞混合物中選擇性地除去銅綠假單胞菌，等等。
用于診斷目的，該單克隆抗體可被標(biāo)記，也可不被標(biāo)記。典型的診斷檢測(cè)必須測(cè)定通過單克隆抗體與銅綠假單胞菌體的鞭毛的結(jié)合而形成的復(fù)合體。當(dāng)未標(biāo)記時(shí)，發(fā)現(xiàn)該抗體可用于凝聚檢測(cè)。另外，未標(biāo)記抗體可以與其它的與單克隆抗體相反應(yīng)的標(biāo)記抗體(第二抗體)結(jié)合使用，如特別對(duì)于免疫球蛋白的抗體?；蛘?，可以直接標(biāo)記單克隆抗體。而能夠使用的標(biāo)記非常之多，如放射性核素、熒光物質(zhì)、酶、酶底物、酶輔助因子、酶抑制劑、配位(尤其是半抗原)等。各種類型的免疫測(cè)定也是可得到的，例如，其中的某些測(cè)定法在美國(guó)專利號(hào)3817827，3850752，3901654，3935074，3984533，996345，4034074和4098876中已有敘述，通過在此引述將該文合并于本文。
本發(fā)明的單克隆抗體普遍用于酶免疫測(cè)定。其中，主抗體或從不同種得來(lái)的第二抗體被連接到一種酶上。當(dāng)將含有某一血清型的銅綠假單胞菌的樣品(如人血或其溶胞產(chǎn)物)與主抗體結(jié)合時(shí)，其結(jié)合發(fā)現(xiàn)在抗體與顯示了所需的抗原決定基的那些分子之間。這些細(xì)胞可以從未結(jié)合的反應(yīng)物分離出來(lái)，再加入第二抗體(用一種酶標(biāo)記)，然后，測(cè)定特異結(jié)合到細(xì)胞上的抗體-酶結(jié)合物的存在。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的其它常規(guī)技術(shù)也可被使用。
診斷盒也可與用于測(cè)定溶液中的銅綠假單胞菌的或用于測(cè)定銅綠假單胞菌的鞭毛抗原的存在的主抗體一起使用。這樣，本發(fā)明的主單克隆抗體組合物通?？梢岳鋬龅男问絾为?dú)地或與對(duì)于其它革蘭氏陰性細(xì)菌特異性的附加抗體結(jié)合地提供。與標(biāo)記結(jié)合或未被結(jié)合的抗體與緩沖劑、穩(wěn)定劑、殺生物劑、無(wú)活性蛋白(如牛清蛋白)或其類似物緩沖液如Tris，磷酸鹽，碳酸等一起包括在診斷盒中。這些物質(zhì)通常以低于活性抗體量的5%(重量)的量提供，且其總量至少為抗體濃度的0.001%(重量)。通常，在盒中還包含一種無(wú)活性的補(bǔ)充劑或賦形劑以稀釋活性成分是可取的。其中賦形劑可以占總組合物的1～99%(重量)。當(dāng)使用能夠結(jié)合到單克隆抗體上的第二抗體時(shí)，它通常是用一個(gè)單獨(dú)的小瓶提供。第二抗體典型地連接到一種標(biāo)記物上，且按與上面所述的抗體配方相類似的方式配成。
本發(fā)明的單克隆抗體，尤其是人單克隆抗體，也可以作為藥用組合物的成分被摻入，該組合物含有治療或預(yù)防量的本發(fā)明的至少一種單克隆抗體和藥用有效載體。藥用載體應(yīng)為任何適合于將單克隆抗體傳遞給患者的相容的非毒性物質(zhì)。無(wú)菌水、乙醇、脂、蠟和無(wú)活性固體都可被用作載體?？勺魉幱玫淖魟?緩沖劑、分散劑)也可被摻入藥用組合物。這些組合物可含單一的一種單克隆抗體，以使其對(duì)銅綠假單胞菌的一種鞭毛型菌株為特異性。或者，一種藥用組合物也可含有兩種或兩種以上的單克隆抗體，以形成一種“雞尾酒”。例如，一種含有抗兩種鞭毛型或抗一組各種銅綠假單胞菌(如不同的血清型)的單克隆抗體的雞尾酒將是一種通用產(chǎn)品，它具有抗絕大多數(shù)那種特定細(xì)菌的臨床分離物的活性。
各種單克隆抗體組分的摩爾比通常相差不大于10倍，更通常的是不大于5倍，與每一種其它抗體組分的摩爾比通常約為1∶1-2。
本發(fā)明的單克隆抗體也可與現(xiàn)在的血漿產(chǎn)品(如用于預(yù)防或治療人體銅綠假單胞菌疾病的商業(yè)上可得到的γ球蛋白和免疫球蛋白產(chǎn)品)結(jié)合使用。對(duì)于免疫球蛋白，血漿最好是從顯示出高水平的與銅綠假單胞菌相反應(yīng)的免疫球蛋白的獻(xiàn)血者獲得。(見，簡(jiǎn)編“Intravenous Immune Globulin and the Comhromised Host”，Amer，J.Med.76(3a)，March 30，1984，pp.1-231，通過在此引述，將該文合并于本文。
主單克隆抗體可以作為分別服用的組合物與抗生素或抗微生物劑結(jié)合使用。典型的抗微生物劑可包括與一種氨基糖苷(如慶大霉素、托普霉素)連接的抗假單胞青酶素(如羧芐基青霉素)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的眾多添加劑(如頭孢菌素)也可被利用。
本發(fā)明的單克隆抗體和其藥用組合物尤其適用于口服或非腸胃服用。非腸胃服用更好，即皮下注射，靜脈注射或肌肉注射。這樣，本發(fā)明提供了用于非腸胃服用的組合物，它包括溶于一種可接受載體(最好是一種水溶性載體)中的單克隆抗體溶液或其雞尾酒?？杀皇褂玫母鞣N水溶液載體有水、緩沖水、0.4%的鹽水，0.3的甘氨酸等等。這些溶液為無(wú)菌的且通常無(wú)顆粒物質(zhì)。這些組合物可采用熟知的常規(guī)滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。組合物可含有可作藥用的接近生理?xiàng)l件所需要的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，毒性調(diào)節(jié)劑及其類似物，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等等。這些配方中的抗體濃度的變化范圍非常之大，即少至約0.5%(重量)，通常為或至少為約1%，多至15或20%(重量)，這主要根據(jù)流動(dòng)體積、粘度等進(jìn)行選擇，最好依具體的服用方式進(jìn)行選擇。
因此，一種用于肌肉注射的藥用組合物可按下列組成配制1毫升無(wú)菌緩沖水和50毫克單克隆抗體。一種用于靜脈注射的典型組合物則含250毫升無(wú)菌Ringer's溶液和150毫克單克隆抗體。制備非胃腸可服用的組合物的實(shí)際方法，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，是熟知的或明顯的，其詳細(xì)敘述見Remington's Phormaceutical Science15th Ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980)等，通過在此引述，將該文合并于本文。
本發(fā)明的單克隆抗體可以冷凍保存，在使用前再在一種合適的載體上重新復(fù)原。這一技術(shù)已被表明對(duì)于常規(guī)免疫球蛋白是有效的，且現(xiàn)有技術(shù)所已知的冷凍和復(fù)原技術(shù)都可使用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將意識(shí)到，冷凍和復(fù)原將導(dǎo)致抗體活性的不同程度喪失(例如，對(duì)于常規(guī)的免疫球蛋白，Ig M抗體要比Ig G抗體具有更大程度的活性喪失)，因此必須對(duì)所用的量進(jìn)行調(diào)整，以補(bǔ)償活性的喪失。
可服用含有本發(fā)明的單克隆抗體或其雞尾酒的組合物來(lái)預(yù)防和/或者治療銅綠假單胞菌感染。在應(yīng)用于治療時(shí)，是給已被一種或多種血清型銅綠假單胞菌感染的患者服用足夠治療或至少部分阻止感染和它們的繁殖的量的組合物。足夠完成這一目的的量稱為“治療有效劑量”。對(duì)這一用途有效的量將取決于感染程度和患者自身免疫系統(tǒng)的總狀態(tài)，但是其總范圍為每千克體重1至200毫克抗體，更通用的是每千克體重5至25毫克抗體。必須注意，本發(fā)明的物質(zhì)一般只是在嚴(yán)重的疾病狀態(tài)時(shí)才可被使用，即在由于銅綠假單胞菌引起危及生命或潛在的危及生命的情況下(尤其是菌血癥或內(nèi)毒素血癥)才被使用。
在用于預(yù)防時(shí)，是給未被銅綠假單胞菌感染的病人服用含有本發(fā)明的抗體或其雞尾酒的組合物，以增強(qiáng)病人對(duì)這種潛在感染的抵抗能力。這種劑量稱作“預(yù)防有效劑量”。在這一應(yīng)用中，其精確用量同樣取決病人的健康狀態(tài)和總的免疫水平，但一般在每千克體重0.1至25毫克的范圍內(nèi)，尤其是0.5-2.5毫克/千克。
本發(fā)明的組合物可按主治醫(yī)師所選擇的劑量水平和服用方式進(jìn)行單獨(dú)服用或多種方法一起服用。但無(wú)論如何，該藥用配方應(yīng)提供給患者足夠有效治療或預(yù)防劑量的本發(fā)明的抗體。
實(shí)施例1實(shí)施例1說(shuō)明了特異性地結(jié)合到銅綠假單胞菌鞭毛上的鼠單克隆抗體的制備方法。
用活的銅綠假單胞菌Fisher免疫型1和Fisher免疫型2(A、T、C、C、＃27312和＃27313)細(xì)菌每一至兩周腹膜內(nèi)免疫三月令的BALB/C小鼠八次，總共九周。細(xì)菌的開始劑量，對(duì)于銅綠假單胞菌Fisher免疫型1和Fisher免疫型2分別為8×106和1×107，且在免疫的過程中劑量增加30至60倍。
最后一次注射后三天，從一個(gè)小鼠中無(wú)菌取出脾臟，然后通過在兩個(gè)無(wú)菌玻片的冰冷末端之間輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)該器官來(lái)制備單細(xì)胞懸浮液。將脾臟單核細(xì)胞與對(duì)數(shù)期鼠骨髓瘤細(xì)胞(NSI-1，從英格蘭劍橋分子研究委員會(huì)(Moleculas Research Council，Cambsedge，England)C，Milstein博士處得到)以4∶1的比例結(jié)合，且按照Tam等(1982，Infect.Immun.，36∶1042-1053)所述的方法進(jìn)行融合，形成雜交瘤。將最終的雜交細(xì)胞懸浮液在RPM I-雜化-HAT(RPM I 1640[Gibco，Grand Island，NY]含15%熱失活牛胎兒血清，1mM丙酮酸鈉，100微克/毫升青霉素和鏈霉素，1.0×10-4M次黃嘌呤，4.0×10-7M氨基喋呤和1.6×10-5胸苷)中稀釋至每毫升1.5×106個(gè)細(xì)胞的濃度，其中包括作為種子細(xì)胞的新鮮制備的BALB/C胸腺細(xì)胞2.0×106個(gè)/毫升。
將該混合物投放(200微升/孔)在96孔平板中(＃3596，Costar，Cambridge，MA)。每?jī)芍寥斐ッ總€(gè)孔中50%體積的RPM I-雜化-HAT，而用50%體積的新鮮RPM I-雜化-HAT取代之，以對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行供養(yǎng)。當(dāng)孔中的細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到約40%的融合時(shí)(通常在7-10天)，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)物上清液中抗銅綠假單胞菌抗體的存在。
同時(shí)在兩種免疫細(xì)菌中每一種的外膜制品上測(cè)定雜交細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。外膜制品是通過修正過的Tam等(1982，Infect.Immun.，36∶1042-1053)的方法進(jìn)行分離的，通過引述將該文合并于本文。將細(xì)胞(銅綠假單胞菌Fisher免疫型1和Fisher免疫型2)接種于胰酶解酪蛋白黃豆培養(yǎng)液(TSB)中，于34℃在一旋轉(zhuǎn)搖床中通氣培養(yǎng)16-18小時(shí)。然后離心收集細(xì)菌，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，0.14M NaCl，3mMKCl，8mM Na2HPO4-7H2O，.1.5mM KH2PO4，pH7.2)沖洗兩次，該鹽水每毫升含有150個(gè)胰蛋白酶抑制單位(T.I.U.)抑肽酶(Sigma，St.Louis，MO)。
將最后一次離心所得沉淀重新懸浮于0.17M三乙醇胺、20mM乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉鹽溶液中，然后在冰上均化10分鐘。于14，900xg轉(zhuǎn)速離心，除掉從勻漿中沉淀的碎片，上清液再次按上法離心，再次除掉沉淀。當(dāng)以141，000xg的轉(zhuǎn)速離心1小時(shí)后，細(xì)胞膜從上清液中沉淀。除去上清液，于每毫升含有75T.I.U.抑制肽酶的10毫升PBS中在4℃過夜保存細(xì)胞膜沉淀。第二天通過旋轉(zhuǎn)重新懸浮沉淀，然后將其分成等分，再于-70℃保存。其中每份的蛋白質(zhì)含量用Lowry等(1951，J.Biol.Chem.，193∶265-275)的方法進(jìn)行了測(cè)定。
用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的抗原平板按下法制備。在PBS中將外膜制品稀釋至每毫升蛋白質(zhì)5微克的濃度，將50微升的該溶液投放到96孔平板(Linbr1 ＃ 76-031-05，F(xiàn)low Laboratorces，Inc.，Mcleam，VA)的每一孔中，密封后于37℃過夜培養(yǎng)。將未結(jié)合的抗體從平板中輕輕除掉，向每一孔中加入100微升溶于PBS的5%(W/V)牛血清白蛋白(BSA)后，于37℃將平板培養(yǎng)1小時(shí)。
輕除未吸附BSA后，將從融合平板的每一孔得到的培養(yǎng)物上清液(50微升)重新投放到相應(yīng)的抗原平板的孔中，于37℃培養(yǎng)30分鐘。從孔中輕除未結(jié)合的抗體，然后每孔用100微升1%(W/V)BSA-PBS洗三次。接著，將適當(dāng)稀釋的生物素化的山羊抗鼠Ig G(Tago，Inc.，Burlingame，CA)以每孔50微升的量加到每一孔中，于37℃培養(yǎng)30分鐘。再將平板按上述方法洗三次，將按制造者的說(shuō)明所制備的預(yù)先形成的抗生物素蛋白∶生物素化的辣根過氧化物酶復(fù)合物(Vectastain ABC Kit，Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)加到孔中。于室溫下放置30分鐘后，從孔中輕除Vectastain試劑，如上一樣洗孔，然后向每孔中加入100微升底物，即鄰-苯-烯二胺(enediamine)(以0.8毫克/毫升的量溶于0.1M檸檬酸緩沖液，pH5.0，與等體積的0.03%(V/V)H2O2混合)。于室溫中在暗處將底物保溫30分鐘，然后以50微升/孔的量加入3NH2SO4以終止反應(yīng)。
通過在Dynatech Model 580微酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定讀數(shù)器Alexandria，VA)上測(cè)定每孔中比色反應(yīng)在490nm處的吸收，找出分泌結(jié)合到兩種抗原制品中的任一種上的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。一個(gè)孔中的定名為Pa3 IVC2的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體僅結(jié)合到Fisher免疫型2抗原平板上。對(duì)這一孔的進(jìn)一步研究見如下所述。來(lái)自這一孔中的單克隆抗體和克隆細(xì)胞系在下面的文章中均用Pa3 IVC2符號(hào)表示。得自主孔的Pa3 IVC2細(xì)胞按Tam等(1982，lnfect.1mmun.，36∶1042-1053)所述的有限稀釋技術(shù)被微克隆和克隆。
按照Tam等所述的方法(1982，1nfect.1mmun.，36∶1042-1053)在CB6 F1小鼠(BALB/C[雌]×C57BL/6[雄]F1)中制備含有高效價(jià)單克隆抗體的腹水液。在用對(duì)數(shù)期Pa3 IVC2細(xì)胞(溶于RPMI)進(jìn)行腹膜注射前10-21天，用0.5毫升Pristane(2，6，10，14-四甲基十五烷，Aldrich Chemical Co.Milwaukee，WI)對(duì)兩至三月令的雄性CB6 F1，小鼠進(jìn)行腹膜注射。每個(gè)小鼠用0.5毫升的0.5-1×107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行注射。大約兩周后，每?jī)芍寥鞆男∈笾腥〕龇e累的液體。用瓊脂糖凝膠電泳儀(Paragon，Bechkman，lnstruments，lnc.，Brea，CA)測(cè)定腹水液中抗體的濃度。收集所有含5毫克/毫升或更多抗體的腹水，等分后于-70℃保存。
被單克隆抗體結(jié)合的分子靶的特征按照上面所述的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法在外膜制品上測(cè)定從克隆的Pa3 IVC2細(xì)胞系得來(lái)的培養(yǎng)物上清液，這些外膜制品來(lái)自所有七個(gè)銅綠假單胞菌Fisher免疫型菌株(A.T.C.C.27312-27318)，致金色假單胞菌(A.T.C.C.13985)和肺炎克雷伯氏菌(A.T.C.C.8047)，它們都是按上述方法準(zhǔn)備?？贵wPa3 IVC2結(jié)合到銅綠假單胞菌Fisher免疫型2，6和7的外膜制品上，而不與其它的Fisher免疫型、致金色假單胞菌或肺炎克雷伯氏菌的外膜制品結(jié)合。
用抗體Pa3 IVC2鑒定過的特定抗原通過放射免疫沉淀進(jìn)行了鑒定。簡(jiǎn)言之，這一分析需要將Pa3 IVC2抗體和來(lái)源于蛋白質(zhì)A的顆粒(它導(dǎo)致形成不溶性抗原抗體復(fù)合物的形成)與放射性標(biāo)記的抗原一起保溫。沖洗這一復(fù)合物，除去任何非特異性結(jié)合的抗原，然后在聚丙烯酰胺凝膠中將其分離，并且分散。凝膠中發(fā)現(xiàn)的主要的放射活性種被鑒定為與抗體Pa3 IVC2結(jié)合的相應(yīng)抗原。
可溶性的銅綠假單胞菌Fisher免疫型2，3，4和5的外膜制品的等分樣品在固相中使用Iodo-gen(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)被125I進(jìn)行了放射性標(biāo)記(Fraker and Speck，1978，Biochem.Biophys.Res.Commun.，80∶849-857;Markwell and For，1978，Biochemistry，17∶4807-4817)。這一方法即使沒有導(dǎo)致外膜制品中含有的所有蛋白質(zhì)被碘化，那么也導(dǎo)致了大部分外露的酪氨酸殘基被碘化。
為了減少外膜抗原與抗體Pa3 IVC2的非特異性結(jié)合，首先將放射性標(biāo)記的制品(每次測(cè)定的每分計(jì)數(shù)為5×106)與BALB/C正常小鼠血清(1∶40的最終稀釋)于4℃保溫1小時(shí)。然后將含有Pa3IVC2抗體的Pa3 IVC2培養(yǎng)物上清液(0.5毫升)加到每一個(gè)外膜樣品中。于4℃將抗原和抗體保溫1小時(shí)后，加進(jìn)蛋白質(zhì)A源，Ig G SORB(每個(gè)樣品0.095毫升)(The Enzyme Center，Inc.，Boston，MA)，于4℃繼續(xù)保溫30分鐘(Kessler，S.W.，1975，J.Immunol.，115∶1617-1622)。Ig G SORB可按生產(chǎn)人的說(shuō)明進(jìn)行制備，在使用前，通過用RPM I-雜種(除去HAT的RPM I-雜化-HAT培養(yǎng)基)沖洗Ig G SORB兩次，來(lái)封閉潛在的與培養(yǎng)基的反應(yīng)位點(diǎn)，就可以防止非特異性的反應(yīng)。
于4℃以1500×g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，沉淀抗原-抗體-IgG SORB復(fù)合物，然后用磷酸鹽-RIPA緩沖液(10mM磷酸鹽，pH7.2，0.15M Na Cl，1.0%[V/V]Triton X-100，1.0%[W/V]脫氧膽酸鹽，0.1%[W/V]十二烷基磺酸鈉[SDS]和1.0%[V/V]aprotimin)洗兩次;用高鹽緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH8.0，0.5MLiCl，1%[V/V]β-巰基乙醇)洗兩次;用裂解緩沖液(0.02M Tris-HCl，pH7.5，0.05M NaCl，0.05%[V/V]Nonidet P-40)洗一次(Rohrschneider等，1979，Proc，Natl，Acad，Sci.，U.S.A，76∶4479-4483)。結(jié)合到復(fù)合物上的抗原通過與樣品緩沖液(0.125M Tris-HCl，pH6.8，2%[W/V]SDS，2%[V/V]β-巰基乙醇，20%[V/V]甘油)一起在95℃保溫10分鐘而被釋放，且通過以1500×g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘后匯集在上清液中。
然后將上清液置于按照經(jīng)Hancock和Carey修改(1979，J.Bacteriol，140∶902-910，通過在此引述合并于本發(fā)明)的B-Lugtenberg等人的方法(1978，F(xiàn)EBS Lett.，58∶254-258)制備的含有SDS的14%聚丙酰胺凝膠中。通過在50V的恒定電壓下過夜電泳，抗原在凝膠中被分離。在40%(V/V)甲醇，10%(V/V)乙酸和5%(V/V)甘油中將凝膠過夜固定后，通過一種Biorad凝膠干燥器(Rechmond，CA)將它在Whatman 3MM紙上干燥。用一塑料包裝物將干燥凝膠覆蓋，且在室溫下對(duì)柯達(dá)X-AR膠片暴光18小時(shí)。
這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，Pa3 IVC2只與銅綠假單胞菌Fisher免疫型2的外膜制品中的一種抗原結(jié)合，而不與其它的外膜制品中存在的任何抗原結(jié)合。凝膠中的抗原的分子量(MW)大約為53，000道爾頓，它是通過比較它與在同一凝膠中分散的14C-標(biāo)記的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(磷酸化酶B，92，5000MW;BSA，69，000MW;卵清蛋白，46，000MW;碳酸酐酶，30，000MW;細(xì)胞色素C，12，000MW)(New England Nuclear，Boston，MA)的遷移率而測(cè)定的。據(jù)Montie等報(bào)道(1982，Infect.Immun.，35∶281-288)，該文獻(xiàn)通過在此引述而合并于本發(fā)明)，這一抗原的分子量與鞭毛蛋白(即組成銅綠假單胞菌的鞭毛的蛋白質(zhì))的分子量相關(guān)。
另外，使用被乙醇固定到96孔微滴定板上的銅綠假單胞菌Habs菌株1-12(A、T、C、C、33348-33359)，通過ELISA對(duì)Pa3 IVC2進(jìn)行了檢查。抗原平板的制備方法如下。
離心沉淀每種生物的過夜培養(yǎng)物，用PBS洗兩次后重新懸浮在PBS中，使其在A660處為0.2 O.D.單位。將稀釋過的細(xì)菌涂布在孔中(每孔50微升)，然后在室溫下以1500×g的轉(zhuǎn)速離心15分子。吸出PBS后向孔中加入95%的乙醇，且于室溫下保持15分鐘。在乙醇從孔中輕除后，將平板空氣干燥，包裹后在4℃保存起來(lái)，以備使用。
按上述方法所完成的ELISA的結(jié)果表明，Pa3 IVC2結(jié)合到乙醇固定的Habs菌株2，3，4，5，7，10，11和12上。這種特異性表明Pa3 IVC2結(jié)合到銅綠假單胞菌的b型鞭毛上(Ansorg，R.，1978，zbl，Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.A.242∶228-238;Ansorg，R.，1984，J.Clin.Microbiol.，20∶84-88，這兩篇文章都通過在此引述而合并于本文。).根據(jù)這種對(duì)于單克隆的Pa3 IVC2的特異性的分配，可知銅綠假單胞菌參考菌株Fisher免疫型2，F(xiàn)isher免疫型6和Fisher 7帶有b型鞭毛。從前面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，Pa3 IVC2特異性地與銅綠假單胞菌b型鞭毛蛋白結(jié)合。
Pa3 IVC2體內(nèi)保護(hù)活性進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以測(cè)定單克隆抗體PA3 IVC2是否能夠保護(hù)被多種LD50量活銅綠假單胞菌攻擊的小鼠。所選擇的模型是被灼傷的小鼠模型(Collins，M.S.和Roby，R.E.，1983，J.Trauma，23∶530-534，該文通過在此引述而合并于本發(fā)明)。按照作者的方法將各組小鼠嚴(yán)重的灼傷，然后立即用5-10LD50的Fisher免疫型7攻擊。在灼傷和攻擊前，按高效價(jià)的腹水對(duì)小鼠腹膜注射單克隆抗體(0.2毫升腹膜注射)。與未接受抗體的小鼠比較，在用Pa3 IVC2處理的動(dòng)物中，其存活數(shù)并沒有增加。
實(shí)例2實(shí)例2說(shuō)明了制備產(chǎn)生鼠單克隆抗體的鼠雜交瘤細(xì)胞系的方法，而這種抗體是在體內(nèi)抗銅綠假單胞菌b型鞭毛蛋白的保護(hù)性抗體。
在用活的銅綠假單胞菌Fisher免疫型5(ATCC27316號(hào))對(duì)成年雌性BALB/C小鼠進(jìn)行腹膜注射(4×106個(gè)生物體)兩周以后，用活的銅綠假單胞菌Fisher免疫型6(ATCC27317號(hào))對(duì)它進(jìn)行第一次腹膜注射(8×106個(gè)生物體)。在接下來(lái)的兩周時(shí)間內(nèi)，每周用活的銅綠假單胞菌Fisher免疫型5和Fisher免疫型6一起注射一次，共兩次。每種生物的劑量不斷增加，致最終劑量為最初劑量的10倍。在最后一次活細(xì)菌注射四天以后，用按照R.E.W.Hancock和H.Nikaido 1978，J.Bacteriol.，136∶381-390)的方法制備的銅綠假單胞菌Fisher免疫型6外膜制品(50微克蛋白質(zhì))對(duì)小鼠進(jìn)行最后一次注射。最后一次免疫后三天，從一小鼠中取出脾臟，按照實(shí)例1所述的方法制備用于雜交的脾細(xì)胞。
在融合后的第十天，按照實(shí)例1所述的方法，通過ELISA測(cè)定雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中抗銅綠假單胞菌抗體的存在，但用于ELISA平板的抗原是固定到96孔微滴定平板的孔中的活細(xì)菌時(shí)除外。平板的制法如下將50微升聚-L-賴氨酸(PLL)(以1微克/毫升溶于PBS)(Sigma ＃P-1524，St.Louis，MO)加到96孔平板(Linbro)每一孔中，于室溫下保溫30分鐘。輕除未吸附的PLL，用PBS洗孔三次。在TSB中過夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物用PBS洗一次，然后重浮于PBS中，致O.D.660nm＝0.2。向平板的每一孔中加入50微升的細(xì)菌懸浮液，于37℃讓它結(jié)合1小時(shí)。未結(jié)合的細(xì)菌通過輕搖平板除去，然后用鹽水-吐溫(0.9%[W/V]NaCl，0.5%[V/V]吐溫-20)洗孔三次。
抗體的非特異性結(jié)合可通過向孔中加入200微升/孔的保護(hù)緩沖液(含有5%[W/V]去脂干乳、0.01%[V/V]Antifoam A[Sigma，St.Louis，MO]和0.01%[W/V]乙基汞硫代水揚(yáng)酸鈉)且于室溫下保溫1小時(shí)而被阻止。排出過量的保護(hù)緩沖液，用前面所述的鹽水-吐溫洗孔三次。
將培養(yǎng)物上清液(50微升)復(fù)制到測(cè)定平板的相應(yīng)孔中，于室溫下保溫30分鐘。通過輕搖平板除去培養(yǎng)物上清液，然后用鹽水-吐溫洗孔五次。
在預(yù)先測(cè)定了的效價(jià)的含有0.1%(V/V)吐溫-20和0.2%(W/V)BSA的PBS中稀釋連接了酶的第二步抗體(結(jié)合了辣根過氧化物酶的山羊抗鼠Ig G+IgM)(Tago，Inc.，Burlingane，CA)，向每孔中加入50微升的該試劑，于室溫下保溫30分鐘，排出過量的試劑;在鹽水-吐溫中洗5次;然后按實(shí)例1所述的方法，每孔加入100微升鄰-苯二胺底物，保溫30分鐘。按實(shí)例1所述的方法終止反應(yīng)。然后在Bio-Tek EL-310Automated EIA Plate Reader上于A(490納米處讀數(shù)。
按照上述方法，測(cè)定從融合物得到的培養(yǎng)物上清液與銅綠假單胞菌Fisher免疫型1，2，3或4結(jié)合的抗體的存在，但這種抗體不與按照同樣的PLL和阻止方法制備的而不含細(xì)菌的平板結(jié)合。分別用七種Fisher免疫型細(xì)菌來(lái)檢測(cè)含有與這四種Fisher免疫型中的任一種結(jié)合的抗體的上清液。存在于從一個(gè)孔中得來(lái)的上清液中的抗體Pa F4 IVE8僅僅與銅綠假單胞菌Fisher免疫型2，6和7結(jié)合。用實(shí)例1所述的有限稀釋法，克隆來(lái)自孔Pa F4 IVE8的細(xì)胞。從這一孔得來(lái)的單克隆抗體和克隆細(xì)胞系在下文中均用Pa F4 IVE8命名來(lái)表示。如同實(shí)例1所述，產(chǎn)生了含高效價(jià)的單克隆抗體的腹水液，僅是使用BALB/C小鼠代替了CB6 F1。
Pa F4 IVE8的特異性一個(gè)用于鑒定結(jié)合到單克隆抗體Pa F4 IVE8上的抗原的測(cè)定是用在細(xì)菌體上的間接免疫熒光方法進(jìn)行的。將銅綠假單胞菌的七種參考Fisher免疫型中的每一種、不具鞭毛的銅綠假單胞菌菌株(PA103，A、T、C、C29260，Leifson，1951，J.Bacteriol.，62∶377-389)和大腸桿菌(G.S.C.A25)于37℃在TSB中過夜培養(yǎng)。離心沉淀細(xì)菌，然后在PBS中洗兩次。每種菌株在PBS中重新懸浮，致其O.D.660nm＝2.2。
細(xì)菌懸浮液進(jìn)一步以1∶150稀釋，將20微升樣品加到Carlson玻片(Calson Scientific Inc.，Peotone，IL)的各個(gè)孔中，然后于40℃干燥玻片。在一潮濕房間中，將Pa F4 IVE8的培養(yǎng)物上清液(25微升)于室溫下在玻片中的干燥細(xì)菌樣品上保溫30分鐘。未結(jié)合的抗體通過在蒸餾水中浸泡玻片而從被玻片上洗掉。
玻片干燥后，在一潮濕的暗房中，將連接了熒光素異硫氰酸鹽的山羊抗鼠Ig G+Ig M(每孔25微升，用PBS以1∶40稀釋)(Tago，Burlingame，CA)在玻片上于室溫中保溫30分鐘。在再用蒸餾水沖洗玻片，干燥后用蓋玻片復(fù)蓋，且用甘油(在PBS中，9∶1)固定。用熒光顯微鏡觀察玻片。
僅在銅綠假單胞菌Fisher免疫型2，6和7中觀察到熒光染料，且觀察到是一種從生物體的僅一端發(fā)射出的正弦圖案(線)。這與這些細(xì)菌極生單鞭毛的形態(tài)學(xué)和分類相一致。
Pa F4 IVE8與鞭毛的反應(yīng)通過免疫吸印分析而被證實(shí)。來(lái)自銅綠假單胞菌Fisher免疫型6(見實(shí)例1)的外膜抗原通過電泳而被分離，電泳是按實(shí)例1所述的方法在含有SDS的14%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行，不同的只是電泳是在80毫安的恒定電流強(qiáng)度下跑5個(gè)小時(shí)。預(yù)先染色的分子量標(biāo)記物(溶菌酶，14，300MW，β-乳球蛋白，18，400MW;α-胰凝乳蛋白酶原，25，700MW;卵清蛋白，43，000MW;牛清蛋白，68，000MW;磷酸化酶B，97，400MW;肌球蛋白，200，000MW)(BRL，Gaithersfurg，MD)也包括在同一聚丙烯酰胺凝膠中。
通過在含有0.05%(W/V)SDS的Tris-甘氨酸-甲醇緩沖液(Towfin等，
，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，76∶4350-4354)中于4℃、200mA的恒定電流強(qiáng)度下過夜電泳，將抗原從聚合丙烯酰胺凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(NCM)(0.45um，Schleicher & Schuell，Inc.，Keen.NH)。轉(zhuǎn)移后，將NCM在溶于PBS的0.05%(V/V)吐溫-20(PBS-吐溫)(Batteiger，B.d等，1982，J.Immunol.Meth.，55∶297-307)中于室溫保溫1小時(shí)。從這一步及所有以后步驟起，將含有NCM的淺盤置于搖床上，以保證溶液均勻分布于整個(gè)NCM。
1小時(shí)之后，例出PBS-吐溫溶液，加入Pa F4 IVE8腹水(以PBS-吐溫中1∶1000稀釋)，再于室溫中與NCM一起保溫1小時(shí)。然后用PBS-吐溫沖洗NCM五次，每5分鐘一次，以除去未結(jié)合的抗體。連接了堿性磷酸酶的山羊抗鼠Ig G+Ig M(Tago，Inc.)按照制造者的說(shuō)明進(jìn)行稀釋，然后與NCM一起在室溫下保溫1小時(shí)。象上述一樣沖洗NCM五次，然后加入含有溴氯吲哚磷酸鹽和氮藍(lán)四唑的底物(Sigma，St.Louis，MO)(按照Leary等，1983，Proc，Natl.Natl.Aead.Sci.，U.S.A.，80∶4045-4049所述的方法制備)，在室溫下保溫10-20分鐘。反應(yīng)的終止是通過用蒸餾水滌掉底物而完成。
這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，Pa F4 IVE8與外膜制品中具有53，000道爾頓的分子量的單個(gè)抗原特異性結(jié)合。間接免疫熒光測(cè)定和免疫吸印的結(jié)果表明，Pa F4 IVE8與銅綠假單胞菌的鞭毛結(jié)合。
Pa F4 IVE8所識(shí)別的鞭毛型用ELISA進(jìn)行了測(cè)定。將每種Habs菌1-12(ATCC33348-33359號(hào)與帶有PLL的96孔微滴定板(Linbro)的孔結(jié)合。ELISA按在此實(shí)驗(yàn)前面部分所述的方法進(jìn)行。Pa F4 IVE8抗體的來(lái)源是培養(yǎng)物上清液。觀察到在含有Habs菌株2，3，4，5，7，10，11，和12的孔中發(fā)生了陽(yáng)性反應(yīng)，這表明Pa F4 IVE8與b型鞭毛結(jié)合。在下面的實(shí)例4中給出了體內(nèi)保護(hù)數(shù)據(jù)。
實(shí)施例3實(shí)施例3說(shuō)明了制備產(chǎn)生單克隆抗體的鼠雜交瘤細(xì)胞系的方法，而這種抗體是與抗-銅綠假單胞菌a型鞭毛相反應(yīng)并在體內(nèi)是保護(hù)性的。
用于融合的淋巴樣細(xì)胞的來(lái)源是從被免疫的BALB/C小鼠得來(lái)源的脾臟，這種小鼠在6周的時(shí)間內(nèi)腹膜注射了4次得自Habs菌株6和8(ATCC33353和33355號(hào))的純化型鞭毛(10-20微克蛋白質(zhì))。鞭毛的純化是按照T.C.Montie等的方法(1982，Infect，Immun.，35∶281-288，它在此被引入本發(fā)明作為參考)進(jìn)行，其不同僅僅為，最后鞭毛的離心是在100，000xg的轉(zhuǎn)速下離心1小時(shí)，而不是在40，000xg的轉(zhuǎn)速下離心3小時(shí)。為了適應(yīng)某些方法的第二種修改是，在一混合物中30秒鐘內(nèi)從細(xì)菌中切除鞭毛，而不是3分鐘。(Allison等，1985，Imfect.Immun.，49∶770-774)。
每種制品的蛋白質(zhì)濃度用Bio-Rad Protein Assay儀(Bio-Rad，Richmond，CA)進(jìn)行了測(cè)定，污染性脂多糖(LPS)的存在通過測(cè)定KDO含量而被確定(Karkhanis，Y.D.，等，1978，Ansl.Biochem.，85∶595-601)。鞭毛蛋白的分子量是通過將它們與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo)記物(見實(shí)例2)在SDS聚丙烯酰胺凝膠中的遷移而被測(cè)定。Habs6鞭毛蛋白的分子量是51，700道爾頓，而Habs 8鞭毛蛋白則為47，200道爾頓。這些數(shù)值與J.S.Allison得出的數(shù)值(1985，Infect.Immun.，49∶770-774，通過在此引述而將該文獻(xiàn)合并于本文)一致。
按照實(shí)例1和2所述，在最后一次免疫后的第三天將來(lái)自鞭毛蛋白免疫過的鼠脾細(xì)胞和NS-1骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)到大約40%的融合(第七天)時(shí)，將培養(yǎng)物上清液復(fù)制到三個(gè)不同的抗原平板[即PLL-結(jié)合的銅綠假單胞菌Fisher免疫型1(制備見例Ⅰ)和福爾馬林固定的Habs6和Habs9)的相應(yīng)孔中。
培養(yǎng)用于福爾馬林固定的抗原平板的細(xì)菌，洗滌后象PLL-結(jié)合的抗原平板所述的一樣進(jìn)行稀釋。稀釋后的細(xì)菌(A660處為0.2 O.D.單位)加到Linbro 96孔微量滴定平板的各個(gè)孔中(每孔50微升)，然后在室溫下以1200×g的轉(zhuǎn)速將平板離心20分鐘。離心后從孔中輕除上清液，再向每孔中加入75微升在PBS中的0.2%(V/V)的福爾馬林，于室溫下保溫15分鐘。從孔中輕除福爾馬林后，空氣干燥平板，于4℃保存以備使用?？贡廾目寡迥鄹栺R林處理過的生物體的能力表明，福爾馬林沒有改變鞭毛的抗原性(Lanyi，B.，1970，Acta Microbiol.Acad.Sci.，Hung.，17∶35-48)。銅綠假單胞菌Fisher免疫型1菌株是作為對(duì)照包括進(jìn)來(lái)，因?yàn)橥ㄟ^媒染劑染料染色(Manual of Clin，Microbiol.，1985，Lennette，ed.Amer.Soc.Microfiol.，Wash.，D.C.，P.1099)證明，這一菌株不具鞭毛?？字械谋环Q作FA6 IIG5的雜交細(xì)胞產(chǎn)生與Habs6和Habs9(兩者均為帶有a型鞭毛的菌株)結(jié)合而不與Fisher免疫型1結(jié)合的抗體。
按照前面的例子中所述的方法，將孔中的FA6 IIG5細(xì)胞傳代培養(yǎng)及克隆。從這一孔中得到的單克隆抗體和克隆細(xì)胞系在下文中均用FA6 IIG5表示。腹水按實(shí)例2所述的方法在BALB/C小鼠中產(chǎn)生。
FA6 IIG5的特異性通過間接免疫熒光和免疫吸印確定抗體FA6 IIG5的特異性。間接免疫熒光基本上按實(shí)施例2所述方法進(jìn)行，改動(dòng)之處如下。
在30℃下使細(xì)菌培養(yǎng)物在胰蛋白酶大豆瓊脂平板上生長(zhǎng)過夜，用棉簽從平板上取出培養(yǎng)物并重新懸浮在磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)中，使其A660為0.2 O.D.單位。在攪拌下將福爾馬林(在PBS中的終濃度為0.37%[v/v])加到懸浮液中。在室溫下培育15分鐘后，以1∶12用PBS稀釋細(xì)菌并將20μl該懸浮液放入Carlson載玻片的每個(gè)孔中。干燥后，如實(shí)施例2所述制備觀察用的玻片?？贵w的來(lái)源是FA6 IIG5細(xì)胞系培養(yǎng)物上清液。
僅在帶有a型鞭毛的銅綠每單胞菌菌株中觀察到利用FA6 IIG5抗體的熒光染色，而在任何一種帶有b型鞭毛的菌株沒有觀察到熒光染色。觀察到的熒光圖譜是正弦曲線圖譜，這表明FA6 IIG5結(jié)合到鞭毛上。用福爾馬林處理細(xì)菌可增強(qiáng)熒光信號(hào)，但用抗體使染色的鞭毛顯色不需處理。
如實(shí)施例2所述進(jìn)行免疫吸印。a型鞭毛抗原的來(lái)源是純化的鞭毛制品(見本實(shí)施例)。在含有SDS的10%聚丙烯酰胺凝膠中使抗原分離(Laemmli，U.K.1970，Nature[London]，227∶680-685)并轉(zhuǎn)移到NCM中。使FA6 IIG5制劑，即培養(yǎng)物上清液或以1∶1000稀釋的腹水，與NCM反應(yīng)，如實(shí)施例2所述用合適的結(jié)合酶試劑和酶底物檢測(cè)該反應(yīng)。免疫吸印說(shuō)明FA6 IIG5特異地結(jié)合到Habs6的鞭毛蛋白(分子量為51，700)和Habs8的鞭毛蛋白(分子量為47，200)上。
用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)可獲得FA6 IIG5只與a型鞭毛而不與b型鞭毛反應(yīng)的證據(jù)，其中將Habs菌株1-12分別與PLL一起結(jié)合到Linbro 96孔微滴平板的孔上。該抗體只結(jié)合到Habs菌株1，6，8和9上，這些菌株是12個(gè)菌株中僅具有a型鞭毛的菌株(見Ansorg，R.，et.al.，1984，J.Clin.Microbiol.，20∶84-88，在此列為參考文獻(xiàn))。在下面的實(shí)施例4中描述了體內(nèi)保護(hù)性研究。
實(shí)施例4實(shí)施例4說(shuō)明在燒傷小鼠模型中用Pa F4 IVE8和FA6 IIG5抗體被動(dòng)免疫的小鼠不受銅綠假單胞菌的攻擊的保護(hù)作用。
按照M.S.Collins和R.E.Roby的方法(1983，J.Trauma，23∶530-534，在此列為參考文獻(xiàn))在燒傷小鼠模型中試驗(yàn)了抗鞭毛單克隆抗體。為了保護(hù)性研究，通過蛋白A-瓊脂糖層析法(Ey，P.L.，et al.，1978，Immunochemistry，15∶429-436，在此列為參考文獻(xiàn))提純了所有抗體，并透析到PBS緩沖液中。用于動(dòng)物試驗(yàn)的具有a型鞭毛的菌株是銅綠假單細(xì)胞PA220(來(lái)自Dr.James Pennington，Boston，MA)，作為對(duì)照的b型鞭毛菌株是銅綠假單胞菌Fisher免疫型2(A.T.C.C.＃ 27313)。
每只小鼠在燒傷和攻擊之前1-2小時(shí)靜脈注射40μg純化單克隆抗體。燒傷后，動(dòng)物立刻于焦痂下(subeschar)接受0.5ml含有攻擊細(xì)菌的冷PBS.攻擊劑量約為每個(gè)有機(jī)體10LD50。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果列在表Ⅰ和表Ⅱ中。
表Ⅰ.抗a型鞭毛單克隆抗體在燒傷小鼠模型1中的保護(hù)性研究每天存活百分?jǐn)?shù)2處理 1 2 3 4 5 6 7 8 9抗鞭毛a， 100 100 100 100 100 90 90 80 80FA6 IIG5抗鞭毛b， 100 20 10 10 10 10 10 10 10Pa F4 IVE8非特異性抗- 100 40 30 20 10 10 10 10 10LPS單克隆抗體PBS，無(wú)機(jī)菌 80 80 80 80 80 80 80 80 80
1.用大約10LD50的銅綠假單胞菌PA220焦痂下攻擊小鼠。
2.百分比基于在10只動(dòng)物組中小鼠的存活率，只有對(duì)照組PBS由5只小鼠組成除外。天數(shù)是指燒傷和攻擊后的天數(shù)。
表Ⅱ.抗b型鞭毛單克隆抗體在燒傷小鼠模型1中的保護(hù)性研究每天存活百分?jǐn)?shù)2處理 1 2 3 4 5 6 7 8 9抗鞭毛b， 100 100 90 90 90 90 90 90 90Pa F4 IVE8抗鞭毛a， 100 20 10 10 10 10 10 10 10FA6 IIG5非特異性抗- 100 20 20 20 20 20 20 20 20LBS單克隆抗體PBS，無(wú)細(xì)菌 100 100 100 100 100 100 100 100 1001.用大約10LD50的銅綠假單胞菌Fisher免疫型2焦痂下攻擊小鼠。
2.百分存活率基于每組10只小鼠的存活數(shù)，只有對(duì)照組PBS例外，它由5只小鼠組成。天數(shù)是指燒傷和攻擊后的天數(shù)。
在用抗-a抗體或抗-b抗體處理，然后用相應(yīng)的抗原攻擊的小鼠中觀察到顯著的存活率。相反地，80-90%未經(jīng)處理，但受過攻擊的小鼠或用不匹配的抗鞭毛單克隆抗體或非特異性抗-LPS抗體處理的動(dòng)物死亡?？?a型鞭毛抗體不能使小鼠免受具有b型鞭毛的銅綠假單胞菌Fisher免疫型2的致死攻擊，抗-b型鞭毛抗體不能使小鼠免受具有a型鞭毛的銅綠假單胞菌PA220的致死攻擊，在體內(nèi)證實(shí)了在體外觀察到的抗體的專一性。燒傷，但未受感染小鼠的存活率表明燒傷本身不會(huì)致死。
實(shí)施例5實(shí)施例5說(shuō)明Pa F4 IVB8和FA6 IIG5與銅綠假單胞菌臨床分離物的廣泛的交叉反應(yīng)性，表明這些抗體在銅綠假單胞菌感染的免疫治療中的臨床應(yīng)用。
從醫(yī)院和診所得到臨床分離菌。分離菌來(lái)自于各種分離點(diǎn)，包括血液，傷口，呼吸道，尿，和耳朵。共檢驗(yàn)了157個(gè)分離菌。
Pa F4 IVB8特異地結(jié)合到34個(gè)臨床分離菌上(22%)，而a型鞭毛抗體，F(xiàn)A6 IIG5結(jié)合到102個(gè)臨床分離菌上(65%)，157個(gè)分離菌中共有136個(gè)被結(jié)合(87%)。在未被任-抗體識(shí)別的21個(gè)菌株中，有19株無(wú)鞭毛，如媒染劑染色所示。因此，兩種抗體都結(jié)合到138個(gè)具鞭毛的臨床分離菌的136個(gè)菌株上(98%)，證實(shí)了以前的報(bào)導(dǎo)(見R.Ansorg，1978，zbl.Bakt.Hyg.，IAbt.Orig.A，242∶228-238，在此列為參考文獻(xiàn))。
實(shí)施例6實(shí)施例6說(shuō)明結(jié)合到銅綠單胞菌b型鞭毛上的人單隆抗體的生產(chǎn)方法。
來(lái)自用高分子量多糖制劑免疫的個(gè)體的外周血樣品(Pier et al.，1984，Infeet Immun.，45∶309)作為B細(xì)胞的來(lái)源。用標(biāo)準(zhǔn)離心技術(shù)在Ficoll-Paque上從血液中分離出單核細(xì)胞(Boyum(1968)Scand.J.Clin.Lab.Invest.，21∶77)并用無(wú)鈣/鎂的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)洗滌兩次。
用改良E-玫瑰花結(jié)法除去單核細(xì)胞中的T-細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，首先在4℃下將細(xì)胞重新懸浮在含有20%胎牛血清(FCS)的PBS中，濃度為1×107細(xì)胞/ml。然后將1ml該懸浮液放在一克17×100mm聚苯乙烯圓底試管中，向管中加入1×1092-氨基-溴化異硫脲(AET)處理的羊紅血球[來(lái)自10%(v/v)的Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(Iscove培養(yǎng)基)溶液](Madsen snd Johnson(1979)J.Immun.Methods，27∶61)。在4℃下將懸浮液輕輕混合5-10分鐘，然后在4℃下以2500×g的速度在Ficoll Paque上離心8分鐘除去E-玫瑰花結(jié)細(xì)胞。收集在界面處結(jié)合的E-玫瑰花結(jié)陰性外周血單核細(xì)胞(E-PBMC)并用Iscove培養(yǎng)基洗滌一次，重新懸浮在含有15%(v/v)FCS，L-谷氨酰胺(2mmol/l)，青霉素(100 IV/ml)，鏈霉素(100 μg/ml)，次黃嘌呤(1×10-4M)，氨基蝶呤(4×10-7M)和胸苷(1.6×10-5M)的Iscove培養(yǎng)基中。此后將這種培養(yǎng)基稱作為HAT-培養(yǎng)基。
這些細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞系一起混合培養(yǎng)來(lái)完成E-PBMC的細(xì)胞從動(dòng)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系是Epstein-Barr核抗原(EBNA)陽(yáng)性人淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系，該細(xì)胞系通過GM1500淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系的乙基甲烷-硫酸鹽(EMS)誘變，然后在30μg/ml 6-硫代鳥嘌呤存在條件下篩選使細(xì)胞變?yōu)榇吸S嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺乏，從而HAT敏感而得到。該細(xì)胞系被命名為1A2細(xì)胞系并于1982年3月29日貯存在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(A.T.C.C)，A.T.C.C.號(hào)為CRL8119。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1A2細(xì)胞懸浮在HAT-培養(yǎng)基中，然后從每個(gè)PBMC含15個(gè)1A2細(xì)胞的比例與E-PBMC結(jié)合。將細(xì)胞混合物置入在30個(gè)圓底96孔的微滴平板(Costar 3799)中，濃度為32，000細(xì)胞/孔，體積為200μl/孔，在37℃，含有6%CO2的濕潤(rùn)空氣中培育。在平板培養(yǎng)后的第5天和第天用新鮮培養(yǎng)基取代一半上清液培養(yǎng)細(xì)胞。平板培養(yǎng)后16天，100%的孔含有多育的細(xì)胞并且在大多數(shù)孔中細(xì)胞都具有足夠的密度可取出并試驗(yàn)抗銅綠假單胞菌抗體的上清液。
用實(shí)施例2所述的ELISA技術(shù)(做如下改動(dòng))篩選有抗銅綠假單胞菌抗體存在的上清液。將7個(gè)Fisher免疫型參照菌株庫(kù)(A.T.C.C.號(hào)27312-27318)(A660＝0.2O.D.單位)結(jié)合到用聚-L-賴氨酸預(yù)先處理過的平底96孔的微滴平板中(Immulon II，Dynatech)，培育，并按實(shí)施例2所述方法洗滌。阻斷非專一性結(jié)合位點(diǎn)并洗滌平板，然后在每個(gè)孔中加入50μl含有0.1%(v/v)吐溫-20和0.2%(w/v)BSA的PBS。然后將培養(yǎng)物上清液(50μl)復(fù)制平板培養(yǎng)到測(cè)定平板的相應(yīng)孔中及用PLL處理并阻斷，但不含細(xì)菌的對(duì)照平板中。在培育并洗滌后，將結(jié)合酶第二步抗體(50ml/孔)，辣根進(jìn)氧化酶結(jié)合山羊抗-人Ig G和山羊抗-人Ig M(在含有0.1%(v/v)吐溫-20和0.2%(w/v)BSA的PBS中適當(dāng)稀釋)加到各孔中并如實(shí)施例2所述完成測(cè)定。
分別用7個(gè)Fisher免疫型細(xì)菌的每一種第二次測(cè)定含有結(jié)合到Fisher免疫型庫(kù)，但未結(jié)合到對(duì)照平板上的抗體的上清液。存在于一個(gè)孔的上清液中的抗體，20H11，只結(jié)合到銅綠假單胞菌Fisher免疫型2，6和7上。以漸減的低細(xì)胞密度反復(fù)傳代培養(yǎng)細(xì)胞直到所有具有生長(zhǎng)細(xì)胞的孔都開始分泌抗體為止。細(xì)胞系和單克隆抗體(Ig M同型)在下文中均以20H11表示。
第二次轉(zhuǎn)化被進(jìn)行，其中B細(xì)胞來(lái)源于囊性纖維變性患者的外周血，已知患者已受銅綠假單胞菌慢性感染。如上所述制備E-PBMC并與此轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，1A2，一起以每個(gè)E-PBMC含72個(gè)1A2細(xì)胞的比例混合培養(yǎng)。將細(xì)胞混合物涂到15個(gè)圓底96孔的微滴平板中，濃度為7.4×104細(xì)胞/孔并如上法培養(yǎng)。
在轉(zhuǎn)化16天之后，用ELISA測(cè)定上清液中抗-銅綠假單胞菌抗體的存在。如前面轉(zhuǎn)化所述進(jìn)行測(cè)定，所不同的是用于起始篩選的銅綠假單胞菌菌株庫(kù)由Fisher免疫型參照菌株，F(xiàn)2，F(xiàn)4，F(xiàn)6，和F7(A.T.C.C號(hào)為27313，27315，27316，和27317)組成，還包括3株來(lái)自Genetic Systems Corporation Organism Bank(GSCOB)的分離菌，這些分離菌具有不同的LPS免疫型和鞭毛型。臨床分離菌PSAI277(GSCOB)帶有a型鞭毛和Fisher免疫型1 LPS;第二種分離菌PSA G98(GSCOB)帶有a型鞭毛和Fisher免疫型3LPS;第三種分離菌PSA F625(GSCOB)帶有b型鞭毛和Fisher免疫型5LPS。這種參照菌株和臨床分離菌的混合物將被稱作為具鞭毛的銅綠假單胞菌庫(kù)。用ELISA第二次對(duì)庫(kù)中各個(gè)菌株測(cè)定上清液，上清液中含有結(jié)合到含具鞭毛的銅綠假單胞菌庫(kù)的平板上，但未結(jié)合到涂有PLL的對(duì)照平板上的抗體。一個(gè)孔，3Cl結(jié)合到參照菌株F2，F(xiàn)6，和F7以及臨床分離菌F625上。
通過首先傳代培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)完成3Cl細(xì)胞系的克隆，低密度傳代培養(yǎng)兩次，先以96孔平板的每個(gè)孔中含20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，再以每孔含2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)。特異抗體產(chǎn)生細(xì)胞的正式克隆是通過平板培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行的，在72孔的Terasaki平板(Nunc ＃1-36538)中細(xì)胞密度約為1個(gè)細(xì)胞/孔，體積為10μl/孔，孔中裝有缺少氨基蝶呤成分的HAT-培養(yǎng)基(HT-培養(yǎng)基)。將平板放在恒溫箱中2-3小時(shí)使細(xì)胞沉到孔的底部，然后用含單個(gè)細(xì)胞孔中的兩個(gè)個(gè)體微觀劃線。每天向孔中加入HT-培養(yǎng)基并當(dāng)增生的細(xì)胞足夠多時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔的圓底平皿中。用ELISA對(duì)具有b型鞭毛的銅綠假單胞菌菌株測(cè)定有增生細(xì)胞的所有孔，發(fā)現(xiàn)所有孔都產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目贵w。細(xì)胞系和單克隆抗體(Ig M同型)在下文均用3 Cl表示。
由20H11和3 Cl所鑒定的抗原是間接免疫熒光和免疫吸印所示的鞭毛。間接免疫熒光和免疫吸附技術(shù)基本上按實(shí)施例2和3所述方法進(jìn)行。對(duì)于間接免疫熒光測(cè)定法，用實(shí)施例3所述方法制備具有b型鞭毛的銅綠假單胞菌菌株，對(duì)照Fisher免疫型F2，F(xiàn)6，和F7(A.T.C.C號(hào)為27313，27317，和27318)和具有a型鞭毛的菌株，對(duì)照Fisher免疫型4(A.T.C.C號(hào)為27315)。通過用鼠的單克隆抗體，Pa F4 IVE8和FA6 IIG5定型確定對(duì)照菌株的鞭毛類型。如實(shí)施例2所述制備觀察用載玻片。兩種抗體的來(lái)源都是培養(yǎng)物上清液，并且FITC結(jié)合試劑是FITC結(jié)合山羊抗-人Ig(多價(jià)的)(Tago，Burlingame，CA)，以1∶100用含有0.5%(W/V)牛γ-球蛋白(Miles Scientific，Cat.NO.82-041-2，Naperville，IL)和0.1%(W/V)疊氮化鈉(作為防腐劑)的PBS稀釋。
只能在具有b型鞭毛的銅綠假單胞菌而不能在具有a型鞭毛的菌株，參照Fisher免疫型4上觀察到用20H11和3C1抗體的熒光染色。觀察到的熒光圖譜是發(fā)源于細(xì)菌一端的正弦曲線圖譜，這表明抗體結(jié)合到細(xì)菌的鞭毛上。
如實(shí)施例2所述進(jìn)行免疫吸印。如實(shí)施例3所述制備純化的b型鞭毛(來(lái)自銅綠假單胞菌參照菌株Fisher免疫型2，A.T.C.C號(hào)為27313)和純化的a型鞭毛(來(lái)自參照菌株Habs6和Habs8、A.T.C.C號(hào)為33353和33355)。在10%聚丙烯酰胺凝膠中使抗原分離(見實(shí)施例3)并轉(zhuǎn)移到NCM中。將含有20H11或3C1抗體的培養(yǎng)物上清液，含有非特異性人抗體的培養(yǎng)物上清液和培養(yǎng)基與NCM一起培養(yǎng)并用堿性磷酸酶結(jié)合山羊抗-人Ig(多價(jià)的)(Tago，Burlingam，CA)(用含有0.05%(V/V)吐溫-20的PBS稀釋)檢測(cè)該反應(yīng)。如實(shí)施例2所述制備酶底物。免疫吸印說(shuō)明兩種抗體都結(jié)合到Fisher免疫型2的鞭毛蛋白(分子量為53，000)上，而不結(jié)合到Habs6的鞭毛蛋白(分子量為51，700)和Habs8的鞭毛蛋白(分子量為47，200)上，用非特異性人抗體或培養(yǎng)基都觀察不到反應(yīng)。
用ELISA可獲得抗體20H11和3C1只結(jié)合到b型鞭毛上而不結(jié)合到a型鞭毛上的其它證據(jù)，其中分別用PLL使Habs菌株1-12結(jié)合到Immulon96孔的微滴平板上?？贵w只結(jié)合到Habs菌株2，3，4，5，7，10，11，和12上，這些菌株是具有b型鞭毛的菌株(Ansorg et al.，(1984)J.Clin.Microbiol.，20∶84)。
實(shí)施例7實(shí)施例7說(shuō)明結(jié)合到銅綠假單胞菌a型鞭毛上的人單克隆抗體的生產(chǎn)方法。
來(lái)自用高分子量多糖制劑免疫的個(gè)體的外周血樣品(Pier et al.，(1981)Infect，Immun.，34∶416)作為B細(xì)胞的來(lái)源。從血液中分離出來(lái)單核細(xì)胞，然后按實(shí)施例6所述方法除去T-細(xì)胞。然后在液氮蒸汽罐中用含有10%二甲基亞砜的FCS使細(xì)胞冷凍。日后在37℃下迅速使細(xì)胞解凍，用Iscove培養(yǎng)基洗滌一次并重新懸浮于HAT-培養(yǎng)基中。E-PBMC與1A2細(xì)胞以每個(gè)E-PBMC含30個(gè)1A2細(xì)胞的比例混合培養(yǎng)完成細(xì)胞從動(dòng)轉(zhuǎn)化。涂到在30個(gè)96孔的組織培養(yǎng)平板中，平板培養(yǎng)濃度為62，000個(gè)細(xì)胞/孔。在平板培養(yǎng)后第7天用HAT培養(yǎng)基取代一半體積進(jìn)行培養(yǎng)。在平板培養(yǎng)后第14天觀察100%孔中的細(xì)胞增殖。
用具鞭毛的銅綠假單胞菌通過ELISA測(cè)定上清液中抗銅綠假單胞菌抗體的存在，以PLL處理的平板作為對(duì)照，方法如實(shí)施例6所述。在具鞭毛庫(kù)的每株細(xì)菌上再次測(cè)定含有結(jié)合到鞭毛庫(kù)上，而不結(jié)合到PLL對(duì)照平板上的抗體的上清液。一個(gè)孔21B8，含有結(jié)合到PSAI277，PSAG98，和參照Fisher免疫型4上的抗體，這些菌株是具鞭毛庫(kù)中帶有a型鞭毛的三個(gè)菌株。
按實(shí)施例6關(guān)于3 Cl細(xì)胞系所述方法，以正式的克隆步驟(做下面改動(dòng))完成21B8細(xì)胞系的克隆，在將只有單個(gè)細(xì)胞存在的Terasaki平板的孔劃線后，將每個(gè)細(xì)胞從Terasaki平板轉(zhuǎn)移到96孔圓底培養(yǎng)皿的各孔中，體積為100μl，內(nèi)有缺少氨基蝶呤成分的HAT-培養(yǎng)基(HT-培養(yǎng)基)。在每個(gè)孔中都含有非轉(zhuǎn)化，HAT-敏感的淋巴母細(xì)胞，密度為500個(gè)細(xì)胞/孔，它們作為喂養(yǎng)細(xì)胞。平板培養(yǎng)后5天，將100μl(HAT-培養(yǎng)基加到孔中選擇性地殺死喂養(yǎng)細(xì)胞。在平板培養(yǎng)后的第7天和第9天用HAT-培養(yǎng)基取代一半上清液再加到孔中。然后用HT-培養(yǎng)基本培養(yǎng)細(xì)胞直到細(xì)胞具有足夠的密度用ELISA檢測(cè)抗體的存在。具有細(xì)胞增生的所有孔都產(chǎn)生結(jié)合到具有a型鞭毛銅綠假單胞菌菌株上的抗體。細(xì)胞系和單克隆抗體(Ig G同型)在下文中都用21B8表示。
由21B8所鑒定的抗原是間接免疫熒光和免疫吸印(見實(shí)施例6描述的方法)所示的鞭毛。只能在具有a型鞭毛的銅綠假單胞菌參照菌株Fisher免疫型4(A.T.C.C號(hào)為27315)上而不能在具有a型鞭毛的銅綠假單胞菌參照菌株Fisher免疫型2(A.T.C.C號(hào)為27313)上觀察到用21B8抗體的熒光染色。觀察到的熒光圖譜是發(fā)源于細(xì)菌一端的正弦曲線圖譜，這表明抗體結(jié)合到細(xì)菌的鞭毛上。
如實(shí)施例2所述進(jìn)行免疫吸印，如實(shí)施例3所述制備純化的a型鞭毛(來(lái)自銅綠假單胞菌參照菌株Habs6，A.T.C.C號(hào)為33353)和純化的b型鞭毛(來(lái)自銅綠假單胞菌參照菌株Fisher免疫型2，A.T.C.C號(hào)為27313)。在10%聚丙烯酰胺凝膠中使抗原分離(見實(shí)施例3)并轉(zhuǎn)移到NCM中。使含有21B8或非特異性人抗體和培養(yǎng)基的培養(yǎng)物上清液與NCM反應(yīng)并用堿性磷酸酶結(jié)合山羊抗-人Ig(多價(jià)的)和酶底物如實(shí)施例2和6所述檢測(cè)該反應(yīng)，免疫吸印說(shuō)明21B8抗體只結(jié)合到Habs6的鞭(分子量為51，700)毛蛋白上，而不結(jié)合到Fisher免疫型2的鞭毛蛋白(分子量為53，000)上。用非特異性人抗體或培養(yǎng)基都觀察不到反應(yīng)。
實(shí)施例8實(shí)施例8說(shuō)明用人抗-鞭毛抗體，20H11，3C1和21B8被動(dòng)免疫的小鼠在燒傷模型中不受銅綠假單胞菌攻擊的保護(hù)作用。
在燒傷小鼠模型中試驗(yàn)了人抗-鞭毛單克隆抗體(見實(shí)施例4)。通過用硫酸銨(50%終濃度)沉淀由各細(xì)胞系所生成的培養(yǎng)物上清液來(lái)制備21B8和20H11抗體(Good et al.，Selected Methods in Cellular Immunology，Mishell，B.B.，and Shiigi，S.M.eds.，W.J.Freeman & Co.，San Francisco，CA，1980，279-286)。將沉淀溶解在PBS中，在4℃下對(duì)PBS透析過夜，并在給動(dòng)物投藥前無(wú)菌過濾。在保護(hù)性研究中用作陰性對(duì)照的抗體3 C1和非特異性抗-LPS抗體的來(lái)源是培養(yǎng)物上清液。作為每項(xiàng)研究的陽(yáng)性對(duì)照，包括有適當(dāng)?shù)募兓髥慰寺】贵w，Pa F4 IVE8或FA6 IIG5。
用于動(dòng)物試驗(yàn)的具有a型鞭毛的菌株是臨床分離菌PSAA522(GSCOB)，該菌株表達(dá)Fisher免疫型1 LPS，b型鞭毛菌株是臨床分離菌PSAA447(GSCOB)，該菌株表達(dá)Fisher免疫型6 LPS。將人抗體0.45ml)預(yù)先與細(xì)菌(在0.05ml中大于5LD100)混合并在燒傷后立即接種。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果列在表Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ中。
表Ⅲ.在燒傷鼠模型1中人抗a型鞭毛單克隆抗體的保護(hù)性研究每天存活百分?jǐn)?shù)2處理 1 2 3 4 5 6 7 8 9鼠抗-鞭毛a，F(xiàn)A6 IIG53100 100 100 100 88 88 88 88 88人抗-鞭毛a21B8 100 100 100 100 100 100 100 100 100人抗-鞭毛b，20H11 100 0 0 0 0 0 0 0 0PBS 100 25 12 12 12 12 12 12 121.
用大于5 LD100的銅綠假單胞菌PSAA522焦痂下攻擊小鼠。
2.
存活百分?jǐn)?shù)基于每組8只動(dòng)物的小鼠存活數(shù)。天數(shù)是指燒傷和攻擊后的天數(shù)。
3.
先將純化的抗體(0.45ml PBS中含10μl)與細(xì)菌混合并在燒傷和攻擊后焦痂下給藥。
表Ⅳ.在燒傷鼠模型1中人抗b型鞭毛單克隆抗體的保護(hù)性研究每天存活百分?jǐn)?shù)2處理 1 2 3 4 5 6 7 8 9鼠抗-鞭毛b，Pa F4 IVE83100 100 100 100 100 100 100 100 100人抗-鞭毛b，20H11 100 100 100 100 100 100 100 100 100人抗-鞭毛a，21B81 100 0 0 0 0 0 0 0 0培養(yǎng)基 80 0 0 0 0 0 0 0 01.
用大于5 LD100的銅綠假單胞菌臨床分離物PSAA447焦痂下攻擊小鼠。
2.
存活百分?jǐn)?shù)基于每組5只動(dòng)物的小鼠存活數(shù)。天數(shù)是指燒傷和攻擊后的天數(shù)。
3.
先將純化的抗體(0.45ml PBS中含10μg)與細(xì)菌混合，在燒傷和攻擊后焦痂下給藥。
表Ⅴ.在燒傷鼠模型1中人抗b型鞭毛單克隆抗體3 Cl的保護(hù)性研究每天存活百分?jǐn)?shù)2處理 1 2 3 4 5 6 7 8 9鼠抗-鞭毛b，Pa F4 IVE83100 100 100 100 100 100 100 100 100人抗-鞭毛b，3 Cl 100 100 80 80 80 80 80 80 80非特異性抗-LPS單克隆抗體 100 0 0 0 0 0 0 0 01.
用大于5LD100的PSAA447焦痂下攻擊小鼠。
2.
存活百分?jǐn)?shù)基于每組5只動(dòng)物的小鼠存活數(shù)。天數(shù)是指燒傷和攻擊后的天數(shù)。
3.
在燒傷和攻擊之前2小時(shí)靜脈注射純化的抗體(40μg)。
在用抗-a型鞭毛的抗體，或兩種抗-b型鞭毛抗體的任一種處理，然后用相應(yīng)的抗原攻擊的小鼠中觀察到非常明顯的存活率。而88%～100%未經(jīng)處理但受過攻擊的小鼠，或用不匹配的抗-鞭毛單克隆抗體或非特異性抗-LPS抗體處理過的小鼠死亡。與用鼠單克隆抗體觀察到的情況一樣(見實(shí)施例4)，人抗-鞭毛抗體特異地保護(hù)小鼠不受具有相應(yīng)鞭毛型的有機(jī)體的致死攻擊，即，人抗-a型鞭毛抗體對(duì)用具有a型鞭毛而非b型鞭毛的菌株攻擊的小鼠，而不保護(hù)用具有a型鞭毛的有機(jī)體攻擊的小鼠。
實(shí)施例9實(shí)施例9說(shuō)明人抗-鞭毛抗體20H11，3C1，和21B8與銅綠假單胞菌臨床分離物的交叉反應(yīng)性。
從醫(yī)院和診所獲得的和從燒傷口和血液中初步分離的銅綠假單胞菌臨床分離物(115)經(jīng)用鼠單克隆抗體，F(xiàn)A6 IIG5或Pa F4 IVE8分型(見實(shí)施例2，3，和5)鑒定為具有a型或b型鞭毛。通過與鼠單克隆抗體FA6 IIG5反應(yīng)鑒定出有55株臨床分離菌具有a型鞭毛，59株臨床分離菌株通過與鼠單克隆抗體，Pa F4 IVE8反應(yīng)鑒定為具有b型鞭毛。
抗-a型鞭毛人單克隆抗體，21 B8的交叉反應(yīng)性是廣泛的，其中抗體可識(shí)別56株具有a型鞭毛的臨床分離菌中的54株(96%)。20H11與具有b型鞭毛的分離菌株的交叉反應(yīng)性也是廣泛的，其中20H11可識(shí)別全部59株分離菌(100%)。相比之下，其它抗-b型鞭毛的單克隆抗體，3Cl，只結(jié)合到59株分離菌中的43株上(73%)。這些結(jié)果說(shuō)明20H11可結(jié)合到全反應(yīng)性抗原決定部位上(即，一個(gè)抗原決定部位至少存在于大約95%的具有鞭毛銅綠假單胞菌上)，而3 Cl可結(jié)合到不存在于所有b型鞭毛抗原蛋白上的抗原決定部位上。即使當(dāng)用多克隆抗血清分析時(shí)b型鞭毛抗原是在血清學(xué)上相同的(Lanvi，B.，見上文，和Ansorg，R.，見上文)，20H11和3 C1的交叉反應(yīng)性圖譜還是令人驚奇地顯示出b型鞭毛至少有兩個(gè)可用單克隆抗體鑒定的獨(dú)立抗原決定部位。
抗體21B8 20H11與銅綠假單胞菌臨床分離物廣泛交叉反應(yīng)性表明這些抗體在銅綠假單胞菌感染的免疫治療中的特殊的臨床效用。
實(shí)施例10實(shí)施例10說(shuō)明另一種典型的人單克隆抗體的生產(chǎn)方法，這種單克隆抗體可結(jié)合到銅綠假單胞菌b型鞭毛上，還說(shuō)明在燒傷小鼠模型中該抗體對(duì)用銅綠假單胞菌的保護(hù)活性。
按實(shí)施例7所述的方法制備并基本克隆轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，所不同的是將轉(zhuǎn)化細(xì)胞混合物在20個(gè)96孔組織培養(yǎng)皿上平板培養(yǎng)，濃度為每個(gè)孔約有2250E-PBMC。除具鞭毛庫(kù)中沒有Fisher免疫型2和4參照菌株外，按實(shí)施例6所述方法用ELISA最初測(cè)定上清液。然后在含有Fisher免疫型2和4的具鞭毛庫(kù)中測(cè)定每個(gè)菌株的陽(yáng)性孔。最分離的細(xì)胞系和單克隆抗體(Ig G同型)在下文中都以12D7表示。
12D7人單克隆抗體顯示廣泛的與抗-a型鞭毛分離菌的交叉反應(yīng)性，該抗體可識(shí)別56株具a型鞭毛的待測(cè)臨床分離菌中的54株(96%)。12D7單克隆抗體的保護(hù)活性列在表Ⅵ中。除攻擊劑量為1 LD100和攻擊菌株是I624，表達(dá)Fisher免疫型2 LPS和a型鞭毛的臨床分離菌外，基本上按實(shí)施例4所述方法進(jìn)行保護(hù)性研究。
表Ⅵ.在燒傷鼠模型1中人抗-a型鞭毛單克隆抗體的保護(hù)性研究每天存活百分?jǐn)?shù)2處理 1 2 3 4 5 6 7 8 9人抗-鞭毛a，12D7 100 100 100 100 100 100 100 100 100人抗-Fisher2LPS2H9 90 90 90 90 90 90 90 90 90鼠抗-鞭毛aIIG5 100 100 100 100 100 100 100 100 100人抗-鞭毛b15F4 100 37.5 25 25 25 25 25 25 251.
用1 LD100(950CFU)的銅綠假單胞菌I624焦痂下攻擊小鼠。
2.
存活百分?jǐn)?shù)基于每組10只動(dòng)物的小鼠存活數(shù)。15F4組;例外，N＝8。天數(shù)是指燒傷和攻擊后的天數(shù)。
3.
在燒傷和攻擊之前2小時(shí)腹腔內(nèi)注射純化的抗體(0.5ml PBS中含50μg)。
實(shí)施例11實(shí)施例11說(shuō)明可與b型鞭毛銅綠假單胞菌反應(yīng)的人單克隆抗體的生產(chǎn)方法和燒傷小鼠模型中用該抗體被動(dòng)免疫的小鼠不受銅綠假單胞菌攻擊的保護(hù)作用。
除1A2與B細(xì)胞轉(zhuǎn)化率約為60∶1和在15個(gè)平板上以大約每孔含1930個(gè)E PBMC的濃度平板培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞混合物外，基本上按實(shí)施例10所述的方法準(zhǔn)備和克隆轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。同樣，在包括G98Fisher 3免疫型，a型鞭毛)和I739(Fisher 5免疫型的臨床分離物，b型鞭毛)的銅綠假單胞菌中測(cè)定這些細(xì)胞，并在不同的銅綠假單胞菌菌株庫(kù)中進(jìn)一步證實(shí)I277，G98，I739和Fisher免疫型F2，F(xiàn)4，F(xiàn)6和F7。最后分離的細(xì)胞系和分泌的單克隆抗體在下文中以2 B8表示。
對(duì)于b型鞭毛，F(xiàn)isher 2免疫型菌株，用2 B8所進(jìn)行的免疫熒光測(cè)定是陽(yáng)性的，而在a型鞭毛，F(xiàn)isher免疫型4參照菌株中則為陰性。試驗(yàn)了59株具b型鞭毛的臨床分離菌均呈陽(yáng)性(100%)。
2 B8的保護(hù)活性列于表Ⅶ中。保護(hù)性研究按實(shí)例10中所述的方法進(jìn)行，僅是用于攻擊的臨床分離物為F164(Fisher免疫型4，b型鞭毛)。
表Ⅶ.在燒傷鼠模型1中人抗b型鞭毛抗體-單克隆抗體2 B8的保護(hù)性研究每天存活百分?jǐn)?shù)2處理 1 2 3 4 5 6 7 8 9人抗-鞭毛b，2 B83100 89 89 89 89 89 89 89 89鼠抗-鞭毛b，Pa F4 IVE84100 100 100 100 100 100 90 90 90鼠抗-Fisher 2 LPSVH3490 20 20 20 20 20 20 20 201.
用1 LD(105CFU)的銅綠假單胞菌F164焦痂下攻擊小鼠。
2.
存活百分?jǐn)?shù)基于每組10只動(dòng)物的小鼠存活數(shù)。2 B8組例外.N＝9。天數(shù)是指燒傷和攻擊后的天數(shù)。
3.
在燒傷和攻擊之前2小時(shí)靜脈注射純化抗體(在0.5ml PBS中含50μg)。
4在燒傷和攻擊之前2小時(shí)腹腔內(nèi)注射純化抗體(在0.5ml PBS中含5μg)。
實(shí)施例12實(shí)施例12說(shuō)明另一種可與b型鞭毛銅綠假單胞菌反應(yīng)的人單克隆抗體的生產(chǎn)方法和在燒傷小鼠模型中用該抗體被動(dòng)免疫的小鼠不受銅綠假單胞菌攻擊的保護(hù)作用。
基本按實(shí)施例7所述方法制備和克隆轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，有下列例外。使不同的個(gè)體免疫(Pier et al.，(1984)45309)并作為B細(xì)胞來(lái)源，E-PBMC的平板培養(yǎng)水平約為2000個(gè)細(xì)胞/孔。對(duì)Fisher 1-7免疫型庫(kù)進(jìn)行篩選。最后分離的細(xì)胞系和分泌的單克隆抗體(Ig G1同型)在下文中均用為14Cl表示。
在臨床試驗(yàn)中，用14Cl試驗(yàn)了59株具b型鞭毛的分離物均呈陽(yáng)性(100%)。如上面實(shí)施例11所述進(jìn)行保護(hù)研究并列于表Ⅷ中。
表Ⅷ.在燒傷小鼠模型1中人抗b型鞭毛抗體-單克隆抗體14Cl的保護(hù)性研究每天存活百分?jǐn)?shù)2處理31 2 3 4 5 6 7 8 9人抗-鞭毛b，14Cl 100 100 100 100 100 90 90 90 90鼠抗-鞭毛b，Pa F4 IVE8 100 100 100 100 100 100 100 100 100人抗-Fisher 2LPSVH3 100 40 20 20 20 20 20 20 201.
用大于1 LD100(90CFU)的銅綠假單胞菌F164焦痂下攻擊小鼠。
2.
存活百分?jǐn)?shù)基于每組10只動(dòng)物的小鼠存活數(shù)。Pa F4 IVE8組除外，N＝9。天數(shù)是指燒傷和攻擊后的天數(shù)。
3.
在燒傷和攻擊之前2小時(shí)靜脈注射純化抗體(在0.5ml PBS中含50μg)。
綜上所述，可以看出本發(fā)明的細(xì)胞系提供生產(chǎn)可與銅綠假單胞菌鞭毛反應(yīng)和對(duì)各種銅綠假單胞菌菌株具有交叉保護(hù)性的單克隆抗體及其片段的方法。令人驚奇的是，分離出許多可與各種鞭毛型上的不同抗原決定部位反應(yīng)的單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可使預(yù)防和治療組合物更經(jīng)濟(jì)和易于生產(chǎn)，該抗體可用于防止由多數(shù)銅綠假單胞菌菌株引起的感染。另外，該細(xì)胞系提供用于免疫測(cè)定和其它已知方法的抗體。
雖然通過說(shuō)明和實(shí)施例較為詳盡地描述了本發(fā)明，但是顯然在權(quán)利要求
書范圍內(nèi)可進(jìn)行某行變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種組合物，它含有能夠特異性地與銅綠假單胞菌鞭毛反應(yīng)的單克隆抗體或其結(jié)合片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中的單克隆抗體或其結(jié)合片段抑制細(xì)菌的游動(dòng)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的組合物，其中的單克隆抗體或其結(jié)合片段在活體內(nèi)是保護(hù)性的。
4.一種組合物，它含有能與銅綠假單胞菌鞭毛蛋白抗原決定簇特異反應(yīng)的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的組合物，其中的單克隆抗體是能夠封閉與ATCC HB9129，HB9130，CRL9300，CRL9301，CRL9422，CRL9423和CRL9424各號(hào)細(xì)胞株所產(chǎn)生的單克隆抗體的抗原決定簇的結(jié)合。
6.一種組合物，它包括一種或一種以上的單克隆抗體，其中所述的第一種單克隆抗體是能與銅綠假單胞菌a型或b型鞭毛的抗原決定簇相反應(yīng)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的組合物，其中所述的第二種單克隆抗體能與銅綠假單胞菌a型鞭毛反應(yīng)但不與所述第一種單克隆抗體反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的組合物，其中所述的第一種單克隆抗體是人單克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的組合物，其中所述單克隆抗體中的至少一種是在體內(nèi)為保護(hù)性的。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1、4、6和8中任何一項(xiàng)所述的組合物，它還包括從人血漿中獲得的γ-球蛋白組分和(或)抗生素。
11.一種藥用組合物，它包括權(quán)利要求
1、4、6和8中任何一項(xiàng)所述的組合物以及藥理上可接受的載體。
12.一種用于治療或預(yù)防銅綠假單胞菌感染的藥用組合物，所述組合物包括與銅綠假單胞菌鞭毛蛋白反應(yīng)并在體內(nèi)為保護(hù)性的單克隆抗體，抗微生物劑，從人血漿中獲得的γ-球蛋白以及藥理上可接受的載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的藥用組合物，其中所述的抗體是人單克隆抗體，從人血漿中獲得的γ-球蛋白組分取自于那些顯示出對(duì)銅綠假單胞菌為反應(yīng)性的免疫球蛋白的水平增高了的人中和(或)其產(chǎn)物中。
14.一種藥用組合物，它包括至少兩種單克隆抗體，每種所述抗體都能特異性地與某種銅綠假單胞菌鞭毛蛋白反應(yīng)并能預(yù)防或治療銅綠假單胞菌感染。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的組合物，其中至少有一種單克隆抗體是人單克隆抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的組合物，它進(jìn)一步包括至少一種能與至少一種銅綠假單胞菌脂多糖分子上血清型抗原決定簇相反應(yīng)的人單克隆抗體和(或)與內(nèi)毒素A反應(yīng)的單克隆抗體。
17.一種治療被懷疑患有菌血癥和(或)敗血病患者的方法，它包括
給所述患者施用預(yù)防量或治療量的根據(jù)權(quán)利要求
1，6，8，12，14和15中任何一項(xiàng)所述的組合物。
18.一種細(xì)胞株，它產(chǎn)生能與銅綠假單胞菌a型或b型鞭毛特異性反應(yīng)的單克隆抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18所述的細(xì)胞株，其中所述的單克隆抗體在體內(nèi)能防御抵抗銅綠假單胞菌。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19的細(xì)胞株，它是雜交細(xì)胞株。
21.根據(jù)權(quán)利要求
18的細(xì)胞株，它產(chǎn)生人單克隆抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求
18的細(xì)胞株，它是ATCC序列號(hào)HB9129，HB9130，CRL9300和CRL9301中的任何一種。
23.一種生產(chǎn)能與銅綠假單胞菌鞭毛蛋白特異反應(yīng)并能治療和預(yù)防銅綠假單胞菌感染的單克隆抗體的方法，它包括培養(yǎng)至少一種權(quán)利要求
22所述的細(xì)胞株并回收所述抗體。
24.一種治療懷疑患有菌血癥和(或)敗血癥患者的方法，它包括給所述患者施以預(yù)防劑量或治療劑量的依權(quán)利要求
23所產(chǎn)生的單克隆抗體。
25.一種能與抗原決定簇反應(yīng)的單克隆抗體或其片段，所述抗原決定簇能與依權(quán)利要求
23所述生產(chǎn)的單克隆抗體相結(jié)合。
26.一種組合物，它包括與抗原決定簇反應(yīng)的單克隆抗體或其片段，所述的抗原決定簇與依權(quán)利要求
23所述生產(chǎn)的單克隆抗體相結(jié)合。
27.一種組合物，它包括能與存在于銅綠假單胞菌鞭毛上的抗原決定簇起特異性反應(yīng)的人單克隆抗體。
28.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的組合物，其中的抗原決定簇存在于a型或b型上，但不是兩者均有。
29.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的組合物，其中的抗原決定簇表現(xiàn)在至少70%b型鞭毛上。
30.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的組合物，其中所述的抗原決定簇僅表現(xiàn)在b型鞭毛上。
31.根據(jù)權(quán)利要求
29所述的組合物，其中所述的抗體是泛-反應(yīng)性抗體。
32.一種治療懷疑患有細(xì)菌侵染患者的方法，它包括給所述患者施用預(yù)防劑量或治療劑量的能與銅綠假單胞菌鞭毛結(jié)合的單克隆抗體，并結(jié)合給以一種以上下述物質(zhì)治療劑量或預(yù)防劑量的能與銅綠假單胞菌內(nèi)毒素A反應(yīng)的單克隆抗體;能與銅綠假單胞菌脂多糖分子至少一種血清型抗原決定簇反應(yīng)的單克隆抗體;來(lái)自人血漿的γ-球蛋白;從與銅綠假單胞菌反應(yīng)的免疫球蛋白的水平顯示出被增高的患者的血漿中得到的γ-球蛋白組分和(或)其產(chǎn)物;抗菌劑。
33.一種單克隆抗體組合物，它具有與被稱作FA6 IIG5，Pa3 IVC2，Pa F4 IVE8，20H11，21 B8的各單克隆抗體中的任何一種相同的結(jié)合特異性。
34.根據(jù)權(quán)利要求
32的單克隆抗體，它共軛有能提供可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物。
35.根據(jù)權(quán)利要求
33的單克隆抗體，其中的標(biāo)記物是熒光物質(zhì)或酶。
36.一種檢測(cè)樣品中銅綠假單胞菌的方法，該方法包括將所述樣品和與銅綠單胞菌鞭毛反應(yīng)的單克隆抗體相結(jié)合，并且測(cè)定復(fù)合物的形成。
37.一種用于檢測(cè)銅綠假單胞菌的診斷試驗(yàn)藥盒，它包括含至少一種單克隆抗體的單克隆抗體組合物，其中所述的抗體與所述細(xì)菌的一種類型的鞭毛蛋白反應(yīng)，提供可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物，它與所述抗體共價(jià)結(jié)合，或結(jié)合于與所述單克隆抗體反應(yīng)的第二種抗體。
專利摘要
本發(fā)明涉及分泌能與所選銅綠假單胞菌的鞭毛蛋白結(jié)合的單克隆抗體的細(xì)胞株。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中的一些抗體可以消除銅綠假單胞菌的致死性威脅。含有這些抗體的藥用組合物，它還可以結(jié)合有另外的單克隆抗體，血漿組分及抗菌劑。還包括將這種組合物用于預(yù)防和治療感染。
文檔編號(hào)C12N15/00GK87104581SQ87104581
公開日1988年9月21日 申請(qǐng)日期1987年8月25日
發(fā)明者馬克·E·羅斯特羅姆, 安托尼, W·西亞達(dá)克, 麥·約恩·羅索克 申請(qǐng)人:遺傳學(xué)系統(tǒng)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan