專利名稱：使用胸腺法新上調(diào)腫瘤抗原表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥診斷和治療領(lǐng)域，涉及胸腺法新(胸腺素α-1)在癌癥診斷和治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗癌疫苗的開發(fā)、免疫成像和藥物遞送技術(shù)都依賴于存在于腫瘤細(xì)胞膜上的、由MHC-1分子適當(dāng)遞呈的特異性分子靶點(diǎn)(例如腫瘤抗原)的鑒定。尤其在腫瘤免疫治療和癌癥疫苗開發(fā)中，抗原鑒定仍是一個(gè)中心問題。雖然已經(jīng)鑒定到各種腫瘤特異性抗原，但是這些抗原的表達(dá)水平和/或MHC-1分子對(duì)它們易變的遞呈使得難以建立足夠特異而靈敏的免疫治療和基于免疫的診斷方法，以檢測(cè)癌細(xì)胞的存在，并破壞癌細(xì)胞。檢測(cè)腫瘤抗原的靈敏性增加使得能夠在疾病早期進(jìn)行診斷，在具有較少腫瘤細(xì)胞的早期階段進(jìn)行治療，并積極地治療轉(zhuǎn)移情況。
之前我們已經(jīng)說(shuō)明腫瘤特異性抗原TLP在人類和實(shí)驗(yàn)性腫瘤中都表達(dá)，且具有保守序列。這使得TLP成為用作免疫診斷和免疫治療方法的靶抗原的良好候選物，但是，TLP的表達(dá)水平對(duì)于這些目的來(lái)說(shuō)和大多數(shù)腫瘤分子靶點(diǎn)一樣不夠理想。
胸腺素α-1或胸腺法新是正常存在于循環(huán)中的28-氨基酸肽。胸腺法新刺激胸腺細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，生成IL-2、T細(xì)胞IL-2受體、IFNα和IFNγ(Baxevanis，1990；Bepler，1994；Serrate，1987；Stzein，1989)。胸腺素α-1還能夠上調(diào)I型MHC的表達(dá)(Giuliani，2000)。已經(jīng)評(píng)價(jià)了胸腺法新在多種疾病中的治療效力，所述疾病包括慢性乙肝和丙肝、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、對(duì)疫苗的應(yīng)答降低和癌癥(Andreone，1996；Garaci，1998，2000；gravenstein，1986；Mutchnick，1999；Sherman，1998)。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胸腺法新能夠在體外或體內(nèi)上調(diào)TLP在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞上的表達(dá)。這種TLP表達(dá)的升高使得各種改進(jìn)的診斷和治療方法成為可能，所述的診斷和治療方法基于例如用于放射免疫引導(dǎo)術(shù)或免疫閃爍掃描技術(shù)的改進(jìn)癌細(xì)胞。用無(wú)毒處理如胸腺法新增加腫瘤抗原表達(dá)的能力對(duì)于治療和診斷目的是相當(dāng)有用的，使得能夠較早檢測(cè)和治療癌癥，更積極而徹底地治療晚期癌癥，尤其是轉(zhuǎn)移性癌癥。


圖1TLP在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系DHD-K12的細(xì)胞膜上表達(dá)。
圖2胸腺法新處理增加結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系WiDr細(xì)胞表面上TLP的表達(dá)。
圖3胸腺法新處理動(dòng)物增加腹水中腫瘤細(xì)胞上TLP的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
胸腺法新處理能夠上調(diào)TLP抗原的表達(dá)。表達(dá)增加可以誘導(dǎo)特異的CD8細(xì)胞群，導(dǎo)致更有效的CTL應(yīng)答。另外，表達(dá)增加能夠使細(xì)胞對(duì)于放射免疫引導(dǎo)術(shù)或免疫閃爍掃描技術(shù)來(lái)說(shuō)更好地得以靶向及檢測(cè)。并且，獲得天然表達(dá)人抗原的實(shí)驗(yàn)性腫瘤在建立臨床前模型中特別有用。用本方法增強(qiáng)腫瘤抗原表達(dá)增加對(duì)診斷和免疫治療方法的敏感性，進(jìn)而可以較早地檢測(cè)和治療癌癥，更積極而徹底地治療晚期癌癥，包括轉(zhuǎn)移性癌癥。
增強(qiáng)TLP表達(dá)的胸腺法新肽的量可以通過(guò)常規(guī)的劑量滴定實(shí)驗(yàn)確定?？梢允褂?μg/kg體重-6mg/kg體重之間，優(yōu)選20μg/kg體重-200μg/kg體重之間劑量的胸腺法新在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)TLP的上調(diào)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胸腺法新對(duì)于人類施用劑量高達(dá)16mg/劑/天、大鼠中施用高達(dá)6mg/kg/天時(shí)是安全的。
胸腺法新可以通過(guò)本領(lǐng)域中所熟知的各種方法中的任意方法來(lái)施用，例如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)注射或灌輸，或直接施用到腫瘤周圍區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胸腺法新肽存在于藥學(xué)上可接受的液體載體中，如注射用水、生理濃度的鹽水等。皮下注射胸腺法新的血漿半衰期只有約2小時(shí)(Rost，et al.，1998)。但是，聚合物與胸腺法新肽的偶聯(lián)會(huì)大大增加該肽的血漿半衰期(Rasi，et al.，未發(fā)表觀察結(jié)果)。當(dāng)以偶聯(lián)胸腺法新的形式應(yīng)用時(shí)，上述劑量只反映存在于組合物中的胸腺法新肽，而不反映與之偶聯(lián)的聚合物的重量。
例如，美國(guó)專利No.4,079,127、美國(guó)專利No.4,353,821、美國(guó)專利No.4,148,788、美國(guó)專利No.4,116,951中描述了胸腺法新肽的分離、鑒定和應(yīng)用。本發(fā)明可用胸腺法新肽，包括天然存在的胸腺法新和具有天然存在的胸腺法新的氨基酸序列、與之基本相似的氨基酸序列或其簡(jiǎn)化序列形式的合成胸腺法新與重組胸腺法新，以及其具有替換、缺失、延長(zhǎng)、置換等修飾序列、具有與胸腺法新基本相似的生物活性的生物活性類似物，例如具有與胸腺法新同源的足夠氨基酸、能夠以基本相同的方式發(fā)揮與胸腺法新基本相同活性的胸腺法新肽。
實(shí)施例1(體外)WiDr(人類)、IA-XsSBR(大鼠)和DHD-K12(大鼠)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系用5～100μg/ml的胸腺法新處理6～48小時(shí)。使用抗TLP的9個(gè)氨基酸肽表位的TLP抗血清(CSH-275)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FC)測(cè)定TLP抗原的表達(dá)，通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)進(jìn)行抗原定位。
TLP天然表達(dá)于所有3種結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系，都表達(dá)于30～55％細(xì)胞的胞漿中(滲透后通過(guò)CLSM和FC)和10～20％細(xì)胞的細(xì)胞膜上(通過(guò)FC)。圖1.胸腺法新能夠增加該抗原在所有受試細(xì)胞系中的表達(dá)。圖2.增加水平、在膜和胞漿處的定位隨處理劑量和時(shí)間而變動(dòng)，可以達(dá)到90％細(xì)胞的表達(dá)水平。
實(shí)施例2(體內(nèi))BD-IX大鼠腹腔注射同系DHD-K12細(xì)胞，并腹腔或皮下注射胸腺法新進(jìn)行處理。如上所述在從腹水或腫瘤塊獲得的腫瘤細(xì)胞上測(cè)定表達(dá)和定位。
從胸腺法新處理的動(dòng)物獲得的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出與體外觀察相似的TLP表達(dá)增加，見圖3。
參考文獻(xiàn)Andreone P.，Cursaro C.，Gramenzi A.，et al.″A randomizedcontrolled trial of thymosin alpha 1 versus interferonalpha treatment in patients with hepatitis B e antigenantibody-and hepatitis B virus DNA-positive chronichepatitis B，″Hepatology24(4)774-777(1996).
Baxevanis，C.N.，et al，″Enhancement of human T lymphocytefunctioh by prothymosin alphaincreased production ofinterleukin-2 and expression of interleukin-2 receptorsin normal human peripheral blood T lymphocytes，″Immunopharmacol.Immunotoxicol.12(4)595-617(1990).
Bepler，G.，″Thymosin alpha-1 as adjunct for conventionaltherapy of malignant tumorsa review，″Cancer Invest.12491-6(1994).
Garaci，E.，et al.″A randomized controlled study for theevaluation of the activity of a triple combination ofzidovudine，thymosin alpha 1，and interferon alpha inHIV-infected individuals with CD4 counts between 200 and500 cells/mm3，″Antiviral Ther.3103-111(1998)Garaci，E.，F(xiàn).Pica，G.Rasi，and C.Favalli，″Thymosinalpha 1 in the treatment of cancerfrom basic researchto clinical application，″Int.J.Immunopharm.221067-1076(2000).
Giuliani，C.，G.Napolitano，A.Mastino，S.Da Vincenzo，C.D′Agostini，S.Grelli，I.Bucci，D.S.Singer，L.D.Kohn，F(xiàn).Monaco，E.Garaci & C.Favalli，″Thymosin-α1 regulatesMHC class I expression in FRTL-5 cells at transcriptionallevel，″Eur.J.Immunol.30778-86(2000).
Gravenstein S.，Ershler W.B.，Drumaskin S.，Schwab R.，Weksler M.E.，″Anti-influenza antibody responseaugmentation in elderly″non-responders″by thymosinalpha 1，″Gerontologist26150A(1986).
Mutchnick，M.G.et al.，″Thymosin alpha 1 treatment ofchronic hepatitis Bresults of a phase IIImulticentre，randomized，double-blind and placebo-controlled study，″J.Viral Hep.6397-403(1999).
Rost，K.L.，W.Wierich，F(xiàn).Masayuki，C.W.Tuthill and W.M.Herrmann，″Pharmacokinetics of thymosin α-1 aftersubcutaneous injection of three different formulations inhealthy volunteers，″Eur.J.Clin.Pharmacol.3751-57(1998).
Serrate S.，Schulof R.，Leondaridis L.，Goldstein A.L.，SzteinM.B.，″Modulation of human natural killer cell cytotoxicactivity，lymphokine production，and interleukin 2receptor expression by thymic hormones″，J.Immunol.1392338-2343(1987).
Sherman，K.E.and Sherman，S.N.″Interferon plus thymosinalpha 1 treatment of chronic hepatitis C infectionameta-analysis，″inTherapies for Viral Hepatitis.Schinazi，RF，Sommadossi，J-P，and Thomas，HC，editors.International Medical Press，379-383(1998).
Sztein M.and Serrate S，″Characterization of theimmunoregulatory properties of thymosin alpha 1 oninterleukin-2 production and interleukin-2 receptorexpression in normal human lymphocytes″，Int.J.Immunopharmacol.11789-800(1989).
權(quán)利要求
1.一種上調(diào)腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)的方法，該方法包括向腫瘤細(xì)胞施用一定量的胸腺法新，使其足以相對(duì)于未處理腫瘤細(xì)胞增加TLP的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的施用是體內(nèi)施用于患者。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的胸腺法新以2μg/kg體重-6mg/kg體重之間的劑量施用。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的胸腺法新以20μg/kg體重-200μg/kg體重之間的劑量施用。
5.一種增強(qiáng)免疫診斷或免疫治療方法敏感性的方法，該方法包括向細(xì)胞施用一定量的胸腺法新對(duì)靶腫瘤細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，使其足以相對(duì)于未處理腫瘤細(xì)胞增加TLP的表達(dá)，然后應(yīng)用免疫診斷或免疫治療方法。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的施用是體內(nèi)施用于患者。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述的胸腺法新以2μg/kg體重-6mg/kg體重之間的劑量施用。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的胸腺法新以20μg/kg體重-200μg/kg體重之間的劑量施用。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的施用是體外施用于細(xì)胞。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述的施用是體外施用于細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種上調(diào)腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)的方法，該方法包括向細(xì)胞施用一定量的胸腺法新，使其足以相對(duì)于未處理腫瘤細(xì)胞增加TLP的表達(dá)。本發(fā)明還提供了增強(qiáng)免疫診斷方法和免疫治療方法敏感性的方法，該方法包括向細(xì)胞施用一定量的胸腺法新對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，使其足以相對(duì)于未處理腫瘤細(xì)胞增加TLP的表達(dá)，然后應(yīng)用免疫診斷和免疫治療方法。這些方法適用于體內(nèi)和體外診斷方法與體內(nèi)免疫治療方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1665522SQ03815396
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者吉多·拉西, 恩里科·加拉奇, 保拉·西尼巴爾迪－巴列沃納 申請(qǐng)人:賽克隆制藥公司