專利名稱：抗菌性多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有自然中不存在的形態(tài)的獨立肽鏈結構的抗菌性多肽以及以該多肽為主成分的抗菌劑(藥用組合物)。
背景技術：
據悉，抗菌性多肽具有很寬的抗菌譜，難以出現(xiàn)抗藥性菌，因此，有望用于以人類和動物的細菌感染性疾病的預防和治療和賦予食材等物品抗菌性為目的的抗菌性多肽的應用。迄今為止，從動植物中已分離出眾多抗菌性多肽。
例如，在日本特開2000-63400號公報中，就揭示了源自臺灣甲蟲的抗菌性多肽和以該抗菌性多肽為有效成分的抗菌劑。而日本特開2001-186887號公報則揭示了源自蝎毒的抗菌性多肽和以該抗菌性多肽為有效成分的抗菌劑。而國際公開WO98/51794號公報則揭示了源自防衛(wèi)素總科之一的人類抗菌性多肽和以該抗菌性多肽為有效成分的抗菌劑。而國際公開WO99/26971號公報中則揭示了源自酪蛋白的抗菌性多肽和以該抗菌性多肽為有效成分的抗菌劑(具體有牙膏、口腔清潔劑等口腔用組合物)。而國際公開WO00/09553號公報則揭示了源自蛙科動物的抗菌性多肽。另外，國際公開WO01/009175號公報揭示了源自植物防衛(wèi)素的含修飾半胱氨酸的抗菌性多肽。
上述各公報中所述的抗菌性多肽，都是在發(fā)現(xiàn)自然界所固有的抗菌性多肽后，從中分離出來的抗菌性多肽(或天然抗菌性多肽的氨基酸序列局部變異抗菌性多肽)。因此，只要是以固有的抗菌性多肽而存在的肽為主成分，就難以開發(fā)出具有超過自然界固有的肽所起到的抗菌活性和抗菌譜的抗菌性能的抗菌劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明所揭示的抗菌性多肽是利用不同于已知的抗菌性多肽的工藝開發(fā)出的多肽。即，本發(fā)明提供利用不同于自然界中所存在的抗菌性多肽的肽中所含的氨基酸序列創(chuàng)造出的自然中不存在的人工合成抗菌性多肽。本發(fā)明還提供上述抗菌性多肽的制造方法。并提供對上述抗菌性多肽編碼的多核苷酸序列和含該序列(典型例為基本上由該序列構成)的自然中不存在的人工合成多核苷酸。還有以該抗菌性多肽或對該多肽進行編碼的多核苷酸為主成分的抗菌劑(藥用組合物)。
本發(fā)明所揭示的抗菌性多肽，其肽鏈中含1單位或2單位以上的1種或2種以上的核定位信號序列(下稱NLS)和/或該NLS序列局部變異的序列。典型例為，上述1單位或2單位以上的NLS和/或NLS變異序列所含氨基酸殘基(即構成本發(fā)明序列的氨基酸殘基)的總數(shù)至少為5個，且相當于構成肽鏈的全部氨基酸殘基的30％以上，優(yōu)選為40％以上。
NLS是由各生物種和病毒中分離出的核定位信號序列，是原本存在于向細胞內移動的各種肽中的部分序列。而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)獨立形態(tài)的NLS本身對細菌等有抗菌性，從而實現(xiàn)本發(fā)明。
本發(fā)明的抗菌性多肽因含有主要構成要素的NLS，從而表現(xiàn)出高抗菌活性。特別是對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有廣譜抗菌性。
本發(fā)明的抗菌性多肽優(yōu)選為，構成肽鏈的所有氨基酸殘基數(shù)大于等于5，小于等于100。多肽達到該長度左右，就能表現(xiàn)出穩(wěn)定的高抗菌活性。且由于肽鏈較短，易于合成，所以經濟效益好。更優(yōu)選為上述NLS和/或NLS變異序列中所含氨基酸殘基總數(shù)占構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的90％以上(例如100％)的肽。該NLS主體的肽具有極高的抗菌活性。
且優(yōu)選為，構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的40％以上為堿性氨基酸(典型例為精氨酸和賴氨酸)。堿性氨基酸殘基數(shù)的存在比例高，則可達到更高的抗菌活性。
而優(yōu)選之一的抗菌性多肽的特征在于，上述NLS和/或NLS變異序列有2單位以上相接近。一個肽鏈中存在2單位以上的NLS，則抗菌活性提高。更優(yōu)選為相鄰串接。
本發(fā)明所提供的其它優(yōu)選抗菌性多肽，含可提高NLS的抗菌活性的其它序列。關于這一點，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)核轉出信號序列(下稱NES)的現(xiàn)有已知序列有望增大肽的抗菌活性。因此通過本發(fā)明提供增加NLS和/或NLS的變異序列，在肽鏈中至少含有1單位NES或對該NES實施部分變異序列的抗菌性多肽。
這種方式的抗菌性多肽優(yōu)選為，特征為NES或NES變異序列的至少1單位配置于接近NLS或NLS變異序列的N末端側或C末端側。NES或其變異序列和NLS或其變異序列相鄰接配置的多肽(肽鏈)表現(xiàn)出對細菌，特別是金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的高抗菌活性。
且本發(fā)明還提供以所述抗菌性多肽為主成分的抗菌劑(即藥用組合物)。就典型抗菌劑而言，根據用途，除作為主成分的本發(fā)明的抗菌性多肽之外，還可含有可藥用的各種載體(輔料)。
本發(fā)明提供對所述抗菌性多肽編碼的核苷酸序列及與該序列互補的核苷酸序列。還提供含這些核苷酸或基本上由這些序列構成的自然中不存在的人工合成多核苷酸(可以DNA片段或RNA片段形式存在)。
本發(fā)明還提供適于制造所述抗菌性多肽的方法。本發(fā)明所揭示的典型方法包括選擇至少1種包括已知是核定位信號序列(NLS)的5氨基酸殘基以上的氨基酸序列；設計含1～2單位的所選NLS和/或NLS局部變異序列，且含于該1～2單位的所選NLS和/或NLS局部變異序列中的氨基酸殘基總數(shù)占全部氨基酸殘基數(shù)的30％以上、優(yōu)選為40％的肽鏈；以及合成具有該設計而成的肽鏈的抗菌性多肽。
NLS局部變異的優(yōu)選方法，可以舉出(a)使天然NLS非堿性氨基酸殘基中的至少1個缺失；(b)至少添加1個堿性氨基酸殘基至天然NLS；及(c)將NLS中所含非堿性氨基酸殘基中的至少1個置換為堿性氨基酸殘基。


圖1為用丙烯酰胺凝膠電泳對含有無細胞蛋白質合成系統(tǒng)合成的多肽的樣品分級的結果照片。
圖2為用MALDT-TOF MS解析由無細胞蛋白質合成系統(tǒng)合成的多肽時所得分子離子峰的質譜。橫軸為質荷比(m/z)，縱軸為相對強度。
圖3為用MALDT-TOF MS解析由無細胞蛋白質合成系統(tǒng)合成的多肽時所得片段離子峰的質譜。橫軸為質荷比(m/z)，縱軸為相對強度。
圖4為向市售表達載體(pET-41a(+))插入本發(fā)明的合成多核苷酸的示意圖。
圖5為用丙烯酰胺凝膠電泳對以一道或多道工序精制源自重組大腸桿菌的融合蛋白而得的樣品進行分級的結果照片。
圖6為以一道或多道工序處理源自重組大腸桿菌的融合蛋白所得精制樣品的逆相色譜分析結果的質譜。橫軸為保留時間(分)，縱軸為峰強(μV)。
圖7為用MALDT-TOF MS解析以一道或多道工序精制源自重組大腸桿菌的融合蛋白而得的多肽時所得分子離子峰的質譜。橫軸為質荷比(m/z)，縱軸為相對強度。
圖8A為以一道或多道工序處理源自重組大腸桿菌的融合蛋白所得精制樣品的逆相色譜分析結果的質譜。橫軸為保留時間(分)，縱軸為峰強(μV)。圖8B為化學合成多肽樣品的逆向色譜分析結果的質譜。橫軸為保留時間(分)，縱軸為峰強(μV)。
序列表列表序列號83 設計出的抗菌性多肽；序列號84 設計出的抗菌性多肽；序列號85 設計出的抗菌性多肽；序列號86 設計出的抗菌性多肽；序列號87 設計出的抗菌性多肽；序列號88 設計出的抗菌性多肽；序列號89 設計出的抗菌性多肽；序列號90 設計出的抗菌性多肽；序列號91 設計出的抗菌性多肽；序列號92 設計出的抗菌性多肽；序列號93 設計出的抗菌性多肽；序列號94 設計出的抗菌性多肽；序列號95 設計出的抗菌性多肽；序列號96 設計出的抗菌性多肽；序列號97 設計出的抗菌性多肽；序列號98 設計出的抗菌性多肽；
序列號99 設計出的抗菌性多肽；序列號100 設計出的抗菌性多肽；序列號101 末端含氨基的設計出的抗菌性多肽；序列號102 末端含氨基的設計出的抗菌性多肽；序列號103 末端含氨基的設計出的抗菌性多肽；序列號104 設計出的抗菌性多肽；序列號105 設計出的抗菌性多肽；序列號106 設計出的抗菌性多肽；序列號107 設計出的抗菌性多肽；序列號108 設計出的抗菌性多肽；序列號109 設計出的抗菌性多肽；序列號110 設計出的抗菌性多肽；序列號111 對設計出的抗菌性多肽序列編碼的合成DNA；序列號112 設計出的抗菌性多肽；序列號113 編碼設計出的抗菌性多肽序列的合成DNA；序列號114 設計出的抗菌性多肽；序列號115 對設計出的抗菌性多肽序列編碼的合成DNA；序列號116 設計出的抗菌性多肽；序列號117 用作引物的合成DNA；序列號118 用作引物的合成DNA；序列號119 用作引物的合成DNA；序列號120 用作引物的合成DNA；序列號121 對設計出的抗菌性多肽序列編碼的合成DNA；序列號122 設計出的多肽；序列號123 合成DNA。
具體實施例方式
本發(fā)明的“自然中不存在的人工合成抗菌性多肽或多核苷酸”是指自然界中不單獨存在全長的該肽鏈或核苷酸鏈，而是通過人工化學合成或生物合成(即根據遺傳工程生成)該抗菌性多肽或多核苷酸。
“多肽”這一術語是指具有多個肽鍵的氨基酸聚合物，不受限于肽鏈所含氨基酸殘基數(shù)，氨基酸殘基數(shù)小于10(例如全部氨基酸殘基數(shù)5～7)的低聚肽也屬于本發(fā)明所述的多肽。
“多核苷酸”這一常用術語是指多個核苷酸通過磷酸二酯鍵結合而成的聚合物(核酸)，不受限于核苷酸數(shù)量。各種長度的DNA片段和RNA片段也屬于本發(fā)明所述的多核苷酸。
“氨基酸殘基”這一術語除特別指明外，包括肽鏈的N末端氨基酸和C末端氨基酸。
在本說明書中，提到“NLS”或“核定位信號序列”時，除特別指明外，并不限于特定的氨基酸序列，而是指所有已知的作為核定位信號序列的氨基酸序列。就NLS而言，本說明書的序列表(序列號1～80)欄中列出了氨基酸序列的典型例，但這并非為了特別限定。
在本說明書中，提到“NES”或“核轉出信號序列”時，除特別指明外，并不限于特定的氨基酸序列，而是指所有已知的作為核轉出信號序列的氨基酸序列。本說明書的序列表(序列號81，82)中列出了NES的典型例，但這并非為了特別限定。
就含NES或NLS的抗菌性多肽而言，“含NLS(或NES)局部變異的序列的抗菌性多肽”是指，該NLS(或NES)的一個至多個氨基酸殘基經修飾的序列(例如C末端氨基酸的羧基酰胺化的序列)，或該NLS(或NES)的一個至多個氨基酸殘基被置換、缺失和/或添加而形成的含變異NLS(或NES)的抗菌性多肽，以便能達到與含指定NLS(或NES)的多肽的抗菌性基本相同甚至更高的抗菌性。本發(fā)明所述的含局部實施了變異的序列的抗菌性多肽包括例如(i)指定NLS中1～5個左右氨基酸殘基經保守置換，即同類氨基酸置換(conservative amino acid substitutions)生成的變異序列(例如1或2、3個堿性氨基酸殘基分別置換為其它堿性氨基酸殘基的序列)；(ii)在指定NLS中添加1～3個左右的氨基酸殘基，優(yōu)選為堿性氨基酸殘基的變異序列；(iii)使指定NLS中缺失1～3個左右的氨基酸殘基，優(yōu)選為非堿性氨基酸殘基的變異序列；(iv)在天然NLS的氨基末端添加蛋氨酸殘基(包括氨基甲?；那闆r)的變異序列等。
此外，1單位(unit)NLS和NES是指構成NLS或NES的1個序列。因此，當提高肽鏈含2單位NLS時，其意為，在該肽鏈中存在2個被看作相互獨立的NLS(或NES)的序列，無論其種類相同與否。
下面說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。且除非本發(fā)明特別聲明，例如抗菌性多肽的一級結構和鏈長，實施本發(fā)明所必需的事項，例如多肽合成、多核苷酸合成、以肽為成分的藥劑的調制等所涉及的事項，均被認為是本領域技術人員基于有機化學、生化學、遺傳工學、蛋白質工學、分子生物學、藥學、醫(yī)學等領域的現(xiàn)有技術的應掌握設計事項。本發(fā)明可根據本說明書所揭示的內容以及本領域技術常識進行實施。本說明書還結合了說明書所引用的專利文獻、專利申請文件及其它刊物的全部內容，以便于參考。
在下述說明中，構成肽鏈的氨基酸殘基以IUPAC-IUB指南所示氨基酸命名法為基準的單字表示(在序列表中用三個字母表示)。且，除非特別聲明，否則，本說明書中記為NLS時，包括根據上文而定義的“實施局部變異的序列(即變異NLS序列)”，NES亦同。
本發(fā)明的抗菌性多肽為自然中不存在的人工合成多肽。具有組合了NLS或僅由NLS構成的一級結構。即，與含部分NLS的天然核定位多肽(肽鏈)相比，NLS占全體氨基酸序列的比例明顯增加。典型例是，NLS所含氨基酸殘基總數(shù)至少為5氨基酸，優(yōu)選為大于等于7氨基酸，這些氨基酸殘基數(shù)基本上是構成肽鏈全長的氨基酸殘基總數(shù)的30％以上，優(yōu)選為40％以上。且優(yōu)選為構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的70％以上含于NLS部分，更優(yōu)選為構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的90％以上含于NLS部分。
本發(fā)明的抗菌性多肽優(yōu)選為全部氨基酸殘基為L型氨基酸，但只要未失去抗菌活性，部分或全部氨基酸殘基也可由D型氨基酸置換。例如，在化學合成本發(fā)明所述氨基酸序列形成的多肽時，其部分或全部可由D型氨基酸殘基構成。由于多肽(即氨基酸殘基數(shù))根據所含NLS或NES的長度而得到不同的鏈長，而無特別限制，優(yōu)選為由5～100個左右的氨基酸殘基構成，更優(yōu)選為由7～50個左右的氨基酸殘基構成，特別優(yōu)選為由9～30個左右的氨基酸殘基構成(參照表1)。
多肽的立體結構無特別限制，只要在使用環(huán)境下能表現(xiàn)出抗菌性即可，但為難形成免疫原(抗原)，優(yōu)選為直鏈狀或螺旋狀。因該形狀多肽難于形成抗原決定位。根據該觀點，適用于抗菌劑的多肽，優(yōu)選為直鏈狀低分子量多肽，典型例為全部氨基酸殘基數(shù)為5～30，優(yōu)選為全部氨基酸殘基數(shù)為5～20。優(yōu)選為不含半胱氨酸殘基或其存在比例小的氨基酸序列。
構成本發(fā)明的多肽的NLS，可從現(xiàn)有各種生物和病毒中發(fā)現(xiàn)的天然NLS中選擇，可直接利用其序列。具體例可舉出序列號1～80所示各NLS。優(yōu)選為堿性氨基酸殘基含率高的的NLS。例如，優(yōu)選為40％以上、更優(yōu)選為50％以上的氨基酸殘基為堿性氨基酸殘基(賴氨酸和/或精氨酸)，優(yōu)選為包含其中的1種或2種以上的NLS的多肽。
優(yōu)選為，與構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的40％以上相當，且至少5個氨基酸殘基屬于NLS部分。優(yōu)選為由5～25個左右的氨基酸殘基構成1單位NLS。例如，優(yōu)選為含1單位或2單位以上的RRMKWKK(序列號1)、RVHPYQR(序列號2)、PKKKRKV(序列號4)、GKKRSKA(序列號5)、RGRRRRQR(序列號7)、RKKRRQRRR(序列號20)及PRRRK(序列號26)等5個以上氨基酸殘基的NLS的多肽，典型例為氨基酸殘基總數(shù)5～100。也可為僅1單位NLS的多肽。
而如RKRR(序列號27)等1單位有4個以下氨基酸殘基的NLS，僅由其1單位不能構成本發(fā)明的多肽。此時，可將相同或不同的NLS組合，設計出全體而言，有5個以上氨基酸殘基的氨基酸序列。即，可設計含2單位以上(典型例為2單位、3單位或4單位)的1單位有4個以下氨基酸殘基的NLS的氨基酸序列。例如，當NLS選擇RKRR(序列號27)時，將兩單位該序列串接，即能設計成8個氨基酸殘基的序列(RKRRRKRR)。
而當由可利用數(shù)據庫等信息源選擇構成抗菌性多肽的NLS時，優(yōu)選從富含堿性氨基酸殘基的NLS中選擇。例如，全部氨基酸殘基數(shù)的40％以上、優(yōu)選為50％以上、特別優(yōu)選為70％以上為精氨酸殘基和/或賴氨酸殘基的NLS為優(yōu)選替代物。
而當設計含2或3單位以上的NLS的氨基酸序列時，優(yōu)選使這些NLS在肽鏈中鄰接。此時，優(yōu)選為鄰接一方的NLS的C末端氨基酸和另一NLS的N末端氨基酸直接結合的形態(tài)(參照實施例)。也可為鄰接的兩NLS之間，還存在作為連接鏈的一個至多個氨基酸殘基。
本發(fā)明的抗菌性多肽可僅由1種或2種以上的NLS構成全體氨基酸序列，而只要不失去抗菌活性，也包括不含NLS的氨基酸殘基(氨基酸序列)。NLS之外部分的序列優(yōu)選為可維持肽鏈的直鏈狀的序列，盡管對此并無特殊限定。
此外，所設計的氨基酸序列優(yōu)選含有起到提高內在的NLS的抗菌活性的作用效果奏效的其它序列。如上所述，適于該目的的候選序列可舉出NES。
典型的NES序列可舉出LPPLERLTL(序列號81)、LALKLAGLDI(序列號82)。氨基酸序列通過組合現(xiàn)有的已知各種NES和NLS，即可構建高抗菌活性多肽。優(yōu)選構建為NES鄰接NLS的N末端或C末端側的多肽。該形式的多肽，例如可舉出，從N末端一側以NLS、NES的順序串接的多肽；從N末端一側以NES、NLS的順序串接的多肽；從N末端一側以NLS、NES、NLS的順序串接的多肽(此時，使NES位于中間的N末端側NLS和C末端側NLS種類可相同也可不同)。
構成本發(fā)明的抗菌性多肽的NLS或NES不僅由天然型序列組成，只要無損于抗菌性，還可使用各種局部變異序列。即，通過設計含天然NLS經適當變異的序列的氨基酸序列(肽鏈)，能得到可表現(xiàn)出更高抗菌活性的多肽。
典型的這類變異可舉出，序列中的1～3氨基酸殘基的同類置換及肽鏈(NLS)N末端添加蛋氨酸殘基(適于重組設計的肽鏈，采用DNA技術進行生物合成的情況)。此外，用于提高抗菌活性的適當變異可舉出，使天然NLS的非堿性氨基酸殘基(中性或酸性氨基酸殘基)至少缺失1個，給天然NLS至少添加1個堿性氨基酸(典型例為精氨酸和賴氨酸)，以及將天然NLS所含至少一個非堿性氨基酸殘基置換為堿性氨基酸殘基。此外，優(yōu)選變異還包括，將肽鏈C末端的氨基酸的羧基酰化，或將N末端的氨基酸的羧基?；?典型例為乙?；?。
本發(fā)明所提供的新型抗菌性多肽之一為，例如，7個氨基酸殘基的典型NLS，PKKKRKV(序列號4)的脯氨酸置換為堿性氨基酸殘基的序列PKKKRKV(序列號83)有1個或2單位以上的多肽。
本發(fā)明所提供的優(yōu)選新型抗菌性多肽為由上述變異序列構成的多肽，以及其C末端羧基酰化修飾而成的多肽，如PKKKRKV-CONH2(序列號102)和RKKKRK，VRKKKRKV-CONH2(序列號103)。
本發(fā)明所提供的優(yōu)選新型抗菌性多肽(設計的肽鏈)的具體例為序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116所示的各氨基酸序列或其1、2或多個氨基酸殘基被置換(同類置換等)、缺失及或添加的變異序列?；旧嫌蛇@些氨基酸序列構成的多肽，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有高抗菌活性(參照參考例)。
該多肽由任30個以下氨基酸殘基，具體為5～28個氨基酸殘基構成，優(yōu)選為可維持直鏈狀。且因免疫原性低，適于用作抗菌劑主成分。
而且，本發(fā)明提供含1種或2種以上選自序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116所示各氨基酸序列的氨基酸序列，或其1、2或多個氨基酸殘基被置換(同類置換等)、缺失及/或添加的變異序列的自然中不存在的人工合成多肽，且整體不超過100個氨基酸殘基，優(yōu)選為不超過50個氨基酸殘基。
一旦如上所述設計成氨基酸序列，根據其氨基酸序列，用現(xiàn)有公知方法能夠合成肽鏈(即本發(fā)明的抗菌性多肽)。例如，根據一般的化學合成法容易制造抗菌性多肽。也可以采用此現(xiàn)有公知的固相合成法或液相合成法。以Boc(叔丁氧羥基)或Fmoc(9-亞芴基甲氧羰基)為適用的氨基保護基的固相合成法。
本發(fā)明的抗菌性多肽可易于通過使用市售多肽合成機(可由PerSeptive Biosystems、Applied Biosystems等公司購入)的固相合成法合成具有預期氨基酸序列和修飾(C末端?；?部分的肽鏈。
也可根據遺傳工學方法，生物合成本發(fā)明的抗菌性多肽。該方法適于制造長鏈多肽。即合成含通過編碼預期抗菌性多肽(以NLS為基質設計的氨基酸序列)而決定的核苷酸序列(典型例為含ATG起始密碼子)的DNA(結構基因)。根據宿主細胞，構建具有由該DNA和用于在宿主細胞內表達該氨基酸序列的各種調節(jié)成分(包括啟動子、核糖體結合部位、終止子、增強子、各種控制表達程度的順式元件等)構成的表達用基因構建物的重組媒介。
利用常用方法，向預定宿主細胞中導入該重組媒介(例如酵母菌、昆蟲細胞、植物細胞、哺乳類細胞)，在預定條件下培養(yǎng)該宿主細胞或含該細胞的組織或個體。由此就能在細胞內表達、生產目標多肽。再從宿主細胞(分泌時的培養(yǎng)基)中分離出多肽，精制后，就能得到目標抗菌性多肽。例如，為在宿主細胞內高效大量生產，可利用融合蛋白表達系統(tǒng)。即，化學合成對目標多肽氨基酸序列編碼的基因(DNA)，將該合成基因導入適當?shù)娜诤系鞍妆磉_用媒介，例如Novagen提供的pET序列和由Amersham Biosciences提供的pGEX序列等GST(谷胱甘肽S-轉移酶)融合蛋白表達用媒介的適當位置。然后通過該媒介對宿主細胞(典型例為大腸桿菌)進行轉化。培養(yǎng)所得轉化體、調制目標融合蛋白。再提取精制該蛋白質，將所得精制融合蛋白用特定酶(蛋白酶)切斷，用親和層析等方法回收游離的目標多肽片段(設計的抗菌性多肽)，通過使用該公知融合蛋白表達系統(tǒng)，例如，可利用由Amersham Biosciences提供的GST/His系統(tǒng)，就能制成本發(fā)明的抗菌性多肽。
也可通過構建無細胞蛋白質合成系統(tǒng)用模版DNA(即，含有對抗菌性多肽的氨基酸序列編碼的核苷酸序列的合成基因片段，參照后述參考例)，使用合成肽所必需的各種化合物，如ATP、RNA聚合酶、氨基酸類等，采用無細胞蛋白質合成系統(tǒng)體外合成目標多肽。無細胞蛋白質合成系統(tǒng)可參考例如Shimizu等人的論文(Shimizu et al.，NatureBiotechnology，19，751-755(2001))、Madin等人的論文(Madin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(2)，559-564(2000))。在本發(fā)明申請時，已有很多企根據這些論文所述技術生產了蛋白質(多肽)，且無細胞蛋白質合成用儀器(例如，可由日本東洋紡織(株)購入的PROTEIOS(商標)小麥芽胚無細胞蛋白質合成系統(tǒng))已有市售品。
因此，一旦決定并設計好上述抗菌性多肽的氨基酸序列，則根據其氨基酸序列，利用無細胞蛋白質合成系統(tǒng)即能很容易生產出目標多肽，例如，根據日本的POST GENOME INSTITUTE CO.，LTD.的PURESYSTEM(注冊商標)，即能很容易的生產出目標多肽。
由對本發(fā)明的抗菌性多肽編碼的核苷酸序列和/或與該序列互補的核苷酸序列構成的基本上為單鏈或雙鏈核苷酸可很容易地利用現(xiàn)有公知方法制造合成。即，通過選擇對應于構成所設計的氨基酸序列的氨基酸殘基的密碼子，可很容易地確定和提供相應于抗菌性多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。因此，一旦確定核苷酸序列，就可很容易地利用DNA合成機等得到與預期核苷酸序列相應的多肽(單鏈)。進而將所得單鏈DNA用作模版，采用各種酶合成方法(典型例為PCR)，就能得到目標雙鏈DNA。
本發(fā)明的多核苷酸，既可為DNA形態(tài)，也可為RNA(mRNA)形態(tài)。DNA既可為單鏈，也可為雙鏈。單鏈時，可為密碼鏈(有義鏈)，也可為其互補序列的非密碼鏈(反義鏈)。
例如，可使用具有對本發(fā)明的抗菌性多肽編碼的核苷酸序列的多核苷酸和用于在宿主細胞內表達該氨基酸序列的各種調節(jié)成分(包括啟動子、核糖體結合部位、終止子、增強子、各種控制表達程度的順式元件等)構建具有外來肽表現(xiàn)用基因構建物的重組媒介。用于構成和構建媒介的調節(jié)成分的種類根據目標宿主細胞的類型而不同。重組媒介的構建，可采用由基因工程學領域易于理解的各種控制酶進行的多核苷酸鏈切斷法(restriction)及多核苷酸片段連接法(ligation)。這些方法可很容易地利用市售各種裝置進行。
此外，重組媒介的構建方法和向宿主細胞導入所構建的重組媒介的方法等，可直接采用該領域內的現(xiàn)有各種方法，由于這些方法本身并不給本發(fā)明帶來特別的特征，因此省略其詳細說明。
本發(fā)明的一或多個多核苷酸對新型氨基酸序列的抗菌性多肽進行編碼。
例如，本發(fā)明提供含有對具備下述(a)和(b)的要件(a)構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)在5～100；(b)含有選自序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116所示各氨基酸序列中至少1種氨基酸序列或該序列的一或多個氨基酸殘基被置換、缺失及/或添加而形成的變異氨基酸序列的抗菌性多肽編碼的核苷酸序列和/或該序列的互補核苷酸序列(或基本上由這些序列構成)的自然中不存在的人工合成多核苷酸。
并且，提供含有對基本上由選自序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116所示各氨基酸序列中至少1種氨基酸序列或該序列的一個至多個氨基酸殘基被置換、缺失及/或添加而形成的變異氨基酸序列構成的抗菌性多肽進行編碼的核苷酸序列和/或與該序列互補的核苷酸序列的(或基本上由這些序列構成)自然中不存在的人工合成多核苷酸。
本發(fā)明的抗菌性多肽具有較廣抗菌譜，適用作抗菌劑(藥用組合物)的主成分。例如，可用于細菌感染癥的治療、創(chuàng)傷面的消毒、眼病預防、口腔內清潔(漱口)、食品防腐和保鮮、除臭、家具和衛(wèi)生器具表面的殺菌和消毒等目的。
除抗菌性多肽之外，可根據抗菌劑的用途和形態(tài)選擇抗菌劑所含載體，即副成分(典型例為制藥可用物質)，例如各種填充劑、增量劑、結合劑、濕潤劑、表面活性劑、賦形劑、色素、香料等。
抗菌劑的形態(tài)無特別限制，可為內服劑和外用劑的各種典型劑型，例如軟膏、液體制劑、懸濁劑、乳劑、氣霧劑、泡沫劑、顆粒劑、粉末、片劑、膠囊等。而為用于注射等情況，也可為在用前將其溶于生理鹽水，以便調制成藥液的冷凍干燥劑和造粒劑。
此外，以抗菌性多肽(主成分)和各種載體(副成分)為材料，調制各種形態(tài)的藥劑工藝本身可根據現(xiàn)有公知方法進行，由于這些制劑方法本身不能給本發(fā)明帶來特別的特征，因此，在此不作詳細說明。
配方的詳細資料，可以舉出例如Corwin Hansch編撰的Comprehensive Medicinal Chemistry，Pergamon Press發(fā)行(1990)。
本發(fā)明的抗菌劑可根據其形態(tài)和目的，采用不同的用法和用量。例如，液體制劑可采用靜脈內、肌肉內、皮下、皮內或腹腔內注射或經灌腸而給患者服用。片劑等固體形態(tài)的制劑可口服。而用于衛(wèi)生陶器表面的消毒(殺菌)和食品防腐時，可直接將含大量(例如1～100mg/ml)肽的液體制劑噴在對象物表面，也可用布或紙等將該液體制劑擦拭在對象物表面。它們能以與現(xiàn)有肽類抗生素和以肽為構成成分的農藥、準藥品等相同的形態(tài)和用法使用，為此，本發(fā)明不再舉例。
例如，對接受放射治療的癌癥和艾滋病患者而言，細菌感染癥的預防和治療非常重要。本發(fā)明所提供的抗菌性多肽對細菌表現(xiàn)出選擇性抗菌作用。因此，本發(fā)明的抗菌性多肽可有效用作抗菌劑主成分。
并且，對本發(fā)明的抗菌性多肽編碼的多核苷酸可用作基因治療材料。例如，將對抗菌性多肽編碼的基因(典型例為DNA片段或RNA片段)與媒介適當組合，導入目標部位，就可在生物體(細胞)內持續(xù)表達本發(fā)明的抗菌性多肽。因此，編碼本發(fā)明的抗菌性多肽的多核苷酸(DNA片段或RNA片段等)就是對上述患者有效的細菌感染預防和治療藥劑。
在再生醫(yī)療領域，培養(yǎng)皮膚、骨、各種內臟時，預防細菌感染尤其重要。本發(fā)明提供的抗菌性多肽對哺乳動物和組織的毒性極低(參照后述實施例)，對細菌表現(xiàn)出選擇性抗菌作用。因此，作為防止培養(yǎng)臟器等時的細菌感染的藥劑非常有效。例如，如后述實施例所述，通過單獨將本發(fā)明的抗菌性多肽或該多肽主成分之一的抗菌劑以適當?shù)臐舛忍砑拥脚囵B(yǎng)液中，能夠防止培養(yǎng)中的臟器等的細菌感染。
并且，對本發(fā)明的抗菌性多肽編碼的多核苷酸可用作對培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)組織進行基因治療的材料。例如，將對本發(fā)明的抗菌性多肽編碼的基因(典型例為DNA片段或RNA片段)與適當媒介組合，導入目標培養(yǎng)組織，就能經?；蛟陬A期時期在培養(yǎng)組織(細胞)內表達本發(fā)明的抗菌性多肽。因此，對本發(fā)明的抗菌性多肽編碼的核苷酸(DNA片段或RNA片段等)可用作非常有效的防止培養(yǎng)組織細菌感染的藥劑。
下面說明本發(fā)明的幾個實施例，但本發(fā)明的主旨并不僅限于所述實施例1抗菌性多肽的化學合成使用后述肽合成機制造出總計36種多肽(樣品1～33，參照品1～3)。表1列舉了這些多肽的氨基酸序列。
表1


表1所述樣品1～6及27為僅由各不相同的1單位天然型NLS組成的多肽。
樣品7是由樣品1的氨基酸序列(PKKKRKV序列號4)的N末端氨基酸的脯氨酸置換成精氨酸的變異序列(RKKKRKV序列號83)構成的多肽。
樣品8～11是由NLS和普通NES串接的序列構成的多肽。即，樣品8的NLS(PKKKRKV序列號4)的C末端側與NES(LPPLERLTL序列號81)鄰接。而樣品9的NES(LPPLERLTL序列號81)的C末端側與NLS(PKKKRKV序列號4)鄰接。樣品10的NLS(RQARRNRRRRWR序列號21)的C末端側與NES(LPPLERLTL序列號81)鄰接，且在其C末端添加有1個天冬氨酸。樣品11的NLS(PKKKRKV序列號4)的C末端側與NES(LPPLERLTL序列號81)鄰接，且在其C末端側與NLS(PKKKRKV序列號4)鄰接。
樣品12～15是由樣品7的變異NLS(RKKKRKV序列號83)和普通NES連接的序列構成的多肽。即，樣品12在變異NLS(RKKKRKV序列號83)的C末端側與NES(LPPLERLTL序列號81)鄰接。而樣品13的NES(LPPLERLTL序列號81)的C末端側與NLS(RKKKRKV序列號83)鄰接。樣品14在變異NLS(RKKKRKV序列號83)的C末端側與其它NES(LALKLAGLDI序列號82)鄰接。而樣品15的NES(LALKLAGLDI序列號82)的C末端側與NLS(RKKKRKV序列號83)鄰接。
樣品16～22及30由2單位或其以上NLS或變異NLS連接的序列構成的多肽。即，樣品16為2單位NLS(PKKKRKV序列號4)連接而成。樣品17為2單位NLS(RIRKKLR序列號43)連接而成。樣品18為2單位的5氨基酸殘基構成的NLS(PRRRK序列號26)連接而成。樣品30為2單位NLS(LKRKLQR序列號50)連接而成。樣品19為1單位的兩個不同的NLS(PKKKRKV序列號4及PPRKKRTVV序列號28)串接而成。
且樣品20、21及22分別由2單位、3單位及4單位上述變異NLS(RKKKRKV序列號83)連接而成。
樣品23由NLS(PRRRK序列號26)的C末端氨基酸的羧基酰化而成。
樣品24由上述變異NLS(RKKKRKV序列號83)的C末端氨基酸的羧基酰化而成。
樣品25是使由2單位的上述變異NLS(RKKKRKV序列號83)連接而成的序列(RKKKRKVRKKKRKV序列號98)的C末端氨基酸的羧基酰化而成。
樣品26是由將樣品1的氨基酸序列(PKKKRKV序列號4)的N末端側起第6個氨基酸殘基“賴氨酸”置換為“精氨酸”的同類置換序列(PKKKRKV序列號104)構成的多肽。
樣品28是由樣品7的變異NLS(RKKKRKV序列號83)的C末端側添加富含堿性氨基酸的7氨基酸殘基而成的多肽。具體而言就是添加使變異NLS(RKKKRKV序列號83)反轉的序列(VKRKKKR)。
樣品29是由在樣品7的變異NLS(RKKKRKV序列號83)的C末端側添加全部是堿性氨基酸的6個氨基酸殘基(KRKKKR)而成的多肽。
樣品31是在樣品1的NLS(PKKKRKV序列號4)的C末端側添加10個氨基酸殘基(ALGKLALGKL)的多肽。
樣品32是在樣品2的NLS(RQARRNRRRRWR序列號21)的C末端側添加5個氨基酸殘基(IAGKI)的多肽。
樣品33是由2單位樣品7的變異NLS(RKKKRKV序列號83)連接而成，且其N末端添加有蛋氨酸殘基的多肽。
在本實施例中，為比較參照上述各樣品的多肽的抗菌活性，合成了3種不屬于本發(fā)明范疇的多肽。
即，參照品1是由僅1單位的4氨基酸殘基組成的短NLS(RKRR序列號27)形成的多肽。
而參照品2和參照品3是由僅1單位的各不相同的NES(LPPLERLTL序列號81、LALKLAGLDI序列號82)組成的多肽，不含NLS。
上述各多肽(各氨基酸序列參照表1和序列表)用市售肽合成機(PEPTIDE SYNTHESIZER 9050，PerSeptive Biosystems制品)，由固相合成法(Fmoc法)合成?？s合劑使用HATU(Applied Biosystems制品)，固相合成用樹酯及氨基酸從NOVA biochem公司購入。氨基酸序列的C末端?；瘯r，固相載體使用“Rink Amide resin(100～200目)”。
而根據上述肽合成機的合成程序反復進行脫保護基反應和縮合反應，結合在樹脂上的Fmoc-氨基酸肽鏈被延伸，得到目標鏈長的合成肽鏈。具體而言，用20％的哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)(肽合成用級，關東化學(株)制品)，切斷除去氨基酸的氨基保護基Fmoc，用DMF清洗，使Fmoc-氨基酸(-OH)各4eq發(fā)生反應，再反復進行用DMF清洗的操作。然后，在肽鏈伸長反應完全結束后，用20％哌啶/DMF切斷Fmoc基，按照DMF、甲醇的順序清洗上述反應物。
固相合成后，將合成的肽鏈和樹脂一起移至離心管，加入乙二醇1.8mL、間甲酚0.6mL、茴香硫醚3.6mL及三氟乙酸24mL，在室溫下攪拌2小時。然后過濾除去與肽鏈結合的樹脂。
再于濾液中加入冷卻乙醇，用冰水冷卻，得到肽沉淀物。然后利用離心分離(2500rpm，5分鐘)棄去上清液。向沉淀物中再加入冷的二乙醚，充分攪拌，然后在同上條件下離心分離。將攪拌和離心分離處理反復3次。
真空干燥所得肽沉淀物，用高效液相色譜(Waters600Waters制品)精制。
具體而言，使用預處理柱(日本Waters(株)制品，Guard-PakDeltapak C18 A300)和C18逆相柱(和光制藥工業(yè)(株)制品、WakopakWS-DHA4.6×150mm ODS-C18)，將0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液和0.1％三氟乙酰乙腈溶液的混合液用作洗提液，即，隨著洗提液中所含三氟乙酰乙腈溶液體積分率隨時間的增大(容積比設為10％～80％的濃度梯度)，使用上述處理柱，以1.5mL/分的流速進行30～40分鐘的分離精制。對由逆向柱洗提出的肽，用紫外線檢測器(490E DetectorWaters制品)在220nm波長下檢測，在記錄紙上出峰。
此外，洗提出的各多肽的分子量用PerSeptive Biosystems公司制Voyager DE RP(商標)，根據MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted LasterDesorption Time of Flight Mass Spectrometry基質輔助激光解吸附飛行時間質譜)確定。結果確認合成精制出目標多肽。
實施例2合成多肽的抗菌活性用96孔(well)微量培養(yǎng)板，由液態(tài)培養(yǎng)基稀釋法求得本發(fā)明的抗菌性多肽(樣品1～33)及參照品1～3的多肽對革蘭氏陰性菌(大腸肝菌E.coli)及革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌S.aureus)的抗菌活性(最小抑制濃度MIC)。
即，分別制成多肽濃度為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、1.9、1.0及0.5μM的液態(tài)肉汁培養(yǎng)基(DIFCO制品“NUTRIENTBROTH Dehydrated”)，填入96孔微量培養(yǎng)板。另外，將用LB BrothLennox(DIFCO制品)在18小時、37℃下靜置培養(yǎng)的菌液(約2×106cells/mL)與藥劑溶液(上述含肽肉汁培養(yǎng)基)等量地接種于96孔微量培養(yǎng)板的各孔(well)中。接種后，在37℃的恒溫箱內開始培養(yǎng)，根據24小時和48小時后的混濁度判斷有無菌產生。將測量時確認因菌導致的混濁度無增加時的最小多肽濃度定為本實施例的MIC。
根據該抗菌試驗得到得各樣品及參照品的抗菌活性(MIC)如表2所示。表2的MIC的單位為μM。
表2


表2所示結果表明，與參照品多肽(參照品1～3)相比，均本發(fā)明的多肽(樣品1～33)表現(xiàn)出高抗菌活性。
NLS和NES鄰接配置的多肽(樣品10、14、15等)對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均表現(xiàn)出高抗菌活性。而2單位或2單位以上的NLS串接多肽(樣品16～22)則確認有極高的抗菌活性。
此外，含1單位以上NLS或變異NLS、且富含氨基酸殘基，優(yōu)選為8個以上的多肽，如樣品2、5、16～22、28、29，表現(xiàn)出極高抗菌活性。而C末端?；亩嚯?樣品24)比C末端未?；亩嚯?樣品7)表現(xiàn)出更高的抗菌活性。
由表2所示結果可知，本發(fā)明的多肽具有極佳的廣譜抗菌活性。
實施例3抗菌多肽然后，再以各種細菌(參照表3)為對象，對樣品16、17、10、14及20的多肽進行與實施例2同樣的抗菌試驗(MIC測定試驗)，評價這些多肽的抗菌譜。其結果如表3所示，確認本發(fā)明的抗菌性多肽對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均有廣譜抗菌活性。
表3 24小時后的抗菌活性MIC(μM)

實施例4對哺乳動物的安全性試驗對哺乳動物細胞的毒性試驗如下所述進行在試驗前一天，將96孔微量培養(yǎng)板的每個孔植入8×103個A172(人神經膠質瘤)細胞，在37℃、5％的CO2的條件下靜置培養(yǎng)。次日，除去培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，然后逐個孔中添加含多肽(樣品1～26之中任一)濃度為0、0.5、5、25、50、100、200、400μg/ml的無血清培養(yǎng)基(不添加血清的GIBCO BRL制培養(yǎng)基RPMI1640)100μl(每個樣品植孔數(shù)(n)＝1或2)。然后再于同上條件下靜置培養(yǎng)24小時。
結束培養(yǎng)后，除去培養(yǎng)基，用PBS清洗1次。再在每個小孔中添加含5％WST-8(細胞繁殖測定用試劑岸田化學(株)制品)的GIBCOBRL制DMEM培養(yǎng)基(含10％FBS)100μl，在同上條件下靜置培養(yǎng)1小時。然后用平板讀數(shù)器，在主波長450nm、參照波長600nm下測定吸光度。以多肽0μg/ml(即無添加)的樣品吸光度值為100％，求出各多肽濃度下的相對細胞存活率。以多肽濃度100μg/ml時的相對細胞存活率在80％以上的情況為無毒，小于80％為有毒。結果，本發(fā)明的多肽(樣品1～26)均無毒。
并且，將10、12、13、14、15及20總計6種樣品調成含肽注射液(溶劑生理鹽水)。將其分別注入小白鼠腹腔。求LD50值。
結果，該試驗的抗菌性多肽LD50值均大于150mg/kg。即，可確認本發(fā)明的抗菌性多肽對哺乳動物來講，毒性極低。
實施例5調制顆粒劑將樣品20的多肽50mg、結晶纖維素50mg及乳糖400mg混合，然后加入乙醇和水混合液1mL混煉。用常規(guī)方法將該混煉物制粒，得到以抗菌性多肽為主成分的顆粒劑。
實施例6抗菌性多肽的基因工學合成(1)使用市售核酸合成機(Applied Biosystems制品ABI3900)根據操作手冊，合成由序列表序列號111、113及115所示核苷酸序列形成的單鏈DNA。而以該DNA為基礎，作為形成雙鏈DNA的引物，化學合成1種正向引物(序列號117)及3種反向引物(序列號118、119及120)。序列號118、119及120的各反向引物分別用于合成序列號111、113及115所示序列的雙鏈DNA。
然后利用使用這些引物的通常的聚合酶鏈反應(參考例如“PCRProtocolsCurrent Methods and Applications，White編撰，Humana Press發(fā)行(1993))，合成包括序列表中序列號111、113及115所示核苷酸序列的雙鏈DNA。
序列號111、113及115所示雙鏈DNA分別對序列號112、114及116所示氨基酸序列的抗菌性多肽編碼，在其編碼區(qū)域的上游(5′末端側)有啟動子序列，下游(3′末端側)有終止密碼。
然后，以Shimizu等人的論文(Shimizu et al.，Nature Biotechnology，19，751-755(2001))所述方案為準，以序列號115所示核苷酸的DNA為模版，由無細胞蛋白質合成系統(tǒng)(無細胞表達系統(tǒng))合成氨基酸序列為MPKKKRKVLPPLERLTLPKKKRKV(序列號116)的多肽。
即，調制出含下述成分9mM醋酸鎂、5mM磷酸鉀、95mM谷氨酸鉀、5mM氯化銨、0.5mM氯化鈣、1mM精脒、8mM腐胺、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、2mM的ATP、2mM的GTP、1mM的CTP、1mM的UTP、10mM磷酸肌酸、2.8單位(A260)的tRNA混合物(Roche制品)、0.5μg的10-甲酰-5，6，7，8-四氫葉酸、0.1mM的各氨基酸、12皮摩的核糖體、及帶有His-tag的各種酶及因子類(即，1μg的起始子1(IF1)、2μg的IF2、0.75μg的IF3、1μg的延伸因子-G(EF-G)、2μg的EF-Tu、1μg的EF-Ts、0.5μg的終止子(RF1)、0.5μg的RF3、0.5μg的RRF、各30～300單位的氨基酰-tRNA合成酶(計20種)和甲硫氨酰-tRNA轉甲酰酶、0.2μg的肌酸激酶(Roche制品)、0.15μg的肌激酶(Sigma制品)、0.054μg的核苷二磷酸激酶、0.1單位的焦磷酸酶(Sigma制品)以及0.5μg的T7 RNA聚合酶)的反應液50μl(pH7.3)。將反應液在37℃下保溫5分鐘。再向反應液中添加上述模版DNA，在37℃下保溫1小時。然后將反應液移至冰水中，使多肽合成反應停止。
然后將反應液填入超過濾用設備(Amicon(注冊商標)Centricon(注冊商標)YM-100設備，Millipore制品)進行離心分離，回收洗提液。然后將回收液用Ni-NTA瓊脂糖(agalose，Qiagen制品)經親和層析精制。將精制液供給SDS-PAGE，合成目標多肽。
即，將回收的部分精制液載入15～25％的丙烯酰胺濃度梯度的丙烯酰胺凝膠，在300V下進行50分鐘的電泳。除最終精制液之外，向該凝膠中同時載入部分上述多肽合成反應后立即經上述37℃、1小時保溫后的反應液以及部分上述超過濾后的洗提液。而反向控制，是將除不添加上述模版DNA(序列好115)之外，實施同樣過程而得的立即經上述37℃、1小時保溫后的反應液、上述超過濾的洗提液以及上述精制液載入同一凝膠。再將用其它肽合成機(上述PEPTIDE SYNTHE-SIZER 9050)合成的序列號116的多肽(MPKKKRKVLPPLERLTLPKKKRKV)載入同一凝膠。
電泳后，將凝膠浸入含熒光染色劑(Amersham Bioscence(株)制品SYPRO(商標)Orange)的染色液(7.5％醋酸)內40分鐘，對凝膠中所含肽進行染色。然后將凝膠浸入7.5％醋酸中，除去多余的染色劑。然后使用Amersham Pharmacia(株)制圖像分析儀(商品名Typhoon)解析(激勵波長532nm，熒光過濾器580BP30)。結果(染色后的影像)如圖1所示。圖1所示電泳泳道1為Amersham Biosciences(株)制LMW標記套件(制品名LMW MarkerKit，制品編碼17-0446-01)的泳動圖。從電泳泳道下側起，可看到約14.4kDa、20.1kDa、30kDa、45kDa、66kDa、97kDa的橫紋。電泳泳道2為Amersham Biosciences(株)制品的肽標記套件(制品名Peptide Marker Kit，制品編碼80-1129-83)的泳動圖。從電泳泳道下側起，可看到約6.2kDa、8.2kDa、10.7kDa、14.4kDa、16.9kDa的橫紋。電泳泳道3和電泳泳道4分別表示含和不含模版DNA的兩種情況下，上述肽合成反應后的反應液的泳動圖。而電泳泳道5和電泳泳道6分別表示含和不含模版DNA的兩種情況下，上述超過濾的洗提液的泳動圖。電泳泳道7為含模版DNA時的流通有Ni-NTA瓊脂糖的上述精制液的泳動圖。電泳泳道8為由肽合成機合成的目標序列多肽(序列號116)的泳動圖(70ng/3.4μl)。電泳泳道9為不含模版DNA時的流通Ni-NTA瓊脂糖的上述精制液的泳動圖。電泳泳道10表示由同樣的無細胞蛋白質合成系統(tǒng)(參照上述Shimizu等人的論文)合成，以同樣過程精制后的二氫葉酸還原酶(DHFR)的泳動圖。
如圖1所示，電泳泳道3、5及7(參照箭頭)在與電泳泳道8(參照箭頭)相同的位置，存在明確的橫紋。該橫紋未見于未添加模版DNA的電泳泳道4、6及9中。
然后將上述凝膠干燥后，分離出電泳泳道7的目標橫紋(圖1箭頭所示橫紋)，使用Amersham Biosciences制MALDI-TOF MS(商品名Voyager RPde)進行多肽的PMF分析(Peptide Mass Finger printinganalysis)。結果確認出現(xiàn)圖2所示的分子離子峰。觀測所得峰質量數(shù)([M+H]+＝2939.94、[M+2H]2+＝1470.49)與計算所得([M+H]+＝2939.89、[M+2H]2+＝1470.45)基本上一致。且未發(fā)現(xiàn)表示N末端和/或C末端被分解的多肽或側鏈有經修飾的氨基酸殘基的多肽存在的峰(N末端的蛋氨酸的氨基通常被甲?；?。
然后，用PSD(post-source decay)方式轉運上述MALDI-TOF MS，進行PSD解析(即在TOF MS內檢測飛行中變成碎片的激勵分子離子的方法)。結果得到如圖3所示的片段離子峰。根據解析，電泳泳道7的目標多肽的氨基酸序列從N末端起，依次識別為M-P-(K/Q)-(K/Q)-(K/Q)-R-(K/Q)-V-(L/I)。其結果與序列號116的多肽的氨基酸序列MPKKKRKVL一致。
根據上述結果，可知，使用模版DNA，由上述無細胞蛋白質合成系統(tǒng)，很容易合成、制造本發(fā)明的抗菌性肽。
實施例7抗菌性多肽的基因工學合成(2)用重組DNA技術在大腸桿菌內表達含目標多肽(上述樣品17)序列的GST融合蛋白(Glutathione S-transferase/His-Tag融合蛋白)，將回收的GST融合蛋白酶用酶消化，對目標多肽(片段)分離精制。
首先，使用市售核酸合成機(Applied Biosystems制品ABI3900)根據操作手冊，分別合成由序列號121及123所示的互補核苷酸序列組成的單鏈DNA。然后將該DNA鏈退火(anneal)，得到雙鏈DNA。序列號121為對本實施例的多肽的氨基酸序列編碼的序列。序列號123為其互補序列。該編碼合成多核苷酸的多肽的氨基酸序列如序列號121及序列號122所示。該氨基酸序列由上述樣品17(序列號93)的氨基酸序列、配置在其N末端側的1個蛋氨酸殘基、6個連續(xù)組氨酸殘基及1個谷氨酸殘基構成。插入的蛋氨酸殘基用于在后述融合蛋白表達不溶性時，使目標氨基酸序列能從融合GST部分被溴化氰切斷。而6個組氨酸序列是用于在切斷融合GST后，親和回收目標多肽(片段)的標記部分。具體而言，插入與組氨酸鄰接的谷氨酸殘基用于由目標多肽切取標記部分。
如序列號121所示序列所示，該合成多肽的兩端，即與蛋氨酸相應的密碼子的上游及終止編碼子的下游，分別含有各種控制酶EcoRI和PstI的認識點。該雙鏈DNA被控制酶EcoRI及PstI切斷。向瓊脂糖凝膠電泳供給控制酶消化物，精制成兩端具有EcoRI切斷點及PstI切斷點的DNA片段。
然后，如圖4所示，將從Novagen公司購入的GST融合蛋白表達媒介(pET-41a(+)DNA索引編號70556-3)用控制酶EcoRI及PstI切斷，在EcoRI及PstI點上連接(插入)上述雙鏈DNA(序列號121)。此外，所用GST融合蛋白表達媒介pET-41a(+)(全核苷酸序列5933bp)的克隆/表達區(qū)域的詳細地圖揭示于Noyagen社的索引中。
使用經連接處理的質體對優(yōu)勢細胞(E.coli JM109)進行轉化，所得轉化體用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基(Km+)在37℃下培養(yǎng)，由該培養(yǎng)物中分離出由插入了雙鏈的質體而轉化的克隆體。培養(yǎng)該克隆體，由該培養(yǎng)物中分離、回收插入了雙鏈DNA的質體。然后，使用回收的重組質體，轉化融合蛋白高表達用大腸桿菌(E.coli BL21(DE3))，對所得轉化體用LB培養(yǎng)基(Km+)在37℃下培養(yǎng)，由該培養(yǎng)物中分離出由插入了雙鏈的質體而轉化的克隆體。
然后，用3升LB培養(yǎng)基(Km+)在30℃下培養(yǎng)上述分離的克隆體。OD600為0.9時，添加IPTG，使最終濃度為0.5mM，誘導產生融合蛋白。再于6小時后離心分離培養(yǎng)液，回收得約11.6g菌體(濕態(tài))，冷凍保存。
此后的第二日，將冷凍保存菌體配成100ml的PBS懸濁液，添加20％的TritonX-100，使最終濃度為1％。對該懸濁液超聲波處理，將菌體破碎，然后離心分離，回收得約110ml上清液，將上清液加入1ml容量的谷胱甘肽瓊脂糖(Glutathione Sepharose)4B柱中，用含1％TritonX-100的PBS清洗柱內，再用PBS清洗。然后將含10mM還原型谷胱甘肽的50mMTris-HCl(pH8.0)加入柱內，從柱內洗提目標融合蛋白。由此得到約60mg的融合蛋白。
然后將回收的融合蛋白溶液用凝血酶處理。即，向融合蛋白溶液中添加預定當量的凝血酶(即每20μg融合蛋白溶液約0.01U)，在20℃下放置一晚。根據該反應，融合蛋白被分成GST部分和含目標氨基酸序列的肽部分。
然后將該蛋白質分解酶處理溶液注入谷胱甘肽瓊脂糖4B柱，回收通過的組分。再用含1％TritonX-100的PBS將柱子洗凈，回收其中的部分(初期洗提組分)。通過將向SDS-PAGE供給回收液，確認目標多肽的回收。即，回收的部分精制液(含目標多肽)載入15～25％的丙烯酰胺濃度梯度的聚丙烯酰胺凝膠(Multigel 15/25第一化學(株)制品)，在30mA下進行約2小時的電泳。結果如圖5所示。凝膠電泳泳道M為肽標記(BenchMark Protein Ladder、Invitrogen制品)的泳動圖，電泳泳道1為上述凝血酶處理前的融合蛋白溶液的泳動圖，電泳泳道2為凝血酶處理后的蛋白質溶液的泳動圖，電泳泳道3為柱中流出的組分的泳動圖，電泳泳道4及5為洗凈上述柱子的洗凈液回收后的組分的泳動圖，電泳泳道6～11為從上述柱中分離出的洗提組分的泳動圖。如圖所示，電泳泳道2～5中確認含有與GST分離的目標氨基酸序列(序列號122)的多肽片段橫紋。
然后，將這些回收物裝入透析用袋，用0.1M碳酸氫銨(pH8.0)透析。然后回收袋內的溶液，在添加有適量內切蛋白酶Glu-C的碳酸氫銨緩沖液(PH7.8)中，在37℃下進行18小時的酶處理(切斷處理)。然后回收酶處理液，供逆向高效液相色譜使用。即，將酶處理液用于規(guī)格為4.6×250mm的逆向柱(Wakosil-II 5C18 HG和光純藥工業(yè)(株)制品)，使用日本分光(株)的RP-HPLC(JASCO Pump System，泵PU-980，UV檢測器UV-970)，在A溶液為含0.05vol％TFA的蒸餾水、B溶液為含0.05vol％TFA的乙腈溶液、變化率為100％A→100％B溶液經40分鐘、流速為1ml/分的條件下進行逆向色譜分析。結果，從溶出開始約經20分鐘，從柱中洗提出的組分中檢測到被認為是目標肽片段的峰(圖8A)。即，該峰位置(溶出時間)與化學合成品(樣品17)的多肽(0.1mg/ml的樣品100μl)用于同一柱內，在相同條件下洗提的情況相同(圖8B)。
然后分離該峰組分，進一步用于逆向色譜分析。即，將上述分離的酶處理液用于規(guī)格為4.6×150mm的逆向柱(LichrosherRP-18Agilent Technologies社制品)，使用日本分光(株)的RP-HPLC(JASCO Pump System，泵PU-980，UV檢測器UV-970)，在A溶液為含0.15vol％TFA蒸餾水、B溶液為含0.1vol％TFA的90vol％TFA乙腈溶液、變化率為100％A→50％A/50％B溶液經40分鐘、流速為1ml/分的條件下進行逆向色譜分析。結果如圖6所示，從溶出開始約經20分鐘，從柱中洗提出的組分檢測到被認為是目標肽片段的峰。該峰組分所含肽的分子量用PerSeptive Biosystems制Voyager DE RP(商標)，根據MALDI-TOFMS確定(圖7)。結果，確定的分子量(1920.78)與根據氨基酸序列的理論分子量(1920.51)同等。
然后，根據同上述實施例2所述的方法，研究由逆向色譜法精制的多肽的抗菌活性(MIC)。結果如表4所示。
表4

如表4所示，由重組大腸桿菌分離精制的多肽與參照的多肽(上述實施例2中的參照品1和2)相比，表現(xiàn)出高抗菌活性。其MIC值與化學合成制成的相同氨基酸序列的多肽(上述樣品17)有同等程度。
以上詳細說明了本發(fā)明的具體例，但本發(fā)明并不受限于所述實施例。本發(fā)明所要求保護的技術，還包括上述所示具體例的各種變形和變更例。
且本說明書所述技術要素為單獨或通過其各種組合發(fā)揮有效性，但也不受限于所述組合。且本說明書所示技術能同時達成多個目的，達成其中之一的目的的技術本身，在技術上即具有有益性。
序列表<110>東亞合成株式會社<120>抗菌性多肽及其應用<130>WK02-012-PCT<140>03809336.7<141>2003-04-24<150>JP 2002-124830<151>2002-04-25<160>123<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>7<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Moede，T<303>FEBS Lett.
<304>461<305>3<306>229-234<307>1999<400>1Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>小家鼠<300>
<301>Wu，J<303>J.Biol.Chem.
<304>274<305>41<306>29202-29210<307>1999<400>2Arg Val His Pro Tyr Gln Arg1 5<210>3<211>24<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Somasokaram，A<303>J.Biol.Chem.
<304>274<305>40<306>28405-28412<307>1999<400>3Lys Arg Pro Ala Cys Thr Leu Lys Pro Glu Cys Val Gln Gln Leu Leu1 5 10 15Val Cys Ser Gln Glu Ala Lys Lys20<210>4<211>7<212>PRT<213>猿病毒40<300>
<301>Kalderon，D<303>Cell<305>39<306>499-509<307>1984<400>4
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5<210>5<211>7<212>PRT<213>啤酒酵母<300>
<301>Moreland，RB<303>Mol.Cell.Biol.
<305>7<306>4048-4057<307>1987<400>5Gly Lys Lys Arg Ser Lys Ala1 5<210>6<211>6<212>PRT<213>鳥類網狀內皮組織增殖病毒<300>
<301>Gilmore.TD<303>J.Virol.
<305>62<306>703-714<307>1988<400>6Lys Ala Lys Arg Gln Arg1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>褐家鼠<300>
<301>Irie，Y
<303>J.Biol.Chem.
<305>275<306>2647-2653<307>2000<400>7Arg Gly Arg Arg Arg Arg Gln Arg1 5<210>8<211>5<212>PRT<213>褐家鼠<300>
<301>Irie，Y<303>J.Biol.Chem.
<305>275<306>2647-2653<307>2000<400>8Arg Lys Arg Arg Arg1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Welch，K<303>Mol.Cell.Biol.
<305>19<306>8400-8411<307>1999<400>9Pro Pro Val Lys Arg Glu Arg Thr Ser1 5
<210>10<211>10<212>PRT<213>啤酒酵母<300>
<301>Welch，K<303>Mol.Cell.Biol.
<305>19<306>8400-8411<307>1999<400>10Pro Tyr Leu Asn Lys Arg Lys Gly Lys Pro1 5 10<210>11<211>17<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Prieve，MG<303>Mol.Cell.Biol.
<305>18<306>4819-4832<307>1998<400>11Cys Tyr Gly Ser Lys Asn Thr Gly Ala Lys Lys Arg Lys Ile Asp Asp1 5 10 15Ala<210>12<211>9<212>PRT<213>果蠅.
<300>
<301>Miyamoto，Y<303>J.Biol.Chem.
<305>272<306>26375-26381<307>1997<400>12Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Glu Lys1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>果蠅.
<300>
<301>Prieve，MG<303>Mol.Cell.Biol.
<305>18<306>4819-4832<307>1998<400>13Lys Lys Lys Arg Arg Ser Arg Glu Lys1 5<210>14<211>18<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Koike，M<303>Exp.Cell Res.
<305>250<306>401-413<307>1999<400>14Lys Val Thr Lys Arg Lys His Asp Asn Glu Gly Ser Gly Ser Lys Arg1 5 10 15Pro Lys
<210>15<211>14<212>PRT<213>褐家鼠<300>
<301>Blauer.M<303>Biol.Repr<305>60<306>588-593<307>1999<400>15Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Lys Lys1 5 10<210>16<211>8<212>PRT<213>博爾納病毒<300>
<301>Shoya，Y<303>J.Virol.
<305>72<306>9755-9762<307>1998<400>16Pro Arg Pro Arg Lys Ile Pro Arg1 5<210>17<211>13<212>PRT<213>博爾納病毒<300>
<301>Shoya，Y<303>J.Virol.
<305>72<306>9755-9762<307>1998<400>17Pro Pro Arg Ile Tyr Pro Gln Leu Pro Ser Ala Pro Thr1 5 10<210>18<211>20<212>PRT<213>小家鼠<300>
<301>Yu.Z<303>J.Endocrinol.
<305>159<306>53-60<307>1998<400>18Lys Asp Cys Val Ile Asn Lys His His Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys1 5 10 15Arg Leu Gln Arg20<210>19<211>11<212>PRT<213>多瘤病毒<300>
<301>Chag，D<303>Virology<305>189<306>821-827<307>1992<400>19Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Cys1 5 10
<210>20<211>9<212>PRT<213>人體免疫缺陷病毒<300>
<301>Truant，R<303>Mol.Cell.Biol.
<305>19<306>1210-1217<307>1999<400>20Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5<210>21<211>12<212>PRT<213>人體免疫缺陷病毒<300>
<301>Truant，R<303>Mol.Cell.Biol.
<305>19<306>1210-1217<307>1999<400>21Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg1 5 10<210>22<211>18<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Palmeri，D<303>Mol.Cell.Biol.
<305>19<306>1218-1225<307>1999<400>22Met Pro Lys Thr Arg Arg Arg Pro Arg Arg Ser Gln Arg Lys Arg Pro1 5 10 15Pro Thr<210>23<211>17<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Sudbeck，P<303>J.Biol.Chem.
<305>272<306>27848-27852<307>1997<400>23Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe Ile Val Trp Ser Arg Asp Gln Arg Arg1 5 10 15Lys<210>24<211>5<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Sudbeck，P<303>J.Biol.Chem.
<305>272<306>27848-27852<307>1997<400>24Arg Pro Arg Arg Lys
1 5<210>25<211>17<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Sudbeck，P<303>J.Biol.Chem.
<305>272<306>27848-27852<307>1997<400>25Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe Ile Val Trp Ala Gln Ala Ala Arg Arg1 5 10 15Lys<210>26<211>5<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Sudbeck，P<303>J.Biol.Chem.
<305>272<306>27848-27852<307>1997<400>26Pro Arg Arg Arg Lys1 5<210>27<211>4<212>PRT<213>阿拉伯芥
<300>
<301>Nover，L<303>Cell Stress Chaperones<305>6<306>177-189<307>2001<400>27Arg Lys Arg Arg1<210>28<211>9<212>PRT<213>肝炎C病毒<300>
<301>Ide，Y<303>Gene<305>182<306>203-211<307>1996<400>28Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val1 5<210>29<211>13<212>PRT<213>非洲淋巴細胞瘤病毒<300>
<301>Liu.MT<303>Virology<305>247<306>62-73<307>1998<400>29Tyr Lys Arg Pro Cys Lys Arg Ser Phe Ile Arg Phe Ile1 5 10
<210>30<211>13<212>PRT<213>非洲淋巴細胞瘤病毒<300>
<301>Liu，MT<303>Virology<305>247<306>62-73<307>1998<400>30Leu Lys Asp Val Arg Lys Arg Lys Leu Gly Pro Gly His1 5 10<210>31<211>5<212>PRT<213>腺病毒<300>
<301>Rosenberg，M<303>Mol.Cell.Biol.
<305>7<306>2451-2456<307>1987<400>31Lys Arg Pro Arg Pro1 5<210>32<211>5<212>PRT<213>啤酒酵母<300>
<301>Bouvier，D<303>Mol.Cell.Biol.
<305>6
<306>1697-1705<307>1995<400>32Arg Lys Arg Lys Lys1 5<210>33<211>7<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Hsieh，JC<303>J.Cell.Biochem.
<305>70<306>94-109<307>1998<400>33Arg Arg Ser Met Lys Arg Lys1 5<210>34<211>10<212>PRT<213>犬細小病毒<300>
<301>Vihinen-Ranta，M<303>Eur.J.Biochem.
<305>250<306>389-394<307>1997<400>34Pro Ala Lys Arg Ala Arg Arg Gly Tyr Lys1 5 10<210>35<211>17
<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Kaneko，H<303>Biochem.Biophys.Res.Commun.
<305>240<306>348-353<307>1997<400>35Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys1 5 10 15Lys<210>36<211>17<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Kaneko，H<303>Biochem.Biophys.Res.Commun.
<305>240<306>348-353<307>1997<400>36Arg Arg Glu Arg Asn Lys Met Ala Ala Ala Lys Cys Arg Asn Arg Arg1 5 10 15Arg<210>37<211>17<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Kaneko，H<303>Biochem.Biophys.Res.Commun.
<305>240
<306>348-353<307>1997<400>37Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg Lys1 5 10 15Leu<210>38<211>17<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Kaneko，H<303>Biochem.Biophys.Res.Commun.
<305>240<306>348-353<307>1997<400>38Lys Lys Ser Lys Lys Gly Arg Gln Glu Ala Leu Glu Arg Leu Lys Lys1 5 10 15Ala<210>39<211>17<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Kaneko，H<303>Biochem.Biophys.Res.Commun.
<305>240<306>348-353<307>1997<400>39Arg Lys Glu Trp Leu Thr Asn Phe Met Glu Asp Arg Arg Gln Arg Lys1 5 10 15
Leu<210>40<211>17<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Kaneko，H<303>Biochem.Biophys.Res.Commun.
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<301>Kaneko.H<303>Biochem.Biophys.Res.Commun.
<305>240<306>348-353<307>1997<400>41Arg Lys Arg Lys Lys Met Pro Ala Ser Gln Arg Ser Lys Arg Arg Lys1 5 10 15Thr<210>42<211>23<212>PRT
<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Eguchi，H<303>J.Biol.Chem.
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<211>13<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
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<305>26<306>12060-12064<307>1995<400>47Leu Glu Lys Lys Val Lys Lys Lys Phe Asp Trp Cys Ala1 5 10<210>48<211>7<212>PRT<213>阿拉伯芥<300>
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<301>Vandromme，M<303>Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
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<300>
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<301>Tinland.B<303>Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
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<300>
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Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp1 5<210>65<211>17<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
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<300>
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1 5<210>70<211>7<212>PRT<213>猿病毒40<300>
<301>Wychowski，C<303>J.Virol.
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Lee，<303>J.Biol.Chem.
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<301>Dang，Lee，<303>J.Biol.Chem.
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<301>Dang，Lee，<303>J.Biol.Chem.
<305>264<306>18019-<307>1989<400>74Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro
1 5<210>75<211>9<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Dang，Lee，<303>J.Biol.Chem.
<305>264<306>18019-<307>1989<400>75Ser Lys Arg Val Ala Lys Arg Lys Leu1 5<210>76<211>10<212>PRT<213>啤酒酵母<300>
<301>Rhee，S<303>Yeast<305>5<306>149-<307>1989<400>76Ile Lys Tyr Phe Lys Lys Phe Pro Lys Asp1 5 10<210>77<211>7<212>PRT<213>啤酒酵母<300>
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<303>EMBO J.
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<301>Underwood.M<303>EMBO J.
<305>9<306>91-<307>1990<400>78Lys His Arg Lys His Pro Gly1 5<210>79<211>8<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Kato，G<303>Genes Dev.
<305>6<306>81-<307>1992<400>79Pro Gln Ser Arg Lys Lys Leu Arg1 5<210>80
<211>9<212>PRT<213>現(xiàn)代人類<300>
<301>Youssoifan.H<303>BloodCellMolDis<305>25<306>305-<307>1999<400>80Lys Lys Glu Lys Lys Lys Ser Lys Lys1 5<210>81<211>9<212>PRT<213>人體免疫缺陷病毒<400>81Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu1 5<210>82<211>10<212>PRT<213>小家鼠<400>82Leu Ala Leu Lys Leu Ala Gly Leu Asp Ile1 5 10<210>83<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>83Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5
<210>84<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>84Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu1 5 10 15<210>85<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>85Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5 10 15<210>86<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>86Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Leu Pro Pro Leu1 5 10 15Glu Arg Leu Thr Leu Asp20<210>87<211>23<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>87Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu1 5 10 15Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val20<210>88<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>88Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu1 5 10 15<210>89<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>89Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5 10 15<210>90<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>90
Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Ala Leu Lys Leu Ala Gly Leu Asp1 5 10 15Ile<210>91<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>91Leu Ala Leu Lys Leu Ala Gly Leu Asp Ile Arg Lys Lys Lys Arg Lys1 5 10 15Val<210>92<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>92Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5 10<210>93<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>93Arg Ile Arg Lys Lys Leu Arg Arg Ile Arg Lys Lys Leu Arg1 5 10
<210>94<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>94Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg1 5 10 15Arg Arg<210>95<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>95Pro Arg Arg Arg Lys Pro Arg Arg Arg Lys1 5 10<210>96<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>96Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr1 5 10 15Val Val<210>97<211>16<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>97Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val1 5 10 15<210>98<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>98Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Arg Lys Lys Lys Arg Lys Vall 5 10<210>99<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>99Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Arg Lys1 5 10 15Lys Lys Arg Lys Val20<210>100<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>100Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Arg Lys1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val20 25<210>101<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述含酰胺端基的設計出的抗菌性多肽<400>101Pro Arg Arg Arg Lys1 5<210>102<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述含酰胺端基的設計出的抗菌性多肽<400>102Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val5<210>103<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述含酰胺端基的設計出的抗菌性多肽<400>103Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5 10<210>104<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽
<400>104Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val1 5<210>105<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>105Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Val Lys Arg Lys Lys Lys Arg1 5 10<210>106<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>106Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Lys Arg Lys Lys Lys Arg1 5 10<210>107<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>107Leu Lys Arg Lys Leu Gln Arg Leu Lys Arg Lys Leu Gln Arg1 5 10<210>108<211>17
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>108Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Leu Gly Lys Leu Ala Leu Gly Lys1 5 10 15Leu<210>109<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>109Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Ile Ala Gly Lys1 5 10 15Ile<210>110<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>110Met Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val Arg Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5 10 15<210>111<211>139<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成DNA
對設計出的抗菌性多肽編碼的序列<220>
<221>CDS<222>(86)..(130)<400>111gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata tacat atg cgc att cgc aaa aaa ctc cgc cgt 112Met Arg Ile Arg Lys Lys Leu Arg Arg1 5atc cgt aag aaa ctc cgc taatgaata139Ile Arg Lys Lys Leu Arg10 15<210>112<211>15<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>112Met Arg Ile Arg Lys Lys Leu Arg Arg Ile Arg Lys Lys Leu Arg1 5 10 15<210>113<211>160<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成DNA對設計出的抗菌性多肽編碼的序列<220>
<221>CDS<222>(86)..(151)<400>113gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata tacat atg cgc caa gct cgt cgt aat cgt cgc 112Met Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg
1 5cgt cgc tgg cgt ctg cca ccg ctc gaa cgc ttg acc ttg taatgaata 160Arg Arg Trp Arg Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu10 15 20<210>114<211>22<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>114Met Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Leu Pro Pro1 5 10 15Leu Glu Arg Leu Thr Leu20<210>115<211>166<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成DNA對設計出的抗菌性多肽編碼的序列<220>
<221>CDS<222>(86)..(157)<400>115gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata tacat atg cct aag aag aaa cgt aag gtc tta 112Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu1 5ccg cca tta gaa cgt ctg act tta ccg aaa aag aag cgc aaa gtt 157Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val10 15 20taatgaata166
<210>116<211>24<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述設計出的抗菌性多肽<400>116Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr1 5 10 15Leu Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val20<210>117<211>85<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成DNA用作引物<400>117gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata tacat 85<210>118<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成DNA用作引物<400>118tattcattag cggagtttct tacgg 25<210>119<211>25<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成DNA用作引物<400>119tattcattac aaggtcaagc gttcg 25<210>120<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成DNA用作引物<400>120tattcattaa actttgcgct tcttt 25<210>121<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(7)..(72)<220>
<223>人工序列描述合成DNA對設計出的抗菌性多肽編碼的序列<400>121gaattc atg cat cac cat cac cat cac gaa cgt ata cgt aaa aag ctg 48Met His His His His His His Glu Arg Ile Arg Lys Lys Leu1 5 10cgt cgc atc cgt aaa aag ctg cgt taactgcag 81Arg Arg Ile Arg Lys Lys Leu Arg15 20<210>122<211>22
<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述設計出的多肽<400>122Met His His His His His His Glu Arg Ile Arg Lys Lys Leu Arg Arg1 5 10 15Ile Arg Lys Lys Leu Arg20<210>123<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成DNA<400>123ctgcagttaa cgcagctttt tacggatgcg acgcagcttt ttacgtatac gttcgtgatg 60gtgatggtga tgcatgaatt c 8權利要求
1.自然中不存在的人工合成抗菌性多肽，其特征在于，肽鏈中含1單位或2單位以上的1種或2種以上的核定位信號序列NLS和/或對所述NLS實施局部變異的序列，所述1單位或2單位以上的NLS和/或NLS變異序列中所含氨基酸殘基的總數(shù)至少為5個，且占構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的30％以上。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)在100以下。
3.如權利要求1或2所述的多肽，其特征在于，構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的40％以上為堿性氨基酸殘基。
4.如權利要求1～3中任一項所述的多肽，其特征在于，所述NLS和/或NLS的變異序列有2單位以上相互接近。
5.如權利要求1～4中任一項所述的多肽，其特征在于，所述NLS和/或NLS的變異序列中所含氨基酸殘基總數(shù)占構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的90％以上。
6.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，肽鏈中含有至少1單位的核轉出信號序列NES或對NES經局部變異的序列。
7.如權利要求6所述的多肽，其特征在于，所述NES和/或NES變異序列的至少1單位配置于接近所述NLS和/或NLS變異序列的N末端側或C末端側。
8.自然中不存在的人工合成抗菌性多肽，其特征在于，含有選自序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116中任一序列號所示氨基酸序列中的至少1種氨基酸序列，或該序列中的一個至多個氨基酸殘基被置換、缺失和/或添加而形成的變異氨基酸序列，所述至少1種氨基酸序列或變異氨基酸序列中所含氨基酸殘基的總數(shù)占構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的30％以上。
9.如權利要求8所述的多肽，其特征在于，構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)在100以下。
10.自然中不存在的人工合成抗菌性多肽，其特征在于，基本上由選自序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116中任一序列號所示氨基酸序列的至少1種氨基酸序列或該序列中的一個至多個氨基酸殘基被置換、缺失和/或添加而形成的變異氨基酸序列構成。
11.如權利要求1～10中任一項所述的多肽，其特征在于，肽鏈的C末端氨基酸殘基被?；?br> 12.含有如權利要求1～11中任一項所述的抗菌性多肽和可用于制藥的載體的抗菌劑。
13.自然中不存在的人工合成多核苷酸，其特征在于，含有對權利要求1～8中任一項所述的抗菌性多肽編碼的核苷酸序列和/或與該序列互補的核苷酸序列。
14.自然中不存在的人工合成多核苷酸，其特征在于，含有對具備下述(a)和(b)的要件(a)構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)在5～100；(b)含有選自序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116所示各氨基酸序列中至少1種氨基酸序列或該序列的一或多個氨基酸殘基被置換、缺失和/或添加而形成的變異氨基酸序列的抗菌性多肽編碼的核苷酸序列和/或與該序列互補的核苷酸序列。
15.自然中不存在的人工合成多核苷酸，其特征在于，含有對基本上由選自序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116所示各氨基酸序列中的至少1種氨基酸序列或該序列的一個至多個氨基酸殘基被置換、缺失和/或添加而形成的變異氨基酸序列構成的抗菌性多肽編碼的核苷酸序列和/或與該序列互補的核苷酸序列。
16.對權利要求1～10的任一項所述的抗菌性多肽編碼的核苷酸序列。
17.對選自序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116所示各氨基酸序列的至少1種氨基酸序列或該序列的一個至多個氨基酸殘基被置換、缺失和/或添加而形成的變異氨基酸序列編碼的核苷酸序列。
18.抗菌性多肽的制造方法，其特征在于，包括選擇至少1種已知核定位信號序列NLS的由5個氨基酸殘基構成的氨基酸序列；設計含1單位或2單位以上的所選NLS和/或該NLS實施了局部變異的序列，且所述1單位或2單位以上的NLS和/或NLS的變異序列中所含氨基酸殘基總數(shù)占全部氨基酸殘基數(shù)的30％以上的肽鏈；和合成含有所述設計的肽鏈的抗菌性多肽。
19.如權利要求18所述的制造方法，其特征在于，所述NLS的局部變異包括(a)～(c)的處理方法中的至少1個(a)使天然NLS至少缺失1個非堿性氨基酸殘基；(b)使天然NLS至少添加1個堿性氨基酸殘基；及(c)使天然NLS所含至少1個非堿性氨基酸殘基被置換為堿性氨基酸殘基。
20.如權利要求18所述的制造方法，其特征在于，使用選自序列號83、序列號84、序列號85、序列號86、序列號87、序列號88、序列號89、序列號90、序列號91、序列號92、序列號93、序列號94、序列號95、序列號96、序列號97、序列號98、序列號99、序列號100、序列號101、序列號102、序列號103、序列號104、序列號105、序列號106、序列號107、序列號108、序列號109、序列號110、序列號112、序列號114、序列號116所示各氨基酸序列中的至少1種氨基酸序列設計所述肽鏈。
21.如權利要求18～20任一項所述的制造方法，其特征在于，所設計的肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)在100以下。
22.如權利要求18～21任一項所述的制造方法，其特征在于，所設計的肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的40％以上為精氨酸和/或賴氨酸。
23.如權利要求18～22任一項所述的制造方法，其特征在于，所設計的肽鏈的所述NLS和/或NLS變異序列的2單位以上相互接近。
24.如權利要求18～23任一項所述的制造方法，其特征在于，所設計的肽鏈的所述NLS和/或NLS變異序列中所含氨基酸殘基的總數(shù)占構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的90％以上。
25.如權利要求18～24任一項所述的制造方法，其特征在于，由化學合成法制造成具有所述肽鏈的抗菌性多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及自然中不存在的人工合成抗菌性多肽及以該多肽為主成分抗菌劑。該多肽的肽鏈中含有1單位或2單位以上的1種或2種以上的核定位信號序列NLS和/或對該NLS實施局部變異的序列，該1單位或2單位以上的NLS和/或NLS的變異序列中所含氨基酸殘基的總數(shù)至少為5個，且占構成肽鏈的全部氨基酸殘基數(shù)的30％以上。
文檔編號A61P27/02GK1650005SQ0380933
公開日2005年8月3日 申請日期2003年4月24日 優(yōu)先權日2002年4月25日
發(fā)明者吉田徹彥, 久米勝嘉, 山田喜直, 松田陽子, 高麗寬紀 申請人:東亞合成株式會社