專利名稱：制備假胰島的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備功能性假胰島(pseudo islet)的方法。另外，本發(fā)明還涉及通過施用按照上述確定識(shí)別的化合物來治療糖尿病和糖尿病相關(guān)病癥的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病以糖尿病患者糖代謝障礙，血糖水平升高為其主要特征。按照障礙，可以將糖尿病分為兩種類型1型糖尿病，或者胰島素依賴型糖尿病(IDDM)，當(dāng)病人缺乏β-細(xì)胞(在胰腺，β-細(xì)胞產(chǎn)生胰島素)時(shí)發(fā)生此病癥，和2型糖尿病，或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)，當(dāng)病人β-細(xì)胞功能受損和胰島素效應(yīng)變化時(shí)發(fā)生此病癥。
2型糖尿病更為普遍，90-95％的高血糖病人罹患此型糖尿病。2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理是胰島素抵抗和胰島素缺乏。只要胰腺β-細(xì)胞保持釋放足夠量胰島素的能力來彌補(bǔ)胰島素抵抗，胰島素抵抗病人就能保持血糖正常而不發(fā)展成顯性糖尿病。然而，β-細(xì)胞不能一直保持胰島素的高輸出，最終，葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌下降，導(dǎo)致葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而發(fā)展成顯性糖尿病。高胰島素血癥還與胰島素抵抗、高甘油三酯血癥、低的高密度脂蛋白(HDL)膽固醇和血漿低密度脂蛋白(LDL)濃度的升高相關(guān)聯(lián)。胰島素抵抗以及高胰島素血癥與相關(guān)的代謝病癥的組合稱為“X綜合癥”，其與提高的患高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)十分相關(guān)。
糖尿病藥物治療的一個(gè)方法是提高胰島的功能，尤其是增強(qiáng)葡萄糖刺激的胰島素釋放。即施用引起分泌葡萄糖依賴的胰島素的藥物會(huì)降低與疾病相關(guān)的高血糖而不導(dǎo)致低血糖或引起不適當(dāng)?shù)母咭葝u素水平。然而，促胰島素化合物的識(shí)別和發(fā)展需要高效有力的方法來評價(jià)葡萄糖依賴的胰島素的釋放。
除影響胰島素分泌外，治療糖尿病(例如1型、2型、受損的葡萄糖耐量)的另一個(gè)方法是保存或恢復(fù)β-細(xì)胞量。最近的研究表明GLP-1及其類似物，如exendin-4，通過提高β-細(xì)胞的新生和增殖而引起β-細(xì)胞量的增加((De Leon等，Diabetes 52365-371，2003；Farilla等，Endocrinology 1434397-4408，2002)。通過影響凋亡、新生或者增殖來影響β-細(xì)胞量的藥物是治療1型和2型糖尿病的有用藥劑。因而，識(shí)別提高胰島素生物合成的藥物，對于通過防止或延緩β-細(xì)胞衰竭來治療糖尿病及其相關(guān)病癥是非常有益的。
目前，多數(shù)培養(yǎng)的胰腺β-細(xì)胞系對生理濃度的葡萄糖不產(chǎn)生應(yīng)答，因此不適于鑒定靶向于葡萄糖調(diào)節(jié)的胰島素釋放的化合物。分離的原代胰島保留了葡萄糖應(yīng)答性；然而，這些細(xì)胞的利用受限于(1)胰島的異質(zhì)性，導(dǎo)致不同組間的胰島有較大的差異；和(2)可分離的功能胰島的數(shù)量有限。
通過使用胰蛋白酶將胰島組織分散成單個(gè)細(xì)胞等嘗試來降低胰島間的變異。然而，這些分散的胰島細(xì)胞喪失了在葡萄糖及其它促分泌素刺激下釋放胰島素的能力。已證實(shí)一些細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用對功能來講是必須的。因而，分散的胰島細(xì)胞間的重新聚集是恢復(fù)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及保持生理調(diào)節(jié)胰島素釋放性能的一個(gè)途徑。
分散的胰島細(xì)胞重新聚合形成假胰島可以通過許多方法來實(shí)現(xiàn)，例如，將胰島細(xì)胞培養(yǎng)幾天(Weir等，Metabolism 33447-453，1984)，將該細(xì)胞機(jī)械旋轉(zhuǎn)2小時(shí)(Pipeleers等，Endocrinology117806-816，1985)，或者通過將細(xì)胞與珠子混合Hopcroft等，Endocrinology 1172073-2080，1985)。但是，這些方法非常耗時(shí)，且所產(chǎn)生的假胰島在大小及產(chǎn)量方面均有較大變化。由于這些限制，這些方法不適于發(fā)現(xiàn)藥物。
本發(fā)明提供了一種新的產(chǎn)生均勻分布假胰島的方法。本發(fā)明的方法還可以用于篩選靶向于胰腺β-細(xì)胞的化合物并且評價(jià)這些化合物對胰島素釋放的效力。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種新的制備均勻分布假胰島的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括將胰島用酶消化以及將分散的胰島接種到容器中，容器的表面積從頂部到底部逐漸減少(例如“V-底”板，離心管，錐形管)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備假胰島的方法包括進(jìn)一步的離心步驟。尤其是，在將分散的胰島細(xì)胞加入容器后，進(jìn)行離心。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于消化胰島的酶包括，例如，胰蛋白酶和脫氧核糖核酸酶I。另一方面，消化的胰島細(xì)胞在接種至容器前，進(jìn)行過濾。
另一方面，假胰島可以從新鮮或冷凍的胰島分離。另外，假胰島可以從任何動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物中分離。
用本發(fā)明的方法制備的假胰島可以用于多種分析。一方面，假胰島可以用于例如篩選和評價(jià)促胰島素或其它化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，假胰島可以用于例如測定胰島素濃度及分析胰島素的生物合成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的方法制備的假胰島可以用于表征化合物對第二信使活性(Second messenger actirity)的影響(例如，cAMP、三磷酸肌醇(IP3)、鈣)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及利用假胰島來檢測胰島細(xì)胞代謝物。而且，用本發(fā)明的方法制備的假胰島可以用于檢測胰高血糖素和促生長素抑制素釋放以及各種化合物對胰高血糖素和促生長素抑制素的調(diào)節(jié)。
另一方面，本發(fā)明的假胰島可以與其它類型細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)共培養(yǎng)。
本發(fā)明還涉及通過給需要的病人施用通過本發(fā)明的方法識(shí)別的化合物來治療糖尿病和糖尿病相關(guān)病癥的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及制備假胰島的試劑盒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒可以包括，例如，消化酶和容器(如“V-底”板)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還可以包括，例如，濾膜(尼龍濾膜)和緩沖溶液。


圖1.圖1表示對用本發(fā)明的方法制備的假胰島的表征。具體地說，用葡萄糖(A欄)、乙酰膽堿(B欄)、GLP-1(C欄)以及優(yōu)降糖(D欄)孵育假胰島，然后評價(jià)這些化合物對胰島素釋放的影響。
圖2.圖2表示對用本發(fā)明的方法制備的假胰島的表征。具體地說，用胰島素釋放促分泌素(毛喉素和IBMX)以及胰島素釋放抑制劑(促生長素抑制素和去甲腎上腺素)孵育假胰島，然后評價(jià)這些化合物對胰島素釋放的影響。
圖3.表示對與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的假胰島的表征。將假胰島與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，然后用量增加的GLP-1孵育，評價(jià)共培養(yǎng)對胰島素釋放的影響。
圖4.圖4表示利用本發(fā)明的方法制備的假胰島，來評價(jià)未知化合物對胰島素分泌的影響。具體地講，在有或無GLP-1存在的條件下，用未知化合物孵育假胰島，然后評價(jià)這些化合物對胰島素釋放的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明不局限于特定的方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、細(xì)胞系、動(dòng)物種或?qū)僖约八鲈噭┑?，因?yàn)樯鲜鰲l件可能會(huì)改變。并且，本文所用的術(shù)語僅是為了描述特定的實(shí)施方案，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的范圍的限制，發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求限定。
必須指出，除非上下文另有清楚的規(guī)定，否則作為在此處的應(yīng)用，單數(shù)形式“一”、“和”以及“這(個(gè))”也包括復(fù)數(shù)形式。這樣，例如，“一個(gè)細(xì)胞”表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，也包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的它的等同物等等。
另外，除非特別指明，本文所用的科技術(shù)語的含義是本領(lǐng)域所通用的含義。
定義為方便起見，將說明書、實(shí)施例以及權(quán)利要求中所使用的特定術(shù)語和詞組的含義定義如下。
術(shù)語胰島指任何小微粒狀內(nèi)分泌細(xì)胞的群體，其在胰腺的小管和胰泡間形成吻合的小梁，分泌胰島素、胰高血糖素以及促生長素抑制素。
假胰島指被重新聚集的分散的假胰島細(xì)胞。
完整的胰島指保留天然拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的分離的胰島。
術(shù)語促胰島素指刺激或影響胰島素的產(chǎn)生和活性。
術(shù)語動(dòng)物包括所有的哺乳動(dòng)物如嚙齒類(例如大鼠、小鼠、豚鼠和倉鼠)、靈長類包括人和猴、綿羊、犬(如狗)、貓、牛以及豬(如豬)。
術(shù)語容器指任何表面積從頂端到底部逐漸減少的容器。例如，容器可以是但不局限于“V”-底板、“U”-底板、離心管、錐形管、培養(yǎng)管、96孔板以及384孔板)。
術(shù)語化合物包括但不局限于激動(dòng)劑(agonist)、拮抗劑、小分子以及抗體。例如，術(shù)語“激動(dòng)劑”指模擬或上調(diào)(例如加強(qiáng)或補(bǔ)充)蛋白的生物活性的物質(zhì)。激動(dòng)劑可以是野生型蛋白或其衍生物，該衍生物具有野生型蛋白的至少一種生物活性。激動(dòng)劑也可以是上調(diào)基因表達(dá)或提高蛋白的至少一種生物活性的化合物。激動(dòng)劑還可以是提高多肽與另一種分子，例如，靶肽或核酸的相互作用的化合物。
“拮抗劑”是指下調(diào)(阻斷或抑制)蛋白的至少一種生物活性的物質(zhì)。拮抗劑可以是抑制或減弱蛋白質(zhì)與另一種分子，例如，靶肽或酶解物的相互作用的化合物。拮抗劑還可以是下調(diào)基因表達(dá)或減少已表達(dá)蛋白的量的化合物。
“小分子”指核酸、肽、多肽、模擬肽(Peptidomimetics)、碳水化合物、脂類或其它無機(jī)或有機(jī)分子。
術(shù)語“抗體”包括任何同種型(IgG，IgA，IgM，IgE等)的全抗體及其片段?？贵w可以用常規(guī)的技術(shù)片段化，片段可以按應(yīng)用進(jìn)行篩選。因而，該術(shù)語包括能與某種蛋白選擇性相互作用的抗體分子的蛋白酶刀割或重組制備的片段。此種蛋白水解和/或重組片段的例子包括但不局限于Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv以及含有通過肽接頭連接的V[L]和/或V[H]的單鏈抗體(scFv)。這些單鏈抗體可以通過共價(jià)或非共價(jià)連接，形成具有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體。本發(fā)明包括多克隆、單克隆或其它純化制備的抗體及重組抗體。
本發(fā)明描述了均勻分布的假胰島的制備及其在促胰島素化合物的研究和開發(fā)中的應(yīng)用。
迄今為止，利用細(xì)胞培養(yǎng)板中的胰島細(xì)胞來研究胰島素釋放的多種努力的失敗主要?dú)w因于兩個(gè)方面1)胰島拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的缺失，因而缺乏對胰島素促分泌素的應(yīng)答；和2)延長培養(yǎng)后，細(xì)胞對培養(yǎng)板粘附的缺失。
為了解決這些問題，本發(fā)明提供了新的利用胰島細(xì)胞孵育方法的途徑。該方法的關(guān)鍵步驟是將分散的胰島細(xì)胞接種到容器，其中該容器的表面積從頂部到底部逐漸減少(例如，“V底”板)。接著離心后產(chǎn)生假胰島。使用此類容器的優(yōu)點(diǎn)是分散的胰島細(xì)胞收集在容器的底部，形成細(xì)胞簇。細(xì)胞簇形成假胰島。此細(xì)胞收集步驟不能在平底板完成，因?yàn)殡x心只將細(xì)胞沿著板底部分散，因此細(xì)胞不能形成假胰島。
離心是該制備假胰島方法的另一關(guān)鍵步驟。在分散的細(xì)胞接種于容器后，單個(gè)細(xì)胞會(huì)在容器底部不均勻的分布。這些不均勻的細(xì)胞簇在大小上不同，因而在胰島素釋放方面也會(huì)有較大差異。此種表面積從容器頂部到底部逐漸減小的容器與離心步驟的結(jié)合使相似假胰島的產(chǎn)生成為可能。因此，這種假胰島的制備方法是非常高效并有力的。過夜培養(yǎng)后，胰島素釋放恢復(fù)，假胰島對葡萄糖及其它促分泌素產(chǎn)生應(yīng)答。而且，該方法還使得培養(yǎng)基更換過程中細(xì)胞的損失最小化，其中培養(yǎng)基的更換在實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)有多次。
與傳統(tǒng)的靜態(tài)胰島孵育方法相比，本發(fā)明的胰島細(xì)胞孵育方法有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)。首先，該方法大大降低了完整胰島的胰島素釋放的變異。胰島由α-、β-和δ細(xì)胞組成，這些細(xì)胞類型的組成在不同的胰島有很大的差異。另外，每個(gè)胰島的細(xì)胞總量的范圍在1,000-10,000。因而，胰島是非同質(zhì)的器官。盡管在相同的條件下進(jìn)行處理，但是胰島的異質(zhì)性仍會(huì)引起不同胰島在胰島素釋放上的較大差異(Hopcroft等，Hormon.Metab.Res.17559-561，1985；Colella等，LIfe Sci.371059-1065，1985)。這種差異極大地限制了靜態(tài)胰島孵育在藥學(xué)工業(yè)上的應(yīng)用。在本發(fā)明的方法中，用胰蛋白酶將胰島組織分散成單個(gè)的細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞接種到容器中以形成假胰島。從而克服了胰島的異質(zhì)性，大大提高了實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量。
其次，本發(fā)明方法極大提高了分析能力。傳統(tǒng)的靜態(tài)胰島孵育需要在每個(gè)孵育孔加至少5個(gè)胰島(Liang等，Biochim.Biophys.Acta14051-13，1998)，然而，本發(fā)明的方法僅需要2,500個(gè)胰島細(xì)胞(其大小大約相當(dāng)于一個(gè)小胰島)。另外，用完整胰島需要相似大小的數(shù)組胰島，而且由于分離的胰島只有一部分可以使用，從而限制了實(shí)驗(yàn)的規(guī)模。但是，本發(fā)明的方法利用分散的胰島細(xì)胞，因此所有分離的胰島均可以用于研究中。而且，本發(fā)明的方法避免了對每個(gè)胰島的人工篩選，在樣品制備上節(jié)省了大量時(shí)間。
總之，本發(fā)明的方法是對目前使用的胰島細(xì)胞純化方法的改進(jìn)，顯著提高了胰島細(xì)胞的制備效率以及特定實(shí)驗(yàn)的分析能力。
這種新方法已被用來對在傳統(tǒng)的胰島系統(tǒng)中激活或抑制胰島素分泌的化合物和肽進(jìn)行表征。例如，葡萄糖是胰島素從胰島β細(xì)胞釋放的主要生理調(diào)節(jié)劑。當(dāng)血糖水平低于或等于5mM時(shí)，基礎(chǔ)胰島素釋放是很低的。然而，血糖水平從5mM升高到15mM時(shí)，會(huì)增加胰島素釋放，從而使血漿胰島素水平升高。分離的胰島細(xì)胞仍很好保留了這種葡萄糖應(yīng)答性，這是評價(jià)胰島制備和靜態(tài)胰島孵育質(zhì)量的關(guān)鍵。利用本發(fā)明的方法，用濃度為2.5-20mM的葡萄糖孵育分散的胰島細(xì)胞。隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的升高，胰島素從β-細(xì)胞中的釋放逐漸增加，在葡萄糖濃度為15mM時(shí)達(dá)到平臺(tái)(見圖1，A)。該結(jié)果表明，由本發(fā)明的分散的胰島細(xì)胞方法制備的假胰島保留了葡萄糖應(yīng)答性和胰島素釋放。
在另外的研究中，用本發(fā)明的方法制備的假胰島來分析乙酰膽堿、GLP-1以及優(yōu)降糖對胰島素釋放的影響。乙酰膽堿(Ach)是能以葡萄糖依賴方式刺激胰島素釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，GLP-1是增強(qiáng)葡萄糖刺激的胰島素釋放的腸促胰島素。用含8mM葡萄糖以及Ach或GLP-1的培養(yǎng)基孵育按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Ach和GLP-1存在的情況下，觀察到對胰島素分泌的顯著的刺激效應(yīng)，兩者的EC50值分別為10.1μM和4.8μM(圖1，B和C)。這一數(shù)據(jù)表明，按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島細(xì)胞對Ach和GLP-1的應(yīng)答與在完整的胰島細(xì)胞觀察到的相似(Gilon等，Endocr.Rev.22565-604，2001；Siege等，Eur.J.Clin.Invest.29610-614，1999)。
優(yōu)降糖通過阻斷KATP通道以及提高細(xì)胞內(nèi)鈣水平刺激胰島素釋放。這種促胰島素效應(yīng)在低(3mM)和高(≥8mM)葡萄糖濃度時(shí)均可發(fā)生。這種特征性效應(yīng)在完整胰島的研究中已有報(bào)道(Boyd等，Am.J.Med.893S-10S，1990)。按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島細(xì)胞顯示與文獻(xiàn)報(bào)道相似的胰島素釋放應(yīng)答(Sako等，Metabolism35944-949，1986)。優(yōu)降糖對于胰島素釋放的EC50值在葡萄糖濃度為8mM時(shí)為0.37μuM(圖1，D)。
細(xì)胞第二信使，環(huán)腺苷酸(cAMP)在葡萄糖刺激的胰島素釋放中發(fā)揮重要作用。在用完整胰島進(jìn)行的研究中，毛喉素和IBMX都增加胰島組織中cAMP的含量，并刺激胰島素釋放(Gromada等，PflugersArch.435583-594，1998；Ammon等，Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol.326364-367，1984；Ziegler等，Acta Biol.Med.Ger.41117-1177，1982)。按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島細(xì)胞對胰島素的釋放也表現(xiàn)出相似的毛喉素和IBMX效應(yīng)(圖2，A)。當(dāng)葡萄糖濃度為8mM時(shí)，毛喉素和IBMX對于分散胰島細(xì)胞的胰島素釋放的EC50值分別為0.9μuM和21.9μM。
在完整胰島的研究中已證明，葡萄糖刺激的胰島素釋放受到神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)或促生長素抑制素，一種腸道激素的明顯抑制(Yamazaki等，Mol.Pharmacol.21648-653，1982；Claro等，Acta Endrocrinol.(Copenh)85379-388，1977)。按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島細(xì)胞表明NE和促生長素抑制素以劑量依賴的方式抑制葡萄糖刺激的胰島素釋放，其IC50分別為56.7nM和0.9nM(圖2，B)。
胰島β-細(xì)胞的存活及其在組織培養(yǎng)中的功能可以通過將胰島與其它細(xì)胞共培養(yǎng)而得到促進(jìn)，這一點(diǎn)在胰島細(xì)胞單層培養(yǎng)物中已有報(bào)道(Rabinovitch等，Diabetes 28(12)1108-13，1979)。按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島細(xì)胞表明，當(dāng)假胰島與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，GLP-1介導(dǎo)的胰島素分泌增強(qiáng)(圖3)。
在按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島中可以評價(jià)促胰島素化合物在有葡萄糖存在以及有或無GLP-1存在下對胰島素分泌的促進(jìn)作用(圖4)。
總之，上述研究的結(jié)果證實(shí)，按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島細(xì)胞與用完整的胰島細(xì)胞所得數(shù)據(jù)相似。因而，按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島細(xì)胞適于替代傳統(tǒng)的靜態(tài)胰島孵育方法，可以用于篩選和評價(jià)促胰島素化合物。而且，按照本發(fā)明的方法制備的假胰島還可以用于檢測胰島素含量、胰島素生物合成以及化合物對例如cAMP(例如，Direct SPA Screening Biotrak Assay Kit，Amersham，Piscataway，NJ)的影響，還可以用來檢測胰島細(xì)胞的代謝物(例如，光譜或熒光酶分析或者其它任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法)。
另外，在按照本發(fā)明的方法制備的假胰島中有大量的α-細(xì)胞。因而，這些假胰島細(xì)胞可以用于檢測胰高血糖素的釋放。高胰高血糖素血癥在2型糖尿病是常見的現(xiàn)象。胰高血糖素的主要生理效應(yīng)是提高肝臟葡萄糖的產(chǎn)生。2型糖尿病患者循環(huán)胰高血糖素水平的升高是空腹高血糖的主要原因。因此，胰高血糖素釋放的抑制或胰高血糖素對靶組織效應(yīng)的降低是治療糖尿病的另一種方法。按照本發(fā)明的方法制備的分散的胰島細(xì)胞提供了檢測胰高血糖素釋放及其被多種化合物調(diào)節(jié)的有力方法。
本發(fā)明的方法可以用來識(shí)別有效治療2型糖尿病(包括伴隨的糖尿病異常脂血癥和其它糖尿病并發(fā)癥)以及其它糖尿病相關(guān)病癥如高血糖、高胰島素血癥、糖耐受損、空腹血糖受損、異常脂血癥、高甘油三酯血癥、X綜合征、胰島素抵抗、肥胖、動(dòng)脈硬化癥、高脂血癥、高膽固醇血癥、低HDL水平、高血壓、心血管疾病(包括動(dòng)脈粥樣硬化癥、冠心病、冠狀動(dòng)脈疾病和高血壓)、腦血管疾病、外周血管疾病、狼瘡、多囊性卵巢綜合癥、癌癥發(fā)生和增生等的化合物。
本發(fā)明的方法識(shí)別的化合物的活性可以通過大量的本領(lǐng)域公知的體內(nèi)分析方法來驗(yàn)證。例如，為了驗(yàn)證治療糖尿病及其相關(guān)病癥例如X綜合癥、糖耐量受損、空腹血糖受損以及高胰島素血癥或動(dòng)脈粥樣硬化癥和相關(guān)的疾病，例如高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥的藥劑的功能，可以使用如下方法檢測血糖水平的方法db/db小鼠(購自Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)取血(通過眼或尾靜脈)，然后按照相等的平均血糖水平分組?？诜o予(用可藥用載體中的管飼法給予)待測化合物，每日一次，持續(xù)14天。然后再通過眼或尾靜脈給動(dòng)物取血，并檢測血糖水平。各種情況下，血糖水平的檢測均使用Glucometer Elite XL(Bayer Corporation，Elkhart，IN)。
檢測甘油三酯水平的方法hApoAl小鼠(購自JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME)取血(通過眼或尾靜脈)，然后按照相等的平均血清甘油三酯水平分組?？诜o予(與可藥用載體結(jié)合，以管飼法給予)待測化合物，每日一次，持續(xù)8天。然后再通過眼或尾靜脈給動(dòng)物取血，并檢測血清甘油三酯水平。各種情況下，甘油三酯水平的檢測都使用Technicon Axon Autoanalyzer(Bayer Corporation，Tarrytown，NY)。
檢測HDL-膽固醇水平的方法為檢測血漿HDL-膽固醇水平，給hApoA1小鼠取血，并按照相等的平均血漿HDL-膽固醇水平分組。口服給予載體或待測化合物，每日一次，持續(xù)7天。第8天取血。血漿HDL-膽固醇水平的檢測用Synchron Clinical System(CX4)(BeckmanCoulter，F(xiàn)ulletyon，CA)。
檢測總膽固醇、HDL-膽固醇、甘油三酯和葡萄糖水平的方法在另一個(gè)體內(nèi)分析中，給肥胖的猴取血，然后口服給予載體或待測化合物，每日一次，連續(xù)4周，然后取血。用Synchron Clinical System(CX4)(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)分析血清總膽固醇、HDL-膽固醇、甘油三酯以及葡萄糖。脂蛋白亞類分析通過Oliver等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 985306-5311，2001)所述的NMR光譜學(xué)方法進(jìn)行。
檢測對心血管參數(shù)影響的方法對心血管參數(shù)(如心率和血壓)也進(jìn)行了評價(jià)。口服給予SHR大鼠載體或待測化合物，每日一次，持續(xù)2周。通過利用Grinsell等(Am.J.Hypertens.13370-375，2000)所述的尾部加套方法(tail-cuff method)來測量血壓和心率。對猴子，血壓和心率的測定利用Shen等(J.Pharmacol.Exp.Therap.2781435-1443，1996)所述的方法。
按照上述方法或其它已知的用于評價(jià)哺乳動(dòng)物上述病癥治療效果的方法，通過將這些結(jié)果與用于治療這些病癥的已知藥劑的結(jié)果進(jìn)行對比，可以很容易地確定治療每種目的病癥的化合物的有效劑量。治療這些病癥之一時(shí)所要給予的活性組分的量固所用化合物和劑量單位、給藥方式、療程、治療患者的年齡和性別以及待治療病癥的性質(zhì)和程度的不同而有很大的區(qū)別。
要給予的活性組分的總量通常在約0.001mg/kg-約200mg/kg，優(yōu)選約0.01mg/kg-約200mg/kg體重/天。每單位劑量可以含有約0.05mg-1500mg活性組分，可以在一天內(nèi)分一或多次給予。通過注射包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和胃腸外注射以及輸液技術(shù)給予的日劑量為約0.01-約200mg/kg。日直腸劑量可以為0.01-200mg/kg總體重。透皮濃度應(yīng)能保持日劑量在0.01-200mg/kg的范圍。
當(dāng)然，對每個(gè)患者的起始和持續(xù)劑量應(yīng)根據(jù)主治醫(yī)師確定的病情、所用化合物的活性、患者的年齡、患者的飲食、給藥的時(shí)間、給藥途經(jīng)、藥物的排泄率、藥物的組合等的不同而有所不同。治療的理想模式以及化合物的劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)的治療實(shí)驗(yàn)確定。
可以將按照本發(fā)明的方法鑒定的化合物通過適當(dāng)調(diào)配的藥物組合物形式給予需要的患者從而達(dá)到理想的療效。本發(fā)明所指的患者是需要對特定病情進(jìn)行治療的哺乳動(dòng)物，包括人。因此，本發(fā)明包括藥物組合物，所述藥物組合物由可藥用載體和按照本文所述方法識(shí)別的藥用有效量的化合物組成。所述可藥用載體是指任何以與活性組分的有效活性相一致的濃度給予時(shí)，由其所引起的副作用不致?lián)p害活性組分的藥效且對患者來說相對無毒無害的載體?；衔锏乃幱糜行Я渴侵改軐χ委煹奶囟ú“Y產(chǎn)生效果或影響的量。按照本發(fā)明方法識(shí)別的化合物可以用任何有效的常規(guī)劑量單位形式與可藥用載體一起給予，其中所述劑量單位形式包括，例如，直接和定時(shí)釋放的制劑，口服、胃腸外、局部應(yīng)用等等。
如果口服給藥，則可以將化合物制成固態(tài)或液態(tài)的制劑如膠囊、丸劑、藥片、錠劑、糖錠、含片、粉劑、溶液、懸浮液或乳液，可以按照藥物組合物制備領(lǐng)域已知的方法制備。固態(tài)劑量單位形式可以是具有普通的硬或軟殼的明膠型膠囊，其中含有例如表面活性劑、潤滑劑和惰性填料如乳糖、蔗糖、磷酸鈣和玉米淀粉。
在另一實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的方法識(shí)別的化合物可以用常規(guī)的片劑基質(zhì)制成片劑如與粘合劑如阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠組合的乳糖、蔗糖和玉米淀粉；服用后輔助片劑給藥后破碎和溶解的崩解劑如土豆淀粉、褐藻酸、玉米淀粉以及香口膠；提高片劑顆粒的流動(dòng)性并防止片劑材料粘附于所沖擊表面的潤滑劑，如滑石粉、硬脂酸或硬脂酸鎂、鈣或鋅；染料、著色劑和改善片劑的品質(zhì)使其易被患者接受的矯味劑等等。適于口服液體劑型使用的合適的賦形劑包括稀釋劑如水和醇類如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，加或不加可藥用表面活性劑、懸浮劑或乳化劑。各種其它材料可以作為包衣或改變劑量單位外觀的物質(zhì)使用。例如，片劑、丸劑或膠囊可以被紫膠、糖或兩者所包裹。
可分散的粉劑和顆粒適于含水懸浮液的制備。其提供與分散劑或潤濕劑、懸浮劑及一或多種防腐劑混合的活性組分。合適的分散或潤濕劑以及懸浮劑已在前面有示例。其它賦形劑如上述的甜味劑、矯味劑和著色劑也可以使用。
本發(fā)明的藥物組合物也可以是水包油乳液形式。油相可以是植物油如液體石蠟或植物油的混合物。合適的乳化劑可以是(1)自然生產(chǎn)的膠如阿拉伯樹膠和黃芪膠，(2)自然生產(chǎn)的磷脂如大豆和卵磷脂，(3)來源于脂肪酸和己糖醇酐的酯或部分酯，例如脫水山梨糖醇一油酸酯，和(4)所述部分酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)品，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯。乳劑還可以含有甜味劑和矯味劑。
油懸浮液可以通過將活性組分懸浮在植物油如花生油、橄欖油、芝麻油或可可油；或礦物油如液體石蠟而制得。油懸浮液可以包含增稠劑如蜂蠟、硬石蠟或十六烷醇。懸浮液還可以含有一或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或正丙酯；一或多種著色劑；一或多種矯味劑以及一或多種甜味劑如蔗糖或糖精。
糖漿和酏劑可以用甜味劑如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖制得。這樣的配方還可以含有濕潤劑、防腐劑、矯味劑和著色劑。
本發(fā)明的方法識(shí)別的化合物可以通過胃腸外給予，即皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，注射劑量的化合物與可藥用載體在生理可接受的稀釋劑中混合，其中所述可藥用載體包括滅菌液體或液體混合物如水、生理鹽水、葡萄糖水溶液及相關(guān)的糖溶液；醇類如乙醇、異丙醇或十六(烷)醇；二醇如丙二醇或聚乙二醇；甘油酮縮醇如2，2-二甲基-1，1-二氧戊環(huán)-4-甲醇，醚如聚(乙二醇)400；油；脂肪酸；脂肪酸酯或甘油酯；或乙?；舅岣视王?，其中加或不加藥用表面活性劑如肥皂或洗滌劑，懸浮劑如膠質(zhì)、卡波姆、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素或羧甲基纖維素或乳化劑和其它藥用佐劑。
可用于本發(fā)明胃腸外制劑的示例性的油是石油、動(dòng)物、植物和合成來源的，例如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄欖油、礦脂和礦物油。合適的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和異硬脂酸。合適的脂肪酸酯是，例如，乙基油酸酯和異丙基豆蔻酸酯。合適的肥皂包括脂肪堿性金屬、銨和三乙醇胺鹽以及合適的洗滌劑包括陽離子劑，例如，二甲基二烷基鹵化銨、烷基鹵化吡啶鎓、烷基乙酸胺；陰離子洗滌劑，例如，烷基、芳基和烯屬磺酸鹽、烷基、烯烴、醚和甘油一硫酸酯鹽及磺基丁二酸鹽；非離子洗滌劑，例如，氧化脂肪胺、脂肪酸鏈烷醇酰胺和聚氧烯聚丙烯共聚物；和兩性洗滌劑，例如烷基-β-氨基丙酸鹽和2-烷基咪唑啉季銨鹽及其混合物。
本發(fā)明的胃腸外組合物溶液中按重量通常含有約0.5％-約25％的活性組分。防腐劑和緩沖液也可以有利地使用。為了使注射點(diǎn)的疼痛最小化或?qū)⑵渫耆コ?，該組合物可以含有具有約12-約17的親水-親脂平衡(HLB)值的非離子表面活性劑。該制劑中表面活性劑按重量占約5％-約15％。表面活性劑可以是具有上述HLB的單組分或具有所需HLB的兩種或多種組分的混合物。
可用于胃腸外制劑的例證性表面活性劑是聚乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯族，例如，脫水山梨糖醇單油酸酯和帶有疏水基的環(huán)氧乙烷的高分子量加合物，該加合物由環(huán)氧丙烷和丙二醇縮合而成。
藥用組合物可以是滅菌注射水懸浮液。這樣的懸浮液可以按照已知的方法使用合適的分散或潤濕劑和懸浮劑制得，懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪膠和阿拉伯樹膠；分散或潤濕劑可以是自然產(chǎn)生的磷脂如卵磷脂、烯烴氧化物與脂肪酸的縮合物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯、環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如十七烷乙烯氧基十六烷醇、環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或者環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。
無菌注射劑還可以是存在于無毒性的胃腸外可接受稀釋劑或溶劑中的滅菌注射溶液或懸浮液。此處可用的稀釋劑或溶劑是，例如，水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的固定油也常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為達(dá)此目的，任何刺激性小的固定油都可以使用，包括合成的一甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸如油酸也可以用于注射劑的制備。
本發(fā)明的組合物還可以栓劑的形式用于直腸給藥。這些組合物可以通過將藥物與合適的非刺激性賦形劑混合制備，賦形劑在常溫下是固態(tài)，但在直腸溫度下變?yōu)橐簯B(tài)，從而在直腸中融化釋放出藥物。這樣的材料是，例如可可脂和聚乙二醇。
本發(fā)明方法中所用的另一種制劑利用透皮輸送裝置(“皮片(Patch)”)。此種透皮皮片可以用來按照控制的量提供本發(fā)明化合物的連續(xù)或不連續(xù)輸注。用來輸送藥物的透皮皮片的結(jié)構(gòu)和應(yīng)用在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的(參見，例如，美國專利No.5,023,252，此處引用作為參考)。這種皮片可以制備成連續(xù)地、脈動(dòng)地(Pulsatile)或按需地釋放藥物的結(jié)構(gòu)。
將藥物組合物經(jīng)由機(jī)械輸送裝置導(dǎo)入患者體內(nèi)是理想的或必要的。輸送藥物的機(jī)械輸送裝置的構(gòu)造和使用是本領(lǐng)域公知的。例如，將藥物直接輸送到腦部的直接技術(shù)通常涉及將藥物輸送導(dǎo)管放置到病人的腦室內(nèi)，從而不必經(jīng)過血腦屏障。這樣一種用于將藥物輸送到機(jī)體的特定的解剖區(qū)域的可植入的輸送系統(tǒng)在美國專利No.5,011,472中有描述，此處引入作為參考。
如果必要或需要的話，本發(fā)明的組合物還可以包含其它常規(guī)可藥用的化合物組分，通常指載體或稀釋劑。本發(fā)明的任何組合物均可以通過添加抗氧化劑如抗壞血酸或其它合適的防腐劑來保存。可以利用常規(guī)的工序?qū)⒔M合物制備成合適的劑型。
常用的可以用于配制藥物組合物使其按照預(yù)想的途徑給藥的可藥用成分包括酸化劑，例如但不局限于乙酸、檸檬酸、反丁烯二酸、鹽酸、硝酸和堿化劑，例如但不局限于氨水、碳酸銨、二乙醇胺、單乙醇胺、氫氧化鉀、硼酸鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、三乙醇胺和三乙醇胺(trolamine)。
其它藥用組分包括，例如，但不局限于吸附劑(如粉狀纖維素和活性炭)；氣霧劑推進(jìn)劑(例如二氧化碳、CCl2F2、F2ClC-CClF2和CClF3)；空氣置換劑(例如氮和氬)；抗真菌防腐劑(例如，苯甲酸、對-羥基苯甲酸丁酯、對-羥基苯甲酸乙酯、對-羥基苯甲酸甲酯、對-羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉)；抗菌防腐劑(例如，苯扎氯銨、芐索氯銨、芐醇、十六烷基氯化吡啶鎓、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和乙基汞硫代水楊酸鈉)；抗氧化劑(例如，抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸、丁基化羥基苯甲醚、丁化羥基甲苯、次磷酸、一硫代甘油、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、硫酸氫鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉)；結(jié)合材料(例如，嵌段聚合物、天然和合成橡膠、聚丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、硅氧烷和苯乙烯-丁二烯共聚物)；緩沖劑(例如，偏磷酸鉀、一代磷酸鉀、醋酸鈉、無水檸檬酸鈉和二水檸檬酸鈉)；載體劑(例如，阿拉伯樹膠糖漿、芳香糖漿、芳香酏劑、櫻桃糖漿、可可糖漿、柑桔糖漿、糖漿、玉米油、礦物油、花生油、芝麻油、無菌注射用氯化鈉和無菌注射用水)；螯合劑(例如，乙二胺四乙酸鈉和乙二胺四乙酸)；著色劑(例如，F(xiàn)D&C Red No.3、FD&C Red No.20、FD&C Yellow No.6、FD&C Blue No.2、D&C Green No.5、D&C OrangeNo.5、D&C Red No.8、焦糖和鐵銹紅)；澄清劑(例如膨潤土)；乳化劑(但不局限于阿拉伯樹膠、cetomacrogol、十六烷醇、硬脂酸甘油酯、卵磷脂、失水山梨糖醇一油酸酯、聚乙烯50硬脂酸酯)；膠囊化劑(例如，明膠和鄰苯二甲酸醋酸纖維素)；調(diào)味劑(例如，茴香油、肉桂油、可可油、薄荷醇油、柑桔油、薄荷油和香蘭素)；保濕劑(例如甘油、丙二醇、和山梨醇)；研磨劑(如礦物油和甘油)；油(例如落花生油、礦物油、橄欖油、花生油、芝麻油和植物油)；軟膏基料(例如羊毛脂、親水軟膏、聚乙二醇軟膏、礦脂、親水礦脂、白軟膏、黃軟膏、玫瑰水軟膏)；滲透增強(qiáng)劑(透皮輸送)(例如，單羥基醇或多羥基醇、飽和或不飽和脂肪醇、飽和或不飽和脂肪酯、飽和或不飽和二羧酸、精油、磷脂酰衍生物、腦磷脂、萜、酰胺、醚類、酮類和脲)；增塑劑(例如，鄰苯二甲酸二乙酯和甘油)；溶劑(例如，醇、玉米油、棉花籽油、甘油、異丙醇、礦物油、油酸、花生油、純凈水、注射用水、滅菌注射用水和滅菌沖洗用水)；硬化劑(例如十六醇、十六醇酯蠟、微晶蠟、石蠟、十八烷醇、白蠟和黃蠟)；栓劑基料(例如，可可黃油和聚乙二醇(混合物))；表面活性劑(例如，苯扎氯銨、nonoxynol10，oxtoxynol 9，多乙氧基醚，十二烷基硫酸鈉和失水山梨糖醇甘油一棕櫚酸酯)；懸浮劑(如瓊脂、膨潤土、卡波姆(carbomer)、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、高嶺土(kaolin)、甲基纖維素、黃芪膠和veegum)；甜味劑(例如天冬甜素、葡萄糖、甘油、甘露醇、丙二醇、糖精鈉、山梨醇和蔗糖)；片劑抗粘著劑(例如硬脂酸鎂和滑石粉)；片劑粘合劑(例如阿拉伯膠、藻酸、羧甲基纖維素鈉、可壓縮的蔗糖、乙基纖維素、明膠、液體葡萄糖、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(povidone)和預(yù)膠凝化淀粉)；片劑和膠囊的稀釋劑(例如磷酸氫鈣、高嶺土、乳糖、甘露糖醇、微晶纖維素、粉狀纖維素、沉淀的碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈉、山梨醇和淀粉)；片劑包衣劑(例如，液體葡萄糖、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、鄰苯二甲酸醋酸纖維素和紫膠)；片劑直接壓縮賦形劑(例如磷酸氫鈣)；片劑崩解劑(例如藻酸、羧甲基纖維素鈣、微晶纖維素、polacrillin potassium、藻酸鈉、乙醇酸淀粉鈉和淀粉)；片劑滑動(dòng)劑(glidant)(膠態(tài)二氧化硅、玉米淀粉和滑石粉)；片劑潤滑劑(例如硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、硬脂酸和硬脂酸鋅)；片劑/膠囊遮光劑(opaquant)(例如二氧化鈦)、片劑拋光劑(例如棕櫚蠟和白蠟)；增稠劑(例如蜂蠟、十六醇和石蠟)；張度劑(例如葡萄糖和氯化鈉)；增粘劑(例如藻酸、膨潤土、卡波姆、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(povidone)、藻酸鈉和黃芪膠)；潤濕劑(例如，十七乙烯基氧代十六烷醇、卵磷脂、聚乙烯山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯山梨醇單油酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯)。
按照本發(fā)明方法所識(shí)別的化合物可以作為單獨(dú)的藥劑施用也可以與一或多種其它藥劑組合使用，只要這種組合不引起難以接受的副作用。例如，本發(fā)明的組合物可以與已知的抗肥胖或與已知的抗糖尿病或其它適應(yīng)癥的藥劑(indication agent)等聯(lián)合，也可以與其混合物和組合物等聯(lián)合使用。
按照本發(fā)明方法識(shí)別的化合物也可以用于研究和診斷或作為分析參考標(biāo)準(zhǔn)等等。因此，本發(fā)明包括組合物，該組合物由惰性載體和有效量的按照本發(fā)明方法識(shí)別的化合物或其鹽或酯組成。惰性載體是指不與所攜帶的化合物相互作用但為其提供支持、運(yùn)送方式、容積和示蹤材料的物質(zhì)。化合物的有效量是指會(huì)對所作用的特定過程產(chǎn)生結(jié)果或施加影響的量。
適于皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等方式的制劑；合適的可藥用載體；以及制備和施用技術(shù)可以按照現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法準(zhǔn)備(參見，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，20thedition，2000)。
以下實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行示例性說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
膠囊配制膠囊按以下配制活性組分 40mg
淀粉109mg硬脂酸鎂1mg將這些組分混合，通過適當(dāng)?shù)木W(wǎng)篩，然后填充到硬的明膠膠囊內(nèi)。
片劑配制片劑按以下配制活性組分 25mg纖維素，微晶 200mg膠狀二氧化硅 10mg硬脂酸 5.0mg將這些組分混合壓縮形成片劑?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)暮蜔o水包衣來改善適口性、外觀和穩(wěn)定性或延緩吸收。
無菌IV溶液用無菌注射用水配制活性組分為5mg/ml的溶液，必要的話調(diào)節(jié)pH值。用5％的無菌葡萄糖將溶液稀釋到適于給藥的1-2mg/ml，以IV滴注給藥60分鐘以上。
肌內(nèi)懸浮液配制下述肌內(nèi)懸浮液活性組分 50mg/ml羧甲基纖維素鈉 5mg/mlTWEEN804mg/ml氯化鈉 9mg/ml苯甲醇 9mg/ml該懸浮液通過肌內(nèi)施用。
硬殼膠囊大量的單位膠囊通過用100mg粉狀活性組分、150mg乳糖、50mg纖維素和6mg硬脂酸鎂充填標(biāo)準(zhǔn)的兩片硬明膠膠囊而制備。
軟明膠膠囊制備活性組分與可消化的油如大豆油、棉籽油或橄欖油的混合物，然后通過正排代泵注射入融化的明膠來形成含有100mg活性組分的軟的明膠膠囊。將膠囊洗滌和干燥。將活性組分溶解于聚乙二醇、甘油和山梨醇的混合物中來制備易與水混合的藥物混合物。
速釋片劑/膠囊這些是按照常規(guī)和新方法制備的固體口服劑型。這些藥物單位可以不用水口服即迅速溶解和輸送。這些活性組分在含液體的組分如糖、明膠、膠質(zhì)和甜味劑等組分的液體中混合。這些液體通過冷凍干燥和固態(tài)提取技術(shù)被固化形成固體藥片或囊片。這些藥物化合物可以與粘彈性和熱彈性糖和聚合物或泡騰劑組分壓縮來形成多孔基質(zhì)以用于迅即釋放，而不需要水。
實(shí)施例本發(fā)明進(jìn)一步通過以下實(shí)施例來進(jìn)行示例性說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。所有引用內(nèi)容(包括文獻(xiàn)資料、公布的專利、公布的專利申請和同時(shí)待審的專利申請)均引入作為參考。
實(shí)施例1在96孔板中制備假胰島將來自Sprague Dawley大鼠的胰島分成大小為約1mm2或更小的小塊。然后，將組織用Hanks-Hepes緩沖液(127mM NaCl，5.4mMKCl，0.34mMNa2HPO4，4.4mMKH2PO4，20mM HEPES，1.2mM CaCl2/5mM葡萄糖)沖洗3次，接著在37℃水浴搖動(dòng)器用膠原酶消化10分鐘(Liberase，0.25mg/ml，Roche Diagnostic Corp.，Indianapolis，IN)。
用50ml Hanks-Hepes緩沖液沖洗消化的胰腺組織3次，除去膠原酶。然后將組織團(tuán)塊通過250μm的過濾器過濾，將過濾物與在Hanks-Hepes緩沖液中16ml 27％的Ficoll(Sigma，St.Louis，MO)w/v混合。將3層Ficoll(分別為23％，20.5％和11％；每個(gè)濃度8ml)置于處于27％Ficoll中的胰島組織混合物的頂部，形成梯度。
然后將Ficoll梯度在室溫下以1,600rpm離心10分鐘。胰島組織根據(jù)胰島大小，在11％和20.5％以及20.5％和23％之間的界面濃縮。然后，從這兩個(gè)界面收集胰島，用無Ca++的Hanks-Hepes緩沖液沖洗兩次。然后將胰島懸浮于含1mM EDTA的5ml無Ca++的Hanks-Hepes緩沖液中，并在室溫下孵育8分鐘。
將胰蛋白酶和脫氧核糖核酸酶I加入胰島懸浮液，終濃度分別為25μg/ml和2μg/ml。將該懸浮液在30℃振搖下孵育10分鐘。通過加入40ml含有10％FBS的RPMI 1640(GIBCO LifeTechnologies，Invitrogen，Carlsbad，CA)使胰蛋白酶消化終止。將胰蛋白酶消化過的胰島細(xì)胞通過63μm的尼龍膜過濾(PGCScientific，F(xiàn)rederick，MD)以除去大的細(xì)胞簇。
將分散的胰島細(xì)胞洗滌，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在顯微鏡下計(jì)數(shù)，然后接種到“V-底”96-孔板(每個(gè)孔2,500個(gè)細(xì)胞)。不過，每孔細(xì)胞范圍在1000-10000個(gè)也可使用。將分散的胰島細(xì)胞懸浮液以1,000rpm離心5分鐘。除去Hanks-Hepes緩沖液，置換為含10％FBS、1％青霉素-鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的200μl RPMI 1640培養(yǎng)基。然后，將96孔板在1,000rpm離心5分鐘以收集聚集在板V底部的形成假胰島的分散的胰島細(xì)胞。將這些假胰島在37℃含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，然后用于分析。
實(shí)施例2用成纖維細(xì)胞孵育假胰島將分散的胰島細(xì)胞(按照實(shí)施例1的方法制備的)用含10％FBS的常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基洗滌，在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，然后與成纖維細(xì)胞一起接種到“V-底”96孔板(每孔2,500個(gè)胰島細(xì)胞和1,250個(gè)成纖維細(xì)胞)。將細(xì)胞懸浮液以1,000rpm離心5分鐘，收集聚集在板的V底部的形成假胰島的分散的胰島細(xì)胞。將這些假胰島與成纖維細(xì)胞在37℃含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜共培養(yǎng)，用于分析。
實(shí)施例3假胰島的冷凍和融化將分散的胰島細(xì)胞(按照實(shí)施例1的方法制備的)按照上述方法計(jì)數(shù)，然后用含10％FBS和10％DMSO的常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到濃度為2×105細(xì)胞/ml。將一部分(1ml)轉(zhuǎn)移到冷凍管，在液氮中冷凍前，先將冷凍管置于液氮罐的氣相中的支架上。
將細(xì)胞解凍，然后用常規(guī)的培養(yǎng)基洗滌，再將其接種到“V-底”96孔板(每孔5,000個(gè)細(xì)胞)。接著，將96孔板以1,000rpm離心5分鐘，收集聚集在板的V底部的形成假胰島的分散的胰島細(xì)胞。將這些假胰島在37℃含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，然后用于分析。
實(shí)施例4用于胰島素釋放分析的靜態(tài)胰島孵育按照實(shí)施例1所述的方法制備假胰島。過夜孵育后，除去RPMI 1640培養(yǎng)基，將其置換為100μl Krebs-Ringer-Hepes緩沖液115mM NaCI，5.0mM KCl，24mM NaHCO3，2.2mMCaCl2，1mM MgCl2，20mM HEPES，0.25％BSA，0.002％酚紅，pH7.35-7.40)。細(xì)胞懸浮液以1,000rpm離心5分鐘，使分散的胰島細(xì)胞成丸。
將96-孔板中的假胰島在37℃連續(xù)用95％O2/5％CO2充氣的水浴中預(yù)孵育30分鐘。然后除去預(yù)孵育緩沖液，置換成含有各種測試基質(zhì)的50μl孵育緩沖液(Krebs-Ringer-Hepes緩沖液，pH7.35-7.40)。
再將96孔板以1,000rpm離心5分鐘，形成假胰島。將96-孔板中的假胰島在37℃水浴中靜止孵育60分鐘，該水浴連續(xù)用95％O2/5％CO2充氣。60分鐘孵育后，收集孵育緩沖液(25μl)用于胰島素含量分析(ELISA分析，ALPCO，NH)。
實(shí)施例5用于胰島素生物合成的靜態(tài)假胰島孵育按照實(shí)施例1所述制備假胰島。過夜培養(yǎng)后，將該假胰島在含有3mM葡萄糖的KRBH(135mM NaCl，3.6mMKCl，10mM HEPES，5mMNaHCO3，0.5mM NaH2PO4，0.5mM MgCl2，1.5mMCaCl2，0.1％牛血清白蛋白)中在37℃預(yù)孵育30分鐘，然后在37℃用測試化合物和2μM3H-亮氨酸(100μl)(Amersham，Piscataway，NJ)孵育90分鐘。接著，將假胰島用含有1mM亮氨酸(Sigma，St.Louis，MO)的KRBH洗滌3次，并溶解于2mM乙酸(100μl)中，超聲15秒，隨后用10NNaOH(20μl)中和。加入含有0.1％Triton X-100的HEPES(50mM)，使體積達(dá)到1ml，將樣品在1750×g自旋10分鐘。將蛋白A瓊脂糖(每樣品50μl)用抗-胰島素抗體(Linco，St.Charles，MO)(每樣品100μl)預(yù)孵育2小時(shí)，洗滌兩次。將抗體珠混合物(50μl)加入到750ul樣品中，在4℃過夜孵育。用含有0.1％Triton X-100的HEPES(50mM)洗滌免疫沉淀物3次，然后用閃爍計(jì)數(shù)儀對珠計(jì)數(shù)。
實(shí)施例6用于胰高血糖素釋放的靜態(tài)假胰島孵育按照實(shí)施例1所述制備假胰島。過夜培養(yǎng)后，除去RPMI 1640培養(yǎng)基，替換成100μl的Krebs-Ringer-Hepes緩沖液(115mM NaCl，5.0mM KCl，24mM NaHCO3，2.2mM CaCl2，1mM MgCl2，20mM HEPES，0.25％BSA，0.002％酚紅，pH7.35-7.40)。將細(xì)胞懸浮液以1,000rpm離心5分鐘以使分散的胰島細(xì)胞成丸。
將96-孔板中的假胰島在37℃水浴中預(yù)孵育30分鐘，該水浴連續(xù)用95％O2/5％CO2充氣。除去預(yù)孵育緩沖液，替換成含有各種測試化合物的50μl孵育緩沖液(Krebs-Ringer-Hepes緩沖液，pH7.35-7.40)再將96孔板以1,000rpm離心5分鐘以形成假胰島。將96-孔板中的假胰島在37℃水浴中靜止孵育60分鐘，該水浴連續(xù)用95％O2/5％CO2充氣。60分鐘孵育后，收集孵育緩沖液(25μl)用于胰高血糖素含量分析(Glucagon RIA kit；Linco，St。Charles，MO)。
實(shí)施例7鑒定促胰島素化合物的方法按照實(shí)施例1所述制備假胰島。洗滌分散的胰島細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，然后用200μl含10％FBS、1％青霉素-鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基將胰島接種到“V-底”96-孔板(每個(gè)孔2,500個(gè)細(xì)胞)。接著，將96孔板以1,000rpm離心5分鐘，收集聚集在板的“V-底”形成假胰島的分散的胰島細(xì)胞。將這些胰島在37℃含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
過夜培養(yǎng)后，除去RPMI 1640培養(yǎng)基，替換成100μl含有3mM葡萄糖的Krebs-Ringer-Hepes緩沖液(115mM NaCl，5.0mM KCl，24mM NaHCO3，2.2mM Cal2，1mM MgCl2，20mM HEPES，0.25％BSA，0.002％酚紅，pH7.35-7.40)。將細(xì)胞懸浮液以1,000rpm離心5分鐘以使分散的胰島細(xì)胞成丸。
將96-孔板中的假胰島在37℃水浴中預(yù)孵育30分鐘，該水浴連續(xù)用95％O2/5％CO2充氣。除去預(yù)孵育緩沖液，替換成含有測試化合物的50μl孵育緩沖液(Krebs-Ringer-Hepes緩沖液，pH7.35-7.40)。再將96孔板以1,000rpm離心5分鐘以形成假胰島。將96-孔板中的假胰島在37℃水浴中靜止孵育60分鐘，該水浴連續(xù)用95％O2/5％CO2充氣。30分鐘孵育后，收集孵育緩沖液(25μl)用于胰島素含量分析。
在不背離本發(fā)明范圍和精神的前提下，對本發(fā)明的方法和系統(tǒng)進(jìn)行各種調(diào)整和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。盡管本發(fā)明描述了特異的優(yōu)選實(shí)施方案，但這些實(shí)施方案不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。事實(shí)上，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的本發(fā)明實(shí)施方式的各種調(diào)整都應(yīng)在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備假胰島的方法，該方法包括用消化酶處理胰島；以及將消化后的胰島接種到容器中的步驟，其中所述容器的表面積從容器頂部到底部逐漸減小。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將所述胰島離心以使胰島聚集的步驟。
3.權(quán)利要求2的方法，其進(jìn)一步包括將所述假胰島冷凍的步驟。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是胰蛋白酶、脫氧核糖核酸酶I或分散酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中將所述消化后的胰島在接種前過濾。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述假胰島分離自哺乳動(dòng)物胰腺組織。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述哺乳動(dòng)物胰腺組織是人的。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述假胰島分離自新鮮的胰腺組織。
9.權(quán)利要求5的方法，其中所述假胰島分離自冷凍的胰腺組織。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述容器是V-底板。
11.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將假胰島與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的步驟。
12.一種識(shí)別促胰島素化合物的方法，其包括如下步驟按照權(quán)利要求1的方法分離假胰島；將測試化合物加入到分離的假胰島中；檢測所述化合物對胰島素分泌的影響。
13.一種治療糖尿病或糖尿病相關(guān)病癥的方法，該方法通過給予需要的患者以有效量的按照權(quán)利要求10的方法識(shí)別的化合物進(jìn)行。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述的糖尿病相關(guān)病癥選自高血糖、高胰島素血癥、糖耐量受損、空腹血糖受損、異常脂血癥、高甘油三酯血癥、X綜合征、胰島素抵抗、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化癥、高脂血癥、高膽固醇血癥、低HDL水平、高血壓、心血管疾病、腦血管疾病、外周血管疾病、狼瘡、多囊性卵巢綜合癥、癌癥發(fā)生和增生。
15.一種藥物組合物，其包含有效量的按照權(quán)利要求10的方法識(shí)別的化合物與一種可藥用載體。
16.一種用于制備假胰島的試劑盒，其包括消化酶和容器，所述容器的表面積從容器頂部到容器底部逐漸減小。
17.一種分析胰島素生物合成的方法，其包括如下步驟按照權(quán)利要求1的方法分離假胰島；將一種測試化合物加入到分離的假胰島中；檢測所述化合物對胰島素含量的影響。
18.一種治療糖尿病或糖尿病相關(guān)病癥的方法，該方法通過給予需要的患者以有效量的按照權(quán)利要求17的方法識(shí)別的化合物進(jìn)行。
19.一種檢測胰高血糖素釋放的方法，其包括如下步驟按照權(quán)利要求1的方法分離假胰島；將測試化合物加入到分離的假胰島中；檢測所述化合物對胰高血糖素含量的影響。
20.一種治療糖尿病或糖尿病相關(guān)病癥的方法，該方法通過給予需要的患者以有效量的按照權(quán)利要求19的方法識(shí)別的化合物進(jìn)行。
21.一種檢測促生長素抑制素釋放的方法，其包括如下步驟按照權(quán)利要求1的方法分離假胰島；將測試化合物加入到分離的假胰島中；檢測所述化合物對促生長素抑制素含量的影響。
22.一種治療糖尿病或糖尿病相關(guān)病癥的方法，該方法通過給予需要的患者以有效量的按照權(quán)利要求21的方法識(shí)別的化合物進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備假胰島的方法。另外，本發(fā)明還涉及通過施用按照本發(fā)明的方法識(shí)別的化合物來治療糖尿病和糖尿病相關(guān)病癥的方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1643134SQ03806740
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者Y·梁, J·朱, L·斯維特, J·N·利文斯頓 申請人:拜爾藥品公司