專利名稱：用于免疫治療的腺病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了包含病毒載體的組合物、方法和試劑盒，所述病毒載體可用于免疫治療。具體地講，本發(fā)明涉及具有B亞族腺病毒衣殼鞭毛的病毒載體，所述病毒載體被構(gòu)建成在具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的抗原提呈細(xì)胞(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞)內(nèi)表達(dá)轉(zhuǎn)基因序列。優(yōu)選的是，所述轉(zhuǎn)基因序列為retrogen表達(dá)框，以及所述腺病毒衣殼鞭毛為Ad11鞭毛。
背景技術(shù)：
據(jù)美國(guó)疾病控制中心報(bào)道全世界有近3.5億人感染了人類乙型肝炎病毒(HBV)。75％的感染者生活在亞洲和西太平洋地區(qū)。如不進(jìn)行有效地治療，平均5～10％的HBV感染者會(huì)發(fā)展為慢性肝病。在亞洲，慢性HBV的感染率為20～30％。在中國(guó)的部分地區(qū)，80％的惡性肝細(xì)胞癌(HCC)是由于慢性HBV感染導(dǎo)致的。在美國(guó)，大約有100萬(wàn)人是慢性HBV的感染者。這種情況的結(jié)果是約15,000人死于肝癌，約20,000人死于肝硬化。人們確定了慢性HBV感染是導(dǎo)致HCC的原因(Beasley and Hwang，Semin.Liver Dis.，411321，1984，以引用方式并入本文)。HBV是非嗜細(xì)胞病毒，肝損傷主要是由針對(duì)感染了病毒的肝細(xì)胞所產(chǎn)生的機(jī)體免疫反應(yīng)和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生引起的。強(qiáng)烈的、多克隆的和多特異性的細(xì)胞毒素及輔助T細(xì)胞對(duì)HBV的反應(yīng)在急性自身限制性乙肝患者的外周血液中容易被檢測(cè)到，但在慢性感染者或HCC患者中較弱、有抗原性限制或無(wú)法檢測(cè)到(參見(jiàn)Kagawa et al.，CancerRes.，613330-8，2001，以引用方式并入本文)。
因?yàn)樵诼訦BV感染者和HBV相關(guān)的HCC患者中，CTL、Th活性及抵抗HCV的血清免疫性較弱或是缺少，加強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)HBV核心抗原反應(yīng)的治療具有終止慢性HBV感染及攻擊HCC的潛能(參見(jiàn)Ferrariet al.，J.Immunol.，1453442-9，1990；和Jung et al.，J.Virol.，693358-68，1995，上述兩份文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。研究HBV感染的轉(zhuǎn)基因小鼠、美洲旱獺或黑猩猩模型的幾個(gè)證據(jù)暗示了HBV免疫療法可有效治療慢性乙型肝炎(參見(jiàn)Mancini et al.，J.Immunol.，1615564-70，1998；以及Pancholi et al.，Hepatology，33448-54，2001，上述兩份文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。在此基礎(chǔ)上，最近有兩個(gè)多中心的隨機(jī)設(shè)對(duì)照的研究已證明HBV核心抗原的免疫療法在降低HBV的復(fù)制和病毒血癥治療中的有效性(參見(jiàn)Pol et al.，J.Hepatol34917-21，2001和Lau，J.Gastoenterol.Hepatol.15 SupplE46-52，2000，上述兩份文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。根據(jù)上述內(nèi)容，我們所需要的是改進(jìn)用于清除慢性HBV感染及消滅HCC的免疫療法的組合物和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了含病毒載體的組合物、方法和試劑盒，所述病毒載體可用于免疫治療。具體地講，本發(fā)明提供了具有B亞族腺病毒衣殼鞭毛的病毒載體，所述病毒載體被構(gòu)建成在具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的抗原提呈細(xì)胞(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞)內(nèi)表達(dá)轉(zhuǎn)基因序列。優(yōu)選的是，所述轉(zhuǎn)基因序列為retrogen表達(dá)框，以及所述腺病毒衣殼鞭毛為Ad11鞭毛。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含腺病毒載體的組合物，其中所述腺病毒載體包含a)一種腺病毒衣殼，其中所述腺病毒衣殼包含選自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的B亞族腺病毒衣殼鞭毛；以及b)核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼retrogen蛋白質(zhì)的retrogen表達(dá)框序列，其中所述retrogen蛋白質(zhì)包含i)抗原蛋白質(zhì)，ii)連接于所述抗原蛋白質(zhì)N末端的前導(dǎo)序列(分泌序列)，以及iii)連接于所述抗原蛋白質(zhì)C末端的細(xì)胞結(jié)合域。
在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含Ad ITR左側(cè)序列和AdITR右側(cè)序列。在具體的實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含一種對(duì)腺病毒衣殼鞭毛編碼的序列(例如，對(duì)選自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的腺病毒鞭毛的編碼)。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含腺病毒包裝序列。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子缺少至少一個(gè)選自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1和/或E3)。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸分子缺少至少五個(gè)選自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1、E3、E2A、E2B、以及E4)。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子缺少下列所有的或幾乎所有的腺病毒基因L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3(如，“空殼病毒”)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒鞭毛為Ad11鞭毛(如實(shí)施例中所示，即使與Ad35鞭毛相比，Ad11鞭毛提供了被顯著改善了的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率)。在另外的實(shí)施方案中，所述腺病毒衣殼還包含Ad5無(wú)鞭毛衣殼成分(即，除去鞭毛的衣殼是Ad5)。在一些實(shí)施方案中，腺病毒衣殼還包含Ad11或Ad35無(wú)鞭毛衣殼成分。在具體的實(shí)施方案中，所述核酸分子在腺病毒衣殼內(nèi)(參見(jiàn)圖1)。
在另外的實(shí)施方案中，所述抗原蛋白質(zhì)為與腫瘤相關(guān)的抗原。在某些實(shí)施方案中，與腫瘤相關(guān)的抗原選自MAGE、GAGE、DAGE、前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗原、酪氨酸酶、Gp100、α-胎蛋白、獨(dú)特型Ig、TCR、Bcr-abl融合產(chǎn)物、P53變種、NY-ESO-1、Her-2/neu、以及Muc-1。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原蛋白質(zhì)為HBeAg或HBcAg(例如，腺病毒用于轉(zhuǎn)導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞，并把該樹(shù)突狀細(xì)胞給藥至HBV感染患者或HCC患者)。
在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞結(jié)合域包含F(xiàn)c區(qū)(例如，IgG1 Fc區(qū))。在其他實(shí)施方案中，所述組合物還包含抗原提呈細(xì)胞(APC)，如樹(shù)突狀細(xì)胞(例如，未成熟的或成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞)。在某些實(shí)施方案中，所述組合物還包含抗原提呈細(xì)胞(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞)，且腺病毒載體在APC(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞)內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含由本發(fā)明病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞的組合物。這種組合物可給藥至需要免疫治療的患者。在一些實(shí)施方案中，樹(shù)突狀細(xì)胞最初來(lái)源于接受被轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞的患者(例如，PBMC收集于患者，并進(jìn)行培養(yǎng)，以便產(chǎn)生未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞并由本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo))。這種被轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞可以冷凍干燥或者以其他方式儲(chǔ)存至患者需要治療時(shí)。在具體的實(shí)施方案中，被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞保存在標(biāo)有患者識(shí)別信息的小瓶?jī)?nèi)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法，該方法包括以下步驟a)提供i)樹(shù)突狀細(xì)胞，和ii)一種含腺病毒載體的組合物，其中所述腺病毒載體包含A)一種腺病毒衣殼，其中所述腺病毒衣殼包含選自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的B亞族腺病毒衣殼鞭毛；以及B)核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼retrogen蛋白質(zhì)的retrogen表達(dá)框序列，其中所述retrogen蛋白質(zhì)包含I)抗原蛋白質(zhì)，II)連接于所述抗原蛋白質(zhì)N末端的前導(dǎo)序列，以及III)連接于所述抗原蛋白質(zhì)C末端的細(xì)胞結(jié)合域；以及b)將所述組合物與所述樹(shù)突狀細(xì)胞在感染復(fù)數(shù)至少為5(如，每個(gè)細(xì)胞中5個(gè)噬斑形成單位(pfu))的一定條件下進(jìn)行接觸，使得至少30％的所述樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)所述retrogen蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生表達(dá)retrogen的樹(shù)突狀細(xì)胞，其中所述抗原蛋白質(zhì)由所述表達(dá)retrogen的樹(shù)突狀細(xì)胞作為MHC-I類抗原和MHC-II類抗原得以提呈。
在某些實(shí)施方案中，在感染復(fù)數(shù)為5～10的條件下進(jìn)行接觸時(shí)，至少35％或55％的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)retrogen蛋白質(zhì)。在具體的實(shí)施方案中，在感染復(fù)數(shù)為10～100的條件下進(jìn)行接觸時(shí)，至少70％的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)retrogen蛋白質(zhì)(參見(jiàn)圖2)。在其他實(shí)施方案中，在感染復(fù)數(shù)為100～500的條件下進(jìn)行接觸時(shí)，至少90％的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)retrogen蛋白質(zhì)(參見(jiàn)圖2中Ad11)。
在一些實(shí)施方案中，接觸發(fā)生在體外。在具體的實(shí)施方案中，所述方法還包括以下步驟在進(jìn)行步驟b)之前從個(gè)體(例如，人體)中收集細(xì)胞如單核細(xì)胞，并培養(yǎng)這些細(xì)胞(例如，加入GM-CSF或IL-4)以產(chǎn)生未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，樹(shù)突狀細(xì)胞可直接收集于個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，PBMC通過(guò)白血球電泳或其他合適的方法收集于個(gè)體。被搜集的細(xì)胞再經(jīng)PBMC淘析獲得純單核細(xì)胞成分。然后，這些被收集的細(xì)胞可以經(jīng)培養(yǎng)得到未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。
在其他實(shí)施方案中，接觸發(fā)生在體內(nèi)。在具體的實(shí)施方案中，將本發(fā)明含病毒載體的組合物給藥至個(gè)體，使個(gè)體的樹(shù)突狀細(xì)胞至少有部分被轉(zhuǎn)導(dǎo)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將本發(fā)明的病毒載體在一定條件下給藥至患者(或者將含本發(fā)明病毒載體的樹(shù)突狀細(xì)胞給藥至患者)，使得患者的癥狀減輕或消除。優(yōu)選的是，個(gè)體內(nèi)的被轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞會(huì)激發(fā)針對(duì)本發(fā)明病毒載體表達(dá)的抗原的Th(例如，CD4+Th)、以及CTL(例如，CD8+CTL)特異性反應(yīng)。在一些實(shí)施方案，接觸包括將所述組合物給藥至個(gè)體。
在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含Ad ITR左側(cè)序列和AdITR右側(cè)序列。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含一種編碼腺病毒衣殼鞭毛的序列。在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含腺病毒包裝序列。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸分子缺少至少一個(gè)選自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1和/或E3)。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子缺少至少五個(gè)選自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1、E3、E2A、E2B、以及E4)。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子缺少下列所有或幾乎所有的腺病毒基因L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3(如，“空殼病毒”)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒鞭毛為Ad11鞭毛。在某些實(shí)施方案中，腺病毒衣殼還包含Ad5無(wú)鞭毛衣殼的成分。在一些實(shí)施方案中，腺病毒衣殼還包含Ad11或Ad35無(wú)鞭毛衣殼成分。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子在腺病毒衣殼內(nèi)(參見(jiàn)圖1)。
在某些實(shí)施方案中，抗原蛋白質(zhì)為與腫瘤相關(guān)的抗原。在其他實(shí)施方案中，與腫瘤相關(guān)的抗原選自MAGE、GAGE、DAGE、前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗原、酪氨酸酶、Gp100、α-胎蛋白、獨(dú)特型Ig、TCR、Bcr-abl融合產(chǎn)物、P53變種、NY-ESO-1、Her-2/neu、以及Muc-1。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原蛋白質(zhì)為HBeAg或HBcAg。
在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞結(jié)合域包含F(xiàn)c區(qū)(例如，IgG1 Fc區(qū))。在其他實(shí)施方案中，所述組合物還包含抗原提呈細(xì)胞(APC)，如樹(shù)突狀細(xì)胞(例如，未成熟的或成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞)。在某些實(shí)施方案中，所述組合物還包含抗原提呈細(xì)胞(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞)，且所述腺病毒載體在APC(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞)內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括步驟c)將表達(dá)retrogen的樹(shù)突狀細(xì)胞給藥至患者。在具體的實(shí)施方案中，患者患有疾病(例如，傳染病、癌癥、自身免疫性疾病等)。在某些實(shí)施方案中，患者是HBV感染繼發(fā)肝細(xì)胞癌的患者或HBV感染者。在具體的實(shí)施方案中，接觸導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞從未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法，該方法包括a)提供i)樹(shù)突狀細(xì)胞，以及ii)一種含腺病毒載體的組合物，其中所述腺病毒載體包含A)一種腺病毒衣殼，其中所述腺病毒衣殼包含Ad11衣殼鞭毛；以及B)核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因序列；以及b)將所述組合物與所述樹(shù)突狀細(xì)胞在感染復(fù)數(shù)至少為5的一定條件下進(jìn)行接觸，使得至少55％的所述樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)所述目標(biāo)蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的樹(shù)突狀細(xì)胞。
在某些實(shí)施方案中，接觸導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞從未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)。在其他實(shí)施方案中，在感染復(fù)數(shù)為10～100的條件下進(jìn)行接觸時(shí)，至少70％的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)(參見(jiàn)圖2)。在一些實(shí)施方案中，在感染復(fù)數(shù)為100～500的條件下進(jìn)行接觸時(shí)，至少90％的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)(參見(jiàn)圖2)。
在具體的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因序列為編碼retrogen蛋白質(zhì)的retrogen表達(dá)框序列，其中所述retrogen蛋白質(zhì)包含i)抗原蛋白質(zhì)，ii)連接于所述抗原蛋白質(zhì)N末端的前導(dǎo)序列，以及iii)連接于所述抗原蛋白質(zhì)C末端的細(xì)胞結(jié)合域。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞結(jié)合域包含F(xiàn)c區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗原蛋白質(zhì)由表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的樹(shù)突狀細(xì)胞作為MHC-I類抗原和MHC-II類抗原來(lái)提呈。
在一些實(shí)施方案中，接觸發(fā)生在體外。在其他實(shí)施方案中，所述方法還包括以下步驟在進(jìn)行步驟b)之前從個(gè)體(比如，人體)中收集細(xì)胞如單核細(xì)胞，并培養(yǎng)這些細(xì)胞(例如，加入GM-CSF或IL-4)以產(chǎn)生未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，樹(shù)突狀細(xì)胞可直接收集于個(gè)體。在其他實(shí)施方案中，PBMC通過(guò)白血球電泳或其他合適的方法從個(gè)體搜集。被搜集的細(xì)胞再經(jīng)PBMC淘析獲得純單核細(xì)胞成分。然后，這些被收集的細(xì)胞可以經(jīng)培養(yǎng)得到未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。
在其他實(shí)施方案中，接觸發(fā)生在體內(nèi)。在具體的實(shí)施方案中，將本發(fā)明含病毒載體的組合物給藥至個(gè)體，使個(gè)體的樹(shù)突狀細(xì)胞至少有部分被轉(zhuǎn)導(dǎo)。優(yōu)選的是，個(gè)體內(nèi)的被轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞會(huì)激發(fā)針對(duì)本發(fā)明病毒載體表達(dá)的抗原產(chǎn)生的Th(例如，CD4+Th)、以及CTL(例如，CD8+CTL)特異性反應(yīng)。在一些實(shí)施方案，接觸包括將所述組合物給藥至個(gè)體。
在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含Ad ITR左側(cè)序列和AdITR右側(cè)序列。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子還包含一種編碼腺病毒衣殼鞭毛的序列。在某些實(shí)施方案中，所述核酸序列還包含腺病毒包裝序列。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸分子缺少至少一個(gè)選自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1和/或E3)。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子缺少至少五個(gè)選自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1、E3、E2A、E2B、以及E4)。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子缺少下列所有或幾乎所有的腺病毒基因L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3(如，“空殼病毒”)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒鞭毛為Ad11鞭毛。在某些實(shí)施方案中，腺病毒衣殼還包含Ad5無(wú)鞭毛衣殼成分。在一些實(shí)施方案中，腺病毒衣殼還包含Ad11或Ad35無(wú)鞭毛衣殼成分。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子在腺病毒衣殼內(nèi)。
在某些實(shí)施方案中，抗原蛋白質(zhì)為與腫瘤相關(guān)的抗原。在其他實(shí)施方案中，與腫瘤相關(guān)的抗原選自MAGE、GAGE、DAGE、前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗原、酪氨酸酶、Gp100、α-胎蛋白、獨(dú)特型Ig、TCR、Bcr-abl融合產(chǎn)物、P53變種、NY-ESO-1、Her-2/neu、以及Muc-1。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原蛋白質(zhì)為HBeAg或HBcAg。
在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括步驟c)將表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的樹(shù)突狀細(xì)胞給藥至個(gè)體。在具體的實(shí)施方案中，個(gè)體是HBV感染繼發(fā)肝細(xì)胞癌的個(gè)體或HBV感染者。
在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了含編碼本發(fā)明病毒載體或編碼部分本發(fā)明病毒載體的核酸序列的組合物。在一些實(shí)施方案中，病毒載體至少由2個(gè)核酸序列所編碼(例如，輔助病毒依賴性腺病毒序列和輔助病毒腺病毒序列或者是能夠允許含有轉(zhuǎn)基因序列(如retrogen表達(dá)框)的輔助病毒依賴性腺病毒序列表達(dá)的輔助病毒腺病毒)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，該試劑盒包含a)本發(fā)明的病毒載體或包含本發(fā)明病毒載體的被轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞；以及b)使用所述病毒載體或被轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)個(gè)體的疾病進(jìn)行治療的說(shuō)明書(shū)，或者應(yīng)用所述病毒載體或被轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行科學(xué)研究的說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用編碼本發(fā)明病毒載體的核酸序列穩(wěn)定地或瞬時(shí)地轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞系。


圖1圖示了本發(fā)明的一種實(shí)施方案，其中病毒載體具有Ad11衣殼鞭毛并被用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，導(dǎo)致成熟樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生。
圖2圖示了在實(shí)施例1中描述的Ad5、Ad5/11和Ad5/35轉(zhuǎn)導(dǎo)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
圖3圖示了在實(shí)施例1中描述的Ad5和Ad5/11感染對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟過(guò)程的影響。
圖4A圖示了實(shí)施例2應(yīng)用的所述retrogen表達(dá)框序列。圖4B顯示了實(shí)施例2中描述的被Ad5和Ad5/11轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞中的GFP或retrogen表達(dá)的百分比。
具體實(shí)施例方式
定義為了便于理解本發(fā)明，下面對(duì)一些術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定義。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”和“患者”指任何動(dòng)物，如狗、貓、鳥(niǎo)、以及家畜，優(yōu)選人。在優(yōu)選實(shí)施方案中，個(gè)體患有能夠利用樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行免疫治療的疾病。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)導(dǎo)”或“感染”指把病毒內(nèi)的病毒DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞(例如，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞)的方法。
在此使用的短語(yǔ)“無(wú)鞭毛衣殼成分”指除去衣殼鞭毛的病毒(例如，腺病毒)衣殼。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“具有編碼多肽的核苷酸序列的寡核苷酸”、“具有編碼多肽的核苷酸序列的多核苷酸”、以及“編碼肽或蛋白質(zhì)的核酸序列”表示含有特定多肽編碼區(qū)域的核酸序列。編碼區(qū)域可以以cDNA、基因組DNA、或RNA的形式呈現(xiàn)。當(dāng)以DNA形式呈現(xiàn)時(shí)，寡核苷酸或多核苷酸可以是單鏈(例如，有意義鏈)或雙鏈。如果需要使轉(zhuǎn)錄適當(dāng)?shù)貑⑹己?或初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄正確地進(jìn)行，適當(dāng)?shù)目刂埔蜃尤缭鰪?qiáng)子/啟動(dòng)子、剪接點(diǎn)、多腺苷酸信號(hào)等可能放置于靠近基因的編碼區(qū)域?；蛘?，用于本發(fā)明的表達(dá)載體的編碼區(qū)域可以包含內(nèi)源的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、剪接點(diǎn)、間插序列、多腺苷酸信號(hào)等，或者是內(nèi)源和外源的控制因子的組合。
同樣，在此使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”和“多核苷酸”在序列大小上沒(méi)有限制或區(qū)別。兩個(gè)術(shù)語(yǔ)僅指由核苷酸組成的分子。同樣，術(shù)語(yǔ)“肽”、“蛋白質(zhì)”、以及“多肽”也沒(méi)有序列大小的區(qū)別。這些術(shù)語(yǔ)僅指由氨基酸殘基組成的分子。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“輔助病毒依賴性病毒DNA”或“有殼病毒DNA”指編碼病毒載體的病毒DNA，該病毒載體含病毒復(fù)制和包裝時(shí)必需的順式作用DNA序列，但通常不包括病毒編碼序列(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6,083,750，以引用方式并入本文)。這些載體能夠容納至約36kb的外源DNA并且不能夠表達(dá)足以用于復(fù)制的病毒蛋白質(zhì)。輔助病毒依賴性病毒載體是通過(guò)輔助病毒依賴性病毒DNA在輔助病毒腺病毒存在下的復(fù)制產(chǎn)生的，輔助病毒腺病毒單獨(dú)或加上包裝細(xì)胞系提供需要的反式病毒蛋白質(zhì)，使得輔助病毒依賴性病毒DNA能夠進(jìn)行復(fù)制。美國(guó)專利號(hào)6,083,750中描述了有殼載體的構(gòu)建。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“輔助病毒DNA”指編碼輔助病毒載體的病毒DNA，其單獨(dú)或加上包裝細(xì)胞系能提供反式病毒蛋白質(zhì)，使得有殼病毒能夠進(jìn)行復(fù)制。例如，輔助病毒可以提供具有B亞族腺病毒鞭毛的衣殼。術(shù)語(yǔ)“輔助病毒腺病毒”或“輔助病毒”指能夠在特定宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的腺病毒。例如，宿主細(xì)胞可以提供腺病毒基因產(chǎn)物如E1蛋白質(zhì)?！o助病毒’可以用來(lái)提供反式功能(例如，蛋白質(zhì))，該功能為第二個(gè)非復(fù)制型病毒(例如，有殼病毒載體)所缺乏。因此，在含有輔助病毒和第二病毒的細(xì)胞內(nèi)，第一復(fù)制型病毒可以“輔助”第二非復(fù)制型病毒進(jìn)行病毒基因組的繁殖。輔助病毒可以包括在某些破壞劑的存在下能削弱輔助病毒復(fù)制的序列。具有破壞性序列的輔助病毒的例子是(+)lox(+)pol輔助病毒。(+)lox(+)pol輔助病毒是一個(gè)E1-區(qū)被刪除、E3-區(qū)被刪除的病毒，該病毒能夠利用Cre重組酶進(jìn)行負(fù)選擇，并且在它的E3區(qū)帶有堿性磷酸酶報(bào)告基因。由包裝因子I-V組成的包裝信號(hào)在直接重復(fù)方向上與loxP位點(diǎn)相連接，因此，在Cre(破壞劑)存在下允許去除包裝信號(hào)。
術(shù)語(yǔ)“病毒”指不能自主繁殖的(如，復(fù)制需要利用宿主細(xì)胞的繁殖系統(tǒng))、超顯微鏡下可見(jiàn)的、細(xì)胞內(nèi)的專性寄生物。腺病毒是雙鏈DNA病毒。左、右反向末端重復(fù)序列(ITR)是分別位于腺病毒線性基因組5′和3′末端的短元件，并且在病毒DNA復(fù)制時(shí)所需要。左ITR通常位于腺病毒基因組的1-130堿基對(duì)之間(可表示為0-0.5mu)。右ITR通常位于腺病毒基因組的約35800至末端堿基對(duì)之間(可表示為99.5-100mu)。兩個(gè)ITR序列互相反向重復(fù)。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)基因”或“轉(zhuǎn)基因序列”指被插入載體或質(zhì)粒的基因，其在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì))是所希望的。轉(zhuǎn)基因序列包括具有治療價(jià)值的基因和報(bào)告基因。優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)基因序列編碼的目標(biāo)蛋白質(zhì)是抗原(例如，與腫瘤相關(guān)的抗原)。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括治療性處理和預(yù)防措施。需要治療的個(gè)體包括那些已經(jīng)出現(xiàn)病癥和需要預(yù)防病癥出現(xiàn)的個(gè)體。
短語(yǔ)“在一定條件下使得癥狀減輕”指對(duì)于任何可以通過(guò)受病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫治療的疾病，任何可檢測(cè)癥狀的定性或定量的減輕，包括但不限于以下幾方面對(duì)于疾病恢復(fù)速度的可觀察效果(例如，體重的增長(zhǎng)速度)、腫瘤體積的減小、或者減輕至少一種通常與特定疾病有關(guān)的癥狀。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了含病毒載體的組合物、方法和試劑盒，所述病毒載體可用于免疫治療。具體地講，本發(fā)明提供了具有B亞族腺病毒衣殼鞭毛的病毒載體，該病毒載體被構(gòu)建成在具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的抗原提呈細(xì)胞(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞)內(nèi)表達(dá)轉(zhuǎn)基因序列。優(yōu)選的是，所述轉(zhuǎn)基因序列為retrogen表達(dá)框，以及所述腺病毒衣殼鞭毛為Ad11鞭毛。以下部分將提供有關(guān)本發(fā)明的描述I)具有B亞族腺病毒鞭毛的病毒載體；II)由病毒載體表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)；以及III)以病毒載體樹(shù)突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療。
I.具有B亞族腺病毒鞭毛的病毒載體本發(fā)明的病毒載體具有B亞族腺病毒鞭毛。例如，B亞族腺病毒鞭毛可以為Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、Ad50、或者是它們的組合。圖1圖示了本發(fā)明中腺病毒衣殼鞭毛為Ad11的一種實(shí)施方案。本發(fā)明具有B亞族腺病毒鞭毛(例如，Ad11)的病毒載體有重要的優(yōu)越性，如增加人類樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，還可以導(dǎo)致未成熟人類樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。具有Ad11鞭毛的病毒載體已顯示了顯著的優(yōu)勢(shì)。例如，以Ad11鞭毛為基礎(chǔ)的載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與以Ad5為基礎(chǔ)的載體相比有顯著的提高，同樣的結(jié)果也顯示在具有B亞族鞭毛(如，Ad35，參見(jiàn)圖2)的其他病毒載體上。本發(fā)明的病毒載體由于改善了取向性可以在很低的感染復(fù)數(shù)下用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞。這就使得病毒載體在較低的感染復(fù)數(shù)下在樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)能夠表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)(參見(jiàn)下文)。如此低的感染復(fù)數(shù)使轉(zhuǎn)導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的劑量更低，并且使人類免疫治療方案(參見(jiàn)下文)得到改進(jìn)。
任意類型的病毒載體都可以應(yīng)用于本發(fā)明。例如，已經(jīng)表達(dá)B亞族衣殼鞭毛的未包膜的DNA或RNA病毒的任意類型，或者被修飾以表達(dá)B亞族衣殼鞭毛(例如，通過(guò)刪除正常鞭毛基因并且用B亞族衣殼鞭毛替換它)的DNA或RNA病毒的任意類型都可以應(yīng)用于本發(fā)明。例如，在一些實(shí)施方案中，病毒載體一部分是具有Ad35或Ad11鞭毛的腺病毒載體，而腺病毒衣殼的其余部分是Ad5。這些病毒載體被稱為Ad5/11或Ad5/35腺病毒載體。在現(xiàn)有技術(shù)中已描述過(guò)產(chǎn)生這種嵌合載體的技術(shù)(例如，參見(jiàn)Shayakhmetov et al.，J.of Virol.，74(6)2567-2583，2000；Shayakhmetov and Lieber，J.of Virol.74(22)10274-10286，2000；以及WO0073478，上述全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文)。例如，在Shayakhmetov等人文章中的圖5A和在WO0073478的圖16、18中提出了有用的構(gòu)建體。同樣值得注意的是，在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有編碼Ad11鞭毛的序列(例如，參見(jiàn)Genbank Accession No.L08231、L08232；Mei and Wadell，Virology，194453-462，1993，以引用方式并入本文)。類似的技術(shù)可以用來(lái)制造其他嵌合的病毒載體。
如上所述，本發(fā)明并不局限于任何特定類型的病毒載體。在現(xiàn)有技術(shù)中已知很多適合的載體，包括但并不局限于如下這些腺病毒載體；第二代腺病毒載體；有殼腺病毒載體；腺相關(guān)病毒載體；以及慢病毒載體。所有這些載體可以被修飾以便具有(或者已經(jīng)包含)B亞族腺病毒鞭毛。腺病毒載體是本發(fā)明首選的病毒載體。下文將更詳細(xì)介紹腺病毒載體。
1.腺病毒載體本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用腺病毒載體。有51種腺病毒血清型被分為A至F亞族。B亞族腺病毒載體包含B亞族腺病毒鞭毛，而A亞族、以及C-F亞族可以被修飾以包含B亞族腺病毒鞭毛。自體繁殖的腺病毒(Ad)載體廣泛地被應(yīng)用以在體內(nèi)和體外向各種各樣的細(xì)胞類型傳輸異體基因。“自體繁殖的病毒”指的是通過(guò)單鏈DNA(重組病毒基因組)轉(zhuǎn)染到單包裝細(xì)胞系中而產(chǎn)生具有感染性病毒的病毒；自體繁殖的病毒在繁殖時(shí)不需要使用輔助病毒。第一代腺病毒載體被刪除了E1和E3基因。
2.第二代腺病毒載體為了解決和第一代腺病毒載體有關(guān)的病毒復(fù)制問(wèn)題，由此發(fā)展了被稱為“第二代”的腺病毒載體。第二代同樣經(jīng)過(guò)修飾(或已含有)使得其具有B亞族腺病毒鞭毛。第二代腺病毒載體還刪除了腺病毒基因組(E2A、E2B、以及E4)的早期區(qū)域。在大規(guī)模載體制備期間，經(jīng)高度修飾的第二代腺病毒載體不太可能產(chǎn)生具有復(fù)制功能的病毒，并且腺病毒基因組復(fù)制的完全抑制作用能夠消除后期基因的復(fù)制。由此針對(duì)后期病毒蛋白質(zhì)的宿主免疫反應(yīng)得以降低[參見(jiàn)Amalfitano et al.，J.Virol.72926-933(1998)]。從腺病毒基因組中刪除E2A、E2B、以及E4基因還增加了克隆容量。
3.有殼腺病毒載體“有殼”、“空殼”、或輔助病毒依賴性腺病毒載體包含順式作用DNA序列，其指導(dǎo)腺病毒的復(fù)制和包裝，但并不包含病毒編碼序列(參見(jiàn)Fisher et al.，Virology 21711-22(1996)；Kochanek et AL.，Hum.Gen.Ther.，102451-9，1999；和美國(guó)專利No.5,994,132，上述全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文)。有殼載體是通過(guò)在輔助病毒存在下進(jìn)行復(fù)制而制備的有缺陷的病毒，其提供了所有必需的反式病毒蛋白質(zhì)。輔助病毒可以提供必需的序列以制備病毒衣殼。在本發(fā)明中，輔助病毒能夠表達(dá)具有B亞族腺病毒鞭毛(例如，Ad11鞭毛)的衣殼。由于有殼載體不包含任何病毒基因，因此病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)是不可能的?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)對(duì)輔助病毒依賴性病毒的制備進(jìn)行了描述[參見(jiàn)Hardy et al.，J.Virol.711842-1849(1997)和hartigan-O′conner et al.，J.Virol.737835-7841(1999)]。有殼腺病毒載體最多能夠容納至約37kb的外源DNA，但是28～30kb的容量更普遍。
II.由病毒載體表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)如上所述，本發(fā)明對(duì)于具有B亞族腺病毒鞭毛(例如，具有B亞族腺病毒鞭毛如Ad11鞭毛的輔助病毒依賴性腺病毒載體)的病毒載體的生產(chǎn)是有益的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生產(chǎn)的病毒載體包括編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因序列(異源核酸序列)，使得該載體有利于各種各樣的應(yīng)用(體外蛋白質(zhì)表達(dá)、治療性應(yīng)用、使用樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫療法等)。適當(dāng)?shù)漠愒碊NA序列包括，例如，對(duì)在接受個(gè)體內(nèi)有缺陷或缺失的蛋白質(zhì)編碼的核酸序列，或?qū)哂邢Ｍ纳飳W(xué)或治療效果(例如，抗菌、抗病毒、或抗腫瘤的作用)的蛋白質(zhì)編碼的異源基因。其他適當(dāng)?shù)漠愒春怂岚?，但并不限于，?duì)那些用于內(nèi)分泌、代謝、血液、心血管、神經(jīng)、肌肉骨骼、泌尿、肺部、以及免疫紊亂治療的蛋白質(zhì)編碼的核酸，所述的免疫紊亂還包括炎性疾病、自身免疫性疾病、慢性感染性疾病如愛(ài)滋病、癌癥、高血脂癥、胰島素紊亂如糖尿病和生長(zhǎng)失調(diào)、各種各樣血液病包括各種貧血病、地中海貧血病、以及血友?。贿z傳缺陷如囊腫性纖維化、高歇氏癥、赫爾勒氏癥、腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥、以及肺氣腫。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因序列將編碼抗原蛋白質(zhì)。該抗原可以包括天然的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片斷、或合成的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片斷或肽。抗原的例子包括，但并不限于，能夠引起對(duì)病毒性或細(xì)菌性肝炎、流感、白喉、破傷風(fēng)、百日咳、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、脊髓灰質(zhì)炎、肺炎球菌、皰疹、呼吸道合胞病毒、b型流感嗜血菌、衣原體、水痘帶狀皰疹病毒或狂犬病病毒等產(chǎn)生免疫反應(yīng)的那些抗原。
在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原蛋白質(zhì)為與腫瘤或癌癥相關(guān)的抗原。例如，抗原蛋白質(zhì)包括，但并不限于，從MAGE-1至MAGE-3(用于黑色素瘤、肺癌、直腸癌的治療)、GAGE、DAGE、前列腺特異性抗原(用于治療前列腺癌)、前列腺特異性膜抗原(用于治療前列腺癌)、酪氨酸酶(用于治療黑色素瘤)、Gp100(用于治療黑色素瘤)、α-胎蛋白(用于治療肝癌)、獨(dú)特型Ig(用于治療B細(xì)胞性NHL、骨髓瘤)、TCR(用于治療T細(xì)胞性NHL)、Bcr-abl融合產(chǎn)物(用于治療CML)、P53變種(用于治療肺癌、直腸癌、頭頸部癌癥)、NY-ESO-1(用于治療黑色素瘤和乳腺癌)、Her-2/neu(用于治療乳腺癌、肺癌、以及卵巢癌)、以及Muc-1(用于治療胰腺癌、肺癌、乳腺癌、以及直腸癌)。
在具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原是由HBV病毒產(chǎn)生的。如上所述，HBV感染和HCC是世界范圍內(nèi)的主要健康問(wèn)題。本發(fā)明的病毒載體可以包含編碼HBV抗原的轉(zhuǎn)基因序列，還可以用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(以治療HBV感染者或HCC患者)。由HBV產(chǎn)生的抗原的一個(gè)例子是乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。由HBV產(chǎn)生的另一個(gè)抗原是HBeAg(現(xiàn)有技術(shù)中已知編碼這些抗原的序列)。例如，HBcAg的編碼序列在基因庫(kù)中的登記號(hào)為M38594。人類乙型肝炎病毒由其中嵌有表面抗原蛋白質(zhì)的脂質(zhì)外殼和包含有病毒基因組的蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)核組成。二十面的病毒粒子是由多個(gè)乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的亞結(jié)構(gòu)組成。HBcAg的非微粒形式，即HBeAg，是在HBV感染期間分泌到血清中的。HBeAg的第1-149個(gè)氨基酸與HBcAg相同，HBeAg還在N端延伸出10個(gè)氨基酸，該10個(gè)氨基酸由HBeAg基因前核核心的前核序列編碼。在大多數(shù)宿主體內(nèi)HBcAg和HBeAg有高度的免疫原性，在小鼠和短尾猿體內(nèi)它們主要為體液和T細(xì)胞免疫反應(yīng)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，在HBeAg基因內(nèi)，可以將HBeAg C末端的富含精氨酸的氨基酸殘基(第150-180位的氨基酸)刪除。
在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明病毒載體中的轉(zhuǎn)基因序列是retrogen表達(dá)框序列。retrogen技術(shù)使用retrogen表達(dá)框作為在載體中的轉(zhuǎn)基因。retrogen表達(dá)框由編碼抗原(例如，與腫瘤相關(guān)的抗原)的序列組成，在該抗原的C末端具有細(xì)胞結(jié)合域序列(用于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用)、以及在該抗原N末端具有前導(dǎo)序列/分泌序列(允許分泌抗原)。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)公開(kāi)(例如，參見(jiàn)You et al.，Cancer Research，61197-205，2001；以及Chen等人的WO03025126，上述兩份參考文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。
由于通過(guò)MHC-I類抗原提呈途徑與通過(guò)MHC-II類的明顯不同，所以抗原很難由樹(shù)突狀細(xì)胞同時(shí)通過(guò)MHC-I和MHC-II兩條途徑提呈。例如由被轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)抗原可以有效地由MHC-I而不是由MHC-II加工并提呈。另一方面，由被轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的分泌蛋白質(zhì)不能由MHC-I提呈。retrogen表達(dá)框技術(shù)可以使抗原同時(shí)通過(guò)MHC-I和MHC-II兩條途徑提呈，并且可以有效地激活Th、CTL和B細(xì)胞(參見(jiàn)上文You et al.)。使用N端前導(dǎo)序列修飾抗原的編碼序列以允許分泌，并且使用，例如，IgG的Fc片斷修飾抗原編碼序列以允許抗原重吸收并通過(guò)Fc-γ-受體內(nèi)吞到樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)。然后，將該被修飾的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到樹(shù)突狀細(xì)胞以產(chǎn)生和分泌融合蛋白質(zhì)(術(shù)語(yǔ)“retrogen”由其逆行性運(yùn)輸/內(nèi)化的特點(diǎn)而得來(lái))，其通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被樹(shù)突狀細(xì)胞吸收、通過(guò)核內(nèi)體途徑被加工以及通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞作為MHC-II提呈的外源物質(zhì)而被提呈，以誘導(dǎo)CD4+Th細(xì)胞。內(nèi)化的抗原也能通過(guò)MHC-I途徑提呈以直接激活CTL(交叉激活)。在抗原提呈中，通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面的分子和細(xì)胞因子使Fc和Fc-γ-受體細(xì)胞相互作用激活樹(shù)突狀細(xì)胞。表達(dá)腺病毒B亞族鞭毛的本發(fā)明病毒載體和retrogen表達(dá)框的結(jié)合顯示出在實(shí)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和人類免疫療法的有力結(jié)合。
III.以病毒載體樹(shù)突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)為基礎(chǔ)的免疫治療本發(fā)明的病毒載體更適宜用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(例如，人類樹(shù)突狀細(xì)胞)，以便該樹(shù)突狀細(xì)胞激活需要治療的患者體內(nèi)的Th、CTL、和/或B細(xì)胞反應(yīng)。具有腺病毒B亞族鞭毛的本發(fā)明病毒載體在較低感染復(fù)數(shù)(參見(jiàn)圖2)下轉(zhuǎn)導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞并刺激其成熟(參見(jiàn)圖3)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒載體包含Ad11衣殼鞭毛，并可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(參見(jiàn)圖1)。以下對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞和免疫療法做進(jìn)一步描述。
樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是專門的抗原提呈細(xì)胞，其作為橋梁在先天的、細(xì)胞的及體液的免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。在體內(nèi)，樹(shù)突狀細(xì)胞戰(zhàn)略性地分布在病原體可能進(jìn)入位置的接觸面上。它們捕獲抗原，并轉(zhuǎn)移到二級(jí)淋巴組織，在那里它們能夠激活T輔助細(xì)胞(Th)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。它們也和B細(xì)胞或可能和NK細(xì)胞相互作用。樹(shù)突狀細(xì)胞從骨髓祖細(xì)胞(CD34+)發(fā)展成外周血祖細(xì)胞(CD11c+)，其通過(guò)同它們的選擇素(例如，CD62L)、粘性分子(例如，LFA-1、VLA-4、CD44、CLA)、以及趨化性細(xì)胞因子受體(例如，CCR1、-5、-6)的相互作用而向不同外周組織進(jìn)行遷移。在它們未成熟的狀態(tài)下，樹(shù)突狀細(xì)胞可以有效地捕獲抗原。在吸收了抗原并暴露于自然刺激的條件下(自然刺激包括某些傳染性物質(zhì)、炎癥細(xì)胞因子、或它們CD40受體的觸發(fā))，樹(shù)突狀細(xì)胞得到活化，并通過(guò)引流淋巴遷移至外周淋巴器官，并在那里同T細(xì)胞相遇。在這個(gè)遷移過(guò)程中，樹(shù)突狀細(xì)胞成熟為專門的在富于共刺激的情況下提呈大量肽/MHC-I類和MHC-II類復(fù)合物的細(xì)胞。隨著樹(shù)突狀細(xì)胞的活化和遷移，抗原的吸收活性和與抗原相關(guān)的受體被下調(diào)，這導(dǎo)致抗原吸收轉(zhuǎn)變?yōu)榭乖岢?。同時(shí)通過(guò)MHC-I類和MHC-II類兩條途徑將抗原進(jìn)行加工，這兩條途徑分別需要CD8+CTL和CD4+Th細(xì)胞的活化。CD4+細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子/共刺激分子，反過(guò)來(lái)也刺激CTL和B細(xì)胞。CTL能夠直接殺死腫瘤細(xì)胞。樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟狀態(tài)在淋巴結(jié)中因細(xì)胞凋亡而結(jié)束。
本發(fā)明提供了樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療的方法，特別是用在此描述的病毒載體進(jìn)行的癌癥免疫療法。采用普通抗原蛋白質(zhì)/肽的抗腫瘤疫苗的治療常常得到很差的免疫效果或甚至導(dǎo)致T細(xì)胞的免疫耐受作用。通過(guò)利用樹(shù)突狀細(xì)胞向T細(xì)胞提呈腫瘤抗原的能力，樹(shù)突狀細(xì)胞能夠扮演癌癥免疫治療的重要角色。已有兩種療法用于樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫療法樹(shù)突狀細(xì)胞同抗原蛋白質(zhì)共同培養(yǎng)(負(fù)載)和樹(shù)突狀細(xì)胞的基因修飾。樹(shù)突狀細(xì)胞被I型限制性合成肽或蛋白質(zhì)、或同自體腫瘤中提取的天然肽負(fù)載。這類方法還包括將樹(shù)突狀細(xì)胞暴露在全部腫瘤溶解產(chǎn)物或細(xì)胞凋亡體以及腫瘤細(xì)胞的融合產(chǎn)物中。樹(shù)突狀細(xì)胞基因修飾的療法是使用病毒載體或非病毒載體(參見(jiàn)Nouri-Shirazi et al.，Immunol.Lett.745-10，2000，以引用方式并入本文)將抗原DNA或RNA轉(zhuǎn)入樹(shù)突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的。與抗原負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞相比，被設(shè)計(jì)為表達(dá)給定抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞具有以下方面的優(yōu)勢(shì)i)能在一段較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)持續(xù)地產(chǎn)生出大量的治療性蛋白質(zhì)，這對(duì)于與MHC-I結(jié)合來(lái)提呈很重要，因?yàn)槠滢D(zhuǎn)換率比較短；ii)內(nèi)源產(chǎn)物和對(duì)抗原的加工可能使其能更好的接近MHC-I類通路并提呈多元的未經(jīng)辨認(rèn)的抗原決定基(相反，肽的使用依賴于對(duì)患者的單模標(biāo)本人白細(xì)胞抗原的認(rèn)知，這將限制任何給定抗原的肽抗原決定基的使用)；以及iii)刺激Th1、Th2和T細(xì)胞、B細(xì)胞反應(yīng)的潛力。樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的癌癥免疫療法的可行性已在一系列前沿的研究中得到了證明(參見(jiàn)Nestle，Oncogene，196673-9，以引用方式并入本文)。例如，在以載有抗原/肽的樹(shù)突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的臨床試驗(yàn)中，在患惡性黑色素瘤、淋巴瘤、腎細(xì)胞癌、以及前列腺癌的患者中頻繁地觀察到了全部和部分反應(yīng)，這在以前建立的癌癥免疫治療的方式中沒(méi)有被觀察到(Dannull et al.，Onkologie，23544-551，200，以引用方式并入本文)。
本發(fā)明的病毒載體(具有腺病毒B亞族鞭毛，如Ad11)可以用來(lái)向樹(shù)突狀細(xì)胞傳遞轉(zhuǎn)基因(例如retorgen表達(dá)框)。通常，非病毒基因體外導(dǎo)入樹(shù)突狀細(xì)胞的效率很低。在病毒載體當(dāng)中，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒、以及腺病毒已被用于樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)(根據(jù)本發(fā)明，所有這些病毒都可以被修飾而含有腺病毒B亞族鞭毛)。致癌性逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)于培養(yǎng)的樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)率是很低的(Westermann et al.，Gene Ther.，5264-71，1998，以引用方式并入本文)。然而，本發(fā)明的病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，因此最適合于樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在免疫療法的應(yīng)用中，本發(fā)明的樹(shù)突狀細(xì)胞可以在體外或者在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，PBMC可以通過(guò)白血球電泳或者其它適合的方法從癌癥患者中進(jìn)行收集。然后單核細(xì)胞可以通過(guò)淘析或其它適合的方法進(jìn)行純化。純的單核細(xì)胞級(jí)分可以通過(guò)同GM-CFS、IL-4或其他適合的物質(zhì)共同培養(yǎng)而誘導(dǎo)分化成樹(shù)突狀細(xì)胞。然后將未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞用本發(fā)明的病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，該病毒載體可含有，例如與腫瘤相關(guān)的抗原，以獲得成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(參見(jiàn)圖1)。接著樹(shù)突狀細(xì)胞可給藥至患者用來(lái)治療癌癥或其它疾病。樹(shù)突狀細(xì)胞能最理想地激活患者體內(nèi)的Th、以及CTL反應(yīng)(以及B細(xì)胞反應(yīng))。樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)也可以通過(guò)向患者體內(nèi)直接注射本發(fā)明的病毒載體來(lái)進(jìn)行，這樣使得患者體內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)。
實(shí)驗(yàn)部分接下來(lái)提供的實(shí)施例是為了證明并進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案和內(nèi)容，但并不應(yīng)被解釋為限定其保護(hù)范圍。
在下面的實(shí)驗(yàn)公開(kāi)中，應(yīng)用了以下縮寫(xiě)M(摩爾)；mM(微摩爾)；nM(納摩爾)；pM(皮摩爾)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；ml(毫升)；μl(微升)；℃(攝氏度)；OD(光密度)；nm(鈉米)；BSA(牛血清蛋白)；PBS(磷酸鹽緩沖溶液)。
實(shí)施例1具有Ad11和Ad35鞭毛的病毒載體高效轉(zhuǎn)導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞并激活樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟本實(shí)施例描述了用于檢測(cè)具有Ad11或Ad35衣殼鞭毛的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人類樹(shù)突狀細(xì)胞的能力。這個(gè)實(shí)施例也檢測(cè)了這些同樣的病毒載體激活人類樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的能力。
在本實(shí)施例中，人類樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)通過(guò)體外分化作用產(chǎn)生。特別是人類樹(shù)突狀細(xì)胞可以通過(guò)體內(nèi)分化作用從骨髓CD34+祖細(xì)胞(來(lái)自于尸體骨髓)產(chǎn)生，也可以在用G-CSF活化后從外周血分離的CD34+祖細(xì)胞或CD14+單核細(xì)胞產(chǎn)生。這里采用了通過(guò)GM-CSF、IL-4、fl3配體、以及TNF對(duì)CD34+祖細(xì)胞體外分化的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見(jiàn)Ferlazzo etal.，J.Immunol.1633597-604，1999，以引用方式并入本文)。
在本實(shí)施例中用的腺病毒載體是第一代腺病毒Ad5載體，該載體經(jīng)過(guò)構(gòu)建可以表達(dá)具有Ad11或Ad35鞭毛(而不是Ad5鞭毛)的GFP。這些病毒載體被稱為Ad5/11或Ad5/35腺病毒載體。現(xiàn)有技術(shù)中已描述過(guò)產(chǎn)生這種嵌合載體的技術(shù)(例如，參見(jiàn)Shayakhmetov et al.，J.ofVirol.，74(6)2567-2583，2000；Shayakhmetov and Lieber，J.of Virol.74(22)10274-10286，2000；以及WO0073478，上述全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文)。例如，在Shayakhmetov et al的圖5A和在WO0073478的圖16、18中提出了有用的構(gòu)建體。同樣值得注意的是，在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有編碼Ad11鞭毛的序列(例如，參見(jiàn)Genbank Accession No.L08231、L08232；Mei and Wadell，Virology，194453-462，1993，以引用方式并入本文)。
Ad5/35和Ad5/11載體、以及Ad5載體用于向未成熟人類樹(shù)突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)移基因。在37℃、不同的感染復(fù)數(shù)的條件下進(jìn)行3個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在感染24小時(shí)后用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)GFP的表達(dá)進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果顯示，在Ad5/35和Ad5/11的感染復(fù)數(shù)為5(pfu/細(xì)胞)的條件下，分別轉(zhuǎn)染了37％和59％的人類CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞。在同樣的感染復(fù)數(shù)下，標(biāo)準(zhǔn)Ad5載體只能轉(zhuǎn)導(dǎo)少于1％骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞。圖2中圖示了這些結(jié)果。重要的是，在感染復(fù)數(shù)為100的條件下，獲得了Ad5/35和Ad5/11載體的最高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(85～95％)，而最大Ad5劑量(感染復(fù)數(shù)為1000)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率僅為58％。在許多來(lái)自Ad5/35和Ad5/11的驅(qū)使轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子中，只有CMV啟動(dòng)子，而不是MSCV或RSV啟動(dòng)子，能啟動(dòng)GFP在樹(shù)突狀細(xì)胞中的表達(dá)，這說(shuō)明這些啟動(dòng)子在人類樹(shù)突狀細(xì)胞中是無(wú)活性的。Ad5/11和Ad5/35載體不能轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞。同Ad5載體相比，Ad5/35和Ad5/11載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)動(dòng)力學(xué)特性被顯著增強(qiáng)了，這導(dǎo)致在加入病毒后幾小時(shí)內(nèi)就出現(xiàn)了很高效的基因表達(dá)。在LPS誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞體外成熟期間，基因表達(dá)水平仍然很高。
我們也進(jìn)行了腺病毒感染對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞成熟標(biāo)記表達(dá)影響的檢測(cè)。未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞用Ad5-、Ad5/11-、以及Ad5/35-CMV-GFP感染(感染復(fù)數(shù)為10)或用LPS進(jìn)行處理。24小時(shí)后，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞的表面標(biāo)記。圖3圖示了這些結(jié)果。同未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞相比，圖3表明了表面標(biāo)記增加的結(jié)果。模擬對(duì)照試驗(yàn)中只使用了用于稀釋病毒的緩沖液。正如圖3中的結(jié)果所示，在CD86、CD83、以及HLA-DR表達(dá)增長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，Ad5/35和Ad5/11的感染也觸發(fā)了樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟(圖3)。相反，在感染復(fù)數(shù)為10的條件下，Ad5載體的感染不能誘導(dǎo)成熟標(biāo)記的顯著增加。此外，將未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞同空的Ad5/11衣殼溫育也能誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟(在圖3中所示的相似水平上)，這說(shuō)明未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞與假定的Ad11受體和/或顆粒吸收的相互作用已足夠激活樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的信號(hào)通路。作為對(duì)比，加入LPS后表面標(biāo)記發(fā)生了上調(diào)，所述LPS一般被用來(lái)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。具有Ad11或Ad35鞭毛的腺病毒載體在很低感染復(fù)數(shù)的條件下有效轉(zhuǎn)導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的能力以及誘導(dǎo)其成熟的能力，說(shuō)明這些載體將成為人體免疫治療中十分有用的工具(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或樹(shù)突狀細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后注射入需治療的患者體內(nèi))。
實(shí)施例2HBeAg-Retrogen在由Ad5和Ad5/11第一代載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞中的表達(dá)本實(shí)施例描述了HBeAg-Retrogen在由Ad5和Ad5/11第一代載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞中的表達(dá)。本實(shí)施例包括具有Ad11鞭毛載體的應(yīng)用和Retrogen技術(shù)。Retrogen技術(shù)是使用Retrogen表達(dá)框作為載體中的轉(zhuǎn)基因。Retrogen表達(dá)框由編碼抗原(例如，與腫瘤相關(guān)的抗原)的序列組成，在抗原的C末端具有細(xì)胞結(jié)合域序列(用于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用)、以及在抗原N末端具有前導(dǎo)序列/分泌序列(允許分泌抗原)。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)公開(kāi)(例如，參見(jiàn)You et al.，Cancer Research，61197-205，2001；以及Chen等人的WO03025126，上述兩份參考文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。
在本實(shí)施例中，RetrogenRetrogen表達(dá)框的抗原編碼序列是來(lái)自人類乙型肝炎病毒(HBV)的HBeAg抗原。人類乙型肝炎病毒由其表面嵌有抗原蛋白質(zhì)的脂質(zhì)外殼和含有病毒基因組的蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)核組成。二十面的病毒粒子是由多個(gè)乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的亞結(jié)構(gòu)組成。HBcAg的非微粒形式，即HBeAg，是在HBV感染期間分泌到血清中的。HBeAg的第1-149個(gè)氨基酸與HBcAg相同，HBeAg還在N端延伸出10個(gè)氨基酸，該10個(gè)氨基酸由HBeAg基因前核核心的前核序列編碼。在大多數(shù)宿主體內(nèi)HBcAg和HBeAg有高度的免疫原性，在小鼠和短尾猿體內(nèi)它們主要為體液和T細(xì)胞反應(yīng)。在本實(shí)施例中，在HBeAg基因內(nèi)，將HBeAg C端的富含精氨酸的氨基酸殘基(第150-180位的氨基酸)(這段氨基酸殘基在HBV感染時(shí)被切除)刪除。使用的HBeAg來(lái)自于“ayw”HBV亞類。該截短的(分泌了的)HBeAg(具有它自身的前導(dǎo)序列，L)在其C端連接于細(xì)胞結(jié)合域(人類IgG FccDNA)上，用于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。將HBeAg基因置于CMV啟動(dòng)子的控制下，已知所述CMV啟動(dòng)子在樹(shù)突狀細(xì)胞中是有活性的。轉(zhuǎn)錄被牛生長(zhǎng)素聚腺苷酸化信號(hào)終止(bPA)。該RetrogenRetrogen表達(dá)框圖示于圖4A。
在本實(shí)施例中，在感染復(fù)數(shù)為10的條件下，用含GFP或HBeAg的Retrogen表達(dá)框的第一代Ad5和Ad5/11為基礎(chǔ)的載體(參見(jiàn)實(shí)施例1)感染Hela細(xì)胞。用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)Hela細(xì)胞的GFP表達(dá)進(jìn)行分析，或在感染48小時(shí)后用FITC標(biāo)記的抗-Fc抗體對(duì)HBeAg表達(dá)進(jìn)行分析。細(xì)胞未進(jìn)行滲透裂解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖4B。(細(xì)胞內(nèi)的)GFP表達(dá)和Retrogen表達(dá)的相似水平表明Retrogen在活細(xì)胞的膜中容易檢測(cè)到。值得注意的是Hela細(xì)胞表達(dá)Ad5和Ad11受體。
實(shí)施例3HBeAg-Retrogen在由Ad5和Ad5/35第一代載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞中的表達(dá)本實(shí)施例描述了由Ad5和Ad5/35第一代載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的HBeAg-Retrogen的表達(dá)。使用的Retrogen表達(dá)框在實(shí)施例2中進(jìn)行了描述，所用腺病毒載體在實(shí)施例1中進(jìn)行了描述。在本實(shí)施例中，用Ad5和Ad5/35感染未成熟CD11c陽(yáng)性樹(shù)突狀細(xì)胞。同感染了Ad5的細(xì)胞相比，感染了Ad5/35的樹(shù)突狀細(xì)胞表現(xiàn)了增強(qiáng)的HBeAg表達(dá)。未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的感染在實(shí)施例1中進(jìn)行了描述。然后感染了Ad5和Ad5/35 HBeAg的樹(shù)突狀細(xì)胞和負(fù)載了抗原的自體外周T細(xì)胞共同培養(yǎng)。同感染了Ad5 HBeAg的細(xì)胞相比，在和感染了Ad5/35 HBeAg的樹(shù)突狀細(xì)胞共同培養(yǎng)的T細(xì)胞中觀察到了增強(qiáng)的T細(xì)胞增殖和Th1細(xì)胞因子IFN-γ的分泌。我們還發(fā)現(xiàn)HBeAg特異性CTL活性在用表達(dá)Retrogen的Ad5/35載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞中比在負(fù)載肽的樹(shù)突狀細(xì)胞中的強(qiáng)。
綜上所述，這些結(jié)果表明B族假型腺病毒能在較低的、無(wú)毒的感染復(fù)數(shù)下，使樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)、成熟和抗原特異性免疫反應(yīng)的刺激更為有效。
實(shí)施例4應(yīng)用具有B亞族衣殼鞭毛的病毒載體的人類免疫療法本實(shí)施例描述了應(yīng)用具有B亞族衣殼鞭毛的病毒載體的人類免疫療法。特別是本實(shí)施例描述了通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞而實(shí)施的免疫療法來(lái)治療人，該未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞在(或來(lái)自于)HBV感染的肝細(xì)胞癌(HCC)患者體內(nèi)。
患有HCC的人類患者可以用被構(gòu)建成表達(dá)Retrogen表達(dá)框的具有B亞族衣殼鞭毛的腺病毒載體進(jìn)行治療。例如，具有Ad11鞭毛的病毒載體可以用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)人類患者的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，該病毒載體包含表達(dá)HBeAg的Retrogen表達(dá)框。樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以發(fā)生在體外。來(lái)自于患者的樹(shù)突狀細(xì)胞可以從患者體內(nèi)分離，然后使用腺病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。作為選擇，可以將腺病毒載體注射進(jìn)患者體內(nèi)靠近樹(shù)突狀細(xì)胞的聚集處(例如，淋巴結(jié))或腫瘤附近。轉(zhuǎn)導(dǎo)(體內(nèi)或體外)能在低感染復(fù)數(shù)下發(fā)生，如感染復(fù)數(shù)為100或10。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞將在患者體內(nèi)成熟并向T細(xì)胞和B細(xì)胞同時(shí)提呈MHC-I類和MHC-II類抗原。這提示患者體內(nèi)的Th、CTL和B細(xì)胞反應(yīng)將被用來(lái)對(duì)抗HCC腫瘤和HBV感染。這種免疫療法可以減少或消除HCC和HBV感染的癥狀。
上述說(shuō)明書(shū)中提及的全部出版物和專利以引用方式并入本文。在不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍和思想的情況下，對(duì)本發(fā)明的不同改進(jìn)和對(duì)所描述的方法和系統(tǒng)的變形將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。盡管本發(fā)明結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但是應(yīng)該理解，本發(fā)明的權(quán)利要求不應(yīng)僅僅限定于這樣特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，實(shí)施本發(fā)明所描述方式的不同改變對(duì)于化學(xué)、醫(yī)學(xué)、以及分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，將落入本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種含腺病毒載體的組合物，其中所述腺病毒載體包含a)一種腺病毒衣殼，其中所述腺病毒衣殼包含選自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的B亞族腺病毒衣殼鞭毛；以及b)核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼retrogen蛋白質(zhì)的retrogen表達(dá)框序列，其中所述retrogen蛋白質(zhì)包含i)抗原蛋白質(zhì)，ii)連接于所述抗原蛋白質(zhì)N末端的前導(dǎo)序列，以及iii)連接于所述抗原蛋白質(zhì)C末端的細(xì)胞結(jié)合域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述腺病毒衣殼鞭毛為Ad11鞭毛。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述抗原蛋白質(zhì)為與腫瘤相關(guān)的抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述抗原蛋白質(zhì)為HBeAg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其還包含樹(shù)突狀細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物還包含樹(shù)突狀細(xì)胞，而且所述腺病毒載體在所述樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)。
7.一種方法，該方法包括以下步驟a)提供i)樹(shù)突狀細(xì)胞，以及ii)一種含腺病毒載體的組合物，其中所述腺病毒載體包含A)一種腺病毒衣殼，其中所述腺病毒衣殼包含選自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的B亞族腺病毒衣殼鞭毛；以及B)核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼retrogen蛋白質(zhì)的retrogen表達(dá)框序列，其中所述retrogen蛋白質(zhì)包含I)抗原蛋白質(zhì)，II)連接于所述抗原蛋白質(zhì)N末端的前導(dǎo)序列，以及III)連接于所述抗原蛋白質(zhì)C末端的細(xì)胞結(jié)合域；以及b)將所述組合物與所述樹(shù)突狀細(xì)胞在感染復(fù)數(shù)至少為5的一定條件下進(jìn)行接觸，使得至少30％的所述樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)所述retrogen蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生表達(dá)retrogen的樹(shù)突狀細(xì)胞，其中所述抗原蛋白質(zhì)由所述表達(dá)retrogen的樹(shù)突狀細(xì)胞作為MHC-I類抗原和MHC-II類抗原得以提呈。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中在感染復(fù)數(shù)為5～10的條件下進(jìn)行接觸時(shí)，至少35％的所述樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)所述retrogen蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中在感染復(fù)數(shù)為10～100的條件下進(jìn)行接觸時(shí)，至少70％的所述樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)所述retrogen蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述接觸發(fā)生在體外。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述腺病毒衣殼鞭毛為Ad11鞭毛。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗原蛋白質(zhì)為與腫瘤相關(guān)的抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗原蛋白質(zhì)為HBeAg。
14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中該方法還包括以下步驟c)將所述表達(dá)retrogen的樹(shù)突狀細(xì)胞給藥至患者。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述患者是HBV感染繼發(fā)肝細(xì)胞癌的患者或HBV感染的患者。
16.一種方法，該方法包括以下步驟a)提供i)樹(shù)突狀細(xì)胞，以及ii)一種含腺病毒載體的組合物，其中所述腺病毒載體包含A)一種腺病毒衣殼，其中所述腺病毒衣殼包含Ad11衣殼鞭毛；以及B)核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因序列；以及b)將所述組合物與所述樹(shù)突狀細(xì)胞在感染復(fù)數(shù)至少為5的一定條件下進(jìn)行接觸，使得至少55％的所述樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)所述目標(biāo)蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的樹(shù)突狀細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述接觸導(dǎo)致所述樹(shù)突狀細(xì)胞從未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中在感染復(fù)數(shù)為10～100的條件下進(jìn)行所述接觸時(shí)，至少70％的所述樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中在感染復(fù)數(shù)為100～500的條件下進(jìn)行所述接觸時(shí)，至少90％的所述樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在體外。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)為HBeAg。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該方法還包括以下步驟c)將表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的樹(shù)突狀細(xì)胞給藥至個(gè)體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述個(gè)體是HBV感染繼發(fā)肝細(xì)胞癌的個(gè)體或HBV感染的個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含病毒載體的組合物、方法和試劑盒，所述病毒載體可用于免疫治療。具體地講，本發(fā)明提供了具有B亞族腺病毒衣殼鞭毛的病毒載體，該病毒載體被構(gòu)建成在具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的抗原提呈細(xì)胞(例如，樹(shù)突狀細(xì)胞)內(nèi)表達(dá)轉(zhuǎn)基因序列。優(yōu)選的是，所述轉(zhuǎn)基因序列為retrogen表達(dá)框，以及所述腺病毒衣殼鞭毛為Ad11鞭毛。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1665921SQ03815438
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月30日
發(fā)明者米杰, 安德烈·利伯 申請(qǐng)人:艾維亞醫(yī)藥/生物技術(shù)有限公司