專利名稱:超氧化物歧化酶衍生物制備方法及醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用的制作方法
本發(fā)明涉及超氧化物歧化酶衍生物，制備方法及醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。
超氧化物歧化酶(在下文中縮寫為SOD)一直被認(rèn)為廣泛存在于生物體中的一種酶，如動物、植物和微生物中都有，具有分解超氧化物的能力，超氧化物是一種對有機(jī)體有害的化合物。最近，人們試圖利用被分離的SOD作為抗炎癥藥物〔Farumashia，17，411(1981);Current Therapeutic Research，16，706(1974)〕。SOD用在對難治療的輻射引起的結(jié)腸炎或在予防和治療胃潰瘍病方面已有研究〔Jikken Igaku(Experimental Medicine)，4(12)，39(1986)〕。
從下面敘述的實(shí)驗結(jié)果很清楚，人型SOD實(shí)際上缺乏抗炎癥的活性，而且抗?jié)兊幕钚院苋酢?br>據(jù)說，當(dāng)靜脈給予SOD在血漿中的半壽期僅4-6分鐘;SOD迅速被代謝并排泄到尿中。為延長SOD在血漿中的半壽期，試圖用聚蔗糖，聚乙二醇或大鼠清蛋白進(jìn)行修飾，將SOD轉(zhuǎn)變?yōu)榇蠓肿?。但是，利用聚蔗糖或聚乙二醇修飾的SOD，酶活力大大降低，而大鼠清蛋白修飾的SOD有抗原性。曾報導(dǎo)，菊粉修飾的SOD跟未修飾的SOD比，降低了SOD的活力，卻大大延長了它在血漿中半壽期〔Japanese Kokai Tokkyo Koho No.58-32826〕。但是，這些修飾的SOD或由于上述原因或由于其分子體積增大，使在組織中的穿透力降低，在實(shí)際應(yīng)用中均有問題。
本發(fā)明的目的是提供新的超氧化物歧化酶衍生物，這種衍生物在血漿中半壽期比SOD大大延長，保留絕大部分SOD的酶活力，不增加SOD的分子大小。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的、安全的超氧化物歧化酶衍生物，它具有藥理學(xué)活性，如抗炎癥，防止局部出血損傷，予防大腦水腫等作用。
本發(fā)明的第三個目的是提供生產(chǎn)上述超氧化歧化酶衍生物的方法。
本發(fā)明的第四個目的是提供此超氧化物歧化酶衍生物作為藥物的應(yīng)用，例如作為抗炎癥藥物，抗局部出血損傷的保護(hù)劑以及用于治療大腦水腫的藥物。
本發(fā)明中的這些目的及其他目的和優(yōu)點(diǎn)，將在下面詳述中使本專業(yè)技術(shù)人員更清楚地了解。
本發(fā)明提供具有如下通式的超氧化物歧化酶衍生物〔SOD〕〔Z〕x式中〔SOD〕是超氧化歧化酶殘基，含1-6個基團(tuán)，每個基團(tuán)是從氨基衍生的，通過在相應(yīng)的氨基上除去一個氫原子后所衍生的，〔Z〕是由下列組份單位組成的一價共聚物殘基(a)從下列組成的基團(tuán)中選擇的一種基團(tuán)
其中R1，R3和R5分別是氫原子或甲基;R2是氫原子、氯原子、溴原子或甲基;R4是氫原子或含1-5個碳原子的烷基;R6是甲基或乙基。
(b)具有如下通式的基團(tuán)
其中R7是氫原子或含1-4個碳原子的鏈烷醇，乙二醇單烷基醚(其烷基含1-4個碳原子)或是甘油二烷基醚(其烷基各含1-4個碳原子)，作為除去羥基后生成的產(chǎn)物。
(c)具有如下通式的基團(tuán)
其中羰基的碳原子通過〔SOD〕氨基的氮原子結(jié)合到〔SOD〕上，共聚物殘基具有平均分子量為800-20，000和X是1-6的整數(shù)，相當(dāng)于SOD的基團(tuán)數(shù)目，每個SOD基團(tuán)是由除去一個氫原子后的氨基衍生來的〔在下文中超氧化物歧化酶衍生物稱為SOD衍生物〕。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)上述SOD衍生物的方法，此方法包括使SOD與下列組份單位組成的共聚物(其平均分子量為800-20000)在堿性水溶液中PH為7-11相反應(yīng)，組份單位如下(a)從下列組成基團(tuán)中選擇的基團(tuán)，
其中R1，R2，R3，R4，R5，R6如上所規(guī)定;
(b)具有如下通式的基團(tuán)
其中R7如上所規(guī)定;
(c)具有如下通式的基團(tuán)
本發(fā)明進(jìn)一步提供以SOD衍生物作為主要成份的藥劑和藥用組合物。
在附圖中，圖1表明在SOD和Bu-SMA(部分半丁酯化的苯乙烯-馬來酸酐共聚物;在下文中將同樣使用)反應(yīng)的情況下，SOD中所含TNBS-可滴定氨基減少的百分?jǐn)?shù)和反應(yīng)時間的關(guān)系。Bu-SMA將在合成例3中敘述;
圖2表明合成例1和合成例2中分別所得的SOD衍生物和起始材料SOD的紫外吸收光譜;
圖3表明在實(shí)驗例5所得的反應(yīng)混合物中Bu-SMA濃度和所得的SOD衍生物中TNBS-可滴定氨基含量之間的關(guān)系，以及此Bu-SMA濃度和SOD衍生物中SOD活性之間的關(guān)系;
圖4(1)表明人紅血球SOD的紅外光譜;
圖4(2)表明牛紅血球SOD的紅外光譜;
圖5、圖6、圖7分別顯示了在合成例7-1，7-2，7-3中分別所得的SOD衍生物的紅外光譜;
圖8表明合成例1用51Cr標(biāo)記后所合成的SOD衍生物，按給定的PH和放射性下等電聚焦的實(shí)驗結(jié)果;
圖9表明在合成例2中用51Cr標(biāo)記后所得SOD衍生物按給定的PH和放射性下等電聚焦的實(shí)驗結(jié)果;
圖10表明按合成例2所得的SOD衍生物和開始材料的SOD經(jīng)牛血清清蛋白-瓊脂糖凝膠柱親和層析的結(jié)果;
圖11表明按合成例2所得的SOD衍生物和起始材料SOD本身耐各種蛋白酶水解的比較;
圖12表明按合成例2所得的SOD衍生物和起始材料SOD大鼠靜脈給藥后，在血漿中的濃度隨時間變化的過程;
圖13表明SOD衍生物和Bu-SMA靜脈給藥后，小鼠股骨肌中不同時間的蓄積過程，予先將0.2ml的HEPES緩沖液(PH6.0)肌肉注射到小鼠左側(cè)股骨肌(酸性側(cè)面)，0.2ml生理鹽水注射到右側(cè)股骨肌(對照側(cè)面);
圖14表明SOD衍生物對大鼠強(qiáng)制性浸水形成急性胃粘膜損傷的抵抗能力的實(shí)驗中所得的潰瘍指數(shù)(mm/組織)和浸水時間之間的關(guān)系;
圖15(1)表明SOD衍生物在誘導(dǎo)產(chǎn)生水腫的大鼠右側(cè)大腦半球(損傷側(cè)面)，左側(cè)大腦半球(完整側(cè)面或?qū)φ諅?cè)面)以及血漿中的蓄積;
圖15(2)表明Bu-SMA在上述相同大鼠的損傷側(cè)面、完整側(cè)面和血漿中的蓄積;
圖16表明小鼠用農(nóng)藥百草枯處理后，給SOD衍生物和僅用百草枯處理不給SOD衍生物(對照組)，處理時間和血漿中GOT水平的關(guān)系。
現(xiàn)就按本發(fā)明產(chǎn)生SOD衍生物的方法作詳細(xì)說明。
SOD與共聚物的反應(yīng)一般按以下方法進(jìn)行，將SOD溶解在一種鹽的水溶液中，這種鹽可以是碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸鈉、磷酸鈉等，再加入共聚物，可以粉末狀或溶于有機(jī)溶劑(如二甲亞砜等)的形式加入。反應(yīng)期間，溶液PH維持在7-11。PH低時，共聚物溶解度降低，反應(yīng)不能進(jìn)行。當(dāng)PH高于11時，SOD的酶活力喪失，得不到本發(fā)明中的SOD衍生物。反應(yīng)溫度選在3°-50℃為宜，最好在3-40℃。反應(yīng)時間取決于溫度和共聚物加入的方式，但一般為10分鐘至3小時。共聚物的所用量是每摩爾SOD約0.5-30摩爾。共聚物結(jié)合到每個SOD分子上的分子數(shù)目，可以通過在上述范圍內(nèi)改變共聚物的量加以調(diào)節(jié)。
如此所得的反應(yīng)混合物中，含有SOD衍生物、未反應(yīng)的SOD及共聚物等。將此反應(yīng)混合物過濾，濾液經(jīng)過凝膠過濾。如必要，所得的含SOD衍生物的洗脫液再進(jìn)行疏水層析，再超濾濃縮。凍干得固體SOD衍生物。
在上述反應(yīng)中，SOD的氨基和共聚物的馬來酸酐環(huán)起反應(yīng)，形成SOD衍生物。例如，人型Cu.Zn-SOD每分子含22個氨基(在人紅血球的SOD，或利用基因工程通過酵母產(chǎn)生人型SOD的情況下)或每分子含24個氨基(在用基因工程方法通過大腸桿菌產(chǎn)生人型SOD的情況下)。上述反應(yīng)中SOD的任何一個氨基，都能和共聚物的馬來酸酐環(huán)起反應(yīng)，生成的SOD衍生物中，每個SOD分子結(jié)合1-6個共聚物分子。每個起始原料的共聚物平均含0.5至2個馬來酸酐環(huán)。當(dāng)一個馬來酸酐環(huán)和SOD的氨基反應(yīng)時，其余的馬來酸酐環(huán)幾乎不和另外的SOD氨基反應(yīng)，而傾向于與水反應(yīng)，由于水解，生成馬來酸衍生基團(tuán)
因此，上述的SOD衍生物的組份單位(b)也包括了上述基團(tuán)，此基團(tuán)中R7是氫原子。當(dāng)以部分半酯化的共聚物作為起始材料時，此組分單位(b)不僅包括半酯化的馬來酸衍生物的基團(tuán)，而且也包含小部分馬來酸衍生物基團(tuán)。有可能一分子共聚物和多個SOD分子反應(yīng)生成副產(chǎn)物，其中共聚物的多個馬來酸酐環(huán)各與每個SOD分子中的一個氨基反應(yīng)并結(jié)合。即使有少量的這種副產(chǎn)物雜質(zhì)，按本發(fā)明合成的SOD衍生物也能作醫(yī)療上使用，根據(jù)本發(fā)明沒有任何特殊的困難。然而，考慮到現(xiàn)時的情況，作為醫(yī)藥的有效成份的化合物，最好具有確定的單一化學(xué)結(jié)構(gòu)。就SOD衍生物論，當(dāng)含有相當(dāng)量的上述副產(chǎn)物時，可采用凝膠過濾或某些其他處理方法，來除去這種副產(chǎn)物，用這樣純化了的產(chǎn)品作為醫(yī)療上的有效成份的化合物將更為理想。上述反應(yīng)所得的SOD衍生物是SOD一共聚物偶聯(lián)產(chǎn)物的混合物，這種偶聯(lián)產(chǎn)物每分子SOD結(jié)合的共聚物分子的數(shù)量不等。因此，在前面表達(dá)本發(fā)明所提供的SOD衍生物的分子式中，X數(shù)目表示與每個SOD分子偶聯(lián)的共聚物分子的平均數(shù)。當(dāng)每個SOD分子偶聯(lián)的共聚物分子，在數(shù)目上為均一的SOD衍生物時，作為有效成分化合物是所希望的。通過上述凝膠過濾或某些其他適當(dāng)?shù)奶幚?，有可能得到這樣的SOD衍生物。在上述反應(yīng)及以后的處理步驟中，SOD衍生物的羧基可能形成堿金屬鹽或銨鹽。本發(fā)明中的SOD衍生物也含有從鹽的形式構(gòu)成的羧基。
隨著每個SOD分子中共聚物分子的增加，SOD衍生物的酶活力傾向于逐漸降低。每個SOD分子中含7個或更多共聚物分子的SOD衍生物，其酶活力太低，因此不適合于用作醫(yī)療有效成份。每分子SOD含1-4共聚物分子的SOD衍生物較為適宜。因為它保留高水平的酶活力及其他有利的性能，如延長在血液循環(huán)中的半壽期。每分子SOD上結(jié)合2分子共聚物的SOD衍生物是最理想的。
起始材料SOD是得自下列生物體來源的提取物，如動物(人，牛等)、植物、微生物，通過已知的方法或采用基因工程的技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。SOD的化學(xué)結(jié)構(gòu)(有關(guān)配位金屬，分子量，氨基酸順序等)在一定程度上已被闡明?，F(xiàn)在已把SOD分為三類，即Fe-SOD，Mn-SOD和Cu.Zn-SOD，分子量30，000-80，000之間，其分子量大小取決于品種和亞細(xì)胞間格。三種不同的SOD氨基酸順序彼此不同。有關(guān)這方面細(xì)節(jié)參閱Yoshihiko Oyanagi“超氧化物和醫(yī)學(xué)”，74-90頁，Kyoritsu Shuppan5月25日，1981發(fā)表;Journal of Biological Chemistry，246，2875-2880(1971);同一雜志，250，6107-6112(1975);Proceedings of the National Academg of Science，70，3725-3729(1973)，及Archives of Biochemishy and Biophysics，179，243-256(1977)等。最附合要求作為起始材料的SOD是人型Cu.Zn-SOD。其分子量為33，000，分子中含22或24個氨基。例如將人血經(jīng)加熱處理、離子交換和凝膠過濾這樣的程序，或采用基因工程技術(shù)能夠得到人型SOD。
通過相應(yīng)于上述組分單位(a)中一種單體的共聚物部分水解，及馬來酸酐的部分水解〔上述部分水解是指水解進(jìn)行到這樣程度，即小量(每分子平均0.5-2)馬來酸酐環(huán)仍然保留，而其余的環(huán)已被水解〕;或通過這種共聚物和乙醇的部分半酯化作用〔上述部分半酯化作用進(jìn)行到這樣程度，即小量(平均每分子0.5-2)馬來酸酐環(huán)被保留，而其余的環(huán)已被半酯化〕可得到這種初始材料的共聚物。按上述方法得到的共聚物的例子有部分水解的苯乙烯-、對-氯苯乙烯-、對-溴苯乙烯-或α-甲基苯乙烯·馬來酸酐共聚物;部分半酯化的苯乙烯-、對-氯苯乙烯-、對-溴苯乙烯-或α-甲基苯乙烯·馬來酸酐共聚物(甲酯、乙酯、丙酯、正丁酯、甲氧基乙酯、乙氧基乙酯、丙氧基乙酯、正丁氧基乙酯、1，3-二甲氧基-2-丙酯、2，3-二甲氧基-1-丙酯、1，3-二氧基-2-丙酯、2-乙氧基-3-甲氧基-1-丙酯、1，3-二丙氧基-2-丙酯、1，3-二丁氧基-2-丙酯，等等);部分水解的乙烯-、丙烯-、α-丁烯、異丁烯-、1-戊烯-、2-甲基-1-丁烯-、1-己烯-或1-庚烯-馬來酸酐共聚物;部分半酯化的乙烯-、丙烯-、α-丁烯-、異丁烯-、1-戊烯-、2-甲基-1-丁烯-、1-己烯-或1-庚烯-馬來酸酐共聚物(如上述例子中所列的同樣的酯);部分水解的醋酸乙烯酯-馬來酸酐共聚物;部分半酯化的醋酸乙烯酯-馬來酸酐共聚物;部分水解的(甲基)丙烯酸甲酯-馬來酸酐共聚物;部分半酯化的(甲基)丙烯酸甲酯-馬來酸酐共聚物;部分水解的(甲基)丙烯酸乙酯-馬來酸酐共聚物;部分半酯化的(甲基)丙烯酸乙酯-馬來酸酐共聚物;等等。
所有這些共聚物都含疏水基和親水基，因此有適當(dāng)?shù)氖杷?。同時，含有極性羧基。因此含此共聚物的SOD衍生物能可逆地和血清蛋白及生物膜結(jié)合，從而延長了在血液循環(huán)中的半壽期以及改善向器官的轉(zhuǎn)移。其他SOD衍生物中，含苯乙烯衍生物作為組分單位(a)和含半酯化基團(tuán)作為組分單位(b)的SOD衍生物，產(chǎn)生這些作用更好，因為它們有相對高的疏水性。
在共聚物中組分單位(a)對組分單位(b)和(c)的比，即〔(a)/｛(b)+(c)｝〕，大約1～1.3是最好的。此比例通常等于1。克分子比例低于1的共聚物，用相應(yīng)于組分單位(a)的一個單體和馬來酸酐共聚合作用很難獲得?？朔肿颖壤哂?.3的共聚物，當(dāng)組分單位(b)是一個半酯化的單體時，得到的產(chǎn)物不理想，因為它們在含鹽水溶液中的溶解度不好，不易和SOD反應(yīng)。
所有上述共聚物在技術(shù)上是眾所周知的。所得產(chǎn)物的平均分子量范圍在800-20，000。從這些共聚物所得的SOD衍生物向有效部位轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)看，共聚物分子量最好不大于3，000。共聚物的分子量在分布上沒有特殊的限制。因此，通過相應(yīng)于上述組分單位(a)的單體和馬來酸酐(共聚物重均分子量/數(shù)均分子量之比約為2.0或更高)的自由基引發(fā)共聚作用所產(chǎn)生的共聚物，可以用作原料。此共聚物可不通過分級分離而進(jìn)行部分水解或部分半酯化以用作原料;或通過分級分離，以獲得分子量分布較窄的產(chǎn)物，接著再進(jìn)行部分水解或部分半酯化，以用作原料。
下列試驗例子說明根據(jù)本發(fā)明制備的SOD衍生物的藥理學(xué)特性。
試驗例1SOD衍生物在局部PH降低的組織中特異蓄積體重約20克小鼠分別肌肉注射0.2ml 0.15M HEPES緩沖液(PH6.0)和0.2ml生理鹽水于左和右股骨肌，然后立即用合成例2中所述步驟，制備125I標(biāo)記的SOD衍生物(14n mol)，或在合成例2中使用的相應(yīng)于Bu-SMA的3H-標(biāo)記的Bu-SMA(0.22μmol)，作靜脈注射，在所指的間隔內(nèi)測量蓄積在左右股骨肌中的放射性，結(jié)果如圖13所示。在左股骨肌中(酸側(cè)面)放射性顯著高于右股骨肌(對照側(cè)面)，表明通過SOD與Bu-SMA偶聯(lián)，按照合成例2的SOD衍生物，選擇性地吸收進(jìn)入酸性組織中(在炎癥一側(cè)PH較低)。
試驗例2局部出血的抑制作用和抗炎作用方法雄性Sprague-Dawley大鼠(體重約200克)饑餓過夜，放入強(qiáng)制性籠中，6只動物為一組，將籠子浸入22℃水中至動物劍突水平作緊張負(fù)載試驗。眾所周知，這種類型的緊張負(fù)載降低了大鼠胃粘膜的血液流動，誘導(dǎo)局部出血，觸發(fā)急性炎癥，導(dǎo)致潰瘍。緊張負(fù)載2，4，6小時后，試驗動物從水中取出，殺死動物。摘取胃，分離的胃注入10%甲醛以固定。固定后統(tǒng)計線狀潰瘍長度、潰瘍指標(biāo)以長度總和表示。
在強(qiáng)制水浸之前，立即將試驗化合物以靜脈給藥，對照組大鼠接受0.5ml生理鹽水，試驗組大鼠接受0.5ml SOD生理鹽水溶液或從合成例2中制備的SOD衍生物(1mg/鼠)。
結(jié)果圖14表示潰瘍指數(shù)(mm/組織)對水浸持續(xù)時間作圖，在圖14中〔○〕表示對照組的數(shù)據(jù)，(△)表示SOD衍生物組的數(shù)據(jù)。順便一提，SOD組的結(jié)果省略了，因為它實(shí)際上與對照組結(jié)果是完全相同的。
從圖14很清楚看到，SOD組表明沒有抗?jié)冏饔玫嫩E象，而在SOD衍生物組表明有明顯的潰瘍抑制作用。
因此，很清楚，對伴隨局部組織PH降低的疾病，SOD衍生物是個極好的預(yù)防局部出血損傷的抗炎劑。
試驗例3大腦水腫的預(yù)防作用大鼠(體重約200克)右側(cè)大腦半球用液氮處理30秒鐘，引起顯著的單側(cè)大腦水腫，同一大鼠予以靜脈注射如試驗例1中所用的0.2μmol3H標(biāo)記Bu-SMA，放射性特異地蓄積在注射一側(cè)，該側(cè)局部PH降低〔圖15(2)〕。當(dāng)同一大腦水腫的大鼠靜脈給予27nmol如試驗例1所用相同的125I-標(biāo)記的SOD衍生物，放射性特異地蓄積在注射一側(cè)〔圖15(2)〕，因此很明顯，按照合成例2與Bu-SMA偶聯(lián)的SOD衍生物完全蓄積在受損害的大腦組織中。這種SOD衍生物的蓄積使水腫顯著減少。
試驗例4氧中毒的預(yù)防作用200mg/kg百草枯注射到小鼠的腹膜內(nèi)(體重約20克)誘導(dǎo)超氧化物陰離子自由基〔O-2〕的形成，〔O-2〕引起肝細(xì)胞的損傷，依次引起血漿GOT顯著升高。腹腔注射20mg/kg上述相同的SOD衍生物于百草枯處理的小鼠，對血漿GOT水平升高，產(chǎn)生顯著的抑制作用(圖16)。
未修飾的SOD沒有這種保護(hù)作用。因此血漿GOT水平與對照組沒有差別。
而且，毒理學(xué)研究已表明，SOD衍生物是低毒性的。
從以上結(jié)果很清楚，SOD衍生物對各種與超氧化陰離子自由基有關(guān)的疾病是有效的，且能用作抗炎劑、局部出血的拮抗劑、抗腦水腫劑、百草枯中毒對抗劑等，以及作為胃潰瘍和由于胃腸粘膜炎癥引起的其他胃腸疾病的預(yù)防劑。
而且，SOD衍生物作為局部出血心臟病的治療藥，或作為藥物，減輕由抗癌藥物引起的與超氧化陰離子自由基有關(guān)的副作用是有價值的。
SOD衍生物的劑量隨疾病種類、疾病嚴(yán)重程度、病人的耐受性及其他因素而定。但是，對成人通常每日劑量為0.1-500mg，最好是0.5-100mg，可以一次給藥，也可以分幾次給藥。SOD衍生物可以不同劑型提供，以適合于各個給藥途徑。
因此，SOD衍生物能通過已確立的藥物學(xué)的步驟配方和制備。所以，本發(fā)明包括了至少包含一種SOD衍生物作為活性成份的各種藥物組合物。這種藥物組合物能應(yīng)用藥理學(xué)可接受的載體、賦形劑以及在藥物生產(chǎn)中普遍使用的其他輔助物質(zhì)來制造。
當(dāng)這種藥物組合物打算口服時，它們最好以適于消化道能吸收的劑型提供?？诜膯我粍┬偷钠瑒┗蚰z囊，可含有粘合劑，如糖漿、阿拉伯膠、果膠、山梨醇、黃膠、聚乙烯吡咯烷酮等，賦形劑如乳茋糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇、甘氨酸等;潤滑劑如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇、硅石等，崩解劑如馬鈴薯淀粉等，藥物學(xué)可接受的濕潤劑如十二烷基硫酸鈉等等。片劑可用眾所周知的方式包衣。口服的液體制劑可以是水劑或乳劑、溶液、糖漿、酏劑(甘香酒劑)等或可以冰凍干燥，用水或其他合適的賦形劑重新配制。這種液體制劑可含通常的添加劑，包括懸浮劑如山梨醇、糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁膠、氫化食用油和脂肪等;乳化劑如卵磷酯、脫水山梨糖醇單油酸酯、阿拉伯膠等;非水賦形劑如杏仁油、分餾的椰子油、油脂、丙二醇、乙醇等;防腐劑如對-羥基苯甲酸甲酯、對-羥基苯甲酸丙酯、山梨酸等等。
為制備注射劑，將SOD衍生物溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，如生理鹽水、注射用葡萄糖溶液等。SOD衍生物的濃度按常規(guī)方法調(diào)至2-20mg/每2-10ml溶劑，配制后便于皮下肌肉或靜脈注射。在制備上述注射劑時，如必要，水溶液中可加入PH調(diào)節(jié)劑、緩沖液、穩(wěn)定劑、防腐劑、加溶劑等等。
上述藥物復(fù)合物可根據(jù)其劑型及其他因素控制SOD衍生物在所選的濃度范圍內(nèi)，通常濃度為0.01%至50%(重量)，最好是大約0.1-20%(重量)。
下列實(shí)例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而決不是對本發(fā)明的限制。
參考實(shí)例1苯乙烯-馬來酸酐共聚物的合成馬來酸酐(383g，3.9mol)加入3.7L枯烯(異丙基苯)，混合物在回流下攪拌，在超過40分鐘時間里滴加16.3g(60mmol)二枯基過氧化物溶液以及在1.7L枯烯中溶解的203g(1.95mol)苯乙烯。滴完后繼續(xù)加熱，攪拌1小時。所得的反應(yīng)混合物放置過夜，除去上清液，粘附在反應(yīng)容器上的粘性產(chǎn)物溶于丙酮，減壓蒸去丙酮得到353g苯乙烯-馬來酸酐共聚物(以后簡稱為SMA)。
SMA的分級分離取120g通過上述方式所得的SMA溶于3L丙酮中。滴加4.9L正己烷，攪拌1小時以上。不透明的產(chǎn)物，丙酮正己烷混合物轉(zhuǎn)入另一容器中，攪拌1.5小時以上，滴加9.74L正己烷。粘附在容器壁上的粘性物質(zhì)溶于丙酮來回收，回收液減壓蒸去丙酮，剩余物在70℃-80℃真空干燥過夜，獲得49.2gSMA分級沉淀物。
取40g上面獲得的SMA，溶于1L丙酮，加入3.8kg表面用硅烷處理的玻璃珠(平均顆粒大小0.1mm)，丙酮蒸發(fā)后玻璃珠表面涂有SMA。
涂有SMA玻璃珠連同1.4L，丙酮正己烷混合物(25℃體積比為24∶76)一起裝填入長80cm、內(nèi)徑80mm的柱子內(nèi)和保持柱體系溫度25℃。兩個不同體積比例的丙酮-正己烷混合物，即(ⅰ)1.6L丙酮正己烷混合物，25℃時體積比為24∶76。(ⅱ)6.0L丙酮正己烷混合物25℃時體積比37∶63;依次從頂部滴加入柱體系中，接著再滴加3.0L丙酮，收集相當(dāng)于上述37∶63(體積計)丙酮正己烷混合物洗脫部分。減壓除去低沸點(diǎn)部分。剩余物在70-80℃下真空干燥過夜。從而獲得所要的SMA產(chǎn)量31.8g。它的重均分子量
Mw和數(shù)均分子量(
Mn)用凝膠透析層檢測定(以下簡稱GPC)，四氫呋喃洗脫，聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果為
Mw1340，
Mn1220(
Mw/
Mn＝1.10)。
Mn用蒸汽壓滲透壓力計測定為1210。用電位滴定測定分級的SMA-馬來酸酐的含量為47.3%(摩爾)。
分級的SMA的部分半丁酯化作用裝有磁力攪拌約40ml安瓿中裝入10.0g經(jīng)上述分級的SMA，2.20g正丁醇，0.10g無水乙酸鋰以及20ml二噁烷，封口。安瓿的內(nèi)容物在90℃加熱攪拌20小時。取出小量反應(yīng)混合物，用氣相色譜分析，乙基溶纖劑為內(nèi)標(biāo)，測定未反應(yīng)的正丁醇。共聚物中馬來酸酐半丁酯化程度，以加入的正丁醇的轉(zhuǎn)化來計算，測得為62%。然后反應(yīng)混合物用20ml二噁烷稀釋，稀釋液滴加400ml正己烷使之再沉淀，收集沉淀，并在60℃真空干燥過夜，獲得11.5g所要的部分半丁酯化的苯乙烯-馬來酸酐共聚物(Bu-SMA)。在這共聚物中剩余馬來酸酐環(huán)的含量基于紅外吸收光譜在1780cm-1和700cm-1波數(shù)吸收強(qiáng)度來測定(傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)，KBr壓片法)，發(fā)現(xiàn)為30.3%(摩爾)，(平均每分子Bu-SMA的馬來酸酐環(huán)數(shù)為1.8)。用GPC測定
Mw和
Mn，分別為1530和1440(
Mw/
Mn＝1.06)。
合成例110ml0.1M碳酸氫鈉(PH8.0)水溶液，在37℃攪拌下溶解50mg(1.5×10-6M)人紅血球SOD(3000單位/mg)，再加入80mg(5mM，這濃度是反應(yīng)混合物中最終Bu-SMA的濃度，在下文中應(yīng)用也相同)部分半丁酯化的苯乙烯-馬來酸酐共聚物固體粉末〔
Mw＝1600;酯化程度＝60%(摩爾);馬來酸酐環(huán)含量＝25%(摩爾)(平均每分子馬來酸酐環(huán)數(shù)目是1.6)〕，苯乙烯-馬來酸酐共聚物分子通過部分半丁酯化作用得到〔用二枯基過氧化物作為起始物自由基聚合作用的產(chǎn)物;在產(chǎn)物中苯乙烯-馬來酸酐摩爾比＝1∶1;
Mw＝1280;分子量的分布
Mw/
Mn不大于1.20〕，反應(yīng)進(jìn)行1小時。
在人紅血球SOD氨基與Bu-SMA反應(yīng)過程中，剩余氨基的含量用三硝基苯磺酸鈉(TNBS)測定，在這個實(shí)例中所用人紅血球SOD的品種，每個分子含有22個氨基，約10-11氨基能用TNBS法測定，這證實(shí)在上述反應(yīng)條件下，人紅血球SOD氨基的20%(摩爾)(相當(dāng)于可滴定氨基的44%(摩爾))已與Bu-SMA發(fā)生反應(yīng)。過濾反應(yīng)混合物，濾液注入K50/30柱(商標(biāo)，瑞典Pharmacia精細(xì)化學(xué)公司產(chǎn)品)，柱中裝填交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)G-100(商標(biāo)，瑞典Pharmacia精細(xì)化學(xué)公司產(chǎn)品)進(jìn)行凝膠過濾。用20mM碳酸氫銨和碳酸銨混合液洗脫，洗脫部分在280nm測量，收集有吸收部分。用超濾膜進(jìn)行濃縮(Sartorius SM145-39)，凍干后得52mg白色粉末。所得粉末的紫外吸收光譜〔圖2中SOD衍生物(Ⅰ)〕，起始材料SOD及Bu-SMA的紫外吸收光譜在PH7.4磷酸緩沖液中測量。光譜見圖2所示。用同一方式制備的5μl51Cr-標(biāo)記的樣品(反應(yīng)產(chǎn)物)在兩性電解質(zhì)(Ampholine)中進(jìn)行等電聚焦(PH1.5-6.0，700mV，通電12小時;分部收集1ml/份)。隨后測量PH和放射性，所得的結(jié)果見圖8所示。獲得的粉末等電點(diǎn)為2.0，白色粉末的蛋白質(zhì)含量用Lowry法測定為80%?；谶@些結(jié)果，測定了每個SOD分子中Bu-SMA分子數(shù)目。
以上面的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，所得的白色粉末鑒定為SOD衍生物，每個SOD分子平均結(jié)合5分子Bu-SMA(用SOD的氨基與Bu-SMA一個馬來酸酐環(huán)反應(yīng))，(
摩爾比＝1∶1;丁酯化程度＝60%;
Mw＝1600)。
合成例210ml0.1M碳酸氫鈉(PH8.0)水溶液在30℃攪拌下溶解50mg人紅血球SOD(3000單位/mg)。再加入30mg(1.9mM)合成例1中所用的Bu-SMA，Bu-SMA與人紅血球SOD用合成例1相同方式進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)混合物同合成例1同樣方式作處理，獲得45mg白色粉末。用合成例1同樣的方式測量的紫外吸收光譜如圖2所示〔SOD衍生物(Ⅱ)〕。等電聚焦后PH及放射性測量的結(jié)果見圖9所示。所得的粉末等電點(diǎn)為4.4。用TNBS法分析剩余氨基酸的含量，證實(shí)在起始材料SOD中氨基的9%(摩爾)(相應(yīng)于可滴定氨基約20%(摩爾))已與Bu-SMA反應(yīng)。
根據(jù)以上數(shù)據(jù)，所得的白色粉末鑒定為SOD衍生物，每個SOD分子平均與2分子Bu-SMA結(jié)合。
合成例35mg(1.5×10-7M)人紅血球SOD(3000單位/mg)溶于1ml0.1M碳酸氫鈉水溶液中(PH8.0)加入4mg(2.5mM)與合成例1同樣的Bu-SMA，以同那方式在37℃下進(jìn)行反應(yīng)。SOD中氨基含量和反應(yīng)時間的關(guān)系見圖1所示。氨基的分析采用TNBS方法。在所用的人紅血球SOD中，每個分子含有22個氨基，其中約10-11可用TNBS法分析。這證實(shí)在上述反應(yīng)條件下，在1小時內(nèi)，38%(摩爾)可滴定氨基已與Bu-SMA發(fā)生反應(yīng)，可獲得每個SOD分子結(jié)合4個Bu-SMA分子的SOD衍生物。反應(yīng)2小時后，反應(yīng)混合物中再加入相同量的Bu-SMA，在這種情況下氨基含量如圖1(……)所表明的進(jìn)一步減少。這清楚地表明Bu-SMA結(jié)合于SOD分子的量可通過反應(yīng)中加入不同量的Bu-SMA來控制。
合成例410mg(3.0×10-7M)人紅血球SOD(3000單位/mg)溶于1ml0.1M碳酸氫鈉水溶液(PH8.0)中，加入一份部分水解的或部分半酯化的苯乙烯-馬來酸酐共聚物，按表1所列使最終濃度為2.5mM(在反應(yīng)混合物中)。反應(yīng)在37℃下進(jìn)行1小時。SOD中剩余氨基的含量用TNBS法測定。在每種情況下證實(shí)，氨基的損失相當(dāng)于15-25%(摩爾)可滴定氨基。在每種情況下，獲得了每個SOD分子平均結(jié)合1.7-2.8個苯乙烯-馬來酸酐共聚物分子的SOD衍生物。
表1酯化反應(yīng) 酯化程度 馬來酸酐環(huán)編號 (是或否) 的含量(環(huán)
Mw及種類 (%(摩爾)) 數(shù)/分子)4-1 是(丁酯) 60 1.3 12004-2 是(丁酯) 40 2.0 16004-3 是(丁酯) 70 1.5 16004-4 是(丁酯) 60 1.9 20004-5 是(甲酯) 60 1.3 16004-6 是(乙酯) 60 1.7 16004-7 是(甲氧乙酯) 60 1.3 16004-8 是(2-丙氧乙酯) 60 1.7 16004-9 是(1，3-二甲氧-2-丙酯) 60 1.4 16004-10 是(1，3-二丁氧-2-丙酯) 60 1.3 16004-11 否 - 2.3 1400合成例5除部分水解的異丁烯-馬來酸酐共聚物(
Mw＝2500，馬來酸酐環(huán)含量＝3.0環(huán)/分子)代替合成例4中所用的苯乙烯-馬來酸酐共聚物外，反應(yīng)和分離步驟以與合成例4相同方式進(jìn)行，獲得具有每個SOD分子與大約4個異丁烯-馬來酸酐共聚物結(jié)合的SOD衍生物。
合成例6除用表2中所用的共聚物之一代替合成例4中苯乙烯-馬來酸酐共聚物外，反應(yīng)與分離步驟以與合成例4完全相同的方式進(jìn)行。這樣獲得相應(yīng)的SOD衍生物。
表2編號共聚物種類酯化作用酯化程度
Mw(是或否) (%(摩爾))及種類6-1 對-氯苯乙烯-馬 是(丁酯) 60 1800來酸酐共聚物6-2 對-溴苯乙烯-馬 是(丁酯) 60 1900來酸酐共聚物6-3 α-甲基苯乙烯- 是(丁酯) 60 1800馬來酸酐共聚物6-4 乙烯-馬來酸酐共 非 - 2500聚物6-5 乙烯-馬來酸酐共 是(丁酯) 60 3000聚物6-6 丙烯-馬來酸酐共 非 - 2000聚物6-7 丙烯-馬來酸酐共 是(丁酯) 60 2500聚物6-8 異丁烯-馬來酸酐 是(乙酯) 60 2800共聚物表2(續(xù))編號共聚物種類酯化作用酯化程度
Mw(是或否) (%(摩爾))及種類6-9 異丁烯-馬來酸 是(丁酯) 60 3000酐共聚物6-10 α-丁烯-馬來 是(丁酯) 60 2800酸酐共聚物6-11 1-戊烯-馬來 是(丁酯) 60 2800酸酐共聚物6-12 2-甲基-1-丁 是(丁酯) 60 2500烯-馬來酸酐共聚物6-13 1-己烯-馬來酸 是(丁酯) 60 2500酐共聚物6-14 1-庚烯-馬來酸 非 - 2000酐共聚物6-15 1-庚烯-馬來酸 是(丁酯) 60 2000酐共聚物6-16 醋酸乙烯酯-馬來 非 - 2500酸酐共聚物6-17 同上 是(丁酯) 60 25006-18 丙烯酸甲酯-馬來 是(丁酯) 60 2500酸酐共聚物表2(續(xù))編號共聚物種類酯化作用酯化程度
Mw(是或否) (%(摩爾))及種類6-19 丙烯酸乙酯-馬來 是(丁酯) 60 2600酸酐共聚物6-20 異丁烯酸甲酯-馬 是(丁酯) 60 2000來酸酐共聚物6-21 異丁烯酸乙酯-馬 是(丁酯) 60 2200來酸酐共聚物(每個共聚物中馬來酸酐環(huán)含量為1.5環(huán)/分子)合成例7按規(guī)定量(表3)人紅血球SOD(Sigma制造)溶于0.1M碳酸氫鈉水溶液(PH8.0)使之濃度為5mg/ml，加入規(guī)定量的部分水解的苯乙烯-馬來酸酐共聚物(分子量約1400;馬來酸酐環(huán)含量約1.0環(huán)/分子);部分水解的對-溴苯乙烯-馬來酸酐共聚物(分子量約1600;馬來酸酐環(huán)含量約1.5環(huán)/分子)，部分水解的α-甲基苯乙烯-馬來酸酐共聚物(分子量約1600;馬來酸酐環(huán)含量約3.3環(huán)/分子)或部分水解的異丁烯-馬來酸酐共聚物(分子量2500;馬來酸酐環(huán)含量約3.5環(huán)/分子)在25℃下反應(yīng)進(jìn)行1小時，反應(yīng)混合物注入裝有Sephadex G-75超細(xì)顆粒(商標(biāo)，Pharmacia精細(xì)化學(xué)公司制造)的K26/40(商標(biāo);同上公司制造)中進(jìn)行凝膠過濾，用10mM碳酸氫銨和碳酸銨混合溶液洗脫。洗脫液在280nm和254nm測量，收集與未處理的共聚物吸收不同的部份，冰凍干燥，得到白色粉末狀SOD衍生物。所獲的結(jié)果列于表3。在SOD中反應(yīng)的氨基，用TNBS法測定。在所用的人紅血球SOD品種中每分子含22個氨基，其中約10-11氨基可用TNBS方法滴定。
表3編號 SOD(mg) 部分水解 SOD中已反應(yīng) SOD衍生物的共聚物 氨基的近似數(shù)目 產(chǎn)量(mg)(mg)7-1 19 苯乙烯-馬來酸酐 3 15共聚物157-2 19 對-溴苯乙烯-馬 3 18來酸酐共聚物167-3 18 α-甲基苯乙烯- 3 17馬來酸酐共聚物117-4 17 異丁烯-馬來酸酐 2 10共聚物9人紅血球SOD和牛紅血球SOD的紅外吸收光譜(FT-IR，KBr片法)分別見圖4(1)和圖4(2)所示。表3所列SOD衍生物編號7-1，編號7-2和編號7-3的紅外吸收光譜(FT-IR，KBr片法)分別見圖5，圖6和圖7所示。
圖5-7圖中，除人紅血球SOD的吸收光譜外亦能觀察到共聚物的吸收(箭號所指)。在這些圖中的吸收光譜表明每個共聚物是與SOD結(jié)合的。
用牛紅血球SOD代替人紅血球SOD進(jìn)行與上同樣的反應(yīng)及分離步驟，以產(chǎn)生相應(yīng)的SOD衍生物，每個都有類似于圖5-7中所示的紅外吸收光譜。
試驗例5人紅血球SOD(5mg/ml)與各種濃度(0.14，0.37，0.75，1.5，3.6及12mM)Bu-SMA，在37℃，PH8.0時反應(yīng)1小時。用這種方法制備了Bu-SMA與SOD不同結(jié)合量的各種SOD衍生物。研究了SOD衍生物Bu-SMA的結(jié)合量和酶活力之間的關(guān)系。酶活力的測量按Journal of Biological Chemistry，244，6049-6055(1965)所述方法進(jìn)行。在反應(yīng)混合物中，Bu-SMA濃度和所得的SOD衍生物中剩余氨基含量間的關(guān)系(用TNBS法測定)，以及Bu-SMA濃度和酶活力的關(guān)系見圖3中所示。圖3中數(shù)據(jù)表明當(dāng)Bu-SMA濃度是6mM時，所得的SOD衍生物中約50%TNBS可滴定的氨基保持完整(如上所述，這意味著，存在于起始材料SOD每個分子中的22個氨基，大約有10-11個氨基與TNBS反應(yīng)，在這種情況下有5個氨基參與了反應(yīng)、有17個氨基保持未反應(yīng))，保持了原先酶活力的50%，而且當(dāng)Bu-SMA結(jié)合量增大時，酶活力就低于原先的50%。因此，SOD用共聚物過分地化學(xué)修飾對保持酶活力是不合適的，而限制共聚物分子與每個SOD分子結(jié)合數(shù)在6或以下是必需的。如圖3所示，每個SOD分子結(jié)合2個Bu-SMA分子的SOD衍生物，保持了SOD原始酶活力的80%。
在合成例2中所得的SOD衍生物與起始材料SOD比較其對蛋白酶的敏感性。反應(yīng)在37℃PH7.4下進(jìn)行。濃度為15單位/ml(5μg/ml)的SOD衍生物和SOD，與各0.1mg/ml胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)或木瓜蛋白酶反應(yīng)，所得的結(jié)果見圖11所示。在木瓜蛋白酶作用下兩者酶活力都減少，但對其他種蛋白酶作用是比較穩(wěn)定的，沒有明顯的失活。因此可以得出結(jié)論SOD用共聚物修飾，不改變SOD酶的穩(wěn)定性。
試驗例6在合成例2中所得的SOD衍生物及開始材料SOD進(jìn)行牛血清白蛋白-瓊脂糖凝膠柱親合層析，見圖10所示。起始SOD不與白蛋白結(jié)合，全部通過親合柱。而SOD衍生物95%以上與白蛋白柱結(jié)合，柱用0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)處理，使相當(dāng)一部分的SOD衍生物洗脫。但在這種條件下，約30%SOD衍生物仍然保持與柱結(jié)合。柱子相繼用鹽酸胍作變性處理，導(dǎo)致SOD衍生物完全洗脫。當(dāng)SDS濃度為0.5%時，SOD衍生物幾乎全部從白蛋白柱上洗脫下來。這些事實(shí)指出，用Bu-SMA結(jié)合于SOD的SOD衍生物不象開始材料SOD，對白蛋白有強(qiáng)的親合性。
在合成例2中所得的SOD衍生物或起始材料SOD靜脈注射給予大鼠。血漿中SOD衍生物的濃度和SOD的濃度變化作了跟蹤，所得結(jié)果見圖12所示。從圖12很清楚看到，SOD衍生物在血漿的濃度在很長時期中保持高水平(半壽期＝6小時)，而起始材料SOD的血漿濃度在很短時期中就降低(半壽期＝5分鐘)。這可能是由于SOD衍生物與血漿白蛋白牢固結(jié)合，由于Bu-SMA存在。
合成例4、5和6所得的SOD衍生物，按上述同樣方式，也進(jìn)行牛血清白蛋白-瓊脂糖凝膠柱親合層析。對每個SOD衍生物，至少有90%與白蛋白相結(jié)合，從那里洗脫下來需要用十二烷基硫酸鈉(SDS)處理。這表明每個SOD衍生物是牢固的與白蛋白結(jié)合的。這種結(jié)合恐怕是由于與SOD偶聯(lián)的共聚物中存在一個疏水基和羧基。
除用牛紅血球SOD代替合成例2中得到的人紅血球SOD外，以合成例2的反應(yīng)與分離步驟相同的方式作了重復(fù)。這樣得到了SOD衍生物，每個牛紅血球SOD分子結(jié)合2個Bu-SMA分子。用這個SOD衍生物也獲得了與上述試驗相同的結(jié)果。因而人紅血球SOD和牛紅血球SOD之間沒有觀察到有差別。
試驗例7在合成例2中得到的SOD衍生物與大鼠血清混合，混合物進(jìn)行凝膠過濾(Sephacryl S-200;Sprague-Dawley大鼠血清0.2ml;樣品0.2mg)。觀察到了SOD衍生物以血清蛋白結(jié)合(主要白蛋白結(jié)合)的形式的洗脫。另一方面，起始材料SOD和大鼠血清混合物以上述同樣方式進(jìn)行凝膠過濾。SOD不與血清蛋白相互作用，但相應(yīng)于它原先分子量(大約33000)的部分被洗脫。
在進(jìn)一步的試驗中，上述SOD衍生物與白蛋白缺乏癥大鼠血清混合?；旌衔锱c上述同樣方式進(jìn)行凝膠過濾，相當(dāng)一部分SOD衍生物以血清蛋白結(jié)合形式(于非白蛋白部分)被洗脫下來。因此，可以考慮，當(dāng)血漿白蛋白濃度低時、SOD衍生物表現(xiàn)出與血清蛋白中另外種蛋白結(jié)合的形式。這就表明，SOD衍生物能有效地治療血清白蛋白濃度降低的疾病。
試驗例8將按照合成例2制備的51Cr-標(biāo)記的SOD衍生物。合成例2所用的相應(yīng)于Bu-SMA的3H標(biāo)記Bu-SMA以及SOD，分別靜脈注射給予大鼠(體重約200g)，劑量200，000cpm/大鼠。1小時后測量各種器官中放射性的水平，結(jié)果如表4所列。很明顯，SOD衍生物由尿排泄顯著地被抑制了，SOD衍生物于血漿的半壽期延長了，SOD衍生物以高濃度在器官中分布。
表4放射性SOD在組織中的分布器官 cpm/器官SOD SOD衍生物 Bu-SMA血液(cpm/ml) 47 4400 7045腦 27 262 230肺 190 849 454心 127 262 383肝 261 11667 832腎 16200 33720 434尿 89725 67 248脾 80 496 385胃 120 271 363小腸(cpm/2g) 160 1300 159肌肉(50g) 3250 11778 11900
從上面各種試驗結(jié)果明顯看出，SOD衍生物有接近于SOD的酶活力，與SOD比，有明顯地延長在血漿的半壽期，而且由于SOD衍生物經(jīng)受與血清蛋白的可逆相互作用，這種性質(zhì)對SOD易位到作用的器官和部位是十分有助的、大家公認(rèn)在炎癥和局部出血損傷處PH是低的，質(zhì)子化羧基化合物有選擇性地蓄積在這種區(qū)域。由于SOD衍生物含有羧基，可以預(yù)料這些羧基在體內(nèi)被質(zhì)子化，從而有效地蓄積在炎癥和局部出血損傷的部位。因此，SOD衍生物作為預(yù)防和治療藥，對潰瘍和其他肌肉炎癥有關(guān)的疾病及對出血癥起到極好的作用。
含有合成例2所得到的SOD衍生物的某些劑型實(shí)例，以及按本發(fā)明的SOD衍生物作為活性成分的一個典型實(shí)例如下所示。
劑型例1以下列成份用常規(guī)的方法制備腸衣膠囊合成例2所得的SOD衍生物 20mg乳糖 46mg玉米淀粉 16mg結(jié)晶纖維素 12mg纖維素羥乙酸酯 5mg山梨醇 10mg總計(每膠囊) 109mg以上膠囊的服法通常成人每日三次，每次二丸，飯后服用。
劑型例2用下列成份按常規(guī)方法制備腸衣片合成例2中所得的SOD衍生物 20mg乳糖 79mg玉米淀粉 45.5mg硬脂酸鎂 0.5mg總計(每片) 145mg以上片劑服法，通常成人每天服三次，每次二片，飯后服用。
劑型例3用下列方式制備注射劑10mg合成例2中所得的SOD衍生物溶于生理鹽水，制成體積為5ml的溶液，通過滅菌的微孔濾器過濾，濾液在無菌的紅棕色玻璃瓶(1型，3ml)中封住。
勘誤表
權(quán)利要求
1.具有如下通式的超氧化歧化酶衍生物，[SOD][Z]x其中[SOD]是超氧化歧化酶殘基，此殘基含1-6個基團(tuán)，每個基團(tuán)是由氨基衍生的，通過在相應(yīng)的氨基上除去一個氫原子后所衍生的，[Z]是一個單價共聚物殘基，由以下組份單位組成(a)從下列組成的基團(tuán)中選擇的一種基團(tuán)
其中R1，R3和R5是氫原子或甲基，R2是氫原子、氯原子、溴原子或甲基，R4是氫原子或含1-5個碳原子的烷基，R6是甲基或乙基；(b)具有如下通式的基團(tuán)
其中R7是氫原子或含1-4個碳原子的鏈烷醇?xì)埢?、乙二醇單烷?其烷基含1-4個碳原子)或甘油二烷醚(其每個烷基含1-4個碳原子)作為除去羥基后生成的產(chǎn)物；(c)具有如下通式的基團(tuán)
其中羰基碳原子通過[SOD]的一個氨基氮原子結(jié)合到[SOD]上；共聚物殘基具有平均分子量800-20，000，X是1-6的整數(shù)，相當(dāng)于[SOD]基團(tuán)的數(shù)目，每個SOD基團(tuán)是通過氨基上除去一個氫原子后所衍生的。
2.生產(chǎn)具有下列通式的超氧化物歧化酶衍生物的方法，〔SOD〕〔Z〕x其中〔SOD〕是超氧化物歧化酶殘基，含1-6個基團(tuán)，每個基團(tuán)是在相應(yīng)的氨基上除去一個氫原子后衍生的，〔Z〕是一個單價的共聚物殘基，由以下組份單位組成(a)從以下組成的基團(tuán)中選擇的一種基團(tuán)
其中R1，R3和R5各為氫原子或甲基，R2是氫原子、氯原子、溴原子或甲基，R4是氫原子或含1-5個碳原子的烷基，R6是甲基或乙基;(b)具有以下通式的基團(tuán)
其中R7是氫原子或含1-4個碳原子的鏈烷醇?xì)埢?、乙二醇單烷?其烷基含1-4個碳原子)或甘油二烷醚(其每個烷基含1-4個碳原子)作為除去羥基后生成的產(chǎn)物;以及(c)具有以下通式的基團(tuán)
其中羰基碳原子通過〔SOD〕的一個氨基氮原子結(jié)合到〔SOD〕上，共聚物殘基具有平均分子量800-20，000，X是1-6的整數(shù)，相當(dāng)于〔SOD〕基團(tuán)的數(shù)目，每個SOD殘基是通過在氨基上除去一個氫原子后衍生的，它包括超氧化物歧化酶與由下列組份單位所組成的共聚物(其平均分子量為800-20000)，在堿性水溶液中PH為7-11起反應(yīng)，組份單位如下(a)從下列通式組成的基團(tuán)中選擇一種基團(tuán)，
其中R1，R2，R3，R4，R5和R6如上所規(guī)定，(b)具有以下通式的基團(tuán)
其中R7是按如上所規(guī)定，以及(c)具有以下通式的基團(tuán)
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中超氧化物歧化酶是人型超氧化物歧化酶或牛型超氧化物歧化酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中超氧化物歧化酶是人紅血球超氧化物歧化酶或牛紅血球超氧化物歧化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中多聚物是選自下列部分水解后的基團(tuán)，苯乙烯-、對-氯苯乙烯-、對-溴苯乙烯-或α-甲基苯乙烯-馬來酸酐共聚物;部分半酯化的苯乙烯-、對-氯苯乙烯-、對-溴苯乙烯或α-甲基苯乙烯-馬來酸酐共聚物;部分水解的乙烯-、丙烯-、α-丁烯-、異丁烯-、1-戊烯-、2-甲基-1-丁烯-、1-己烯-、1-庚烯-馬來酸酐共聚物;部分半酯化的乙烯-、丙烯-、α-丁烯-、異丁烯-、1-戊烯-、2-甲基-1-丁烯-、1-己烯-、或1-庚烯-馬來酸酐共聚物;部分被水解的醋酸乙烯酯-馬來酸酐共聚物;部分半酯化的醋酸乙烯酯-馬來酸酐共聚物;部分水解的(甲基)丙烯酸甲酯-馬來酸酐共聚物;部分半酯化的(甲基)丙烯酸甲酯-馬來酸酐共聚物;部分水解的(甲基)丙烯酸乙酯-馬來酸酐共聚物;部分半酯化的(甲基)丙烯酸乙酯-馬來酸酐共聚物。
6.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中共聚物的量為每摩爾超氧化物歧化酶含約0.5摩爾到30摩爾。
7.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中PH7-11的堿性水溶液是指碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸鈉或磷酸鈉溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中反應(yīng)溫度范圍大約為3-50℃。
9.含通式如下的超氧化物歧化酶衍生物的藥物，其通式為〔SOD〕·〔Z〕x其中〔SOD〕是超氧化物歧化酶殘基，它含1-6基團(tuán)，分別由相應(yīng)的氨基上除去一個氫原子后衍生的，〔Z〕是單價的共聚物殘基，由以下組份單位組成的(a)從下列組成的基團(tuán)中選擇的一種基團(tuán)
其中R1，R3和R5各是氫原子或甲基，R2是氫原子、氯原子、溴原子或甲基，R4是氫原子或含1-5碳原子的烷基，R6是甲基或乙基;(b)具有以下通式的基團(tuán)
其中R7是氫原子或含1-4碳原子的鏈烷醇?xì)埢?、乙二醇單烷?其烷基含1-6個碳原子)或甘油二烷醚(其烷基含1-4個碳原子)作為除去羥基后生成的產(chǎn)物;(c)具有如下通式的基團(tuán)
其中羰基的碳原子通過〔SOD〕氨基氮原子結(jié)合到〔SOD〕上，共聚物殘基具有平均分子量800-20000，X是1-6的整數(shù)，相當(dāng)于〔SOD〕的基團(tuán)數(shù)，每個〔SOD〕基團(tuán)是通過氨基上除去一個氫原子后所衍生的。
10.用于預(yù)防和治療炎癥和/或局部出血癥的一種藥物組合物，此組合物包含對于預(yù)防或治療炎癥和/或局部出血癥有效量的超氧化物歧化酶衍生物以及一種藥理上可接受的稀釋劑或載體，此超氧化物歧化酶通式為〔SOD〕〔Z〕x此式中〔SOD〕是一超氧化物歧化酶的殘基，含1-⑤個基團(tuán)，每6個基團(tuán)從相應(yīng)的氨基上除去一個氫原子后所衍生的，〔Z〕是單價的共聚物殘基，由下列組份單位組成(a)從以下組成的基團(tuán)中選擇的一個基團(tuán)
其中R1，R3和R5各為氫原子或甲基，R2是氫原子、氯原子、溴原子或甲基，R4為氫原子或含1-5碳原子的烷基，R6為甲基或乙基;(b)具有以下通式的基團(tuán)
其中R7是氫原子或含1-4個碳原子的鏈烷醇?xì)埢?，乙二醇單烷?其烷基含1-4個碳原子)或甘油二烷醚(其烷基各含1-4個碳原子)作為除去羥基后生成的產(chǎn)物;(c)具有以下通式的基團(tuán)
其中羰基的碳原子通過〔SOD〕的氨基的氮原子結(jié)合到〔SOD〕上，共聚物殘基具有平均分子量800-20000，X為1-6的整數(shù)，相當(dāng)于〔SOD〕基團(tuán)數(shù)目，每個SOD基團(tuán)是通過氨基上除去一個氫原子后衍生的。
11.預(yù)防和治療炎癥和/或局部出血癥的方法，此方法包括給予預(yù)防和/或治療炎癥和/或局部出血癥有效量的超氧化物歧化酶衍生物，其通式為〔SOD〕〔Z〕x式中〔SOD〕是超氧化物歧化酶殘基，含1-6個基團(tuán)，每個基團(tuán)從相應(yīng)的氨基上除去一個氫原子后所衍生的，〔Z〕是單價的共聚物殘基，由以下組份單位組成(a)從以下組成的基團(tuán)中選擇的一個基團(tuán)
其中R1，R3和R5各是氫原子或甲基，R2是氫原子、氯原子、溴原子或甲基，R4是氫原子或含1-5個碳原子的烷基，R6是甲基或乙基;(b)具有以下通式的基團(tuán)
其中R7是氫原子或含1-4個碳原子的鏈烷醇?xì)埢?、乙二醇單烷?其烷基含1-4個碳原子)或甘油二烷醚(其烷基各含1-4個碳原子)作為除去羥基后生成的產(chǎn)物;以及(c)具有以下通式的基團(tuán)
其中羰基的碳原子通過〔SOD〕的氨基氮原子結(jié)合到〔SOD〕上，共聚物殘基具有平均分子量800-20，000，X是1-6的整數(shù)，相當(dāng)于〔SOD〕基團(tuán)的數(shù)目，〔SOD〕基團(tuán)是通過氨基上除去一個氫原子后衍生的。
專利摘要
一種新的超氧化物歧化酶衍生物，這種衍生物具有分解超氧化物的酶活力，超氧化物是對機(jī)體有害的物質(zhì)。本發(fā)明所提供的超氧化物歧化酶衍生物在血漿中的半壽期大大長于超氧化物酶本身，而且保留大部分酶活力。這種物質(zhì)有藥理學(xué)的活性，例如具有對炎癥、局部出血損傷、大腦水腫等的保護(hù)作用。本發(fā)明還提供了制造這種超氧化物歧化酶衍生物的一種方法及其在醫(yī)療上的應(yīng)用。
文檔編號A61K47/48GK87104249SQ87104249
公開日1987年12月9日 申請日期1987年5月16日
發(fā)明者井上正康, 荻野哲也, 森野能昌, 廣田昌彥 申請人:井上正康, 可樂麗股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan