專利名稱：利用纖溶性金屬蛋白酶處理留置導管阻塞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及纖溶性金屬蛋白酶的治療性施用，并且更具體地涉及在體內通過局部遞送向血管血栓施用此類制劑，以實現(xiàn)血凝塊溶解的方法。本發(fā)明也涉及溶解留置導管、旁路或其它血管通路裝置中的血凝塊，以恢復該血管通路裝置功能的方法。
背景技術：
由血凝塊導致的血管阻塞如栓塞及栓子是嚴重的醫(yī)學疾病，如不即時治療可具斷肢或生命威脅。用于處理和消除血管血凝塊的裝置和方法業(yè)已建立。作為舉例說明，參見1984年5月8日公布的美國專利No.4,447,236(Quinn)；1987年9月8日公布的美國專利No.4,692,139(Stiles)；1988年7月5日公布的美國專利No.4,755,167(Thistle等)；1992年12月1日公布的美國專利No.5,167,628(Boyles)；1993年6月29日公布的美國專利No.5,222,941(DonMichael)；1993年10月5日公布的美國專利No.5,250,034(Appling等)；1994年12月6日公布的美國專利No.5,370,653(Cragg)；1995年1月10日公布的美國專利No.5,380,273(Dubrul等)；1996年3月12日公布的美國專利No.5,498,236(Dubrul等)；1997年5月6日公布的美國專利No.5,626,564(Zhan等)；1998年1月20日公布的美國專利No.5,709,676(Alt)；1999年2月2日公布的美國專利No.5,865,178(Yock)以及WO 90/07352(1990年7月12日出版)。此類方法和裝置包括用于將溶栓劑或纖維蛋白溶解劑遞送到血凝塊并使之溶解的輸注導管。輸注導管典型地與能夠降解血凝塊中的纖維蛋白的酶促活性制劑聯(lián)用，從而有效溶解血凝塊。此類酶典型地被稱之為“溶栓劑”或“纖維蛋白溶解劑”。
纖溶酶(fibrolase)是已知的纖維蛋白溶解活性鋅金屬蛋白酶，其首次分離自南方銅頭蛇(Agkistrodon contortrix contortrix)的毒液。參見Guan等，Archives of Biochemistry and Biophysics，289卷，2期，197-207頁(1991)；Randolph等，Protein Science，Cambridge University Press(1992)，590-600頁；1989年7月12日出版的歐洲專利申請No.0 323 722(Valenzuela等)以及1986年9月9日公布的美國專利No.4,610,879(Markland等)。已證明纖溶酶具有纖維蛋白溶解活性，且已有文獻記載該金屬蛋白酶對纖維蛋白原Aα-鏈具有蛋白水解活性，對Bβ-鏈的蛋白水解切割減弱，而對纖維蛋白原γ-鏈沒有活性；Ahmed等，Haemostasis，20卷，147-154頁(1990)。由于纖維蛋白是血凝塊的主要組分，纖溶酶的纖維蛋白溶解活性特點表明了其作為血凝塊溶解劑用于體內溶栓劑的用途的潛力；參見Markland等，Circulation，9卷，5期，2448-2456頁(1994)以及Ahmed等，同上。
新型作用溶栓劑(NAT)為修飾形式的纖溶酶，其與纖溶酶的差異在于NAT含201個氨基酸，其N-端序列為SFPQR，而天然纖溶酶的N-端序列以EQRFPQR起始，且長度為203個氨基酸。設計所述氨基端修飾是用來防止能夠形成可變量的環(huán)化谷氨酰胺(焦谷氨酸)的氨基酸殘基處的化學反應，該反應具有造成產品質量及均一性批間偏差的可能性。因而，NAT可視作更為穩(wěn)定的分子。
盡管存在這些結構差異，NAT和纖溶酶就酶促(纖維蛋白溶解)活性而言是相似的。這種生物活性的相似性與如Manning在Toxicon，33卷，1189-1200頁(1995)中所述的表明纖溶酶分子的活性位點跨越氨基酸139-159、且其在三維空間中推測的定位遠離氨基端的數(shù)據(jù)相一致。纖溶酶和NAT分子的活性位點含鋅原子，其絡合三個組氨酸殘基。
有關蛇毒液來源的纖溶酶的公開文獻已證明了其對纖維蛋白原Lys413-Leu414位點處以及對胰島素氧化β-鏈Ala14-Leu15位點處的蛋白水解活性；Retzios和Markland，Thrombosis Research，74卷，355-367頁(1994)；Pretzer等，Pharmaceutical Research，8卷，1103-1112頁(1991)以及Pretzer等，Pharmaceutical Research，9卷，870-877頁(1992)。也已經(jīng)確定了NAT對這些底物的相同切割位點處具有蛋白水解活性。
與纖溶性金屬蛋白酶如纖溶酶和NAT形成對照，血凝塊溶解劑如鏈激酶、尿激酶和組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)為纖維蛋白溶酶原激活劑，其通過激活內源性纖維蛋白溶解系統(tǒng)而促進血栓溶解。更具體地，纖維蛋白溶酶原活化劑催化纖維蛋白溶酶原轉化為纖維蛋白溶酶，一種絲氨酸蛋白酶。纖維蛋白溶酶能夠在精氨酰-賴氨酰鍵切割纖維蛋白原和纖維蛋白，并且正是通過纖維蛋白溶酶的產生，纖維蛋白溶酶原活化劑最終實現(xiàn)了纖維蛋白的降解和血凝塊的溶解。當前商業(yè)上可獲得的溶栓劑為纖維蛋白溶酶原活化劑如尿激酶、鏈激酶或tPA。
與纖維蛋白溶酶原活化劑類的溶栓劑不同，纖溶性金屬蛋白酶如纖溶酶和NAT并不依賴于內源性纖維蛋白溶解系統(tǒng)(纖維蛋白溶酶原轉化為纖維蛋白溶酶)。因此，這類血凝塊溶解劑可因其獨特的作用模式而有別于纖維蛋白溶酶原活化劑，并被定義為“直接”纖維蛋白溶解劑。
α2-巨球蛋白是普遍存在于哺乳動物血清中的蛋白酶抑制劑，并且是最大的血清蛋白之一(具有725千道爾頓的分子量)。α2-巨球蛋白的蛋白酶特異性很廣，涵蓋絲氨酸、半胱氨酸、天門冬氨酸及金屬蛋白酶類。α2-巨球蛋白分子為相同亞基的四聚體，它們以二硫鍵連接成對，半個分子之間以非共價鍵結合。因而，在還原條件下，天然α2-巨球蛋白可解離為四個單體亞基。
α2-巨球蛋白的每個亞基都擁有極易于被蛋白水解切割的區(qū)域(“誘餌”區(qū))。誘餌區(qū)的蛋白水解誘導α2-巨球蛋白的構象改變，這俘獲了位于α2-巨球蛋白分子結構之內的蛋白酶。該過程在文獻中被描述為“捕蠅草”相互作用。一旦蛋白酶被俘獲，其在空間上受阻，因此不能接近其高分子底物。
另外，在α2-巨球蛋白和許多其俘獲的蛋白酶之間可形成共價鍵。如所提到的那樣，蛋白酶的俘獲誘導了α2-巨球蛋白分子的構象改變。據(jù)推測，經(jīng)此構象改變，α2-巨球蛋白分子內部的硫酯鍵具有反應性，并可與俘獲蛋白酶的親核殘基(例如賴氨酸)形成共價鍵。因而，在體循環(huán)內，α2-巨球蛋白能夠有效地中和多種蛋白酶。
而且，由蛋白酶俘獲帶來的α2-巨球蛋白的構象改變產生了可被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)識別的形式。α2-巨球蛋白俘獲的蛋白酶的清除通常用以分鐘計的半衰期值描述，并且據(jù)信是通過表達于巨噬細胞、肝細胞和成纖維細胞之上的低密度脂蛋白(LDL)-受體相關蛋白發(fā)生的。有關α2-巨球蛋白更多的內容，參見Methods in Enzymology，A.J.Barrett編輯，Academic Press，Inc.，Philadelphia，(1981)，pages737-754。
α2-巨球蛋白能夠與纖溶酶、NAT及其它蛋白酶形成絡合物。不同于能夠與α2-巨球蛋白形成可解離絡合物的某些蛋白，纖溶酶及NAT為在生理條件下形成不能從α2-巨球蛋白上解離的絡合物的纖溶性金屬蛋白酶的兩個實例。例如，當純化的人類α2-巨球蛋白和NAT在一起溫育時，絡合物的形成起始于數(shù)秒之內，并且在數(shù)分鐘之內幾乎完成。這種現(xiàn)象表明在體外絡合物形成可以是極為快速的，并且暗示了在體內α2-巨球蛋白與NAT或其它纖溶性金屬蛋白酶之間的絡合物形成的潛在速度。
盡管α2-巨球蛋白是主要的血漿蛋白之一，可是仍存在有限量的α2-巨球蛋白將會結合并中和纖溶性金屬蛋白酶。因此所述α2-巨球蛋白的結合能力是可飽和的。一旦超過α2-巨球蛋白的結合能力，則未結合的纖溶性金屬蛋白酶隨著樣品中附加纖溶性金屬蛋白酶的加入而成指數(shù)地上升。
患者體循環(huán)中α2-巨球蛋白的存在對系統(tǒng)(例如靜脈內)施用可被全身血循環(huán)中的α2-巨球蛋白結合的纖溶酶、NAT及其它纖溶性金屬蛋白酶構成了挑戰(zhàn)。除非內在α2-巨球蛋白的可飽和水平被此類纖溶性金屬蛋白酶的系統(tǒng)施用劑量超過，否則后者將被有力地中和并致使其對于治療目的而言無效。
在于兔子中進行的一個體內研究中，在系統(tǒng)靜脈內施用后檢測了來源于蛇毒液的纖溶酶的生物學效力。Ahmed等，Haemostasis，見上文。所用的纖溶酶劑量為3.7毫克每公斤，這估計會在3.0公斤的兔子中產生約為60微克每毫升的最終血液濃度。這種含量是基于在血液或血漿，很可能是歸因于α2-巨球蛋白的存在下酶失活檢測的研究而選擇的(見第336和339頁)。
在另一個體內研究中，在犬中檢測了重組纖溶酶對血凝塊溶解的生物學效應。Markland等，Circulation，見上文。在5分鐘內在接近左頸動脈預先誘導的血栓處通過導管裝置向每公斤(動物體重)灌輸4毫克這種物質(見第2450頁)。再一次地，注意到纖溶酶的失活發(fā)生在全身血循環(huán)中，很可能是歸因于α2-巨球蛋白的存在(見第2454頁第二欄最后一段)。
正如這兩個研究所證明的那樣，α2-巨球蛋白的滅活效應可通過施用或系統(tǒng)投藥超過內在α2-巨球蛋白可飽和水平的纖溶性金屬蛋白酶(兔子的研究)或者通過將酶局部遞送到血凝塊位點處(狗的研究)避免系統(tǒng)施用而克服。在另一方面，超過α2-巨球蛋白可飽和水平的纖溶性金屬蛋白酶劑量，無論是系統(tǒng)或是局部遞送的，有可能超過安全且為待治療受試者良好耐受的水平。特別是，纖溶性金屬蛋白酶不僅能夠破壞纖維蛋白，而且他們也可以降解其它結構蛋白，因此在體內當超過α2-巨球蛋白的可飽和水平而大量存在時是具有潛在毒性的。
當使用留置導管或其它血管通路裝置時，血凝塊的形成或其它基于纖維蛋白的阻塞也是關注的問題。存在許多需要反復或延長使用血管通路裝置的情況，例如導管、通路移植、套、針、動靜脈瘺管或旁路。例如，與血透、化療、輸血或換血相關的各種操作、以及涉及反復靜脈內或動脈內藥物遞送(或體液抽取)的其它操作可能涉及使用留置導管或其它永久性或半永久性植入的醫(yī)學裝置。血凝塊可形成在已被引入血管空間之內的任何裝置之中、周圍或附著在其上，當裝置在血管空間中保留一段延長的時間周期時或者當裝置具有一個或多個極小的孔時尤為如此。另外，其它基于纖維蛋白的阻塞可附著在留置血管通路裝置的任何部分，這將防止或妨礙所述裝置的正常運轉。
擁有處理即破壞、分解或溶解已形成在留置血管通路裝置之中、周圍或附著在其上的血凝塊或其它阻塞的快速而有效的方法將是有益的。在不存在處理已形成在血管通路裝置之中或周圍的血凝塊的有效方法時，留置裝置將不得不由醫(yī)師替換，招致額外的花費和患者的風險。
因此，本發(fā)明的目的在于提供處理留置血管通路裝置之中或周圍的血凝塊或阻塞的安全且有效的方法。
本發(fā)明的目的也在于提供恢復完全或部分阻塞的留置血管通路裝置的開放性的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供恢復其功能被基于纖維蛋白的阻塞改變的留置血管通路裝置的功能的方法。
本發(fā)明的目的也在于提供使用局部施用的纖溶性金屬蛋白酶在體內溶解血凝塊的安全且生物學有效的方式。
發(fā)明概述在某些實施方案中，本發(fā)明為經(jīng)由所述血管通路裝置施用一定量的處于藥學上可接受的溶液中的纖溶性金屬蛋白酶治療性處理留置血管通路裝置之中的血凝塊的方法，其中所述含量為每公斤待治療人類受試者體重不超過1.7毫克纖溶性金屬蛋白酶。在某些實施方案中，血管通路裝置留置在人類受試者的動脈或靜脈之中。在某些實施方案中，留置血管通路裝置為導管、旁路、通路移植、針或套。在某些實施方案中，血管通路裝置被用來引入或從血管區(qū)取液。在某些實施方案中，本發(fā)明的血管通路裝置與血透、輸血、取血或換血、化療或者需要引入或從靜脈或動脈取液的任何其它操作聯(lián)合使用。
在某些實施方案中，本發(fā)明為通過向所述血凝塊局部施用一定量的處于藥學上可接受的溶液中的與α2-巨球蛋白絡合的纖溶性金屬蛋白酶溶解留置血管通路裝置之中的血凝塊的方法，所述含量足以促進血凝塊溶解、同時水平又不超過明顯高出所述人類受試者中α2-巨球蛋白的可飽和水平。
在某些實施方案中，本發(fā)明為恢復完全或部分阻塞的留置血管通路裝置的開放性的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明為恢復留置血管通路裝置功能的方法。
附圖簡述

圖1A-1C.圖1A為在充氣囊導管誘導的損傷和阻塞性血栓形成前成年豬頸動脈的基線血管造影照片。圖1B為在第四天在按照本發(fā)明的方法施用NAT之前對同一動物拍的血管造影照片。圖1C為在經(jīng)由″PRO″導管施用30mg NAT后2小時的血管造影照片(有關該裝置的舉例說明，參見圖3)。
圖2舉例說明了被設計用于在血管中局部遞送溶栓劑的一類導管裝置。
圖3為用于在血管中局部遞送溶栓劑的一類備選導管裝置的代表性側視圖。
圖4為估計的周圍血管阻塞患者中NAT的最大劑量的柱形圖。
圖5舉例說明了NAT在體外導管阻塞模型中的用途。
圖6舉例說明了眾多試驗結果的總結，所得平均值數(shù)據(jù)顯示NAT在體外溶解阻塞比用于導管清除的商業(yè)尿激酶產品AbbokinasesOpen Cato快達40％。
發(fā)明詳述在某些實施方案中，本發(fā)明為在人類受試者中通過纖溶性金屬蛋白酶在體內處理血凝塊的方法，包括向血凝塊局部施用安全、生物學有效量的纖溶性金屬蛋白酶，例如通過使用導管或其它血管通路裝置。典型的，靜止的纖維蛋白血凝塊將分布于人類受試者的血管(動脈或靜脈、天然或合成的(如移植物))之中。在某些實施方案中，本發(fā)明為處理位于留置導管、旁路、針或其它血管通路裝置之中、周圍或附著在其上的血凝塊的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明為恢復完全或部分阻塞的留置血管通路裝置的開放性的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明為恢復功能已因基于纖維蛋白的阻塞改變或在某種程度上受損的血管通路裝置的功能的方法。
“安全、生物學有效”量是指足以降解纖維蛋白并促進血凝塊(如血栓)溶解、同時水平又不明顯高于待治療患者循環(huán)系統(tǒng)中α2-巨球蛋白可飽和水平(即可能對血管壁造成損傷的水平)的含量。典型地，該含量將在每公斤待治療人類受試者體重0.025和1.7毫克之間的范圍，正如由來自于已研究了體外α2-巨球蛋白含量和結合能力的人類受試者的血樣進行的研究所確定的那樣。根據(jù)這種研究的體外結果，實際上已有可能限定α2-巨球蛋白的體內可飽和水平，從而使得能夠對生物學有效量進行描繪，它不僅考慮了生物學效力所需纖溶性金屬蛋白酶的最低水平，而且考慮到良好耐受施用的最高水平。這種研究進一步在下文的實施例中詳細描述。
適用于纖溶性金屬蛋白酶遞送方式的術語“局部地”或“局部化的”在文中是指動脈內或靜脈內施用，或者直接向血凝塊本身(如血栓內)，或者在血凝塊附近(相對于血流的遠端或者近端)，且足夠近以使多數(shù)纖溶性金屬蛋白酶為血凝塊所吸收。為了處理血管通路裝置之中、周圍或附著在其上的血凝塊，或者為了恢復血管通路裝置的開放性或功能，纖溶性金屬蛋白酶的遞送通常藉由血管通路裝置本身完成，因而固有地為局部(遞送)。在某些實施方案中，可使用第二血管通路裝置如導管，以向植入的醫(yī)學裝置如支架遞送纖溶性金屬蛋白酶。
術語“導管遞送工具”或“血管通路裝置”在文中以約定俗成的含義使用，是指為輸注或抽液或保持通道開放之目的用以插入到管道、血管、通道或體腔之中的管狀醫(yī)學裝置。一般而言，此類工具將典型地包括含有一個或多個內部通道(或“內腔”)的延伸的柔性管體；允許將物質(即血凝塊溶解劑)引入到管體并使之穿過所述內腔流動的近端；具有任選地錐形端的遠端；以及位于遠端處或附近的一個或多個出口，以允許物質相應外加壓力離開導管。
術語“蛋白水解性地降解”、“分解”、“溶解”和“治療性處理”在文中都用來指血凝塊或基于纖維蛋白的其它阻塞的降解、瓦解、分解、破碎或其它形式的消除。血凝塊可能部分或者完全堵塞血管或醫(yī)學裝置的內腔。類似地，“恢復開放性”是指因其中血凝塊分解而致的通過血管或裝置內腔或出口的血流(例如，以流量或流速計)的任何可測的增加。
如文中所用的術語“血凝塊”或“阻塞”是指任何基于纖維蛋白的塊、簇、堵塞或生長。典型地當血液在動脈或靜脈內凝固并完全或部分地阻止、阻隔、阻礙或封阻其中的血液流動時，血凝塊就形成了。血凝塊也能夠在引入到血管空間的任何外來物件之中或周圍形成。血凝塊可以是靜止的，例如血栓(在血管中形成并保留在其中的血凝塊)，或者它可以是可移動的，例如栓子(自其形成部位移動到身體另一場所的血凝塊)。血凝塊也可以在大小、形狀和組成方面廣泛變化，并且可包括團塊以及瓣片或其它平面結構。有時，動脈粥樣硬化斑、小塊腫瘤、脂肪球、空氣、羊水或見于血中的其它物質可象血凝塊一樣以相同的方式起作用。就此類物質含有纖維蛋白或易于被纖溶性金屬蛋白酶降解的其它物質而言，本發(fā)明的一種方法將可用于處理之。
本發(fā)明的另一種方法進一步在下文就周圍動脈阻塞(PAO)而言進行舉例說明。PAO由于動脈硬化癥而起源于外周血管病。癥狀在多年的動脈硬化進程中緩慢形成，下肢疾病患者的臨界局部缺血水平約達15到20％。醫(yī)學治療是有限的，并且主要是利用諸如降脂或抗血小板制劑的藥物治療、戒煙計劃以及體育運動旨在預防或降低風險。Jackson和Clagett，Chest，114卷，666S-682S頁(1998)。
外周血管病的臨床表現(xiàn)可能包括威脅肢體的局部缺血的急性發(fā)作或者更為慢性的血管病跡象(如間歇性跛行)的出現(xiàn)。除上述預防措施之外，慢性PAO典型地在嚴重的生活方式缺陷或威脅肢體的局部缺血發(fā)作之前不予治療。視患病血管區(qū)段和阻塞程度而定，可用的醫(yī)學干預包括經(jīng)皮腔內血管成形術、外科手術血管再造以及血栓溶解術。研究表明血凝塊溶解劑的動脈內輸注，尤其是在阻塞早期，能夠避免外科手術干預的需要。如在急性PAO將纖維蛋白溶酶原活化劑尿激酶的血栓溶解與外科手術治療相比較的Rochester試驗中所證明的那樣(Ouriel等，Journal of Vascular Surgery，1994，19卷，1021-1030頁)，該研究中處于血栓溶解武器之下的大約33％的患者僅用醫(yī)學干預就得到了成功的治療，從而避免了更為侵入性的操作。相反，處于手術武器之下的98％的患者經(jīng)歷血管內或外科手術操作。
能夠以類似的方式通過本方法有效治療的涉及阻塞性血凝塊的其它醫(yī)學紊亂包括但不限于急性心肌梗塞、局部缺血性中風、深靜脈血栓形成和肺栓塞。在某些實施方案中，也可使用本發(fā)明的方法以溶解伴隨長期植入的醫(yī)學裝置如留置導管和血透通路移植出現(xiàn)的血凝塊。其它示例性的植入醫(yī)學裝置包括旁路、通路部件、針、套或其它血管通路裝置。
在某些實施方案中，本發(fā)明適用于治療性遞送能夠與α2-巨球蛋白絡合的任何纖溶性金屬蛋白酶。此類纖溶性金屬蛋白酶如果是天然存在的話，可從其天然來源純化，例如來自蛇毒液的纖溶酶。備選地，其核酸和氨基酸序列已知的多肽纖溶性金屬蛋白酶制劑可利用重組表達和純化的常規(guī)方法制備。
一般而言，重組方法使用編碼目的纖溶性金屬蛋白酶的DNA分子，其被插入到合適的載體中用以在合適的宿主細胞中表達。挑選在特定宿主細胞中具有功能，即與宿主細胞及其相容的載體，從而DNA的表達得以發(fā)生。載體也可以含5′側翼序列(也稱之為“啟動子”)和可操作地連接于待表達DNA的其它表達調控元件，以及其它已知的元件，例如復制起點元件、轉錄終止元件、含供體和受體剪接位點的完整內含子序列、信號肽序列、核糖體結合位點元件、多聚腺苷酰化序列、用以插入編碼核酸的多聚接頭區(qū)以及可選標記元件。載體也可以任選地含有“標簽”序列，即位于多肽編碼序列5′或3′端的寡核苷酸序列，其編碼多聚His或另外的小免疫原性序列。這種標簽將與目的蛋白一同表達，并且可作為親和標簽用于從宿主細胞中純化該多肽。如果期望，所述標簽隨后可通過多種手段從純化的多肽上去除，例如使用選擇性肽酶。
在期望多肽從宿主細胞中分泌出來的那些情況下，可使用信號序列以將多肽引導到合成它的宿主細胞之外。典型地，信號序列位于核酸序列的編碼區(qū)中，或者直接位于編碼區(qū)的5′端。已鑒定到許多信號序列，并且可以使用任一在所選宿主細胞中有功能的(信號序列)。
在已構建了載體且核酸已被插入到合適的載體位點之中后，可將完成的載體插入到合適的宿主細胞中用于擴增和/或多肽表達。宿主細胞可以是原核的(如大腸桿菌)或真核的(例如酵母細胞、昆蟲細胞或脊椎動物細胞)。
合適的宿主細胞或細胞系可以是哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或3T3細胞。合適哺乳動物宿主細胞的選擇以及用于轉化、培養(yǎng)、擴增、篩選和產物生產及純化的方法是本領域公知的。其它合適的哺乳動物細胞系有猴COS-1和COS-7細胞系，以及CV-1細胞系。另外示例性的哺乳動物宿主細胞系包括靈長類動物細胞系和嚙齒類動物細胞系，包括轉化的細胞系在內。正常的二倍體細胞、來源于體外原代組織培養(yǎng)物的細胞株、以及原代外植塊也適用。候選細胞可以是選擇基因基因型缺陷性的，或者可以含有顯性作用的選擇基因。還有其它合適的哺乳動物細胞系，包括但不限于HeLa、小鼠L-929細胞、來源于Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK倉鼠細胞系。
同樣可作為宿主細胞的有細菌細胞，例如，多種大腸桿菌菌株以及多種酵母細胞菌株。
將載體插入(也稱之為“轉化”或“轉染”)到所選宿主細胞中可利用諸如磷酸鈣、電穿孔、微注射、脂質體轉染或DEAE-葡聚糖法等方法實現(xiàn)。所選方法將部分地為待用宿主細胞類型的函數(shù)。這些方法及其它合適的方法是熟練技術人員眾所周知的。
當在合適的條件下培養(yǎng)時，宿主細胞能夠合成目的纖溶性金屬蛋白酶。宿主細胞可利用熟練技術人員眾所周知的標準培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基通常將含有細胞生長和存活必需的所有營養(yǎng)。例如，用于培養(yǎng)大腸桿菌細胞的合適的培養(yǎng)基為Luria肉湯(LB)和/或Terrific肉湯(TB)。用于培養(yǎng)真核細胞的合適的培養(yǎng)基為RPMI 1640、MEM、DMEM，它們都可按培養(yǎng)中的特定細胞系所需補充血清和/或生長因子。
典型地，用于轉化細胞選擇性生長的抗生素或其它化合物僅作為培養(yǎng)基補充物添加。待用化合物將由用于轉化宿主細胞的質粒上存在的可選標記元件決定。例如，當可選標記為卡那霉素抗性時，添加到培養(yǎng)基中的化合物將為卡那霉素。
宿主細胞中產生的蛋白量可利用本領域公知的標準方法進行評價，包括蛋白質印跡分析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、非變性凝膠電泳、HPLC分離、免疫沉淀和/或活性測定如DNA結合凝膠移位測定。
如果蛋白由除革蘭氏陰性細菌以外的宿主細胞分泌，則多數(shù)將很可能見于細胞培養(yǎng)基中。如果不分泌，它將存在于胞質之中。對于胞內蛋白，宿主細胞典型地首先被機械破碎。對于定位于周質的蛋白，可利用機械破碎或滲透處理將周質內含物釋放到緩沖液中，然后從該溶液中分離多肽。之后可利用多種技術實現(xiàn)自溶液中的純化。
如果蛋白已被合成從而含有標簽，例如在其羧基或氨基端的六聚組氨酸或其它小肽，則通過使溶液穿過其中柱基質對所述標簽或直接對所述多肽具有高親和力(如單克隆抗體)的親和柱，其可以基本上以一步操作純化。當多肽無標簽且抗體不存在時，可使用其它眾所周知的純化操作，例如離子交換層析、分子篩層析、反相色譜、HPLC、自然凝膠電泳聯(lián)合凝膠洗脫、以及制備性等電聚焦(″Isoprime″machine/technique，Hoefer Scientific)。在有些情況下，可結合兩種或多種這些技術以獲得增加的純度。
在文中用于舉例說明本發(fā)明的實施的新型作用溶栓劑(NAT)多肽一般是指SEQ ID NO1的纖維蛋白溶解活性金屬蛋白酶。所述NAT多肽由SEQ ID NO2的cDNA分子編碼，盡管根據(jù)進一步在下文提及的特定方法，編碼同一多肽的變體序列的DNA分子也可用于表達和生產。
纖溶酶在科技和專利文獻中已有描述，參見上文的參考文獻。典型地，在本發(fā)明的實施中所用的纖溶酶形式將是SEQ ID NO3，其由SEQ ID NO4的cDNA分子或編碼相同氨基酸序列的其變體編碼。
優(yōu)選地，采用酵母表達系統(tǒng)用于NAT的重組表達。特別提及的是畢赤氏酵母屬菌株，例如巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)，是最為有利和優(yōu)選使用的。此系統(tǒng)的詳細描述可見于美國專利No.4,855,231(Stroman等)、美國專利No.4,812,405(Lair等)、美國專利No.4,818,700(Cregg等)、美國專利No.4,885,242(Cregg)以及美國專利No.4,837,148(Cregg)，特此將其公開內容并入作為參考。此系統(tǒng)中纖溶酶的表達將典型地涉及SEQ ID NO5的DNA分子，除“成熟”多肽(核苷酸784-1392)外，其還編碼“前原”序列(核苷酸1-783)。此系統(tǒng)中NAT的表達將典型地涉及SEQ ID NO6的DNA分子，除“成熟”多肽(核苷酸784-1386)外，其還編碼“前原”序列(核苷酸1-783)。
根據(jù)本發(fā)明使用的纖溶性金屬蛋白酶，無論它是NAT、纖溶酶、或是某些其它纖溶性金屬蛋白酶，都以藥學上可接受的溶液施用，單獨或含附加的藥學上可接受的成分。如果期望，除纖溶性金屬蛋白酶和溶劑(即蒸餾水或生理鹽水)外，此類溶液可包含常規(guī)量的標準成分如穩(wěn)定劑(以防止蛋白聚集或在水性介質中的物理或化學降解)、膨脹劑(以提供體積)、稀釋劑、抗菌劑、粘度調節(jié)劑、抗氧化劑等等?？砂ㄔ谥苿┲械囊阎x形劑包括聚醇(包括甘露醇、山梨糖醇和丙三醇)、糖(包括葡萄糖和蔗糖)以及氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。例如參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania。也見WO01/24817 A2(特此將其全文并入作為參考)，其公開了可用于本發(fā)明的纖溶制劑的多種組合物。
期望在施用前藥物組合物將被緩沖(用生物相容性緩沖劑，例如檸檬酸或檸檬酸鹽)至處于或接近中性(7.0)的pH，并且通常在約6.5和約8.0的pH(±0.5)之間。
如果纖溶性金屬蛋白酶的金屬離子為鋅，如纖溶酶或NAT那樣，可優(yōu)選包括水溶性鋅鹽(例如硫酸鋅或醋酸鋅)作為穩(wěn)定劑。為進一步增強組合物的長期穩(wěn)定性和保存限期，也可以有利地冷凍溶液或將其轉變?yōu)閮龈?冷凍-干燥)品，其在用前融化或重構，視情形而定。
作為舉例說明，本發(fā)明的方法中可用的可冷凍液體醫(yī)學組合物包含纖溶酶或NAT、水溶性鋅鹽、檸檬酸緩沖液、任選地選自水溶性鈣鹽的附加穩(wěn)定劑、以及任選地膨脹劑(例如甘露醇)。也可以添加表面活性劑如Tween80(BASF，Gurnee，Illinois)以增進凍融穩(wěn)定性?？商砑覶ris緩沖液(Sigma，St.Louis，Missouri)或另外的緩沖能力高于pH7.0的緩沖液以使pH穩(wěn)定在或高于pH7.4。這些成分多數(shù)將以從0.001到2.0毫摩爾(mM)或小于10％(w/v)的范圍小量存在。緩沖劑將以足以達到期望pH的量添加，且該量可根據(jù)特定制劑而變。
作為進一步的舉例說明，本發(fā)明的方法中可用的可凍干或凍干藥物組合物包含纖溶酶或NAT、鋅穩(wěn)定劑(如諸如上述的水溶性鋅鹽)、以及檸檬酸緩沖液，有或無其它賦形劑(如膨脹劑，例如甘露醇、甘氨酸等)。凍干組合物也可以含二糖如蔗糖或海藻糖作為凍干保護劑?？商砑颖砻婊钚詣┤鏣ween80以防護作用于纖溶性金屬蛋白酶(如纖溶酶或NAT)的凍干壓力。pH理想地將維持在pH8.0±0.5，使用pKa在此范圍內的合適緩沖液(例如Tris)。成分的用量依據(jù)上文。
如所提到的那樣，在某些實施方案中，使用本發(fā)明的方法局部施用生物學有效量的在0.025和1.7mg/kg之間的劑量范圍內的纖溶性金屬蛋白酶。優(yōu)選地，此含量將在從約0.1到約0.5mg/kg的范圍中。溶液濃度將據(jù)此配制，在施用時按需施行稀釋。
與天然動脈或靜脈如PAO中的血栓治療不同，發(fā)生在植入或留置血管通路裝置中的血凝塊處理構成了額外的挑戰(zhàn)。例如，在阻塞的中央靜脈線中，導管的“死容量”(即導管內徑乘以其長度)限定了導管內可容納的最大容量。例如，具有1.0mm內徑和40.0cm長度導管擁有約0.3ml的死容量。由于容量可如此有限，限定合適的溶液強度是很重要的。因此，提高溶液強度或濃度是提高可溶解靶標血凝塊的用藥量的有效手段。
在某些實施方案中，本發(fā)明的方法涉及纖溶性金屬蛋白酶治療與血管通路裝置相關的阻塞的用途。此類血凝塊可發(fā)生在血管通路裝置之中、周圍或附著在其上。典型地，血凝塊將形成在裝置如導管的內腔或出口，并且可能干擾導管的功能。血凝塊也可以發(fā)生在血管通路裝置的外部，例如瓣片，其有可能覆蓋出口并因而阻止藥物的引入或血液的移取。血凝塊也可以附著在血管通路裝置之上，干擾裝置的正確運作。所述干擾可以因部分阻塞或封阻(也就是說有些流體可能通過)或者其中無流體可通過的完全阻塞而引起。
為示范本發(fā)明的一種方法，使用體外導管阻塞模型來模擬留置導管型裝置中的血凝塊。在這種模型中，使用膠原涂敷的巴斯德移液管模擬導管的留置部分。通過毛細管作用由指刺將人血抽至3.0mm的長度并使之凝固。將一個移液管頭插入到含鹽水的瓶中，而另一個插入到4mg NAT(40mg/ml溶液濃度100ul)的NAT溶液中。圖5舉例說明了這種體外導管阻塞模型的結果，其顯示鹽水中的血凝塊保持完好，而40mg/ml中的血凝塊在溶解血凝塊方面是活躍的。
在另一個實驗中，將不同的一組移液管(在頭部每一個都含血凝塊)插入并在含如下100ul鹽水、100ul尿激酶溶液(5000IU/ml)以及100ul NAT溶液的瓶中溫育，其中通過將溶液濃度從5mg/ml提高到40mg/ml而使藥量從0.5變化到4mg。圖6舉例說明了眾多實驗的總結結果，所得平均值數(shù)據(jù)證明NAT在體外溶解阻塞比AbboknnaseOpenCath，一種用于導管清除的商業(yè)尿激酶產品快達40％(第二柱，UK 500I.U.)。圖6也證明了NAT就NAT通過蛋白水解起降解血凝塊作用的速度而言的劑量依賴性質。
為處理相對小的留置導管阻塞，如由體外導管阻塞模型所模擬的阻塞，優(yōu)選的處理范圍將會是大約5到40mg/ml纖溶酶、NAT或其它纖溶性金屬蛋白酶。然而，根據(jù)血管通路或其它醫(yī)學裝置的類型和大小、還有血凝塊或阻塞的位置、大小以及程度，可能需要小得多或大得多的劑量。例如，處于相對大的血透旁路中的血凝塊很可能將會比封阻1.0mm直徑導管出口的血凝塊需要更高濃度的纖溶性金屬蛋白酶。因此，用于該適應癥的濃度無論在何處可在從0.1mg/ml或更小到80mg/ml以上的范圍內變化。
對于位于留置血管通路裝置之中、周圍或附著在其上的血凝塊，有效劑量可通過多種方式遞送，包括脈動輸注、連續(xù)輸注、團塊施用或者所有三種的組合?？紤]到由“死容量”束縛所造成的困難，團塊施用通常是優(yōu)選的。
在典型的情況下，本發(fā)明的方法與導管引導的血栓溶解操作聯(lián)合實施。此類操作包括使用預先滅菌的導管型藥物遞送裝置，其側壁可由薄的半剛性或柔性生物適應性材料(例如聚烯烴、含氟聚合物或其它惰性聚合物)制成。一般而言，合適的導管含有至少一個沿裝置長度延伸的內部腔(或內腔)。構造導管的材料足夠柔韌，從而可在脈管系統(tǒng)內部移動而不會對血管壁造成損傷，但是又足夠剛硬，從而可朝治療部位延伸一段距離，而裝置的內腔保持充分擴張。典型地，此類導管裝置將在導管直徑French標度從2到20(1/3毫米等于1French)、而長度從2到6英尺或更長的范圍內變化。
根據(jù)本發(fā)明的用于血管內遞送血栓溶解藥物的示例性的導管裝置在圖2和3中舉例說明，其實際應用在下文的實施例中詳細說明。不過，可以使用任何適用于該方法的普通導管遞送或血管通路裝置，包括但不限于文中提及的特定裝置。
例如，圖2舉例說明了設計用于在血管中局部遞送溶栓劑的一類導管裝置。所述裝置以側向截面角度顯示，在遞送終端含有“側孔”，在外加液壓下浸劑(infusate)(溶栓劑)通過該側孔釋放出來。該圖及其后圖中相對于總尺寸的導管直徑被擴大以更好地顯示細節(jié)。同時參見圖3，其舉例說明了側向截面角度的用于在血管中局部遞送溶栓劑的另一類導管裝置。所述裝置含有細的裂縫，稱之為“壓力感應出口”(PRO)，其以規(guī)則的間距在導管壁上切割而成，從而當導管內的液壓達到臨界點、導致裂縫開啟時，浸劑溢出。所述裝置可與能夠遞送藥物輸注脈沖的自動化活塞驅動脈沖輸注裝置(未顯示，但在下文進一步例示)聯(lián)合使用。
對于發(fā)生在靜脈或動脈中且與血管通路或其它醫(yī)學裝置的引入無關的血凝塊，有效劑量的纖溶性金屬蛋白酶可通過脈動輸注、連續(xù)輸注、團塊施用或者所有三種的組合經(jīng)由導管向局部治療部位遞送。對于這些類別的血凝塊，治療液中纖溶性金屬蛋白酶的溶液強度(即濃度)也是重要的參數(shù)。更具體地，應選擇在效力低端纖溶性金屬蛋白酶最小稀釋度(這對于團塊施用尤為重要)和在高端纖溶性金屬蛋白酶最大溶解度之間的范圍。一般地，采用從約0.1到約80mg/ml范圍內的溶液強度。然后據(jù)此選擇團塊的體積(或者在“脈沖”遞送的情況下為多個團塊的總體積)，以遞送有效量的在上文規(guī)定的范圍之內的纖溶性金屬蛋白酶。
具體實施方案的描述本發(fā)明在下列實施例中進一步舉例說明，所述實施例是示例性的，而并非將本發(fā)明限制為所述實施方案。在這些實施例中，并且在本發(fā)明描述的始終，“kg”表示每個測試受試者體重的千克數(shù)，“mg”表示毫克數(shù)，“mL”表示毫升數(shù)，而“min”表示分鐘數(shù)。舉例說明的纖溶性金屬蛋白酶，即新型作用溶栓劑(NAT)是重組來源的，并且根據(jù)上文所提及的方法制備。
實施例1成年豬頸總動脈亞急性血栓癥的血栓溶解
NAT已在合同實驗室(Charles River Laboratories，Southbridge，Massachusetts)中在體重平均75kg的成年豬頸動脈亞急性血栓癥模型中進行了研究。該研究的目的在于確定NAT在與人類外周動脈阻塞相關的血栓癥模型中的纖維蛋白溶解活性。
在這種動物模型中，通過聯(lián)合充氣囊損傷、凝血酶和停滯沿頸動脈整個長度(從主動脈起點到頸動脈分岔大約為20厘米)形成血栓。血栓大小接近于臨床上遇到的外周動脈阻塞的人類的血栓大小。在血栓形成成功之后，使動物進行為期四天的恢復。選擇四天周期以允許廣泛的纖維蛋白交聯(lián)、血栓重塑以及細胞浸潤。特別地，這種模型中血栓的大小和時期都是多數(shù)近來發(fā)表的纖維蛋白溶酶原活化劑在人類外周動脈阻塞血栓溶解TOPAS試驗中報道的缺血癥狀大小和持續(xù)時間的合理體現(xiàn)。有關參考文獻，參見Ouriel等，New England Journalof Medicine，338卷，1105-1111頁(1998)。
簡要地，頸總動脈可通過熒光鏡檢指導的充氣囊損傷沿其整個長度形成血栓。所用的充氣囊為特大型的且不易屈從。所述充氣囊在高達12個大氣壓的壓力下充氣，這導致血管內膜層的壓傷。當給充氣囊充氣時，前后移動之以便揭掉血管內皮。
充氣囊操作極為有害并造成高度血栓形成的血管表面，并且沿頸總動脈的整個長度上重復。在徹底損害整個動脈之后，將充氣囊撤回到靠近主動脈的近位，并充氣以堵塞血液沿血管的流動。在堵塞的同時，通過充氣囊導管的遠側端口注射50單位的牛凝血酶以刺激凝固。充氣囊在為期30分鐘的時間內保持充氣，這引起血管的血栓形成性阻塞。30分鐘后，對充氣囊放氣，并進行血管造影以確認血管已被堵塞。利用這些操作，在大于90％的情況下實現(xiàn)了血管阻塞。
圖1A為在充氣囊導管誘導的損傷和阻塞性血栓形成前成年豬頸動脈的基線血管造影照片。箭頭表示左頸總動脈中對照介質的位置和存在，標志著動脈中的血流未被阻塞(即血管是“開著的”)。圖1B為在第4天在按照本發(fā)明的方法施用NAT之前對同一動物拍的血管造影照片。箭頭表示左頸總動脈的位置，然而，由于阻塞性血栓的存在對照介質不在動脈中流動。圖1C為在經(jīng)由″PRO″導管施用30mg NAT后2小時的血管造影照片(有關該裝置的舉例說明，參見圖3)。箭頭表示血管中對照介質的存在，證明左頸總動脈已恢復了開放性。在動脈內腔中可見最小限度的殘留血栓。
一旦血栓形成，則取出充氣囊導管、引導導管和通路套，并允許動物進行為期四天的恢復。在第四天，重新麻醉動物，重新形成阻塞，并在熒光鏡檢指導下推進并安置一多側孔藥物遞送導管(見圖2和3)，從而使側孔位于血栓之內。使用從10到30mg范圍內變化的固定NAT劑量(或者基于體重調整的大約0.1到0.4mg/kg)，通過血管造影術觀察NAT的血栓溶解，如圖1A-1C所示。
如圖1B中圖像所舉例說明的那樣，如通過血管造影術評估的那樣，NAT可有效地恢復靠前等級的流動。更為定量地，靶標血管中的流動被定性地按照4-分的等級(從0到3的范圍內變化)計分，其中0＝?jīng)]有流動1＝流動估計小于對側(無血栓形成的)頸動脈的30％2＝流動估計為對側頸動脈的30-80％3＝流動與對側頸動脈無差別圖1B所示圖像得分為等于3的流動等級，在由固定30mg劑量的NAT(在75kg豬中大約為0.4mg/kg)治療的血栓形成血管中這是常見的結果。下文下列實施例中的表1-3舉例說明了治療方案和來源于連續(xù)血管造影照片的平均流動得分。在所有研究中，持續(xù)監(jiān)測呼吸、體溫、心率和動脈血壓，并且保持在生理范圍之內，在施用NAT后未觀察到變化。
實施例2PRO導管的選擇和脈沖-噴霧遞送在外周動脈阻塞的臨床處理中，溶栓劑經(jīng)由置于血栓附近或植入其中的導管遞送。如圖2和3所示，存在兩類常用導管。
一種“側孔”導管(圖2)在靠近封閉遠端6處具有在導管(4)上切割而成的微小圓側孔(2)，并在近端12所附的配對環(huán)中具有入口8(為纖溶性金屬蛋白酶溶液之用)。導管4由柔性延長的生物適應性聚合物管材構造，它中空薄壁，且具有2到20French的統(tǒng)一直徑，并且優(yōu)選3到5French。所述導管在靠近遠端6的外表面上含有兩個不透射線的標記14，這劃分出了含側孔2的導管部分的界限。在實踐中，所述導管被插入到阻塞的動脈或靜脈的外科手術開口中，并且在按照標準認可操作經(jīng)由熒光鏡檢觀察的同時，小心地使之穿過血管移動，從而將遠端6置于血栓之中或附近。在熒光鏡圖像中清晰顯示的標記14可作為安置該導管部分的向導，從而由側孔2出現(xiàn)的浸劑將直接與血栓接觸。然后在輕壓下將纖溶性金屬蛋白酶藥液自注射器樣貯液器16注射到入口8中，并朝遠端6推進，穿過孔2進入到血栓中，導致纖維物質的降解。
當利用這類導管進行纖溶性金屬蛋白酶輸注時，多數(shù)含纖維蛋白溶解劑的溶液傾向于從近側孔(即離藥物入口8最近的孔)溢出，這對于治療部位藥物遞送的均一性具有負面影響。也存在血液在負壓下經(jīng)由側口2逆流到導管中的可能性。
另外一種導管也是由中空薄壁的生物適應性聚合物材料組成的，如圖3所示，具有極其細的裂縫2，它是在柔性導管4上以規(guī)則間隔在靠近封閉遠端6處由激光切割而成的。所述裂縫稱之為壓力感應出口(“PRO”)，它足夠緊密，浸劑不會溢出，除非導管內的液壓達到臨界點并同時導致裂縫擴張從而臨時開啟。所述導管也可以含有外部不透射線的標記8，以有助于將裝置安置在血栓部位。
理想地，此類“PRO”輸注導管與能夠將低容量調節(jié)的藥物輸液脈沖遞送到導管4近端14處所附配對環(huán)12上的入口10中的自動化活塞驅動脈沖輸注裝置(未顯示)聯(lián)合使用。當遞送脈沖時，導管內的壓力即刻升高。作為響應，壓力感應出口(裂縫2)即刻開啟，并允許浸劑(如纖溶性金屬蛋白酶藥液)溢出。浸劑脈沖遞送和PRO型導管的理論優(yōu)勢在于浸劑沿導管整個長度經(jīng)由裂縫均一地遞送，而經(jīng)由“側孔”導管(圖2)遞送的浸劑如所說的那樣，沿最小阻力的路徑而行，并以非均一的方式流出近端側孔。
利用固定劑量的30mg NAT(在75kg豬中大約為0.4mg/kg)，使用四天史頸動脈血栓癥的豬模型評估上述兩種導管類型的性能。結果總結于表1。
表1利用側孔和PRO輸注導管由NAT獲得的血管造影流動得分的比較
CMCragg-McNamaraTM閥式輸注“側孔”型導管(MicroTherapeutics，Inc.，San Clemente，CaLfornia)。PS如由通過使用壓力感應(PRO)出口導管(Uni*Fuse CatheterTM，AngioDynamics，Inc.，Queensbury，New York)所限定的“脈沖噴霧”遞送與自動化脈沖輸注裝置(PULSE*SPRAY INJECTOR Model PSI-1，AngioDynamics，Inc.，Queensbury，New York)聯(lián)合使用。
如表1所示，由脈沖噴霧形式治療的組中血管造影流動得分在30分鐘血管造影照片處表現(xiàn)出略高的初始流動得分，并持續(xù)到四小時的時間點。盡管未獲得統(tǒng)計學差異，血管造影結果一般被判斷為較優(yōu)越。所以，PRO型導管聯(lián)合脈沖噴霧遞送是根據(jù)本發(fā)明的纖溶性金屬蛋白酶優(yōu)選的遞送模式。
實施例3藥物遞送時間的評估急性外周動脈阻塞典型地由纖維蛋白溶酶原活化劑如尿激酶治療，其作為輸液遞送，持續(xù)時間通常為24小時，并偶見長達48小時。漫長的輸注據(jù)推測可在延長的時間周期內維持低水平的纖維蛋白溶酶原活化劑產生，以有效地溶解阻塞的血栓。由于NAT和纖溶酶都是纖溶性金屬蛋白酶，此種延長的輸注可能不是必要的。為評估遞送速率是否影響血管造影血凝塊溶解，利用PRO導管和脈沖噴霧裝置遞送固定30mg劑量的NAT(在75kg豬中大致為0.4mg/kg)。使用0.1mL脈沖體積，在6分鐘(每分鐘10個脈沖)或60分鐘(每分鐘1個脈沖)內遞送5mg/mL NAT溶液。結果示于表2。
表2由PRO導管和脈沖噴霧注射器遞送的NAT藥物遞送時間的比較
如表2所示，在6分鐘之內遞送30mg NAT在30分鐘的血管造影照片中在三只動物中產生2.7的平均流動得分，其持續(xù)到四小時時間點之外。相反，在60分鐘之內通過脈沖輸注遞送30mg NAT遠不及它可觀。盡管這些數(shù)據(jù)未經(jīng)統(tǒng)計學比較，結果似乎支持以更為快速的脈沖方案遞送NAT。
實施例4脈沖體積的優(yōu)化脈沖噴霧輸注裝置可設計用于遞送每個脈沖0.1到0.5mL的脈沖體積。為確定是否脈沖體積對豬模型的血管造影結果有任何影響，將0.2mL的脈沖體積與0.4mL的體積進行了比較。NAT以10mg的固定劑量(在75kg豬中相當于0.15mg/kg)遞送。結果示于表3。
表3使用以0.2mL或0.4mL脈沖體積遞送的NAT的血管造影結果的比較
如表3所示，在30分鐘處，0.4mL脈沖體積組的平均血管造影得分略高。不過，在四小時時間點，0.2mL脈沖體積的組平均值略高。既如此，由這些研究無法得出一種脈沖體積優(yōu)于另一種的結論。
前文和表中的結果提示幾乎所有這些NAT治療方案用本發(fā)明的遞送方法可有效治療外周動脈阻塞，并且這些結果至少與纖維蛋白溶酶原活化劑如尿激酶治療相當，它是目前溶栓劑的治療選擇。
結果證明脈沖噴霧遞送的PRO導管似乎提供更優(yōu)越的血管造影結果?？紤]到這些研究中的動物體重(70-100kg)，30mg的固定劑量基于體重調整大致相當于0.3-0.4mg/kg。
將固定劑量的NAT降至10mg導致四小時處組平均血管造影得分的下降，并且在有些動物中，無法獲得開放性。這表明在這種模型中10mg劑量的NAT似乎是生物活性的閾值劑量?？紤]到這些研究中的動物體重(70-100kg)，10mg的固定劑量基于體重調整大致相當于0.1-0.15mg/kg。將脈沖體積由0.2mL變?yōu)?.4mL，似乎對血管造影開放性得分并無深刻影響。
實施例5人類安全、良好耐受、生物學有效劑量范圍的確立有關α2-巨球蛋白在外周血管疾病(PVD)老年患者中的血清濃度或生化活性不存在令人滿意的文獻。由于α2-巨球蛋白濃度為安全性的關鍵性決定因素，并且很可能與體內纖溶性金屬蛋白酶的耐受有關，在PVD患者中進行了代表性的流行病學研究，以評價血清α2-巨球蛋白濃度和纖溶性金屬蛋白酶結合能力(利用NAT作為測試制劑)。
征集了兩個中心(Cleveland Clinic Foundation，Cleveland，OH和Rochester General Hospital，Rochester，NY)的216名患者。收集人口統(tǒng)計學信息及其它患者特征，并獲取血清用于檢測α2-巨球蛋白、NAT結合能力(通過利用檢測未結合NAT的HPLC測定法滴定個體患者的血清樣品)及其它血清化學參數(shù)。主要目的在于確定α2-巨球蛋白血清濃度和能夠在體外被中和(NAT結合能力)的NAT含量(以每毫升血清中的毫克計)之間的關系。
本研究中患者特征與兩個最大的已發(fā)表的PAO血栓溶解研究(即STILE和TOPAS研究)中患者特征的比較顯示本研究中的患者群具有先前的PAO血栓溶解研究的代表性；有關先前研究的更多詳情，分別參見Annals of Surgery，220卷，251-266頁(1994)和Ouriel等，NewEngland Journal of Medicine，338卷，1105-1111頁(1998)。
利用NAT結合能力和每個患者血漿體積的估計值計算了每個患者估計的NAT最大劑量(EMD)。研究結果預測普通患者可接受1.7mg/kg(局部或系統(tǒng)遞送)的劑量，而不會超過α2-巨球蛋白結合和中和NAT的能力。來自該研究的結果總結于圖4。
在圖4中，計算了該研究中216名受試者每人估計的NAT最大劑量。研究結果描繪為上文的柱形圖，其中通過目測可觀察到鐘形分布。該研究中的普通患者據(jù)推測能夠耐受1.7mg/kg的NAT(鐘形分布的峰)。動物研究中施用的劑量用作參考(右手邊)，并且可看出對于99％的研究人口而言超過了估計的最大NAT劑量。
因而，本發(fā)明規(guī)定的0.025到1.7mg/kg范圍代表了投藥患者能夠安全接受(基于血漿體積和α2-巨球蛋白的NAT結合能力)而循環(huán)中不會出現(xiàn)游離NAT的合理估計。
總而言之，來自示例性的藥理學研究，即上文實施例1-4的結果顯示了纖溶性金屬蛋白酶在血栓癥動物模型中作為血凝塊溶解劑的生物學效力，其中血栓在大小和時期上與人類外周動脈阻塞中頻繁遇到的相當。在所述動物模型中確定的劑量是未考慮或評估動物中的潛在毒性而獲得的。如Ahmed等和Markland等(上文)描述的在兔子和狗中的有效劑量(分別為3.7和4.0mg/kg)可能使得纖溶性金屬蛋白酶的獸用成為可能。然而，當在人類數(shù)據(jù)存在下考慮時，施用3.7和4.0mg/kg的劑量將會對99％的研究人口過量投藥。因此，已公開的動物研究不能使得纖溶性金屬蛋白酶在人類中安全且生物學有效方式的治療應用成為可能。而在另一方面，實施例5中所提供的數(shù)據(jù)確實使得這種人類應用成為可能。
序列表<110>Toombs，Christopher F.
<120>利用纖溶性金屬蛋白酶處理留置導管阻塞的方法<130>A-627A<140>N/A<141>2002-06-20<150>09/466,276<151>1999-12-17<160>6<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>201<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述NAT(南方銅頭蛇纖溶酶的類似物)<400>1Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp His Arg1 5 10 15Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln Trp Val20 25 30His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn Ile35 40 45Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp Leu Ile50 55 60Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp65 70 75 80Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln Leu85 90 95
Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val100 105 110Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln Asp His115 120 125Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu Gly130 135 140His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly Ala145 150 155 160Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu165 170 175Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn180 185 190Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro195 200<210>2<211>603<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述編碼NAT(纖溶酶類似物)<400>2tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac 120gaaatctaca gaccactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180caagatttga tcaccgttac ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300gacttcgacg gtgatactgt tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat 360tctactggtg ttatccagga ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca 420cacgaactgg gtcataacct gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca 480aactcctgtg ttatggctgc tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc 540tctaagaaag actaccagac cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa 600ccg 603
<210>3<211>203<212>PRT<213>南方銅頭蛇<220>
<223>南方銅頭蛇固有纖溶酶<400>3Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp1 5 10 15His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln20 25 30Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Ash Glu Ile Tyr Arg Pro Leu35 40 45Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp50 55 60Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly65 70 75 80Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala85 90 95Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala100 105 110Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln115 120 125Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu130 135 140Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys145 150 155 160Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser165 170 175
Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr180 185 190Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro195 200<210>4<211>609<212>DNA<213>南方銅頭蛇<220>
<223>編碼南方銅頭蛇固有纖溶酶<400>4caacaaagat tcccacaaag atacgtacag ctggttatcg ttgctgacca ccgtatgaac 60actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120attaacgaaa tctacagacc actgaacatc caattcactt tggttggttt ggaaatctgg 180tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240aactggcgtg aaaccgacct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300gctatcgact tcgacggtga tactgttggt ctggcttacg ttggtggcat gtgtcaactg 360aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420atggcacacg aactgggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480ggtgcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc aaccatccaa actgttctcc 540gactgctcta agaaagacta ccagaccttc ctgaccgtta acaacccgca gtgtatcctg 600aacaaaccg 609<210>5<211>1392<212>DNA<213>南方銅頭蛇<220>
<223>南方銅頭蛇固有前纖溶酶<400>5atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360
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<223>人工序列描述前NAT(南方銅頭蛇前纖溶酶類似物)<400>6atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg ctgaccaccg tatgaacact 840aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc accaaatcgt caacaccatt 900
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1.溶解人用留置血管通路裝置之中、周圍或附著在其上的血凝塊的方法，包括通過所述血管通路裝置施用一定量的纖溶性金屬蛋白酶，其數(shù)量為每公斤人體重不超過1.7毫克纖溶性金屬蛋白酶。
2.蛋白水解性地降解人用留置血管通路裝置之中、周圍或附著在其上的血凝塊的方法，包括通過所述血管通路裝置施用一定量的與α2-巨球蛋白絡合的纖溶性金屬蛋白酶，其量足以促進血凝塊溶解、同時不超過明顯高于所述人體中α2-巨球蛋白可飽和水平的水平。
3.權利要求1或2的方法，包括0.1到80mg/ml纖溶性金屬蛋白酶。
4.權利要求1或2的方法，包括0.1到50mg/ml纖溶性金屬蛋白酶。
5.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置為導管。
6.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置為旁路。
7.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置為通路移植。
8.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置為針。
9.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置用于向人類動脈或靜脈之中引入液體組合物。
10.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置用于從人類動脈或靜脈中取血。
11.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置與血液透析操作結合使用。
12.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置與輸血操作結合使用。
13.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置與化療結合使用。
14.權利要求1或2的方法，其用于治療周圍動脈阻塞。
15.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置與取血結合使用。
16.權利要求1或2的方法，其中所述血凝塊位于留置血管通路裝置的內表面。
17.權利要求1或2的方法，其中所述血凝塊位于留置血管通路裝置的外表面。
18.權利要求1或2的方法，其中所述血凝塊附著在留置血管通路裝置上。
19.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置位于動脈之中。
20.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置位于靜脈之中。
21.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置包括“側孔”導管裝置。
22.權利要求1或2的方法，其中所述血管通路裝置包括“壓力感應出口”(PRO)導管遞送裝置。
23.權利要求1或2的方法，其中所述纖溶性金屬蛋白酶溶液通過團塊施用。
24.權利要求1或2的方法，其中所述纖溶性金屬蛋白酶包括新型作用溶栓劑(NAT)。
25.權利要求1或2的方法，其中所述纖溶性金屬蛋白酶包括纖溶酶。
26.恢復具有以纖維蛋白為基礎的阻塞的人用留置血管通路裝置開放性的方法，包括通過所述血管通路裝置施用一定量的與α2-巨球蛋白絡合的纖溶性金屬蛋白酶，其量足以促進血凝塊溶解、同時水平不超過明顯高于所述人體中α2-巨球蛋白可飽和水平，其中所述量為每公斤人體重不超過1.7毫克纖溶性金屬蛋白酶。
27.恢復具有以纖維蛋白為基礎的阻塞的人用留置血管通路裝置功能的方法，包括通過所述血管通路裝置施用一定量的與α2-巨球蛋白絡合的纖溶性金屬蛋白酶，其量足以促進血凝塊溶解、同時水平不超過明顯高于所述人體中α2-巨球蛋白可飽和水平，其中所述量為每公斤人體重不超過1.7毫克纖溶性金屬蛋白酶。
28.每公斤人類受試者體重不超過1.7毫克數(shù)量的、藥學上可接受的溶液中的纖溶性金屬蛋白酶在生產用于治療性處理留置血管通路裝置之中、周圍或附著在其上的血凝塊的藥劑中的用途。
29.含量足以促進留置血管通路裝置之中、周圍或附著在其上的血凝塊溶解、同時水平不超過明顯高于α2-巨球蛋白可飽和水平的、藥學上可接受的溶液中的與α2-巨球蛋白絡合的纖溶性金屬蛋白酶在生產用于蛋白水解性地降解所述留置血管通路裝置之中、周圍或附著在其上的血凝塊的藥劑中的用途。
30.權利要求28或29的用途，其中所述纖溶性金屬蛋白酶濃度為0.1到80mg/ml。
31.權利要求28或29的用途，其中所述纖溶性金屬蛋白酶濃度為0.1到50mg/ml。
32.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置為導管。
33.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置為旁路。
34.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置為通路移植。
35.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置為針。
36.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置用于向人類動脈或靜脈之中引入液體組合物。
37.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置用于從人類動脈或靜脈中取血。
38.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置與血液透析操作結合使用。
39.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置與輸血操作結合使用。
40.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置與化療結合使用。
41.權利要求28或29的用途，其用于治療周圍動脈阻塞。
42.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置與取血結合使用。
43.權利要求28或29的用途，其中所述血凝塊位于留置血管通路裝置的內表面。
44.權利要求28或29的用途，其中所述血凝塊位于留置血管通路裝置的外表面。
45.權利要求28或29的用途，其中所述血凝塊附著在留置血管通路裝置上。
46.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置位于動脈之中。
47.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置位于靜脈之中。
48.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置包括“側孔”導管裝置。
49.權利要求28或29的用途，其中所述血管通路裝置包括“壓力感應出口”(PRO)導管遞送裝置。
50.權利要求28或29的用途，其中制備所述藥劑用于團塊施用。
51.權利要求28或29的用途，其中所述纖溶性金屬蛋白酶包括新型作用溶栓劑(NAT)。
52.權利要求28或29的用途，其中所述纖溶性金屬蛋白酶包括纖溶酶。
53.每公斤人類受試者體重不超過1.7毫克纖溶性金屬蛋白酶數(shù)量的、其量足以促進血凝塊溶解、同時水平不超過明顯高于所述人類受試者中α2-巨球蛋白可飽和水平的、藥學上可接受的溶液中的與α2-巨球蛋白絡合的纖溶性金屬蛋白酶在生產用于恢復具有以纖維蛋白為基礎的阻塞的留置血管通路裝置開放性的藥劑中的用途。
54.每公斤人類受試者體重不超過1.7毫克纖溶性金屬蛋白酶數(shù)量的、其量足以促進血凝塊溶解、同時水平不超過明顯高于所述人類受試者中α2-巨球蛋白可飽和水平的、藥學上可接受的溶液中的與α2-巨球蛋白絡合的纖溶性金屬蛋白酶在生產用于恢復具有以纖維蛋白為基礎的阻塞的留置血管通路裝置功能的藥劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了以安全且有效溶解阻塞的含纖維蛋白的血凝塊的含量向人類受試者局部血管內施用纖溶性金屬蛋白酶、同時也避免循環(huán)血中α
文檔編號A61K38/43GK1674928SQ03819829
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月23日 優(yōu)先權日2002年6月21日
發(fā)明者C·F·圖布斯 申請人:安姆根有限公司