專利名稱：非金屬陽離子作橋聯(lián)劑的脂質(zhì)卷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明闡述了一種全新的脂質(zhì)混合物，用于將通透性差的治療物質(zhì)輸送穿過組織、生物膜。這種混合物為由負(fù)電荷的脂質(zhì)雙層與有機(jī)多價(jià)陽離子通過靜電作用卷曲而形成的柱狀多層卷結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
隨著基因重組技術(shù)的突飛猛進(jìn)，臨床治療中涌現(xiàn)出越來越多的生物治療物質(zhì)，與之相對的這類物質(zhì)的輸送技術(shù)的發(fā)展卻相對落后。生物治療物質(zhì)由于在體內(nèi)及制備過程中普遍存在穩(wěn)定性差、對動物組織的透過率低的問題，頻繁注射成為主要的給藥方式[1]，造成病人的順從性差。在過去的若干年時(shí)間里，更有效的藥物輸送載體的研究吸引了科學(xué)家大量的研究熱情和努力[2]。
在所有的給藥途徑中，口服給藥最簡單、最方便，尤其當(dāng)患者進(jìn)行長時(shí)間治療需要長久、頻繁用藥時(shí)，口服的優(yōu)點(diǎn)更加突出。針對改善組織滲透性差的藥物的口服吸收，文獻(xiàn)報(bào)道了諸多方法[3]，通常包括1)將藥物改構(gòu)成脂溶性前體藥物，2)將藥物與脂溶性片斷復(fù)合，3)將藥物進(jìn)行包封制成顆粒[3]。藥物微?；夹g(shù)可以避免使用化學(xué)手段不改變分子結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)保護(hù)生物治療物質(zhì)的活性，然而能夠經(jīng)胃腸道吸收的顆粒通常不足1％[3]。
脂質(zhì)體的磷脂雙層結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜類似，曾經(jīng)一度被認(rèn)為是藥物輸送的理想載體，自從其四十年前出現(xiàn)至今已經(jīng)吸引了大批科學(xué)家投入了巨大的研究努力[4]。然而由于物理、化學(xué)、生物學(xué)不穩(wěn)定性嚴(yán)重阻礙了脂質(zhì)體在臨床治療中的實(shí)際應(yīng)用。盡管研發(fā)部門堅(jiān)持不懈地努力，目前只有少數(shù)幾個(gè)脂質(zhì)體基礎(chǔ)的處方開發(fā)成商品[5]。為了克服穩(wěn)定性問題，其他的脂質(zhì)載體相繼被報(bào)道，包括隱形脂質(zhì)體[5]，聚合物脂質(zhì)體[6]、聚乙二醇包裹的脂質(zhì)體[7]、脂質(zhì)囊泡[8]、脂質(zhì)卷[9]。
脂質(zhì)卷是由負(fù)電荷磷脂雙層與多價(jià)陽離子橋聯(lián)劑借助靜電(Ca2+、Zn2+)作用將雙層結(jié)構(gòu)卷曲而形成的[9]。脂質(zhì)卷作為一種微粒載體具備獨(dú)特的性質(zhì)與脂質(zhì)體相比，不僅具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)而且這種固化了的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)大大改善了機(jī)械強(qiáng)度。機(jī)械強(qiáng)度差是脂質(zhì)體等類生物膜結(jié)構(gòu)的主要缺點(diǎn)之一。脂質(zhì)卷優(yōu)越的機(jī)械穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)了對包封藥物更好的保護(hù)作用；處于雙層之間的橋聯(lián)劑一旦被萃取出來，這種固體結(jié)構(gòu)被還原為脂質(zhì)體。上述獨(dú)特性質(zhì)保證了脂質(zhì)雙層卷可以成為理想的載體，用于將難溶成分擔(dān)載于脂質(zhì)中再繼續(xù)制成穩(wěn)定性好的脂質(zhì)卷，從而避免了脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性問題[10]。
最近，本發(fā)明人申請了另一專利技術(shù)--納米脂質(zhì)卷，詳細(xì)闡述了納米尺度的脂質(zhì)卷的結(jié)構(gòu)、制備、應(yīng)用[11]。例如兩性霉素B是一種脂溶性藥物，目前通過脂質(zhì)體或膠束靜注方式給藥，這種尺寸減小到納米范圍的脂質(zhì)卷有可能實(shí)現(xiàn)兩性霉素B口服給藥，兩性霉素B的研究進(jìn)展促使本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一種全新的脂質(zhì)卷，這種新載體可以將電荷數(shù)高的生物膜不可通透的治療物質(zhì)囊包于其中實(shí)現(xiàn)口服給藥。
脂溶性藥物分子先被囊包于磷脂雙層結(jié)構(gòu)中，然后加入陽離子橋聯(lián)劑形成脂質(zhì)卷結(jié)構(gòu)。藥物包封率取決于藥物能夠在不破壞雙層結(jié)構(gòu)的前提下在脂質(zhì)基質(zhì)中溶解多少，這種結(jié)構(gòu)限制了脂質(zhì)卷在脂溶性分子傳遞中的應(yīng)用。
曾經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道脂質(zhì)卷可以用于輸送DNA、蛋白疫苗[12，13]。這些研究人員認(rèn)為親水大分子可以被包封于脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中，然而上述論斷尚未找到確鑿的科學(xué)依據(jù)，僅僅在實(shí)驗(yàn)中觀察到加入陽離子橋聯(lián)劑之后上清液中的DNA、蛋白濃度減少了。由于多價(jià)陽離子(Ca2+、Zn2+)可以與蛋白、DNA通過靜電力作用熬合，在形成脂質(zhì)卷的同時(shí)大分子可能直接和Ca2+、Zn2+借助靜電力發(fā)生共沉淀而不是被包封于脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中。蛋白、DNA大分子由于其粒徑、親水特征等因素導(dǎo)致很難被囊包于脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中。
本發(fā)明描述了一種新技術(shù)，可以將親水性藥物擔(dān)載于脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中制成納米脂質(zhì)卷或脂質(zhì)卷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種新型脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷技術(shù)，可以將解離的、組織通透性差的分子包封于脂質(zhì)雙層之間制成脂質(zhì)卷使之透過組織-生物膜。脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷是金屬陽離子與磷酸脂的共沉淀物，通過Ca2+、Zn2+促使單室脂質(zhì)體融合形成大片脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，然后在Ca2+、Zn2+橋聯(lián)劑作用下卷曲形成柱狀的脂質(zhì)卷。這種新型脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷不同于以往傳統(tǒng)的脂質(zhì)卷，主要表現(xiàn)在1)單室脂質(zhì)體的融合不再借助Ca2+、Zn2+等金屬陽離子，而是采用囊包的分子充當(dāng)橋聯(lián)劑(參見圖1)；2)荷電的、組織難以通透的、親水性分子可以以較高的包封效率擔(dān)載于這種結(jié)構(gòu)中。既然這種新型脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷制備過程中無需使用金屬陽離子作橋聯(lián)劑，那么橋聯(lián)劑分子就可以保證被擔(dān)載于脂質(zhì)卷中，而不會發(fā)生傳統(tǒng)脂質(zhì)卷中金屬陽離子橋聯(lián)劑與DNA、蛋白分子共沉淀現(xiàn)象。
另一方面，新型脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷保留了傳統(tǒng)脂質(zhì)卷的理化性質(zhì)及在藥物輸送中的功能加入EDTA等熬合劑促使這種柱狀卷曲結(jié)構(gòu)打開轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)體，可以與細(xì)胞膜融合從而將囊包于其中的橋聯(lián)劑注射到細(xì)胞膜的另一端(參見圖2)。
本發(fā)明嘗試采用不同粒徑的有機(jī)陽離子(例如2，3，4，5-四氨基嘧啶、妥布霉素、多聚賴氨酸)作橋聯(lián)劑，都可以形成脂質(zhì)卷，試驗(yàn)結(jié)果說明有機(jī)陽離子可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的金屬陽離子形成脂質(zhì)卷，同時(shí)被囊包于這種結(jié)構(gòu)之中。
本發(fā)明提供一種簡單的制備納米脂質(zhì)卷的方法，多聚陽離子例如+5價(jià)多肽直接加入脂質(zhì)體混懸液中即可形成納米脂質(zhì)卷，不再需要采用復(fù)雜的水凝膠隔離技術(shù)。


圖1為磷脂雙層與Ca2+、有機(jī)陽離子絡(luò)合過程的機(jī)理示意圖。
圖2為藥物充當(dāng)橋聯(lián)劑的脂質(zhì)卷在細(xì)胞膜表面融合從而將藥物輸送至細(xì)胞膜另一端的過程機(jī)理示意圖。
圖3為2，3，5，6-四氨基嘧啶脂質(zhì)卷作橋聯(lián)劑顯微鏡圖像。AEDTA處理前；BEDTA處理后。
圖4為2，3，5，6-四氨基嘧啶納米脂質(zhì)卷作橋聯(lián)劑顯微鏡圖像。AEDTA處理前；BEDTA處理后。
圖5為妥布霉素脂質(zhì)卷作橋聯(lián)劑顯微鏡圖像。AEDTA處理前；BEDTA處理后。
圖6為妥布霉素納米脂質(zhì)卷作橋聯(lián)劑顯微鏡圖像。AEDTA處理前；BEDTA處理后。
圖7為妥布霉素納米脂質(zhì)卷粒徑分布圖。
圖8為多聚賴氨酸脂質(zhì)卷作橋聯(lián)劑顯微鏡圖像。AEDTA處理前；BEDTA處理后。
圖9為37℃孵育大腸桿抗菌，測試妥布霉素對照溶液、脂質(zhì)卷、納米脂質(zhì)卷抗菌活性圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種新型脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷體系，采用有機(jī)陽離子代替金屬陽離子充當(dāng)橋聯(lián)劑將脂質(zhì)雙層卷曲起來形成脂質(zhì)卷。新型脂質(zhì)卷體系被定義為通過多價(jià)有機(jī)陽離子與帶負(fù)電脂質(zhì)雙層之間的靜電作用形成的螺旋狀脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)(參見圖1)，外觀可能呈柱形，也可能非柱形。
與傳統(tǒng)脂質(zhì)卷不同新型脂質(zhì)卷可以將帶電荷的、親水性治療物質(zhì)例如多肽囊包于脂質(zhì)卷中；另一方面，新型脂質(zhì)卷保留了傳統(tǒng)脂質(zhì)卷的理化性質(zhì)和輸送功能，加入陽離子的載體(進(jìn)行萃取)，很容易被還原為脂質(zhì)體，能夠與細(xì)胞膜融合將橋聯(lián)劑注射至細(xì)胞膜的另一端，上述特點(diǎn)使之有潛力成為口服輸送多肽藥物的新載體。
本發(fā)明中介紹的新型脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷通過治療物質(zhì)作脂質(zhì)雙層間的橋聯(lián)劑將治療物質(zhì)囊包其中。
本發(fā)明中的治療物質(zhì)包括但不局限于以下類別物質(zhì)帶有兩個(gè)或更多正電荷的多肽或多聚氨基酸或核苷酸或親水化學(xué)藥。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上面描述的新型脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷體系可以應(yīng)用于帶兩個(gè)或更多正電荷的多肽藥物或多聚氨基酸或核苷酸或親水化學(xué)藥的口服輸送，上述體系也可以用于其它類藥物，熟悉常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作的技術(shù)人員可以獨(dú)立完成制備本發(fā)明中列舉的及其他藥物脂質(zhì)卷。
在另一個(gè)實(shí)施例中，治療物質(zhì)的輸送體系是通過吸入給藥的。
本發(fā)明還提供了一種采用直接絡(luò)合[9]、水凝膠隔離[11]、多價(jià)陽離子粒徑控制(參見圖5)制備新型脂質(zhì)卷的方法。有機(jī)陽離子可以直接加入到脂質(zhì)體混懸液中進(jìn)行攪拌或渦旋；也可以加入至水相--兩相高分子體系中，脂質(zhì)體選擇性地分配在分散相中形成彼此隔離的小液滴[11]。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以不通過操作繁雜的水凝膠隔離技術(shù)制備得到納米脂質(zhì)卷[11]。超過5個(gè)正電荷的有機(jī)陽離子，可以通過調(diào)節(jié)有機(jī)陽離子超過脂質(zhì)電荷數(shù)的比例來控制脂質(zhì)卷的粒徑增加有機(jī)陽離子超出脂質(zhì)電荷數(shù)的化學(xué)計(jì)量數(shù)值，可以直接將有機(jī)陽離子加入到脂質(zhì)體混懸液中得到脂質(zhì)卷(例5)。借助高電荷數(shù)和長鏈結(jié)構(gòu)，有機(jī)陽離子的部分正電荷與脂質(zhì)負(fù)電荷發(fā)生靜電作用形成脂質(zhì)卷，其余的電荷則分布在脂質(zhì)卷表面保證了彼此相互隔離，本發(fā)明提供了一種非常簡單的制備納米尺度脂質(zhì)卷的操作方法。
參照以下的實(shí)施例可以更好地理解我們的這個(gè)發(fā)明；但是對于這方面的專家來說，他們是完全能夠立即明白這些例子只是起了演示作用而并不是為了給在下面被下定義的本發(fā)明限定一個(gè)研究范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1制備2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽脂質(zhì)卷配制10.5mM多價(jià)有機(jī)陽離子2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽(TAS)水溶液，HCl調(diào)節(jié)pH至2。二油酰磷脂酰絲氨酸混懸于水中，在氮?dú)猸h(huán)境下超聲，開始階段呈乳狀隨后轉(zhuǎn)為淡藍(lán)色澄明液體，樣品于光學(xué)顯微鏡下鏡檢未觀察到脂質(zhì)體，說明顆粒小于1um，得到小單室脂質(zhì)體。然后將2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽水溶液在磁力攪拌下逐滴滴入到脂質(zhì)體混懸液中直至生成沉降物，在光學(xué)顯微鏡下觀察到沉降物呈針狀(參見圖3A)。其他有機(jī)陽離子例如抗生素、多肽也可作為橋聯(lián)劑制備得到脂質(zhì)卷。
為了考察新型脂質(zhì)卷的理化性質(zhì)，取沉降物滴加20mM pH8.5的EDTA于顯微鏡下觀察，如圖3B所示卷曲的多層針狀沉降物伸展打開轉(zhuǎn)變成大脂質(zhì)體。圖3A、圖3B結(jié)果表明與傳統(tǒng)脂質(zhì)卷中的Ca2+，Zn2+相同，有機(jī)多價(jià)陽離子可以與脂質(zhì)體借助靜電作用構(gòu)建脂質(zhì)卷。
實(shí)施例2制備2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽納米脂質(zhì)卷2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽納米脂質(zhì)卷可以按照本發(fā)明人從前申請的專利中的水凝膠隔離技術(shù)制得[11]。過程簡述如下實(shí)施例1中的脂質(zhì)體混懸液加入到5-25％葡聚糖溶液中，得到0.2-2％脂質(zhì)濃度的混懸液，再將其分散在5-25％聚乙二醇溶液中進(jìn)行攪拌，葡聚糖和聚乙二醇溶液不相混溶形成水相-兩相體系，攪拌下逐滴加入實(shí)施例1中的電荷數(shù)超過脂質(zhì)的2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽(TAS)水溶液，持續(xù)攪拌10-60分鐘，然后用大量的水清洗，此時(shí)葡聚糖和聚乙二醇的濃度足夠低至形成均相水溶液，離心回收于顯微鏡下觀察(圖4A)。由于顆粒粒徑范圍，無法在光學(xué)顯微鏡下觀察到針狀結(jié)構(gòu)。激光散射粒度儀測試結(jié)果表明脂質(zhì)卷粒徑小于1um。用EDTA處理后置于顯微鏡下觀察得到脂質(zhì)體，結(jié)果如圖4B所示。比較圖3B、圖4B水凝膠隔離法制得的納米脂質(zhì)卷或直接加入制得的脂質(zhì)卷經(jīng)EDTA處理后得到的脂質(zhì)體，前者的粒徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于后者。用EDTA處理的納米脂質(zhì)卷得到小粒徑脂質(zhì)體這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅僅在本發(fā)明人從前申請的Ca2+絡(luò)合的納米脂質(zhì)卷發(fā)明專利中有過報(bào)道[11]。Nicomp(＜1um)粒度分析儀測試結(jié)果顯示脂質(zhì)卷的平均粒徑在400nm左右。
實(shí)施例3制備妥布霉素脂質(zhì)卷和妥布霉素納米脂質(zhì)卷同實(shí)施例1和2中的操作步驟，用鹽酸妥布霉素代替2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽充當(dāng)橋聯(lián)劑制備脂質(zhì)卷。妥布霉素分子含5個(gè)氨基、分子量467，是一種水溶性鹽類抗菌素通常注射給藥。
100mg妥布霉素溶解于100ml水中配制工作液，分成5份分別調(diào)節(jié)pH至1.2，2.5，3.5和5，分別逐滴加入實(shí)施例1方法制得的脂質(zhì)體混懸液中，pH＝1.2，2.5的樣品中出現(xiàn)可見的沉降物，這一現(xiàn)象說明妥布霉素必須具備足夠多的氨基正離子才能制得脂質(zhì)卷。光學(xué)顯微鏡下觀察制得的脂質(zhì)卷和EDTA處理后的現(xiàn)象，結(jié)果分別如圖5A，圖5B所示沉降物呈針狀(圖5A)，EDTA處理后得到脂質(zhì)體(圖5B)。
同實(shí)施例2中的操作步驟，用pH＝2.5的鹽酸妥布霉素水溶液代替2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽溶液充當(dāng)橋聯(lián)劑制備納米脂質(zhì)卷，光學(xué)顯微鏡下觀察見圖6A。類似地，EDTA處理納米脂質(zhì)卷打開轉(zhuǎn)化為小粒徑脂質(zhì)體(圖6B)。Nicomp(＜1um)粒度分析儀測試結(jié)果顯示脂質(zhì)卷的平均粒徑在300nm左右(圖7)。
實(shí)施例4制備多聚賴氨酸脂質(zhì)卷同實(shí)施例1中的操作步驟，用多肽溶液充當(dāng)橋聯(lián)劑制備脂質(zhì)卷。多聚賴氨酸(MW＝1000～2000，pH＝4)溶液逐滴加入至按照實(shí)施例1方法制得的脂質(zhì)體混懸液中，生成沉降物。二油酰磷脂酰絲氨酸與多聚賴氨酸的最終比例為1∶1.2。顯微鏡下觀察可見沉降物呈針狀(圖8A)。用EDTA處理結(jié)果同Ca2+、Zn2+、2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽、妥布霉素針狀沉降物很容易打開轉(zhuǎn)化為大脂質(zhì)體(圖8B)。
實(shí)施例5制備多聚賴氨酸納米脂質(zhì)卷如果多肽充當(dāng)橋聯(lián)劑，可以避免使用操作繁瑣的水凝膠隔離技術(shù)[11]制備納米脂質(zhì)卷。實(shí)驗(yàn)步驟如下同實(shí)施例1中的方法制得的脂質(zhì)體，按照最終脂質(zhì)或多聚賴氨酸比例為1∶4，同實(shí)施例4操作攪拌條件下脂質(zhì)體加入其中，兩個(gè)澄明溶液消失出現(xiàn)液體呈云霧狀，光學(xué)顯微鏡下觀察無可見的顆粒生成。Nicomp(＜1um)粒度分析儀測試結(jié)果顯示脂質(zhì)卷的平均粒徑在60～100nm，比以上實(shí)施例中的粒徑小，出現(xiàn)這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是緣于多聚賴氨酸與脂質(zhì)體的比例增加，機(jī)理類似于DNA與高價(jià)陽離子絡(luò)合。
實(shí)施例6脂質(zhì)卷對橋聯(lián)劑分子的包封率測試了2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽、妥布霉素的新型脂質(zhì)卷和納米脂質(zhì)卷包封率。
2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽新型脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷首先溶于氯仿，之后加入pH＝2水相，強(qiáng)烈振搖分層取出水層，重復(fù)上述操作2-3次，合并水層于λ＝380nm測定紫外吸收值。
妥布霉素由于無紫外-可見吸收，參照美國藥典方法與一染料進(jìn)行衍生化。通過測試脂質(zhì)卷形成后混懸液中上清液中濃度減少量來計(jì)算包封率。
流動相配制如下2.0g三羥甲基氨基甲烷溶解于800ml水中，加入1N硫酸20ml，加入乙腈稀釋至2000ml。
分析實(shí)驗(yàn)要求10mg/ml的2，4-二硝基苯熒光染料乙醇溶液需要5天內(nèi)配制冰箱存放；濃度15mg/ml的三羥甲基氨基甲烷貯備液需要在分析測試4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行如下稀釋取出40ml用DMSO稀釋至200ml。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將550mg妥布霉素、1N硫酸2ml溶解于水中配制成100ml溶液。分析之前溶液被稀釋5倍至妥布霉素濃度0.22mg/ml。
調(diào)整脂質(zhì)/妥布霉素比例為1/5，取濃度為5.5mg/ml的妥布霉素溶液1ml加入到脂質(zhì)體混懸液中，待生成沉降物后收集上清液用水稀釋至50ml待測。
量取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的上清液2ml，加入5ml預(yù)先配制好的2，4二硝基苯熒光染料乙醇溶液、5ml三羥甲基氨基甲烷溶液，于60℃反應(yīng)50分鐘，冷卻后乙腈稀釋待測樣品至25ml。
進(jìn)行HPLC測試之前，標(biāo)準(zhǔn)品/樣品都按照4/1的比例用α-萘酚苯基甲醇的乙腈溶液進(jìn)行稀釋。HPLC測試采用C-18色譜柱于λ＝266nm測試吸收值。
2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽和妥布霉素的包封率測試結(jié)果見表1。
表1.2，3，5，6-四氨基嘧啶硫酸鹽和妥布霉素脂質(zhì)卷的包封率

實(shí)施例7妥布霉素脂質(zhì)卷和納米脂質(zhì)卷抗菌活性測試選擇妥布霉素作為模型藥物考察脂質(zhì)卷和納米脂質(zhì)卷輸送藥物進(jìn)入細(xì)胞膜能力以及抗菌活性。妥布霉素的活性位點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)核糖體上，妥布霉素的抗菌活性即反應(yīng)了進(jìn)入細(xì)胞的能力。為了考察本發(fā)明中新型脂質(zhì)卷和納米脂質(zhì)卷的抗菌活性，按照實(shí)施例2中實(shí)驗(yàn)操作制備妥布霉素脂質(zhì)卷和納米脂質(zhì)卷；以妥布霉素溶液劑作空白對照，不同劑量與大腸桿菌一起孵育。
一滴大腸桿菌細(xì)胞株DH5a加至2mlLB肉湯溶液于37℃下孵育24小時(shí)制備1/10DH5a培養(yǎng)液。量取5ulDH5a培養(yǎng)液稀釋至2ml，加入終濃度分別為0，0.5，1.0，2.5和5.0ug/ml妥布霉素脂質(zhì)卷和納米脂質(zhì)卷。與妥布霉素共同孵育的細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃、200rpm搖床培養(yǎng)24小時(shí)；細(xì)胞培養(yǎng)液分別以1/100，1/1000，1/10000比例稀釋，取50ul置于瓊脂培養(yǎng)皿于37℃下孵育24小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9。
低劑量0.5ug/ml條件下，妥布霉素溶液顯示出最強(qiáng)的抗菌活性，高于大脂質(zhì)卷75倍，輕微超過納米脂質(zhì)卷；參照美國藥典的給藥量，當(dāng)劑量增加超過1ug/ml時(shí)，納米脂質(zhì)卷的抗菌活性最強(qiáng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)值分別低于對照溶液/大脂質(zhì)卷10/100倍；當(dāng)劑量為5ug/ml時(shí)，三種處方的細(xì)胞計(jì)數(shù)值都降低至0。上述試驗(yàn)結(jié)果說明納米脂質(zhì)卷大大提高了妥布霉素的抗菌能力?；诎饴屎推骄降目紤]每個(gè)納米脂質(zhì)卷中大約囊包2,000,000個(gè)分子，因此相同劑量下，納米脂質(zhì)卷顆粒攻擊大腸桿菌的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于妥布霉素溶液。然而事實(shí)上如圖9所示更多的納米脂質(zhì)卷擔(dān)載的藥物分子進(jìn)入大腸桿菌攻擊核糖體，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了我們的假設(shè)即脂質(zhì)卷促使親水性藥物穿過細(xì)胞膜，有可能是由于納米脂質(zhì)卷兩端的脂質(zhì)雙層邊界上的張力提供了與細(xì)胞融合從而消除張力的驅(qū)動力(圖2)。
在0.5ug/ml低劑量時(shí)，由于脂質(zhì)卷的數(shù)量過少不足以讓藥物分子與細(xì)胞發(fā)生足夠的作用，同理解釋大脂質(zhì)卷相對低的抗菌活性(圖9)，因此對照溶液表現(xiàn)出輕微超過的抗菌能力。
納米脂質(zhì)卷能夠促使帶電荷、不可通透的分子穿過細(xì)胞膜，這種特征在藥物輸送中有廣泛的應(yīng)用前景。許多治療物質(zhì)例如多肽屬于水溶性、生物膜不可通透，而治療的活性位點(diǎn)通常作用在細(xì)胞內(nèi)部而不是細(xì)胞表面受體，這種載體有潛力實(shí)現(xiàn)正電荷多肽的口服輸送。例如兩性霉素B是一種脂溶性抗真菌藥物，通常以注射方式給藥，本發(fā)明人將從前的納米脂質(zhì)卷技術(shù)用于研制兩性霉素B口服劑型，體內(nèi)生物利用度和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出顯著性優(yōu)勢。這種新型脂質(zhì)卷雖然不同于以往采用金屬陽離子橋聯(lián)劑制備的脂質(zhì)卷，但是卻同樣具備傳統(tǒng)脂質(zhì)卷的理化性質(zhì)，可以與細(xì)胞膜發(fā)生融合輸送藥物(圖7)，因此這種新型脂質(zhì)卷有潛力實(shí)現(xiàn)通透性差的治療物質(zhì)的口服給藥。
參考文獻(xiàn)1.P.Vermeij，D.Blok，“New peptide and protein drugs”， Pharm. World Sci.，1996；18，87-93.
2.R.Langer，“Drug delivery and targeting”；Nature，1998，392 (Suppl.)，5-10.
3.H.Chen，R.Langer，“Oral particulate deliverystatus and future trends”；Adv.DrugDelivery Rev.，1998，14，339-350.
4.G.Gregoriadis，in Liposome Technology，CRC Press，Boca Raton，Vol，I，1993，Preface discussion.
5.G.Gregoriadis，in Liposome Technology，CRC Press，Boca Raton，Vol，I，1993，Preface discussion.
6.H.Chen，V.Torchilin，and R.Carpenter，“Lectin-bearing Polymerized Liposomes asPotential Oral Vaccine Carriers，”Pharm.Res.，1996，13(9)，pp.1378-1383.
7.T.Jin，P.Pennefather，P.I.Lee，“Lipobeadsa Hydrogel Anchored Lipid VesicleSystem”；FEBS Letters，1996，Vol.397，70-74.
8.D.Papahadjopoulos，“Calcium-induced phase changes and fusion in natural andmodel membranes，”Cell.Surg.Rev.，1978，5，pp.765-790.
9.D.Papahadjopoulos，W.J.Vail，K.Jacobson，and G.Poste，“Cochleate lipidcylindersformation by fusion of unilamellar lipid vesicles，”Biochim.Biophys.Acta，1975，394，pp.483-491.
10.L.Zarif，J.Graybill，D.Perlin，R.J.Mannino；“Cochleatesnew lipid based drugdelivery system”；Journal of Liposome Research，2000，Vol.10，523-538.
11.T.Jin，L.Zarif，and R.J.Mannino，“Nanocochleate formulations，process ofpreparation and method of delivery of pharmaceutical agents”；US Patent #6，153，217，2000.
12.S.Gould-Forgerite，J.E.Mazurkiewicz，K.Raska Jr.，K.Voelkerding，J.M.Lehman，and R.J.Mannino，“Chimerasome-mediated gene transfer in vitro and invivo，”Gene，1989，84，429-438.
13.S.Gould-Forgerite，M.Kheri，F(xiàn).Zhang，Z.Wang，A.J.Scolpino，E.Feketeova，M.Canki，R.J.Mannino；“Targeting immune response induction with cochleate andliposome-based vaccines”；Adv.Drug Delivery Review，1998，32，273-287.
14.A.V.Kabanov，V.A.Kabanov，“DNA complexes with polycations for the deliveryof genetic materials into cells”，Bioconj.Chem.，1995，6，7-20.
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)卷體系，其特征在于，所述的脂質(zhì)卷采用有機(jī)多價(jià)陽離子作橋聯(lián)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系，其特征在于，所述的脂質(zhì)卷是納米脂質(zhì)卷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系，其特征在于，所述的脂質(zhì)卷根據(jù)有機(jī)陽離子的大小，包括外觀可以呈柱狀也可以不呈柱狀的脂質(zhì)卷。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系的方法，其特征在于，所述的方法包括直接絡(luò)合法和水凝膠隔離法。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系的方法，其特征在于，所述的方法包括通過控制陽離子橋聯(lián)劑與脂質(zhì)的比例來控制脂質(zhì)卷粒度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的脂質(zhì)卷粒度分布在40-1000nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系，該脂質(zhì)卷用于微囊包封和輸送治療物質(zhì)，其特征在于，所述的治療物質(zhì)是作橋聯(lián)劑而被載于脂質(zhì)的脂質(zhì)雙層之間的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脂質(zhì)卷體系，其特征在于，所述的治療物質(zhì)包括多肽、聚氨基酸、核苷酸、以及制備條件下帶有超過兩個(gè)凈電荷親水化學(xué)藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系，其特征在于，所述的脂質(zhì)卷用于組織不可滲透的或親水性的治療試劑的輸送。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系，其特征在于，所述的脂質(zhì)卷用于多肽藥物口服輸送。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系，其特征在于，所述的脂質(zhì)卷用于治療物質(zhì)的吸入給藥。
12.一種包括權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系的混合物。
13.一種包括權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系的藥用混合物及一種藥用載體。
14.一種治療用到權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)卷體系的疾病治療方法。
15.一種調(diào)節(jié)脂質(zhì)卷的脂質(zhì)雙層間距的方法，包括使用經(jīng)設(shè)計(jì)的分子大小適宜的有機(jī)橋聯(lián)劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述的脂質(zhì)雙層間距為幾個(gè)埃到幾個(gè)納米之間。
全文摘要
本發(fā)明提供脂質(zhì)卷和納米脂質(zhì)卷體系，所述的脂質(zhì)卷采用有機(jī)多價(jià)陽離子作橋聯(lián)劑。本發(fā)明還提供一種制備所述的脂質(zhì)卷體系的方法，該方法包括直接絡(luò)合法和水凝膠隔離法。該制備方法包括通過控制橋聯(lián)劑與脂質(zhì)的比例來控制脂質(zhì)卷粒度。該脂質(zhì)卷或納米脂質(zhì)卷體系可被用于微囊包封和輸送治療物質(zhì)，其中，所述的治療物質(zhì)是作橋聯(lián)劑而被載于脂質(zhì)的脂質(zhì)雙層之間的。最后，本發(fā)明提供了該新型脂質(zhì)卷和納米脂質(zhì)卷體系的其他用途。
文檔編號A61K9/00GK1674869SQ03818569
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月6日
發(fā)明者金拓 申請人:金拓