專利名稱：包括cdk抑制劑和多柔比星的聯(lián)合的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及適用于癌癥和其它增殖性疾病治療的藥物聯(lián)合。
背景技術：
哺乳動物細胞周期的啟動、發(fā)展和結束受對細胞生長至關重要的各種細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)復合物調控。這些復合物包括至少一種催化(CDK自身)亞基和一種調節(jié)(細胞周期蛋白)亞基。用于細胞周期調控的一些比較重要的復合物包括細胞周期蛋白A(CDK1-還稱為cdc2，和CDK2)、細胞周期蛋白B1-B3(CDK1)、細胞周期蛋白C(CDK8)、細胞周期蛋白D1-D3(CDK2、CDK4、CDK5、CDK6)、細胞周期蛋白E(CDK2)、細胞周期蛋白K和T(CDK9)和細胞周期蛋白H(CDK7)。這些復合物中的每一種都在細胞周期的特定期中涉及到。
通過與其它蛋白的短暫聯(lián)合以及它們細胞內定位的變化，CDK的活性在翻譯后被調節(jié)。腫瘤發(fā)展與CDK及其調節(jié)蛋白的基因變化和反調節(jié)密切相關，表明CDK抑制劑可為有用的抗癌治療藥。事實上，早期結果表明，轉化細胞和正常細胞在對例如細胞周期蛋白A/CDK2的需求上不同，因而可開發(fā)沒有使用常規(guī)胞毒和細胞抑制劑時觀察到的常見宿主毒性的新型抗腫瘤藥。
CDK的功能是磷酸化并因此激活或失活特定的蛋白，包括例如成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白、核纖層蛋白、組蛋白H1和有絲分裂紡錘體的成分。由CDK介導的催化步驟涉及從ATP到大分子酶底物的磷酸基轉移反應。已發(fā)現(xiàn)幾類化合物(N.Gray，L.Détivaud，C.Doerig，L.Meijer，Curr.Med.Chem.1999，6，859)由于CDK特異性ATP拮抗作用而具有抗增殖活性。
Roscovitine為化合物6-芐氨基-2-[(R)-1-乙基-2-羥乙基氨基]-9-異丙基嘌呤。已證實Roscovitine為有效的細胞周期蛋白依賴性激酶尤其是CDK2的抑制劑。目前這種化合物正發(fā)展作為抗癌藥。CDK抑制劑被認為阻斷了來自細胞周期G1/S和G2/M期的細胞途徑。還表明Roscovitine為成視網(wǎng)膜細胞瘤磷酸化的抑制劑，并因此被暗示對Rb陽性腫瘤更有效。
在本領域中已很好地證實，為了使治療方案最佳經常聯(lián)合提供活性藥劑。因此本發(fā)明設法提供一種已知藥劑的新型聯(lián)合，該聯(lián)合特別適用于增殖性疾病尤其是癌癥的治療。更具體地說，本發(fā)明集中于令人驚奇和預料不到的與聯(lián)合使用某些藥劑相關的效果。
發(fā)明簡述第一方面，本發(fā)明提供一種包括CDK抑制劑和多柔比星(Doxorubicin)的聯(lián)合。
第二方面提供一種包括根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合并與藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑混合的藥物組合物。
第三方面涉及根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合在制備用于治療增殖性疾病的藥物中的應用。
第四方面涉及包括CDK抑制劑和多柔比星的藥物制品，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯(lián)合制劑。
第五方面涉及治療增殖性疾病的方法，所述方法包括同時、依次或分別地為患者給藥CDK抑制劑和多柔比星。
第六方面涉及CDK抑制劑在制備用于增殖性疾病治療的藥物中的應用，其中所述治療包括同時、依次或分別地為患者給藥CDK抑制劑和多柔比星。
第七方面涉及CDK抑制劑和多柔比星在制備用于治療增殖性疾病的藥物中的應用。
第八方面涉及CDK抑制劑在制備用于增殖性疾病治療的藥物中的應用，其中所述藥物用于在與多柔比星聯(lián)合治療中使用。
第九方面涉及多柔比星在制備用于增殖性疾病治療的藥物中的應用，其中所述藥物用于在與CDK抑制劑聯(lián)合治療中使用。
發(fā)明詳述下文中闡述的優(yōu)選實施方式適用于本發(fā)明的所有上述方面。
如上所述，本發(fā)明涉及包括CDK抑制劑和多柔比星的聯(lián)合。優(yōu)選地，聯(lián)合為協(xié)同聯(lián)合。
多柔比星為化合物(8S-順)-8-乙?；?10-[(3-氨基-2，3，6-三去氧-α-L-來蘇-吡喃己糖基)氧]7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-1-甲氧基-5，12-萘二酮，是一種蒽環(huán)類抗生素。在1939年首先從微生物中分離出蒽環(huán)類抗生素，并在20世紀50年代研究了它們的抗生素性能。這些抗生素能相當容易地殺死細菌，但毒性太大以至于不能用于治療人類感染。直到20世紀60年代才試驗蒽環(huán)類抗生素的抗腫瘤性能，并發(fā)現(xiàn)具有抵抗癌細胞的活性。
蒽環(huán)類藥物全部結合到DNA上，它們的細胞毒性很大程度上由這種結合引起。更具體地說，它們結合到雙鏈DNA上。在用蒽環(huán)類藥物處理的人類染色體制備物中，觀察到結合藥物為清晰的橙紅色熒光帶。這種與DNA的相互作用通過嵌入進行，并已通過數(shù)種方法證實。如果修飾蒽環(huán)類藥物的結構以改變與DNA的結合，則抗腫瘤活性通常會降低或喪失。因此，DNA結合看來對這些藥物的抗癌活性至關重要。但是，導致細胞毒性的途徑還未被清楚地闡明。并不認為DNA和RNA合成的抑制對細胞毒性至關重要，因為其只在高的藥物濃度下發(fā)生。
蒽環(huán)類藥物具有許多重要作用，其中的任何一種或全部都對這些藥物的胞毒作用有影響。首先，它們可嵌入DNA，從而影響DNA的許多功能，包括DNA和RNA合成。還會發(fā)生DNA鏈的斷裂。這被認為通過酶DNA拓撲異構酶II或通過自由基形成來介導。酶拓撲異構酶II的抑制，例如，可引起導致DNA中雙鏈斷裂的一系列反應。
暫時的雙鏈斷裂由拓撲異構酶II在其正常催化周期過程中通過形成可分裂復合體來誘導。導致永久雙鏈斷裂的這種復合體的破裂很少在沒有藥物時發(fā)生。拓撲異構酶II的抑制劑能促使這種可分裂復合體持續(xù)，從而增加了可分裂復合體被轉化到不可逆雙鏈斷裂的可能性。
蒽環(huán)類藥物還能導致活性氧物類的形成，并接著主要導致單鏈斷裂。蒽環(huán)類藥物發(fā)色團含有羥基醌，其具有明確的鐵螯合結構。藥物-Fe-DNA復合體催化電子從谷胱甘肽到氧的轉移，從而導致活性氧物類的形成。
本發(fā)明的另一方面涉及包括CDK抑制劑和蒽環(huán)類藥物的聯(lián)合。
又一方面涉及包括CDK抑制劑和蒽環(huán)類藥物的藥物制品。
如上所述，本發(fā)明的一個方面涉及包括CDK抑制劑和多柔比星的藥物制品，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯(lián)合制劑。
可同時、聯(lián)合、依次或分別(作為給藥方案的一部分)給藥CDK抑制劑和多柔比星。
本文中使用的“同時”是指同時地給藥兩種藥劑，而術語“聯(lián)合”是指在時限內如果不能同時則“依次”地給藥以使它們能在同一時限內起治療作用。因此，“依次”給藥可允許在一種藥劑后5分鐘、10分鐘或大約幾小時后給藥另一種藥劑，只要第一種給藥藥劑的循環(huán)半衰期能使二者同時以治療有效量存在即可。兩成分給藥間的延時依成分的確切性質、它們之間的相互作用和它們各自的半衰期而改變。
與“聯(lián)合”或“依次”相比，本文使用的“分別”是指給藥一種藥劑和另一種藥劑之間的間隔是明顯的，即當給藥第二種藥劑時，在血流中可不再存在治療有效量的第一種給藥藥劑。
優(yōu)選地，同時或依次給藥CDK抑制劑和多柔比星。
本發(fā)明的一個方面涉及CDK抑制劑在制備用于治療增殖性疾病的藥物中的應用，其中所述治療包括為患者同時、依次或分別地給藥多柔比星和CDK抑制劑。
在一種特別優(yōu)選的實施方式中，在為患者依次或分別地給藥多柔比星前為所述患者給藥CDK抑制劑。
在替代優(yōu)選實施方式中，在為患者依次或分開地給藥CDK抑制劑前為所述患者給藥多柔比星。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，對于單獨成分，分別給藥治療有效量的CDK抑制劑和多柔比星。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式中，對于單獨成分，分別給藥亞治療量的CDK抑制劑和多柔比星。
本發(fā)明的另一方面涉及CDK抑制劑和多柔比星在制備用于治療增殖性疾病的藥物中的應用。
本發(fā)明的又一方面涉及CDK抑制劑在制備用于增殖性疾病治療的藥物中的應用，其中所述藥物用于與多柔比星在聯(lián)合治療中使用。
本發(fā)明的還一方面涉及多柔比星在制備用于增殖性疾病治療的藥物中的應用，其中所述藥物用于與CDK抑制劑在聯(lián)合治療中使用。
本文中使用的術語“聯(lián)合治療”是指在時限內如果不能同時則依次給藥多柔比星和CDK抑制劑以便在同一時限內它們均可起治療作用的治療。
本文使用的術語“藥物制備”包括本發(fā)明的成分除了用于這類藥物制備的任意階段外還有直接作為藥物的應用。
本文使用的術語“增殖性疾病”廣義上包括需要控制細胞周期的任何疾病，例如心血管疾病如心瓣手術后再狹窄和心肌病、自動免疫疾病如腎小球腎炎和類風濕性關節(jié)炎、皮膚疾病如牛皮癬、抗炎癥、抗真菌、抗寄生物的疾病如瘧疾、氣腫和脫發(fā)。在這些疾病中，本發(fā)明的成分可根據(jù)需要誘導目標細胞內的細胞凋亡或保持停滯。
優(yōu)選地，增殖性疾病為癌癥或白血病，最優(yōu)選癌癥。
在一種特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及本文所述的聯(lián)合在CDK依賴性或敏感性疾病治療中的應用。CDK依賴性疾病與超過一種或多種CDK酶的活性正常水平有關。這種疾病優(yōu)選與CDK2和/或CDK4的異常活性水平有關。CDK敏感性疾病為這樣一種疾病，其中CDK水平的異常不是主因，而是在主要新陳代謝異常的后階段。在這種情況下，CDK2和/或CDK4可被認為是敏感性新陳代謝途徑的一部分，因此CDK抑制劑可有效地治療這種疾病。這種疾病優(yōu)選為癌癥或白血病。
優(yōu)選地，CDK抑制劑為CDK2和/或CDK4的抑制劑。更優(yōu)選地，CDK抑制劑選自WO97/20842、WO98/05335(CV Therapeutics)、WO99/07705(Regents of the University of California)中描述的roscovitine、purvalanol A、purvalanol B、奧羅莫星和其它2，6，9-三取代嘌呤。
甚至更優(yōu)選地，CDK抑制劑選自roscovitine和purvalanol A。
在一種特別優(yōu)選的實施方式中，CDK抑制劑為roscovitine。
roscovitine為化合物2-[(1-乙基-2-羥乙基)氨基]-6-芐氨基-9-異丙基嘌呤，還描述為2-(1-D，L-羥甲基丙基氨基)-6-芐氨基-9-異丙基嘌呤。本文中使用的術語“roscovitine”包括拆分的R和S對映異構體、它們的混合物和它們的外消旋物。
甚至更優(yōu)選地，聯(lián)合具有協(xié)同效應，即聯(lián)合是協(xié)同性的。
藥物聯(lián)合的效果本質上不可預知，并經常存在一種藥物部分或完全地抑制其它藥物作用的傾向。本發(fā)明基于以下令人驚奇的觀察，即聯(lián)合(同時、分別或依次)給藥多柔比星和roscovitine不會導致兩種藥劑間任何的不利相互作用。如此意外地不產生任何所述相互拮抗作用對臨床應用至關重要。
為了使治療方案最佳而聯(lián)合提供多種抗癌藥劑。例如，經常作為雞尾酒或化療藥劑給藥方案的一部分給藥多柔比星，參見例如http//www.indiacancer.org/prof/acd11.html上的化療聯(lián)合療法數(shù)據(jù)庫。在乳腺癌治療中多柔比星已被建議在多西他奇(docetaxal)、多柔比星和環(huán)磷酰胺的連續(xù)療法中使用(Journal of Clinical Oncology，第19卷，第14期，3367-3375頁，2001)。但是，直到目前還沒有聯(lián)合給藥多柔比星和roscovitine的任何建議。
在一種優(yōu)選實施方式中，多柔比星和roscovitine的聯(lián)合與單獨給藥的任一種藥物相比產生了增強的效果。這種令人驚奇的特性與根據(jù)現(xiàn)有技術預料的大不相同。
癌癥治療領域的那些技術人員已很好地認識到，不僅可按它們的位置(乳房、肺、腎等)和性質(小細胞、實體、軟性等)將癌癥分類，而且可根據(jù)與特定腫瘤相關的基因型在生物化學上分類?？紤]各式各樣的癌癥，在顯示出p53突變的不同癌癥內存在亞群體。例如在特定癌癥內，在乳癌內，基于基因型特征的亞型將為顯示出brca 1或brca 2突變的那些。隨著我們對不同癌癥的基因型基礎認識的提高，希望能開發(fā)更特異性的治療或治療方案。
在這點上，在本發(fā)明一種尤其優(yōu)選的實施方式中，增殖性疾病為Rb缺失的增殖性疾病。試驗出人意料地顯示，在為Rb缺失的癌細胞系給藥時，與單獨給藥任何一種藥物相比，多柔比星和roscovitine的聯(lián)合產生了最大作用。該觀察的令人驚奇性質與預料的相反，尤其從所述的roscovitine抑制Rb磷酸化的活性來看。
因此，本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式涉及治療Rb缺失的增殖性疾病的方法，包括給藥治療有效量的CDK抑制劑和治療有效量的多柔比星。
另外，本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式涉及CDK抑制劑在生產用于治療Rb缺失的增殖性疾病的藥物中的應用，其中治療包括給藥治療有效量的CDK抑制劑和治療有效量的多柔比星。
作為定義，本文使用的術語“Rb缺失的”是指不同于野生型Rb基因的基因型。因此，Rb基因型可能是突變型的或缺失(deleted)的，或野生型Rb基因雜合存在。對于野生型Rb基因的參考在Lee等人(Lee W.H，Booksten，R，Hong，F(xiàn)D，Toung，LJ，Shew JY，Lee，EY-HP，1987Human retinoblastomasusceptibility genecloning，identification and sequence.等Science 2351394-1399)中給出。
成視網(wǎng)膜細胞瘤(Restinoblastoma)蛋白通過在遺傳眼腫瘤菌髓(context)中最初識別的基因表達(Nevins JR，Human Molecular Genetics 2001，10，699-703)。在它的磷酸化形式中，已觀察到涉及到轉錄因子如E2F的控制。目前，已在一系列人類癌癥中觀察到Rb功能的喪失(Hunter T，Cell(1997)88，333-346，Sherr CJ，(1996)Science 274，1672-1677和Weinberg RA(1995)Cell81，537-548)。因此，在不同類型的癌癥亞群體內，已觀察到在Rb基因中表現(xiàn)出突變，下文中稱為Rb缺失的癌癥。
Li等人的最近報道(Cancer Research，卷61，第6期，2579-82頁，2001)顯示，當與CDK抑制劑flavopiridol聯(lián)合治療時，pRb缺失的骨肉瘤系SaOS-2顯著地對多柔比星的胞毒效應敏感。這種效應只在pRb缺失的細胞中看到，因為用Rb轉染的SaOS-2細胞對于同樣的藥物聯(lián)合未表現(xiàn)出這種增強的敏感度。細胞周期分析表明，flavopiridol在Rb恢復的細胞中的S期降低了多柔比星誘導的細胞累積，而不是在Rb缺失的細胞中。在SaOS-2 Rb缺失的細胞中看到因flavopiridol的p21waf-l增加和伴隨的細胞周期蛋白依賴性激酶2激酶活性的降低，而不是在Rb恢復的細胞中。還報道了脂肪肉瘤細胞系的PRb缺失(Li等人，1994 Br J Cancer 69，1052-1058)。
如上所述，已觀察到CDK抑制劑優(yōu)選roscovitine聯(lián)合多柔比星的使用在Rb缺失的癌癥中特別有效。下面給出綜合但非詳盡的癌癥列表?？赏ㄟ^簡單的基因型分析識別以Rb缺失的方式表現(xiàn)出特定癌癥的患者。通過免疫組化的Rb表達降低或增加分析描述在·Xing EP，Guang-Yu，Y，Wang L-D，Shi，ST和Yang CS(1999)Loss ofheterozygosity of the Rb gene correlates wit pRb protein expression andassociates with p53 alteration in hu8man esophageal cancer.Clinical CancerResearch 51231-1240·Geradts，J，F(xiàn)ong，KM，Zimmerman，PV，Maynard，R和Minna，JD(1999)Correlation of abnormal RB，p16ink4a，and p53 expression with 3p loss ofheterozygosity，other genetic abnormalities and clinical features in 103 primarynon-small cell lung cancers因此，本發(fā)明的聯(lián)合尤其在Rb缺失的惡性和腫瘤前疾病的治療中有效。本發(fā)明尤其用于涉及Rb缺失的腺癌治療，如小細胞肺癌、腎癌、子宮癌、前列腺(prostrate)癌、膀胱癌、卵巢癌、結腸癌和乳腺癌。例如，根據(jù)本發(fā)明可治療的惡性腫瘤包括Rb缺失的急性和慢性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，Rb缺失的肉瘤如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管內皮細胞肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、血管肉瘤、內皮肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤，和當Rb缺失的基因型存在時的下列癌癥結腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、鱗狀上皮細胞癌、基細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、囊腺癌、脊髓癌、支氣管癌、絨膜癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌精原細胞瘤、胚胎癌、子宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽覺神經瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、寡枝神經膠質細胞瘤、menangioma、黑素瘤、中性胚細胞瘤和成視網(wǎng)膜細胞瘤。
藥物組合物盡管可單獨給藥本發(fā)明的成分(包括它們的藥物可接受鹽、酯和藥物可接受溶劑化物)，但對于人類治療，通常與藥物載體、賦形劑或稀釋劑混合給藥。
因此，本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式涉及包括CDK抑制劑和多柔比星并與藥物可接受賦形劑、稀釋劑或載體混合的藥物組合物。
可在由Wade和PJ Weller編輯的“Handbook of Pharmaceutical Excipients”第二版(1994)中找到用于本文所述各種不同形式藥物組合物的這類合適賦形劑的例子。
在藥物領域，用于治療用途的可接受載體或稀釋劑是眾所周知的，并在例如Remington的Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co(A.R.Gennaroedit.1985)中有描述。合適的載體的例子包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露醇、山梨糖醇等。合適的稀釋劑的例子包括乙醇、甘油和水。
藥物載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可根據(jù)預定給藥途徑和標準藥物實踐來選擇。藥物組合物可包括作為或除載體、賦形劑或稀釋劑之外的任何粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑。
合適的粘合劑的例子包括淀粉、明膠、天然糖如葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β乳糖、玉米甜味劑、天然和合成橡膠、如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉、羧甲基纖維素和聚乙二醇。
合適的潤滑劑的例子包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等。
在藥物組合物中可提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至增香劑。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸的酯。還可使用抗氧化劑和懸浮劑。
鹽/酯本發(fā)明的藥劑可以鹽或酯尤其是藥物可接受的鹽或酯的形式提供。
本發(fā)明藥劑的藥物可接受鹽包括它們合適的酸加成鹽或堿性鹽?？稍贐erge等人的J.Pharm Sci，66，1-19(1977)中找到合適藥物鹽的綜述。用例如以下酸形成鹽強無機酸，如礦物酸，例如硫酸、磷酸或氫鹵酸；強有機羧酸，如未取代或取代(如被鹵素)的1至4個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或與有機磺酸，如未取代或取代(如被鹵素)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或對甲苯磺酸。
使用有機酸或醇/氫氧化物形成酯，取決于被酯化的官能團。有機酸包括羧酸，如未取代或取代(如被鹵素)的1至12個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或與有機磺酸，如未取代或取代(如被鹵素)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或對甲苯磺酸。合適的氫氧化物包括無機氫氧化物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁。醇包括未取代或取代(如被鹵素)的1至12個碳原子的鏈烷醇。
對映異構體/互變異構體本發(fā)明還適當包括藥劑的全部對映異構體和互變異構體。本領域的技術人員能認識到具有光學性質(一個或多個手性碳原子)或互變異構特征的化合物?？赏ㄟ^本領域中已知的方法分離/制備相應的對映異構體和/或互變異構體。
立體異構體和幾何異構體本發(fā)明的一些藥劑可以立體異構體和/或幾何異構體的形式存在，例如它們可具有一個或多個不對稱和/或幾何中心并因此可以二種或多種立體異構和/或幾何形式存在。本發(fā)明包括藥劑所有的單獨立體異構體和幾何異構體及它們的混合物的使用。權利要求中使用的術語包括這些形式，只要所述形式保留適當?shù)墓倌芑钚约纯?但不必到相同程度)。
本發(fā)明還包括藥劑的所有合適的同位素變體或其藥物可接受鹽。本發(fā)明藥劑的同位素變體或其藥物可接受鹽定義為至少一個原子被具有相同原子序數(shù)但原子質量與自然界中通常發(fā)現(xiàn)的原子質量不同的原子取代的物質?？杀唤Y合到藥劑和其藥物可接受鹽的同位素的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分別如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。藥劑和其藥物可接受鹽的某些同位素變體，例如結合放射形同位素如3H或14C的那些，在藥物和/或底物組織分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制備和可檢測性而特別優(yōu)選。此外，用同位素如氘即2H的取代可因較大的新陳代謝穩(wěn)定性而提供特定的治療益處，例如體內半衰期增加或劑量要求降低，并因此可在一些情況下被優(yōu)選。通?？墒褂煤线m試劑的適當同位素變體通過常規(guī)過程制備本發(fā)明藥劑的同位素變體和其藥物可接受鹽。
溶劑化物本發(fā)明還包括本發(fā)明藥劑的溶劑化物形式。權利要求中使用的術語包括這些形式。
多晶型物本發(fā)明還涉及各種結晶形式、多晶型形式和無水/水合形式的本發(fā)明的藥劑。在藥物工業(yè)中已很好地完善了通過稍微改變這種化合物合成制備中所用溶劑的純化方法和或分離形式來分離化合物的任意這類形式。
前體藥物本發(fā)明還包括前體藥物形式的本發(fā)明的藥劑。這種前體藥物通常為一個或多個適當基團已被修飾的化合物，并且，在向人或哺乳動物患者給藥時，修飾可被逆轉。通常通過在這類患者中天然存在的酶實現(xiàn)這種逆轉，但也可與這種前體藥物一起給藥第二種藥劑以實現(xiàn)體內逆轉。這類修飾的例子包括酯(例如上述那些中的任一種)，其中可通過酯酶等進行逆轉。其它這類系統(tǒng)為本領域中那些技術人員所熟知。
化學衍生物本發(fā)明還涉及包括藥劑衍生物的聯(lián)合。本文中使用的術語“衍生物”包括藥劑的化學修飾。例如這類化學修飾可為氫被鹵基、烷基、?；虬被〈?。
給藥可使本發(fā)明的藥物組合物適合于口服、直腸、陰道、腸胃外、肌內、腹膜內、動脈內、鞘內、支氣管內、皮下、皮內、靜脈內、鼻、口腔或舌下給藥途徑。
對于口服給藥，特別利用壓片、藥丸、片劑、凝膠(gellules)、滴劑和膠囊。優(yōu)選地，這些組合物每劑包含1-2000mg和更優(yōu)選50-1000mg的有效成分。
其它給藥形式包括溶液或乳液，它們可靜脈內、動脈內、鞘內、皮下、皮內、腹膜內或肌內注射，并由無菌或可消毒溶液制備。本發(fā)明的藥物組合物還可為栓劑、陰道栓劑、混懸劑、乳液、洗液、軟膏、乳膏劑、凝膠、噴霧劑、溶液或撒布粉的形式。
經皮給藥的其他方式是利用皮膚貼片。例如，可將有效成分結合到由聚乙二醇含水乳液或液體石蠟組成的乳膏劑內。還可以1-10wt％的濃度將有效成分結合到軟膏內，該軟膏由白蠟或白色軟石蠟基礎成分與可能需要的穩(wěn)定劑和防腐劑共同組成。
可注射形式每劑量可包含10-1000mg、優(yōu)選10-500mg的有效成分。
組合物可被配制成單元劑型，即包含單元劑量的離散部分或單元劑量的多重單位或亞單位的形式。
在一種特別優(yōu)選的實施方式中，靜脈內給藥本發(fā)明的聯(lián)合或藥物組合物。
劑量本領域的普通技術人員不用額外試驗就可容易地確定一種速溶組合物的適宜劑量以為患者給藥。典型地，醫(yī)師會確定對個體患者最適合的實際劑量，并且其取決于各種因素，包括使用的具體藥劑的活性、藥劑的新陳代謝穩(wěn)定性和作用長短、年齡、體重、平常健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時間、排泄速度、藥物聯(lián)合、特定病癥的嚴重程度和個別正進行的治療。本文公開的劑量為典型的一般情況。當然也可有較高或較低劑量范圍有益的個別情況，這都在本發(fā)明的范圍內。
根據(jù)需要，可以0.1-30mg/kg體重或2-20mg/kg體重的劑量給藥藥劑。更優(yōu)選地，以0.1-1mg/kg體重的劑量給藥藥劑。
如上所述，優(yōu)選以藥學可接受量的形式給藥治療有效量的每種有效成分即CDK抑制劑和多柔比星。本領域那些技術人員熟悉這些用量。利用手冊，典型地靜脈內或口服給藥多柔比星，最典型地靜脈內給藥。對于單一藥劑，靜脈內劑量典型地為60mg/m2，每21天1次，在聯(lián)合治療中劑量在20-30mg/m2范圍內，每21或28天再有1次。其它合適的給藥方案可包括250mg或500mg多柔比星，并根據(jù)醫(yī)師指導以依據(jù)患者體重的總劑量靜脈內給藥，例如每周口服15mg/kg，最大劑量1g/天，或4小時內靜脈內12mg/kg，或每天24小時內24-49mg/kg連續(xù)5天。典型地使施用的劑量和頻率適合于患者平常的體格狀況和引起的副作用的嚴重程度，尤其是引起造血、肝和腎系統(tǒng)的那些。
多柔比星可在幾種劑型中存在；用于再組成的粉劑、在溶液中、和在包裹在脂質體內的脂質制劑中。熟練的醫(yī)師能確定對具體患者和癌癥類型最適合的劑量和劑型。
典型地以約0.05-約5g/天、優(yōu)選約0.5-約5g/天或1-約5g/天、甚至更優(yōu)選約1-約3g/天的劑量口服或靜脈內給藥roscovitine?；蛘?，優(yōu)選以約0.4-約3g/天的劑量給藥roscovitine。優(yōu)選以片劑或膠囊的形式口服給藥roscovitine。roscovitine的總日劑量可作為單次劑量給藥，或分成每天給藥2、3或4次的分散劑量。
通過實施例并結合以下圖進一步描述本發(fā)明，其中

圖1顯示了使用中值效果分析HTB88，多柔比星和roscovitine聯(lián)合處理的效應。使用CalcuSyn程序得到數(shù)據(jù)。聯(lián)合指數(shù)(CI)＜1.0表明有協(xié)同作用。
圖2顯示了使用中值效果分析HTB114，多柔比星和roscovitine聯(lián)合處理的效應。使用CalcuSyn程序得到數(shù)據(jù)。聯(lián)合指數(shù)(CI)＜1.0表明有協(xié)同作用。
圖3顯示了在POMC-Cre/POMC-Luc；Rb-flox(flox)/flox復合突變型小鼠中的腫瘤發(fā)展。頂部12、14和16周后的腫瘤發(fā)展；中部生物體發(fā)光(BLU)對時間，對于八種不同的小鼠；底部BLU對腫瘤重量(mg)。
圖4顯示了在POMC-Cre/POMC-Luc；Rb-flox/flox復合突變型小鼠中對用多柔比星處理(4×5mg/kg；靜脈內)的腫瘤應答。
圖5顯示了藥物給藥時間表，其中每周給藥多柔比星一次，連續(xù)四周(5mg/kg；靜脈內)，并在每次多柔比星給藥前，每日口服給藥roscovitine兩次，連續(xù)兩天(500mg/kg)。
圖6顯示了未處理小鼠相對于第1天的生物體發(fā)光上的倍差(folddifference)。
圖7顯示了未處理小鼠和單獨用多柔比星或roscivitine處理的小鼠相對于第1天的生物體發(fā)光上的倍差。
圖8顯示了未處理小鼠、單獨用多柔比星或roscivitine處理的小鼠和用多柔比星/roscovitine聯(lián)合處理的小鼠相對于第1天的生物體發(fā)光上的倍差。
圖9顯示了單獨用多柔比星處理的小鼠和用多柔比星/roscovitine聯(lián)合處理的小鼠相對于第1天的生物體發(fā)光上的倍差。
圖10顯示了細胞周期蛋白A的Western免疫印跡分析；A對照(48小時)；B10μM roscovitine；C20μM roscovitine；D5nM多柔比星；E10nM多柔比星；Froscovitine/多柔比星。
實施例材料多柔比星和組織培養(yǎng)試劑由Sigma Aldrich提供。Roscovitine由CyclacelLtd.(Dundee UK)提供。CalcuSyn程序從Cambridge Biosoft(2001/2002)得到。HTB-88SK-LMS-1細胞系從ATCC得到；人類外陰原發(fā)平滑肌肉瘤，p53突變體(Patterson等人(1994)Br J Cancer 691052-1058)、pRb野生型、p16缺失。HTB-114SK-UT-1從ATCC得到；人類子宮等級III平滑肌肉瘤，p53突變體(Patterson等人(1994)supra.)，pRb缺失，p16野生型。
細胞毒性方法將細胞以3×104個細胞/ml的密度接種到200μl等分試樣中的96孔板中。培養(yǎng)液為最低基本的培養(yǎng)液，并加入非必需氨基酸和丙酮酸鈉和10％FCS(Life Technologies/Invitrogen)。在充氣的增濕培育箱中放置細胞24小時以平衡。
在無菌水中配制多柔比星的藥物原料，在DMSO中配制Roscovitine的藥物原料，并在使用前在-20℃下貯存。在組織培養(yǎng)液(包含10％FCS)中稀釋藥物得到所需的終濃度。在50μl等分試樣中加入單獨或作為聯(lián)合(即Roscovitine+多柔比星)的藥物。以10nM到320nM的逐步劑量單獨給藥多柔比星(DOX)。以1.25μM到40μM的逐步劑量單獨給藥單一的Roscovitine。
在上述逐步稀釋系列即以10nM DOX1.25μM Roscovitine開始到320nMDOX40μM Roscovitine期間，以DOXRoscovitine彼此的固定比1∶0.125使用聯(lián)合的藥物。
使用MTT方法(根據(jù)Twentyman和Luscombe 1987，Br J Cancer 56279-285)分別估算HTB114和HTB88在72小時和96小時后的細胞存活力。
根據(jù)基于中值效果分析方法的CacuSyn程序估算聯(lián)合指數(shù)(CI)。
結果提供由CacuSyn程序計算的聯(lián)合指數(shù)(CI)的結果示于圖1和2。當顯示CI指數(shù)＜1時表明協(xié)同效應。在HTB-88上觀察到輕微的協(xié)同效應，其與pRb磷酸化的降低有關系。在HTB-114(Rb缺失)上觀察到顯著的協(xié)同效應。
體內研究在垂體腫瘤發(fā)光小鼠模型中研究Roscovitine和多柔比星的效應。產生成視網(wǎng)膜細胞瘤依賴性散發(fā)癌癥的條件小鼠模型(Vooijs等人；Cancer Res 2002Mar 15；62(6)1862-7；2002)，其能通過體內熒光素酶表達的生物體發(fā)光成象而允許非侵入監(jiān)測活的動物內垂體腫瘤發(fā)展。這種小鼠模型允許縱向監(jiān)測腫瘤發(fā)生、發(fā)展和對特異性地以成視網(wǎng)膜細胞瘤途徑為靶向的治療藥的應答。總之，使成視網(wǎng)膜細胞瘤條件KO系與POMC-Cre/POMC-熒光素酶轉基因系雜交以產生POMC-Cre/POMC-Luc；Rb-flox/flox復合突變型小鼠。這些小鼠發(fā)育POMC(Rb缺失)腫瘤(Vooijs等人，同前)，如圖3所示。用多柔比星的處理(4×5mg/kg；靜脈內)顯示出能延遲腫瘤發(fā)生。多柔比星是S期特異性的并暫時使腫瘤發(fā)展停止(參見圖4)。
一旦建立了對多柔比星的原始基本應答，就使用模型研究使用Roscovitine和多柔比星聯(lián)合治療的效應。在這項研究中，每周給藥多柔比星一次，連續(xù)四周(5mg/kg；靜脈內)。在每次多柔比星給藥前，按照圖5所示時間表每日口服給藥Roscovitine兩次，連續(xù)兩天(500mg/kg)。
相對于第1天的生物體發(fā)光的倍差示于圖6(未處理的小鼠)、圖7(未處理的、多柔比星和Roscovitine(“CDK”)處理的小鼠)、圖8(未處理的、多柔比星、Roscovitine、和多柔比星/Roscovitine處理的小鼠)和圖9(多柔比星和多柔比星/Roscovitine處理的小鼠)。Kruskal-Wallis檢驗(P＜0.01)顯示四種末期處理組(圖8)的平均斜率是不等的。此外，Mann-Whitney檢驗(P＜0.009)確定在多柔比星處理的組和多柔比星/Roscovitine處理的組之間存在明顯差異(圖9)。
總之，結果表明，多柔比星能暫時使腫瘤發(fā)展停止，而且預給藥Roscovitine能加強這種多柔比星作用，從而導致暫時的腫瘤退化。這是第一次在體內證實多柔比星和Roscovitine之間的協(xié)同效應。
Western免疫印跡分析使用NOVEX電泳系統(tǒng)利用SDA-PAGE凝膠(10、12或4-12％)和MES或MOPS緩沖進行蛋白質水平的檢測。由適當處理的細胞制備全部細胞的溶菌產物，該處理細胞在TRIS緩沖液中用SDS和蛋白酶抑制劑收獲并制備。在每個道內裝載等量的蛋白質。
結果24小時時，對于Roscovitine，觀察到細胞周期蛋白A的劑量依賴性降低，與單獨多柔比星相比，對于聯(lián)合，在SK-UT-1細胞中觀察到水平的降低(圖10)。在48小時時觀察到類似的結果。
細胞周期分析流式細胞儀用于DNA細胞周期分析通過離心收獲藥物處理的細胞，并在PBS中洗滌，然后在70％乙醇/PBS中固定。用PI染色細胞，并在用適當選通(gating)的FL3進行流式細胞法分析前用核糖核酸酶處理。
結果占整個的％(48小時處理)樣品G0 G1 S G2M對照10 64 10 15Roscovitine 23 36 16 19多柔比星22 9 18 43多柔比星+Roscovitine26 36 7 21結果表明，Roscovitine與多柔比星相加導致單獨用多柔比星時看到的G2M峰值的大幅度降低，從而推進細胞到G1。細胞周期分析顯示了在SK-UT-1細胞中由Roscovitine加入引起的多柔比星誘導的G2M阻斷的顯著降低。
在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明的各種改變和變化對本領域的那些技術人員來說是顯而易見的。盡管已結合具體的優(yōu)選實施方式描述了本發(fā)明，但應該認識到要求的本發(fā)明不過分限制于這種具體實施方式
。事實上，對相關領域那些技術人員明顯的用于實施本發(fā)明上述方式的各種改變都意在被本發(fā)明覆蓋。
權利要求
1.一種聯(lián)合，包括CDK抑制劑和多柔比星。
2.根據(jù)權利要求1所述的聯(lián)合，其中CDK抑制劑為CDK2或CDK4的抑制劑。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的聯(lián)合，其中CDK抑制劑選自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奧羅莫星。
4.根據(jù)任一前述權利要求所述的聯(lián)合，其中CDK抑制劑為roscovitine。
5.一種藥物組合物，包括根據(jù)任一前述權利要求所述的聯(lián)合和藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
6.根據(jù)權利要求1至4中任意一項所述的聯(lián)合在制備用于增殖性疾病治療的藥物中的應用。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其中增殖性疾病為Rb缺失的增殖性疾病。
8.根據(jù)權利要求6所述的應用，其中增殖性疾病為CDK依賴性或CDK敏感性疾病。
9.一種藥物制品，包括CDK抑制劑和多柔比星，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯(lián)合制劑。
10.根據(jù)權利要求9所述的藥物制品，其中CDK抑制劑為CDK2或CDK4的抑制劑。
11.根據(jù)權利要求9或10所述的藥物制品，其中CDK抑制劑選自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奧羅莫星。
12.根據(jù)權利要求9至11中任意一項所述的藥物制品，其中CDK抑制劑為roscovitine。
13.根據(jù)權利要求9至12中任意一項所述的藥物制品，以包括藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物的形式存在。
14.根據(jù)權利要求9至13中任意一項所述的藥物制品，用于治療增殖性疾病。
15.根據(jù)權利要求14所述的藥物制品，其中增殖性疾病為Rb缺失的疾病。
16.根據(jù)權利要求14所述的藥物制品，其中增殖性疾病為癌癥。
17.一種治療增殖性疾病的方法，所述方法包括同時、依次或分別地為患者給藥多柔比星和CDK抑制劑。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，包括在為患者依次或分別地給藥多柔比星前為所述患者給藥所述CDK抑制劑。
19.根據(jù)權利要求17所述的方法，包括在為患者依次或分別地給藥CDK抑制劑前為所述患者給藥多柔比星。
20.根據(jù)權利要求17至19中任意一項所述的方法，其中CDK抑制劑為CDK2或CDK4的抑制劑。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中CDK抑制劑選自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奧羅莫星。
22.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中CDK抑制劑為roscovitine。
23.根據(jù)權利要求17至22中任意一項所述的方法，其中對于單獨成分，分別給藥治療有效量的CDK抑制劑和多柔比星。
24.根據(jù)權利要求17至22中任意一項所述的方法，其中對于單獨成分，分別給藥亞治療量的CDK抑制劑和多柔比星。
25.根據(jù)權利要求17至24中任意一項所述的方法，其中增殖性疾病為Rb缺失的疾病。
26.根據(jù)權利要求17至24中任意一項所述的方法，其中增殖性疾病為癌癥。
27.CDK抑制劑在制備用于增殖性疾病治療的藥物中的應用，其中所述治療包括同時、依次或分別地為患者給藥多柔比星和CDK抑制劑。
28.CDK抑制劑和多柔比星在制備用于治療增殖性疾病的藥物中的應用。
29.CDK抑制劑在制備用于增殖性疾病治療的藥物中的應用，其中所述藥物用于在與多柔比星聯(lián)合治療。
30.多柔比星在制備用于增殖性疾病治療的藥物中的應用，其中所述藥物用于在與CDK抑制劑聯(lián)合治療。
31.一種聯(lián)合，包括CDK抑制劑和蒽環(huán)類藥物。
全文摘要
本發(fā)明的第一方面涉及包括CDK抑制劑和多柔比星的聯(lián)合。本發(fā)明的第二方面涉及包括CDK抑制劑和多柔比星的藥物制品，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯(lián)合制劑。本發(fā)明的第三方面涉及治療增殖性疾病的方法，所述方法包括同時、依次或分別地為患者給藥CDK抑制劑和多柔比星。
文檔編號A61K45/00GK1655821SQ03812085
公開日2005年8月17日 申請日期2003年3月25日 優(yōu)先權日2002年3月27日
發(fā)明者羅杰·N·斯萊, 安東·伯恩斯, 海倫·M·科利, 斯科特·萊昂斯 申請人:西克拉塞爾有限公司