專利名稱：用于微生物細胞和微生物油的巴氏消毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，包括在不超過30分鐘之內(nèi)將細胞從40℃加熱到70℃。該巴氏消毒過程中，加熱速率可以為至少0.5℃/分鐘。所述巴氏消毒方法可以包含三個階段，即加熱階段、平臺(其間細胞被保持于恒定的溫度)以及冷卻階段。如果用繪圖方式來描述該巴氏消毒方案，則其在時間(分鐘)對溫度(℃)曲線圖下的面積小于13,000℃·分鐘。巴氏消毒后，可以從細胞中提取出多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，例如花生四烯酸，或者提取出微生物油。所述的油可能具有低過氧化值(peroxide value，POV)和/或低茴香胺值(anisidine value，AnV)。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid)，或PUFA，可以在自然界中發(fā)現(xiàn)。各種各樣不同的PUFA由不同的單細胞生物(藻類、真菌等)產(chǎn)生。一種特別重要的PUFA是花生四烯酸(arachidonic acid，ARA)，它是若干種長鏈多不飽和脂肪酸(Long Chain Poly-Unsaturated FattyAcid，LC-PUFA)之一。化學上，花生四烯酸是順式-5，8，11，14-二十碳四烯酸(20∶4)，屬于LC-PUFA的(n-6)族。
花生四烯酸是多種具有生物活性的化合物的主要前體，這些化合物合稱為類二十烷酸(eicosanoid)，其中包含多種前列腺素(prostaglandin)、凝血噁烷(thromboxane)和白細胞三烯(leukotriene)?；ㄉ南┧徇€是人類母乳脂類成分(lipid fraction)的組分之一，并被認為對嬰兒的理想神經(jīng)發(fā)育來說是必要的?；ㄉ南┧峋哂懈鞣N各樣的不同應用，包括用于嬰兒配方食品(infant formula)、食品和動物飼料。
WO-A-97/37032(Gist-Brocades)中提到了由經(jīng)過巴氏消毒的生物物質(zhì)(biomass)來制備含有PUFA的微生物油。但是，其卻并未揭示迅速地加熱至巴氏消毒發(fā)生的溫度或冷卻自巴氏消毒發(fā)生的溫度。此外，對巴氏消毒過程中所使用的能量總數(shù)也未有說明。
WO-A-00/15045和WO-A-01/67886中都提到了在食物制備中使用Mucorales真菌。上述文獻中的第一篇提到，在將細胞加入到食品中之前需要進行減少RNA的操作，并暗示使用加熱的步驟。單獨的巴氏消毒或熱激都是可行的。第二篇文獻暗示，通過將真菌細胞置于發(fā)酵容器內(nèi)，并使其得以“成熟(ripen)”，可以避免用加熱步驟來減少RNA的含量。
國際專利申請PCT/EP01/08902中提到了制備油類混合物的方法，該方法通過混合一種粗制的含ω6 PUFA的油和一種粗制的含ω3 PUFA的油，制成油類混合物，然后再對該粗制的油類混合物進行提純。
涉及加熱生物物質(zhì)或微生物細胞的方法是已知的。從WO-A-97/37032也可以獲知，在被提取出以油的形式存在的PUFA之前，微生物細胞可以被進行巴氏消毒。然而，本申請人已發(fā)現(xiàn)，一種新的巴氏消毒方法能夠提高從經(jīng)過巴氏消毒的細胞中提取到的油的質(zhì)量。具體而言，得到的油可能氧化更少或更少地被氧化，而且可能具有低過氧化值(POV)和/或低茴香胺值(AnV)。此外，本申請人還發(fā)現(xiàn)，上述新的巴氏消毒方法更為高效，因為其只需要更少的能量。故而該方法是有益的，因為其不僅提高了油的質(zhì)量，而且因其需要的能量更少從而可以降低成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就此提供了一種對微生物細胞進行的改良的巴氏消毒方法。除需要更少的能量之外，本發(fā)明的巴氏消毒方法還能得到更高質(zhì)量的產(chǎn)品。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，該方法包含在不超過30分鐘之內(nèi)，(于一種溫度，包含)從40℃至(60℃或)70℃加熱細胞；或以至少0.5℃/分鐘的速率加熱細胞。該方面因此提供了在巴氏消毒期間對微生物細胞的迅速的加熱，這樣的高加熱速率在本領(lǐng)域還未有披露過。雖然本領(lǐng)域給出過巴氏消毒的溫度，但卻沒有對下列內(nèi)容有過正面的評價或討論，包括加熱速率、或者該參數(shù)可能是重要的以及相對迅速的速率能帶來益處。事實上，高加熱速率是與直覺相反的，因為它們可能被認為會導致氧化，或者會降解從細胞中提取出來的PUFA或油。
本發(fā)明的第二方面涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，該方法包含一種包括(至少)三個階段的巴氏消毒方案。它們是一個(第一)加熱階段、一個(第二)平臺階段(其間，微生物細胞被保持于期望溫度，或細胞被維持在恒定和/或最高的溫度上)以及一個(第三)冷卻階段。本發(fā)明的此方面被稱為三階段巴氏消毒方案。如果將該方案繪制于時間對溫度的曲線圖上，將能得到一個梯形。
本發(fā)明的第三方面涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，該方法包含使用一種巴氏消毒方案，使得在時間(分鐘)對溫度(℃)曲線圖下的面積小于13,000℃·分鐘。時間對溫度曲線圖下的面積給出了在巴氏消毒過程中加熱細胞所消耗的能量值?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)迅速加熱和/或迅速冷卻(分別對應于第二方面中的第一和第三階段)能提供益處，例如一種更高質(zhì)量的油。此外，較之本領(lǐng)域中描述過的巴氏消毒方法，上述的巴氏消毒方法需要的能量也會減少。上述第三方面因此關(guān)系到所述巴氏消毒方法所需要的能量輸入。
本發(fā)明的第四方面涉及一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，該方法包含(加熱細胞并且)將細胞在一個提高的溫度(T，℃)下維持一段時間(t，分鐘)，例如在平臺階段；其中乘積tT(即時間和溫度參數(shù)相乘，例如在該平臺階段)為140℃·分鐘至100,800℃·分鐘。如人們所認識到的，該第四方面與第二方面相似，因為它也含有平臺階段。此時細胞被保持于恒定的或是最高的溫度。乘積tT因此可以代表此平臺階段在時間對溫度曲線圖下的面積。


圖1是三種巴氏消毒方案的溫度(℃)對時間(分鐘)的曲線圖(A和C屬于本發(fā)明，B用作對照)；
圖2是在三種不同溫度平臺(40℃、70℃和85℃)進行的巴氏消毒的溫度(℃)對時間(分鐘)曲線圖；圖3和4是AnV(及圖3的POV)對時間(小時)的曲線圖。
圖5是具有兩種不同(持續(xù)/平臺)時間(8秒和300秒)的巴氏消毒的POV(meq/kg)和AnV對溫度(℃)的曲線圖；圖6和7是在五種不同溫度(60℃、80℃、100℃、120℃和140℃)下進行的兩種不同(持續(xù)/平臺)時間(圖6為8秒，圖7為5分鐘)的溫度(℃)對時間(秒)的曲線圖。
具體實施例方式
第一方面——迅速加熱在該方面，細胞被加熱，從而其溫度在不超過30分鐘(例如不超過15分鐘)內(nèi)經(jīng)歷或是從40℃至70℃(或60℃)。從40℃至70℃所經(jīng)歷的時間優(yōu)選不超過40至50分鐘。或者或此外，上述細胞以至少0.5℃/分鐘的速率被加熱。當然，微生物細胞可以始于(或被加熱于)低于40℃的溫度。例如，這些細胞可以處于室溫或環(huán)境溫度。這些細胞可以處于發(fā)酵溫度，例如30℃±5℃。所以，當加熱(巴氏消毒)開始時，細胞可以處于20℃至40℃，例如23℃至27℃(或者25℃或29℃至32℃或37℃)。在某些情況下，微生物細胞可以是經(jīng)過冷卻的，例如在發(fā)酵結(jié)束之后。所以當加熱開始時，這些細胞的(初始)溫度可以是5℃至10℃，例如7℃至9℃。
微生物細胞可以被加熱至其溫度升高到(60℃或)70℃以上。因此，該溫度可以并非巴氏消毒期間微生物細胞的最終溫度。事實上，細胞可以被加熱到(60℃或)70℃以上的溫度。溫度可能升高直至達到70℃至90℃、110℃或130℃，例如75℃至87℃，最適為78℃至84℃。巴氏消毒期間的最高溫度因此可以在上述范圍內(nèi)，但對于某些實施方式，其也可以達到100℃、120℃或140℃。優(yōu)選地，細胞被保持或被維持于該(最高)溫度。
因此可以認識到，對細胞的加熱可以在低于40℃的溫度下進行或從40℃開始，達到70℃或更高。40℃至70℃的范圍可以提供更寬廣的加熱/溫度范圍的“快照(snapshot)”，其時間(及由此的速率)可以被確定(并由此被計算)。
可以計算出，上述的加熱(30分鐘內(nèi)從40℃至70℃)速率為1℃/分鐘。但是如果有必要的話，速率還可以較此稍低，第一方面中的迅速加熱意味著加熱速率超過0.5℃/分鐘。該速率優(yōu)選為至少0.6℃/分鐘、1.0℃/分鐘或者甚至1.5℃/分鐘。但是，特別快速的加熱速率是可以考慮的，它取決于設備和被加熱的微生物細胞的體積或質(zhì)量。因此本發(fā)明中也有超過2.0℃/分鐘或甚至2.5℃/分鐘的加熱速率。
可以使用專門的設備來獲得特別高的加熱速率。其可以在一段短時間內(nèi)達到高溫，同時，這樣做能將之后被分離出來的PUFA或微生物油的氧化或破壞降至最低。因此，加熱可以在最高溫度高達140℃、150℃或者甚至160℃下進行。優(yōu)選地，加熱可以達到100℃至180℃之間的溫度范圍，例如120℃至160℃，優(yōu)選從130℃至150℃。采用特別迅速的加熱儀，可以特別快地獲得上述的溫度，例如在少于一分鐘的時間(30秒)以內(nèi)。達到上述的溫度可以僅在20、30、40或50秒內(nèi)，也可以需要150、175、200、225或250秒。然而，上述的溫度可以在短如2、4、6、8或10秒內(nèi)達到，例如采用灌流加熱儀(infusion heater)，或是相對較小的樣品。因此，高達每分鐘50℃、100℃、150℃或者甚至200℃的加熱速率都是可以獲得的。稍低一些的加熱速率，每分鐘從5℃或10℃至50℃或60℃因此也是可能的，例如每分鐘從15℃至45℃。
已發(fā)現(xiàn)，迅速的巴氏消毒過程中的迅速加熱不僅更加高效及需能更少，而且它看上去還是獲得更高質(zhì)量的微生物油(一旦從經(jīng)過巴氏消毒后的細胞中被提取出來)的原因中的至少一個因素。
第二方面——三階段巴氏消毒方案第一階段可以是加熱階段。它實際上相當于本發(fā)明第一方面中所描述過的迅速加熱，因此，第一方面中的所有特征和特性在經(jīng)過必要的修正后都可以應用于第二方面的第一(加熱)階段。
第二階段是細胞處于(溫度)平臺之時。由此細胞可以在特定的期望溫度下(正負1℃或2℃、5℃或甚至10℃)被保持一段期望長度的時間。上述細胞由此可被維持于恒定的溫度。該平臺階段的溫度(或溫度范圍)優(yōu)選為上述巴氏消毒方案中所達到的最高溫度。該平臺階段的溫度(和/或巴氏消毒期間的最高溫度)優(yōu)選為至少70℃。它可以低于90℃或100℃，適于從70℃至85℃，例如從70℃至77℃。此外，它可以從80℃至160℃，例如從100℃至140℃。
平臺階段或是細胞被保持于期望或最高溫度的時間的長度，可以從5秒至90分鐘，例如從1或10分鐘至80分鐘，例如從20分鐘至70分鐘。該時間最適于從40或50分鐘至60或70分鐘，例如從45分鐘至65分鐘，從55分鐘至63分鐘是有益的。特別短的時間，例如從8秒至5分鐘，也是可能的。
第三階段是冷卻階段。優(yōu)選地，細胞被冷卻至與前面所提到的加熱(或第一階段)伊始時的溫度范圍相同或在其范圍之內(nèi)的溫度。微生物細胞優(yōu)選被線性地冷卻和/或加熱(適當?shù)?，第一?或第三階段)，那即是說，當被繪制在時間對溫度的曲線圖上時，冷卻或加熱曲線(近似地)為直線。上述細胞可以自然冷卻，或者其可以被主動冷卻，例如使用熱交換器(heat exchanger)和/或冷卻物質(zhì)，例如為了(降低)到環(huán)境溫度或室溫，或者更低。
冷卻速率優(yōu)選為至少0.4℃/分鐘、0.6℃/分鐘、1.0℃/分鐘或1.5℃/分鐘。這些數(shù)值代表了細胞被自然冷卻時可獲得的冷卻速率。但是，更迅速的冷卻速率也是有可能的，尤其是采用了主動冷卻時。因此，至少為2.0℃/分鐘、2.5℃/分鐘、3.0℃/分鐘或者甚至3.5℃/分鐘的冷卻速率也是可以得到的。但是，更高的冷卻速率，例如高于每分鐘5℃也是可能的，例如，每分鐘7℃或10℃至50℃或60℃，優(yōu)選為每分鐘15℃至45℃。
優(yōu)選的加熱和/或冷卻速率優(yōu)選保持在至少10℃、20℃或30℃以上，雖然在一些實施方式中，可以獲得超過至少40℃或50℃的范圍的速率。
可以認識到，具有迅速加熱階段和迅速冷卻階段的巴氏消毒，其中用到的能量可以被降低。這不僅僅導致了成本的節(jié)約，而且還不會對(最終的)微生物油的質(zhì)量產(chǎn)生負面影響，事實上，它看起來還對油有著有益的效果。
第三方面——時間對溫度曲線圖下的面積(能量輸入)從第二方面可以明顯獲知，如果將本發(fā)明的巴氏消毒方案繪制在一幅時間對溫度的曲線圖上，將會得到一個梯形。第一(加熱)和第三(冷卻)階段的形狀可能均為三角形，而中間或第二(平臺)階段(第四方面的主題)(通常)是矩形。時間對溫度曲線圖下的面積代表輸入到系統(tǒng)中的能量值。通過將巴氏消毒方案分為三部分，就可以計算出曲線圖的面積，從而計算出能量輸入。
在第三方面，時間(分鐘)對溫度(℃)的曲線圖下的面積小于13,000℃·分鐘。但是，遠小于此的數(shù)量也已經(jīng)被獲得，小于11,000℃·分鐘、10,000℃·分鐘、9,000℃·分鐘、8,000℃·分鐘或者甚至1,000℃·分鐘的數(shù)值也是可能的。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，這些數(shù)值可以不超過7,000℃·分鐘、6,000℃·分鐘或800℃·分鐘。在所述的曲線圖中，時間被繪制在x軸(或水平軸或橫坐標)上，0分鐘代表原點。溫度由此將被繪制在y軸(或垂直軸或縱坐標)上，0℃代表原點。
微生物細胞一旦被加熱至它們巴氏消毒的溫度，然后即可冷卻(或被冷卻)。這些細胞通常被冷卻至室溫或環(huán)境溫度，或至少低于30℃的溫度。因此不但有細胞從30℃被加熱至60℃的時間，也還有細胞從60℃冷卻至30℃的時間。這兩個時間可以被加合起來提供組合的30℃-60℃-30℃的加熱和冷卻時間。該組合時間優(yōu)選為少于150分鐘，例如是少于120分鐘或100分鐘。但是，對更小的樣品，還能獲得更快得多的時間，上述組合(30℃到60℃再回到30℃)時間可以少于70、50或者甚至30分鐘。
第四方面——有平臺階段的巴氏消毒方案本方案可以是一種依據(jù)第二方面的方案，其中有(例如，第一)加熱階段和(例如，第三)冷卻階段、夾在中間的(例如，第二或中間或居中的)平臺階段。但是，這并不是必需的，其它的巴氏消毒方案也能被設想出來。第四方面涉及上述平臺階段的優(yōu)選特征。第二(和其它)方面中的所有特征和特性在經(jīng)過必要的修正后也適用于此第四方面。
上述細胞被維持或保持于特定的期望溫度(正負1℃、2℃、5℃或者甚至10℃)，在一種溫度(T，℃)下持續(xù)一段時間(t，分鐘)。這兩個參數(shù)可以被乘起來，從而給出乘積tT。它適于從140℃·分鐘或280℃·分鐘至50,000℃·分鐘或100,800℃·分鐘。該乘積優(yōu)選從500℃·分鐘、1,000℃·分鐘、2,000℃·分鐘或3,000℃·分鐘或甚至6,000℃·分鐘至10,000℃·分鐘、18,000℃·分鐘或25,000℃·分鐘。該乘積tT最適為2,000℃·分鐘至6,000℃·分鐘，例如3,000℃·分鐘至5,000℃·分鐘，最適從4,000℃·分鐘至4,500℃·分鐘。在一些實施方式中，該乘積tT為從13℃·分鐘至900℃·分鐘，例如從100℃·分鐘或200℃·分鐘至700℃·分鐘或800℃·分鐘，優(yōu)選從300℃·分鐘或400℃·分鐘至600℃·分鐘或700℃·分鐘。
因此，通過與第三方面中相似的方式，可以認識到，該乘積tT代表了當細胞被保持于升高的溫度時的時間對溫度曲線圖下的面積。因此，該倍增因數(shù)tT實際上正是平臺(但非加熱或冷卻)階段曲線圖下的面積。
PUFA的提取本發(fā)明的第五方面涉及一種從微生物細胞中獲取PUFA的方法，該方法包含如前所述，根據(jù)本發(fā)明的第一、第二、第三或第四方面中之任一，對細胞進行巴氏消毒，再從經(jīng)過巴氏消毒的細胞中提取和/或分離出PUFA。
本發(fā)明的第六方面涉及微生物油，其可以包含至少40％的花生四烯酸(ARA)和/或具有含量為至少90％的甘油三酯。所述的油可以具有低于2.5、1.5、0.8、0.6或者甚至0.5的POV和/或低于1.0的AnV。所述的油可以通過第五方面的方法來制備。
多不飽和脂肪酸(PUFA)和微生物油所述的PUFA可以是一種PUFA，也可以是兩種或更多種不同的PUFA。該PUFA或每種PUFA可以是n-3或n-6族的。優(yōu)選為C18、C20或C22的PUFA。它可以是具有至少18個碳原子和/或至少3或4個雙鍵的PUFA。該PUFA可以以一種游離脂肪酸、一種鹽的形式，作為一種脂肪酸酯(例如甲酯或乙酯)，作為一種磷脂和/或以甘油單、雙或三酯的形式被提供。
適合的(n-3和n-6)PUFA包括二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA，22∶6Ω3)，適合來自藻類或真菌，例如(甲藻)Crypthecodinium或(真菌)Thraustochytrium；γ-亞麻酸(γ-linolenic acid，GLA，18∶3Ω6)；α-亞麻酸(α-linolenic acid，ALA，18∶3Ω3)；共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，十八碳二烯酸(octadecadienoicacid)，CLA)；雙高-γ-亞麻酸(dihomo-γ-linolenic acid，DGLA，20∶3Ω6)；花生四烯酸(ARA，20∶4Ω6)；和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA，20∶5Ω3)。
優(yōu)選的PUFA包括花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和/或γ-亞麻酸(GLA)。具體而言，優(yōu)選為ARA。
所述的PUFA可以通過經(jīng)本發(fā)明的方法進行了巴氏消毒的細胞來生產(chǎn)，例如微生物細胞。其可以是細菌、藻類、真菌或酵母細胞。真菌是優(yōu)選的，優(yōu)選為Mucorales目的，例如Mortierella、Phycomyces、Blakeslea、Aspergillus、Thraustochytrium、Pythium或Entomophthora。ARA的優(yōu)選來源為Mortierella alpina、Blakeslea trispora、Aspergillusterreus或Pythium insidiosum。藻類可以是甲藻(dinoflagellate)和/或包括Porphyridium、Nitschia或Crypthecodinium(例如Crypthecodiniumcohnii)。酵母包括Pichia或Saccharomyces屬的，例如Pichia ciferrii。細菌可以是Propionibacterium屬的。該微生物油(在室溫下)可以為液體。
大多數(shù)的PUFA優(yōu)選為以甘油三酯的形式存在。因此，優(yōu)選為至少50％，例如至少60％，或最優(yōu)為至少70％的PUFA都以甘油三酯的形式存在。但是，甘油三酯的數(shù)量還可以更高，例如為油的至少85％，優(yōu)選為至少90％，最優(yōu)為至少95％或98％。這些甘油三酯中，優(yōu)選至少40％，例如至少50％，而最優(yōu)為至少60％的PUFA，都處于甘油的α位(出現(xiàn)于甘油三酯的主鏈(backbone)中)也就是所謂的1或3號位。處于β(2)位的上述PUFA優(yōu)選為至少20％，例如至少30％，最優(yōu)為至少40％。
上述微生物油可以包含至少10％、35％、40％或45％或更多期望的PUFA，例如花生四烯酸。它可以有至少90％的甘油三酯含量。該微生物油具有的甘油三酯含量優(yōu)選為從90％至100％，例如至少96％，優(yōu)選為至少98％，更優(yōu)選為至少99％，而最優(yōu)的為超過99.5％。典型地，這種油中二十碳五烯酸(EPA)的含量低于5％，優(yōu)選為低于1％，而更優(yōu)選的是低于0.5％。該油中C20、C20∶3、C22∶0和/或C24∶0多不飽和脂肪酸(PUFA)中任何一種的含量可以少于5％，少于2％，少于1％。游離脂肪酸(free fattyacid，F(xiàn)FA)的含量可以≤0.4％，0.2％或0.1％。上述的油可以含有很少或沒有GLA和/或DGLA。
該微生物油可以是粗制的油。它可以通過使用溶劑從細胞中萃取出來，例如超臨界態(tài)二氧化碳、己烷或異丙醇。
巴氏消毒過程巴氏消毒通常發(fā)生于發(fā)酵完成之后。在一種優(yōu)選實施方式中，巴氏消毒將終止發(fā)酵，因為巴氏消毒期間的熱度會殺死細胞。巴氏消毒因此可以對發(fā)酵培養(yǎng)液(或液體(水性)培養(yǎng)基中的細胞)進行，雖然其也能夠?qū)呐囵B(yǎng)液中獲得的微生物生物物質(zhì)(biomass)進行。在前一種情況中，巴氏消毒可以發(fā)生于微生物細胞仍處于發(fā)酵罐中時。巴氏消毒優(yōu)選于微生物細胞受到更多的處理之前進行，例如微粒化(比如通過擠壓)粉碎，或者捏煉(kneading)。
優(yōu)選地，巴氏消毒方案足以抑制或失活一種或多種能使PUFA或微生物油降解或者對其產(chǎn)生不良影響的酶，例如脂肪酶。
一旦發(fā)酵被終止，就可以過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，或者進行其它處理以去除其中的水或水性液體。水分被移除之后，可以獲得一種生物物質(zhì)“壓濾渣(cake)”。如果巴氏消毒還未開展，就可以對這些去水的細胞(或生物物質(zhì)壓濾渣)進行巴氏消毒。
PUFA的提取方法然后PUFA(或通常包含該PUFA的微生物油)就可以從所述(經(jīng)過巴氏消毒)的微生物細胞中提取得到。其優(yōu)選從含有細胞的(比如，干燥的)微粒(例如，擠壓出的產(chǎn)物)中提取。這種提取可以使用溶劑來進行。優(yōu)選使用無極性溶劑，例如C1-8，優(yōu)選為C2-6的鏈烷，舉例來說是己烷。也可以使用二氧化碳(液態(tài)形式的，比如處于超臨界狀態(tài)的)。
優(yōu)選地，溶劑被允許從干燥微粒中濾出。在WO-A-97/37032中描述了合適的微生物微?；蛿D壓技術(shù)以及其后的對含有PUFA的微生物油的提取。
上述溶劑可以令我們獲得含有PUFA的粗制油。這種油在此狀態(tài)即可被使用，無需更多處理，或者它也可以再經(jīng)過一步或數(shù)步精煉。然而，粗制的油通常含有溶劑，例如用來萃取該油的溶劑(例如己烷，或醇，例如異丙醇)，或其還未經(jīng)歷下述精煉步驟中的一種(或優(yōu)選為全部)。PCT/EP01/08902號國際專利申請(該文件的內(nèi)容和本文中所述及的其它所有文件的內(nèi)容通過引用的方式包括于本文中)中描述了合適的精煉方案。例如，可以對這種油進行一步或數(shù)步的精煉，包括酸處理或脫膠(degumming)、堿處理或去除游離脂肪酸、脫色或去除色素、過濾、冬化(winterisation)(或冷卻，例如為了去除飽和的甘油三酯)、脫臭(或?qū)τ坞x脂肪酸的去除)和/或上光(polishing)(或?qū)τ筒蝗苄晕镔|(zhì)的去除)。上述所有精煉步驟在PCT/EP01/08902中都有更為詳細的描述，在經(jīng)過必要的修正后都可以被應用于本申請所描述的步驟中。
由此得到的油特別適合于營養(yǎng)上的用途，其可以被添加到(人類)食物或(動物)飼料中。例子包括奶、嬰兒配方食品、健康飲品、面包和動物飼料。
微生物細胞本發(fā)明中使用的微生物細胞(或微生物)可以是上文所述的任何一種，尤其是在關(guān)于PUFA和微生物油的一節(jié)中的那些。它們可以包含或能被用于生產(chǎn)PUFA或微生物油，所述的PUFA油可以適當?shù)靥崛』蚍蛛x自上述的細胞中。這些細胞可以是絲狀的形式，例如真菌或細菌，或者可以是酵母、藻類和細菌等單個的細胞。這些細胞可以包含酵母、真菌、細菌或藻類等微生物。優(yōu)選的真菌是Mucorales目的，例如該真菌可以是Mortierella、Phycomyces、Blakeslea或Aspergillus屬的。優(yōu)選的真菌是Mortierella alpina、Blakeslea trispora或Aspergillus terreus種的。
至于考慮到酵母，優(yōu)選是Pichia(例如是Pichia ciferrii種的)或Saccharomyces屬的。
細菌可以是Propionibacterium屬的。
如果該細胞來自藻類，優(yōu)選為甲藻(denoflagellate)和/或?qū)儆贑rypthecodinium屬的，優(yōu)選的藻為Crypthecodinium cohnii屬的。
加熱直接或間接地加熱(上述細胞)都是可行的。所述的加熱，如果是直接的，則可以是通過向發(fā)酵罐中傳送蒸汽。間接的方式可以是通過熱交換器使用一種介質(zhì)，其既可以通過發(fā)酵罐的壁，也可以有加熱線圈，或外部的熱交換器，例如板式熱交換器(plate heat exchanger)。
通常，巴氏消毒將發(fā)生于進行發(fā)酵的發(fā)酵容器中。但是，對一些微生物(例如細菌)而言，通常優(yōu)選的是首先將細胞移出容器，然后再進行巴氏消毒。巴氏消毒可以發(fā)生于對生物進行其它處理之前，例如干燥或微粒化。
巴氏消毒通常將殺死大多數(shù)的微生物，如果不是全部的話。巴氏消毒后，至少95％、96％或者甚至98％的微生物都已被殺死，即它們已經(jīng)死亡。
酸化在一些情況下，人們期望降低細菌在經(jīng)過巴氏消毒之后生長的風險。一種可能是用合適的酸來酸化細胞。因此，為了防止微生物物種的生長(outgrowth)，將細胞的pH調(diào)節(jié)到從3至4的范圍是合乎期望的。但是根據(jù)所述的細胞，也還可以采用更寬的pH范圍，所以pH可以調(diào)節(jié)為2至5，最優(yōu)是在大約3.3至3.7的范圍內(nèi)。
對細胞的酸化可以發(fā)生于巴氏消毒之前。然而，其優(yōu)選卻進行于巴氏消毒之后。
對pH的調(diào)節(jié)可以通過任何適當?shù)耐緩交蛉魏芜m當?shù)乃醽磉M行。優(yōu)選是使用磷酸來獲得的，例如85％的或稀釋的55％或33％的磷酸。
過氧化值(POV)上述微生物油的POV優(yōu)選為從4至8或12，尤其是對粗制的油而言。然而，該POV可以不超過3.0，2.5或2.0。但是，使用本發(fā)明的方法還可以獲得更低得多的POV，這些值可以低于1.5或低于1.0。低于0.8或0.6以及甚至低于0.4的POV也是能夠獲得的。(來自于實施方式的)數(shù)值變動于1.3(或0.8)至0.4之間。(POV的)單位通常是meq/kg。
茴香胺值(AnV)該值表示對醛類含量的測量。上述微生物油的茴香胺值優(yōu)選為從5、6、7或10至15、20或25，尤其是對粗制的油而言。AnV適于不超過20，例如不超過15。它可以不超過10或者甚至不超過5。優(yōu)選地，POV和/或AnV是就粗制的而非經(jīng)過精煉的油而言的。AnV值(在優(yōu)選的實驗中)在15至5之間變化，可以是在12至7之間。
粗制油與精煉油的對比下面展示了上述兩種油之間的一些區(qū)別。每種粗制的或精煉的油都可能具有下表中恰當對應于粗制或精煉油的一種或多種特征。粗制的油通常含有抗氧化劑(例如生育酚、抗壞血酸棕櫚酸)。

適當?shù)?，本發(fā)明中的粗制油可以具有以下特征中的一個或數(shù)個(a)未皂化物含量從2.0％至3.5％(w/w)；(b)溶劑(例如己烷)含量從10ppm、50ppm或100ppm至1000ppm、1500ppm或2000ppm；(c)游離脂肪酸含量從0.1％或0.2％至1％，例如0.2％-0.6％或0.3％-0.5％；(d)POV從2、3、4或6至10；(e)含磷量為至少2、3或5mg/kg；(f)含硅量為50ppm或100ppm至500ppm；和/或
(g)水分含量少于1％或從0.5％至1％或2％。
油及PUFA的用途本發(fā)明的第六方面涉及一種組合物，其中包含第五方面所述的油以及如果合適的話，還具有一種或多種(額外的)物質(zhì)。該組合物可以是為動物或人類提供的食品和/或食物添加劑。在本發(fā)明的多種供人類消耗的實施方式中，可以對上述的油進行加工，使其適合人類消耗，典型地是對從微生物中獲得的油進行精煉或提純。
上述組合物可以是嬰兒配方食品或(人類)食品。此處的配方食品的成分可以經(jīng)過調(diào)節(jié)，使其中各種油脂或PUFA的含量與正常母乳相似。這可以包括將本發(fā)明的微生物油與其它油類摻合，以獲得合適的組合物。
上述組合物可以是動物或海產(chǎn)飼料的組合物或添加劑。上述飼料和添加劑可以供給任何的養(yǎng)殖動物，特別是綿羊、牛和家禽。此外，上述飼料或添加劑還可以供給被養(yǎng)殖的海產(chǎn)生物，例如魚和有殼水生動物。上述組合物因此還可以包括一種或多種適于上述動物的飼料物質(zhì)或成分。
本發(fā)明的油可以作為油直接售賣，也可以被包納于合適的包裝中，典型地，是一種內(nèi)部涂上環(huán)氧酚紫膠漆(epoxy phenolic lacquer)并且經(jīng)過充氮的鋁瓶。上述的油可能含有一種或多種抗氧化劑(例如，生育酚、維生素E、棕櫚酸)，每種的濃度例如為50ppm至800ppm，比如從100ppm至700ppm。
合適的組合物可以包括藥用或動物治療用的(veterinary)組合物，例如，口服或化妝品用途的組合物。所述的油可以按照所述的方式被使用，或者還可以被裝入膠囊，例如在一種殼(shell)里，因此可以成為膠囊的形式。所述的殼或膠囊可以包含明膠和/或甘油。所述的組合物可以含有其它成分，例如調(diào)味料(比如檸檬或酸橙香料)或者一種藥用或動物治療可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明中一個方面的優(yōu)選特征和特性在進行必要的修正后同樣可適用于另一個方面。
現(xiàn)在將采用舉例的方式通過下述的實施例來對本發(fā)明進行描述，下述的實施例通過闡述對本發(fā)明提供支持，而并非欲對本發(fā)明的范圍進行限制。
實施例1含有PUFA的微生物油在生產(chǎn)過程中的氧化，被認為是由酶活性導致的。巴氏消毒被當作一種在處理微生物細胞以獲得微生物油的過程中穩(wěn)定(stabilising)氧化的方法?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這種穩(wěn)定的程度取決于巴氏消毒的條件。
為此，我們開展了若干項實驗，來確定巴氏消毒的哪些條件會影響到油的氧化水平特別是其過氧化值(POV)。過氧化值采用AOCSCd8-53中詳細描述的標準方案來測定。
上述實驗遵循以下方案發(fā)酵；貯藏；巴氏消毒；(微生物油的)提取；對油的分析。
真菌Mortierella alpina被培養(yǎng)于發(fā)酵罐中。發(fā)酵持續(xù)了大約148小時。M.alpina生產(chǎn)名為花生四烯酸(ARA)的PUFA。上述生物物質(zhì)被移出發(fā)酵罐，并被貯藏(于低于-18℃的溫度)。
當發(fā)酵培養(yǎng)液還處于發(fā)酵罐中時，就將M.alpina生物質(zhì)的樣品從發(fā)酵培養(yǎng)液中移出，而且立刻將其冷凍起來。
我們嘗試了多種巴氏消毒方案。巴氏消毒被進行于三種不同的溫度，即40℃、70℃和85℃。上述方案遵循一種三階段方法，其具有迅速加熱的第一階段，接著為處于期望溫度也即是所使用的最高溫度的平臺(第二或中間階段)。然后是迅速冷卻的(第三)階段。不同的生物物質(zhì)樣品經(jīng)歷了具有三種不同時間的中間(平臺)階段，即一個、兩個和24個小時。
巴氏消毒之后，采用濕法提取(wet extraction)技術(shù)來獲得微生物油。生物物質(zhì)樣品被過濾、(在壓力下)壓榨，油被提取出來。
然后對微生物油進行分析，首先是用AOCS方法來分析過氧化值(POV)。一些樣品中的ARA含量也被測定。分析顯示，獲得的每kg微生物油具有大約420g的ARA。
詳細方案發(fā)酵和樣品提取從發(fā)酵罐容器中移出一升的發(fā)酵培養(yǎng)液，并將其過濾(Seitz兩升過濾器，F(xiàn)-FA10)。得到的壓濾渣用600ml的去離子水漂洗。上述濕壓濾渣被風吹干燥一分鐘，然后在400bar進行壓榨(使用HAFICOTM裝置，酊壓(tincture press)，C-OAO21，300-400Atm)。再用Ultra TurraxTM儀器，在室溫(20℃至25℃)下用500ml的己烷(Merck)對濕的壓出物進行一小時的萃取以得到微生物油。然后將己烷移走。再用250ml新鮮的己烷在室溫對剩下的壓濾渣進行漂洗(攪拌下30分鐘)。移走己烷，并將其加入到前次萃取后的己烷中。
然后將一種玻璃過濾器和一種GFA玻璃過濾器聯(lián)合使用來過濾萃取物。再使用RotavaporTM儀器，使己烷于50℃左右從澄清的萃取物中揮發(fā)約15分鐘。上述的油被轉(zhuǎn)移至氣密性杯中，然后對每只樣品杯充氮30秒。再將上述樣品杯關(guān)好并貯藏于-18℃。
巴氏消毒方案我們試驗了三種不同的方案(A、B和C)。每種都由三個階段組成，即第一加熱階段，(處于最高溫度的)第二平臺階段和第三冷卻階段。下表1顯示了這三種巴氏消毒模式的方案。
表1


所述的三種巴氏消毒模式A、B和C還另外以繪圖方式展現(xiàn)于圖1中?？梢哉J識到，對每種模式中的三個步驟的每一個而言，其在溫度(T，℃)對時間(t，分鐘)曲線圖下的面積都能被計算出來，然后將它們加合，就能給出三種模式中每一種在曲線圖下的總面積。此類計算還顯示于上表1中。
從經(jīng)歷A、B和C三種巴氏消毒方案后的細胞中萃取得到的油，其過氧化值(POV)被測定。所述萃取的油的POV分別為8.7、14.3和2.4。模式B的加熱和冷卻速率緩慢，其僅作為對照出現(xiàn)。它的POV最高，為14.3。
與之相反，模式A和C都是本發(fā)明的內(nèi)容。模式A比模式B在第一和第三階段的加熱和冷卻速率都更快。在本發(fā)明中，加熱和冷卻速率優(yōu)選為至少和模式A中所示的一樣快。模式A給出的POV為8.7。
但是，使用模式C才獲得了最好的結(jié)果，其POV僅為2.4。如圖1所示，它具有一個非常迅速的加熱階段和快速的冷卻(第三)階段。
實施例2
我們進行了與實施例1類似的實驗，區(qū)別只在于此處巴氏消毒的溫度變化更寬，即為40℃(用作對照)、70℃和85℃。溫度(℃)對時間(分鐘)的曲線顯示于下面的圖2和表2中。所有樣品的曲線都基本一樣，當然除了其適當具有巴氏消毒平臺的延伸(一個小時到4或24小時)。
表2

對來自兩次不同長度的不同的發(fā)酵的樣品(均為M.alpina)進行檢測。樣品號11至20。表3是一次略為長一點的發(fā)酵，其中有約兩升的培養(yǎng)液被轉(zhuǎn)移至一個接種體發(fā)酵罐，發(fā)酵延續(xù)了48小時，其中沒有任何額外的葡萄糖的加入。
巴氏消毒后對上述樣品進行加工，先是在大約1bar氮氣的壓力下進行過濾。得到的壓濾渣再被工藝用水(process water，大約為初始的培養(yǎng)液體積的0.6倍)漂洗。使用水果壓榨機在300至400bar的活塞壓力下完成脫水。接著加入500ml新鮮的己烷，使用Ultra-turrax儀來混合一分鐘。然后在環(huán)境溫度下進行大約一小時的萃取。過濾后，用250ml新鮮的己烷對得到的壓濾渣進行漂洗，得到的溶劑于60℃至70℃在真空下?lián)]發(fā)。然后充氮，再貯藏于-18℃。
表3中顯示了上述結(jié)果，包括第一次和第二次測量的過氧化值，以及這兩個數(shù)值的平均值，還有茴香胺值(AnV)。圖3和圖4(分別對應較短和較長的發(fā)酵)中還示出了POV和AnV的降低。
表3


從上述結(jié)果中看到，沒有巴氏消毒時，POV為5.6或5.7。40℃下的巴氏消毒降低了POV，但在該巴氏消毒溫度，需要相對較長的一段時間(例如24小時)來將POV降低至可接受的數(shù)值2.1。
更高的溫度則要成功得多。例如，在70℃僅進行1小時的巴氏消毒，就能得到2.2的POV，相比之下在40℃要24小時才能獲得2.1的POV。在更高的溫度上還獲得了甚至更好的數(shù)值，85℃進行1小時得到的POV僅為1.2。(上述數(shù)據(jù)只是較短發(fā)酵的，雖然從在較長的發(fā)酵中生長的細胞上也能獲得類似的結(jié)果)。
圖3和圖4以圖的形式展示了POV和AnV值是怎樣隨不同的巴氏消毒時間而變化的。同預計一樣，較長的巴氏消毒時間給出了較低的AnV和POV值。然而，更為重要的是，在巴氏消毒期間使用相對高的溫度。當巴氏消毒溫度(T消毒)增加至70℃時，就能發(fā)現(xiàn)AnV和POV有了顯著的降低，在85℃時還能發(fā)現(xiàn)甚至更低的數(shù)值。(以十字形、實心圓和星號表示的頂部三條線顯示了AnV，而以菱形、方形和三角形表示的較低的三條線則給出了POV)。
下表4顯示了九個不同的巴氏消毒方案(三個不同的平臺溫度以及持續(xù)三段不同的時間)的計算乘積tT(℃·分鐘)。該乘積能有效地代表(加熱階段之后、但早于冷卻階段的)平臺階段的(時間，t，分鐘對溫度，T，℃的)曲線圖下的面積。
表4

實施例3如前例，用真菌M.alpina進行生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵，然后用發(fā)酵培養(yǎng)液來進行更多的巴氏消毒試驗。將未經(jīng)過巴氏消毒的培養(yǎng)液(800升)轉(zhuǎn)移出來并貯藏于4℃。再將該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至一個700升的攪動容器中，并展開10種不同的巴氏消毒方案。
首先，于五種不同的(最高)溫度，即140℃、120℃、100℃、80℃和60℃，進行巴氏消毒，(在最高溫度)持續(xù)(平臺)時間為8秒。此外，還在140℃、120℃、100℃、80℃和60℃，進行于最高溫度持續(xù)(平臺)時間*為300秒的巴氏消毒。
將樣品(2升)取出并直接冷凍于-18℃。消毒后的樣品(200ml)被取出后冷凍，然后采用下述方案從樣品中回收得到粗制的花生四烯酸油。
在1bar的N2下過濾發(fā)酵培養(yǎng)液的樣品(1.7升)。用0.6倍體積的冷凝水漂洗壓濾渣，再在400kg/cm2下進行約5分鐘的壓榨。然后，將正己烷(500ml)加入到濕的壓濾渣中，使用Ultra Turrax儀在24,000rpm進行粉碎。在環(huán)境溫度(約21℃)下對油進行超過約110分鐘的萃取。使用GF/A Whatman過濾介質(zhì)對懸浮液進行真空過濾。再用250ml新的己烷來漂洗壓濾渣。己烷在溫度為大約60℃至70℃的水浴中揮發(fā)15分鐘。然后將得到的油轉(zhuǎn)移至氣密性的樣品杯中，充氮30秒，接著將其關(guān)好并在分析前貯藏于-18℃。
圖5、6和7提供了分析后的數(shù)據(jù)。圖6和7顯示了上述兩套實驗的時間對溫度曲線，分別為在五種溫度設置，一是平臺(持續(xù))時間為8秒，二是平臺(持續(xù))時間為5分鐘。如上述的圖所示，中間的水平線(代表8秒或5分鐘)顯示平臺階段。
圖5顯示了全部10種巴氏消毒體系下獲得的POV和AnV。如圖所示，隨著溫度逐漸變得更高，獲得的POV則更低；并且較長的持續(xù)時間(5分鐘)給出了最低的POV。
權(quán)利要求
1.一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，所述方法包括在不超過30分鐘內(nèi)在包括從40℃至70℃的溫度加熱細胞，或以大于0.5℃/分鐘的速率加熱細胞。
2.一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，所述方法包含三個階段，即(第一)加熱階段，(第二)平臺階段(其間細胞被維持于一個恒定的溫度)以及(第三)冷卻階段。
3.一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，所述方法包含使用一種巴氏消毒方案加熱細胞，從而使時間(分鐘)對溫度(℃)曲線圖下的面積小于13,000℃·分鐘。
4.一種對微生物細胞進行巴氏消毒的方法，所述方法包含加熱細胞，然后在平臺階段將細胞在提高的溫度(T，℃)下維持一段時間(t，分鐘)，其中的乘積tT為從140℃·分鐘至100,800℃·分鐘。
5.一種如權(quán)利要求2或4所述的方法，其中(a)所述平臺為最高溫度；(b)所述巴氏消毒方案在時間(t)對溫度(T)曲線圖上的形狀為梯形；(c)所述加熱和/或冷卻是線性的；和/或(d)所述細胞被加熱自低于40℃的溫度，和/或被加熱至高于70℃的溫度；和/或(e)所述細胞含有或產(chǎn)生PUFA或(可以含有PUFA的)微生物油。
6.一種如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中微生物細胞在不超過15分鐘內(nèi)被從40℃加熱至70℃，和/或以至少0.6℃/分鐘或1.0℃/分鐘的速率加熱細胞。
7.一種如前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中(a)以至少2℃/分鐘的速率加熱所述的微生物細胞；(b)所述巴氏消毒(或平臺)溫度從70℃至100℃，最適為從70℃至85℃；(c)所述細胞以至少-0.6℃/分鐘或-1.6℃/分鐘的速率被冷卻；和/或(d)所述時間(分鐘)對溫度(℃)曲線圖下的面積小于10,000℃·分鐘或8,000℃·分鐘。
8.一種從微生物細胞中獲得PUFA或微生物油的方法，所述方法包含按照前述任意一項權(quán)利要求所述，對細胞進行巴氏消毒，再從經(jīng)過了巴氏消毒的細胞中提取或分離出PUFA或微生物油。
9.一種微生物油，含有至少90％的甘油三酯，其過氧化值(POV)低于1.5(或1.0)，和/或其茴香胺值(AnV)低于15，可選地，低于12。
10.一種如權(quán)利要求9所述的油，其中(a)所述的PUFA包含C18、C20、C22Ω-3或Ω-6的脂肪酸；(b)所述的PUFA含量為至少40％；(c)所述的PUFA包含花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)；和/或(d)所述的油是粗制的或未經(jīng)過精煉的油。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改良的巴氏消毒方案，用以對微生物細胞進行巴氏消毒。所述方案具有三個階段，即第一加熱階段，第二平臺階段，其間細胞被保持于(最高且)恒定的溫度，以及第三冷卻階段。加熱和冷卻階段都是迅速的，加熱階段中，細胞的溫度在不超過30分鐘內(nèi)經(jīng)歷從40℃至80℃。加熱速率為至少0.5℃/分鐘，冷卻期間為至少－0.5℃/分鐘。平臺最高溫度為70℃至85℃。通過將巴氏消毒方案繪制成時間(t，分鐘)對溫度(T，℃)的曲線圖，能獲得一個面積小于13,000℃·分鐘的梯形。這不僅僅使得能量輸入更少(而且成本因此而降低)，而且還能得到過氧化值(POV)低于1.5且茴香胺值(AnV)低于1.0的質(zhì)量更好(和更少被氧化)的油。
文檔編號A61K8/67GK1662642SQ03814382
公開日2005年8月31日 申請日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月19日
發(fā)明者艾伯特·沙普, 迪尼埃爾·韋爾科埃爾騰 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司