專利名稱：一種治療炎癥性腸病的藥物－羊表皮生長因子的提取、純化工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種治療炎癥性腸病的藥物——羊表皮生長因子的提取、純化工藝。
背景技術：
炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病率在我國有明顯增高的趨勢，已受到國內醫(yī)學界的普遍重視。由于現(xiàn)有的IBD藥物療效欠佳，副作用多，因此新的治療藥物不斷出現(xiàn)。表皮生長因子(EGF)首先由美國化學家Cohen從小鼠頜下腺提取，并于1962年被提純，1995年1月12日被基因庫注冊。EGF是最早用于臨床治療胃腸道潰瘍的細胞因子，能加速胃潰瘍的治療和抑制胃酸的分泌。對人和動物的胃和十二指腸潰瘍研究表明，EGF聚集在潰瘍區(qū)域，直接與潰瘍邊緣的細胞結合，使?jié)儏^(qū)有高濃度EGF，有利于潰瘍愈合。EGF其他的生物學作用還包括促進人皮膚上皮細胞、角膜上皮細胞和哺乳動物上皮細胞的生長等。并且在國內外，天然與重組的EGF已應用于角膜、皮膚損傷和胃腸潰瘍的臨床試驗。因此EGF的研究開發(fā)有重要的應用前景和經濟價值，但目前普遍存在著投資大、收益率低等缺陷，使其不能完全產業(yè)化。生產EGF有三種方法化學合成法，其合成的產物的純度及產率度都無法滿足工業(yè)化生產要求；基因工程法，但其制成的EGF價格昂貴；生物合成法，主要來源于小鼠頜下腺，而小鼠頜下腺來源有限。山羊頜下腺含有豐富EGF。143.0g山羊頜下腺凍干粉純化可以得到EGF約為96.0mg，而山羊頜下腺制成凍干粉的得率為10％，這樣總的得率為0.067mg/g腺體。每只山羊頜下腺約重10g，且山羊頜下腺為宰殺后廢棄產品，因此有豐富的來源。其制作成本低、得率高適應于我國臨床治療的需要。
最初EGF的分離純化有1972年Savage用酸抽提、BIO-纖維柱和DEAE-纖維柱制備。而后有1975年Cohen、Carpenter于從預處理的濃縮尿液中分離的5步法Bio-Rex70柱吸附、Bio-GelP10柱過濾、Sephadex G-75柱過濾、DE-52、CM-52柱層析分離[10]。不管從天然還是基因工程，EGF的初始濃度總是偏低，需要經過較長時間的分離和純化過程，才能得到相對較純的EGF，工藝較復雜，而且成本高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單、提取純化周期短的羊表皮生長因子的提取、純化工藝。
由于EGF是一種耐酸、熱穩(wěn)定的陽離子蛋白質，針對其特殊的理化性質，我們采用酸抽提法除去了絕大部分的雜蛋白，再經具分子篩效應的Sephadex G15凝膠層析及與陽離子不結合的DEAE Sphaeel層析柱，經SDS-PAGE電泳分析其相對分子量為6kDa，與人EGF的分子量相近，再經ELISA法、MTT法及小鼠睜眼、萌齒試驗證明羊頜下腺凍干粉經純化后為EGF。
本發(fā)明羊表皮生長因子的提取、純化的步驟如下(1)、取羊頜下腺凍干粉，加入稀醋酸，混勻，制成勻漿液；(2)、將勻漿液置于高速離心機中離心，取上清液；(3)、將上清液的PH值調至6.5，置于4℃冰箱8～12小時；(4)、置于高速離心機中離心，得到沉淀物；(5)、在沉淀物中加入緩沖液，得到懸浮液；(6)、將懸浮液裝入Sephadex G15柱進行層析洗脫，然后用ELISA法檢測活性洗脫峰；(7)、將洗脫液過DEAE Sphacel陰離子交換柱，截留活性峰進行冷凍干燥即得。
其中，所述的稀酸可以是0.05N的醋酸；高速離心機的離心速度為15000rpm；調PH時用0.05N的NH4OH。
經ELISA法、MTT法及小鼠睜眼、萌齒試驗證明羊頜下腺凍干粉經純化后為EGF。
本發(fā)明EGF的提取、純化工藝簡單、提取純化周期短，而且為今后建立一條適合國內條件的相對簡單、高效的純化途徑。
試驗EGF對炎癥性腸炎的藥效學研究一、材料與方法(一)主要實驗試劑及材料1.十二烷基硫酸鈉(SDS)美國SERVE公司2.16.7％鄰聯(lián)二茴香胺(O-dianisidine dihydrochloride)美國Sigma公司3.十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide，HTAB)北京西中化工廠4.其余試劑均為國產分析純(二)實驗動物健康、性成熟、一級質量標準的SD大鼠，雄性，體重250g～280g，由浙江大學醫(yī)學院動物實驗中心提供。全部采用架式籠養(yǎng)，自由食用全價營養(yǎng)飼料，每日晨8時清籠，飼養(yǎng)溫度為20±1℃，濕度50～60％，光照每12小時明暗交替，通風8～15次/小時，單獨空調。
(三)IBD制模法在大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為3組，即單純造模組、生理鹽水治療對照組及EGF治療組。每組10只。大鼠禁食24小時后用7％乙酸2ml經自制聚乙烯灌腸器(直徑約2mm)灌腸，灌腸器插入深度為距肛緣8cm，倒提大鼠準確定時15秒后，經灌腸器再以同一深度用生理鹽水5ml沖洗一次，24小時后即成模。
(四)給藥方法1.EGF治療組，在造模成型后每日晨起空腹用純化鑒定后的羊EGF270μg/次/只，用生理鹽水2ml溶化后灌腸，療程7天。
2.生理鹽水治療對照組在造模成型后每日晨起空腹給與生理鹽水2ml每日灌腸。
3.單獨造模組，造模后不灌腸飼養(yǎng)7天。
(五)標本制備所有實驗動物在療程7天后禁食不禁水24小時，予乙醚麻醉處死，破腹暴露全腸，在距肛8cm處離斷，取出腸段，沿腸系膜剪開并用生理鹽水沖洗干凈后，將腸粘膜平鋪于泡沫板上，用大頭針固定，肉眼觀察腸粘膜的病理改變，計算粘膜損傷指數(shù)，并數(shù)碼相機攝片，然后立即用10％的中性甲醛溶液固定，送浙大醫(yī)學院病理室，石蠟包埋，每份蠟塊制成厚度5μm的切片HE染色，鏡下評價粘膜損傷指數(shù)。
(六)髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)檢測方法主要步驟如下取大鼠腸組織300mg稱重，于小燒杯中加磷酸緩沖溶液2.0ml，用剪刀剪碎，轉移至試管中，于組織勻漿儀上勻漿10s，4℃20kg冷凍離心4000rpm×15min，棄去上清液，按50mg(組織)/1.0ml比例加入上述HTAB溶液，勻漿30s，超聲勻漿10s，上述條件冷凍離心15min，轉移上清液進行比色測定。取上清液0.1ml加O-dianisidine溶液(含0.0005％H2O2)2.9ml，在460nm處測定3min，計算每分鐘吸光度的變化(ΔA460nm·min-1)。
(七)觀察指標1.一般情況大鼠在飼養(yǎng)過程中的精神狀態(tài)，活動情況，毛發(fā)光澤度，食欲，大便情況(血便、腹瀉、大便次數(shù)增多等)，體重等。
2.腸標本大體觀腸粘膜的色澤、潰瘍、出血點、充血等情況，其觀察和評分標準如下[6](見表4)表4 大鼠結腸粘膜肉眼評分標準
分數(shù) 肉眼觀察結腸0分 無損傷，無充血水腫，表面光滑，無糜爛或潰瘍1分 粘膜充血、水腫，表面光滑，無糜爛或潰瘍2分 粘膜充血、水腫，粘膜粗糙，呈顆粒樣，輕度糜爛，無潰瘍3分 粘膜充血、水腫，中度糜爛有單個潰瘍4分 粘膜充血、水腫，高度糜爛，有多處潰瘍5分 粘膜充血、水腫，重度糜爛，有＞1cm潰瘍3.腸標本鏡下觀判定標準低倍鏡下取10個視野，按炎癥細胞侵潤的程度分成0、1、2、3四個級別。評分標準具體如下(見表5)表5 大鼠結腸組織病理評分標準分數(shù)鏡下觀上皮及腺體的破壞0分 正常1分 上皮局部破壞2分 上皮帶狀破壞或帶狀隱窩消失3分 彌散和/或粘膜潰瘍累及粘膜下和/或隱窩缺失腺隱窩擴張0分 正常1分 局灶擴張2分 條狀擴張3分 彌散擴張杯狀細胞耗竭及缺失0分 正常1分 輕度耗竭2分 條狀或中度耗竭3分 彌散或完全耗竭炎性細胞浸潤0分 無1分 局限于上皮下，固有層或隱窩基層2分 浸潤粘膜基層3分 嚴重廣泛浸潤達粘膜下和/或累及固有基層水腫0分 無1分 局灶2分 帶狀或/和中度彌散3分 廣泛及嚴重血管充血0分 無1分 局灶2分 帶狀
3分彌散隱窩膿腫0分無1分局灶2分條狀3分彌散萎縮0分無1分局灶2分條狀3分彌散4.MPO活性單位(U)定義為25℃時每分鐘分解1μmol過氧化物的量。1μmolH2O2的吸光度改變?yōu)?.13×10-2/min，0.1ml樣品單位組織的酶活性為MPO(×103U)·ng-1組織＝ΔA460nm·min-1/1.13×10-2)÷5[7]。
二、結果1.大鼠一般情況造模組大鼠在灌腸后第15～24h起出現(xiàn)腹瀉，表現(xiàn)為黃色或血性稀便和/或肛周體毛被稀便沾染，精神萎靡，喜拱背扎堆，活動量少，食欲減退，毛發(fā)欠光澤，體重增長較慢等。
生理鹽水對照組在生理鹽水灌腸后一直有稀便，肛周體毛不潔，精神差，活動少，食欲差，類似于造模組。
EGF治療組在EGF灌腸后稀便于第三天起開始好轉，肛周體毛逐漸變干凈，精神狀況好轉，食欲好轉，毛發(fā)光澤度好轉，體重增加。(附圖2、3)2.大鼠腸粘膜肉眼改變(見表6)造模組全部大鼠24h成模后均可見潰瘍多而大、嚴重充血水腫、糜爛出血點、穿孔腸粘連等。
生理鹽水對照組亦可見潰瘍多而大、充血水腫、糜爛出血點、穿孔等。
EGF治療組在第一天有1只大鼠腸穿孔死亡，剩余9只治療后見有個別小潰瘍、充血水腫、糜爛出血較上述兩組明顯好轉，未見穿孔。(附圖4、5、6)表6 大鼠結腸粘膜肉眼評分結果組別動物數(shù) 組織損傷積分(x±S)
模型對照組 10 4.20±0.92空白對照組 10 2.70±1.06EGF組* 90.67±1.00*與模型組比較P＜0.01，*與生理鹽水對照組比較P＜0.053.大鼠腸粘膜組織病理變化(見表7)造模組大鼠結腸粘膜可見粘膜上皮脫落、糜爛、炎癥可累及腸壁全層，主要表現(xiàn)為中性粒細胞侵潤，亦可見數(shù)量不等的巨噬細胞和嗜酸性細胞，另可見增生的纖維母細胞，潰瘍周圍可見隱窩變形。腺體增生，排列紊亂。肉芽組織增生，杯狀細胞減少。粘膜及粘膜下充血、水腫及典型潰瘍病形成。
生理鹽水對照組粘膜充血水腫，可見典型潰瘍，腺體增生，杯狀細胞減少，炎癥細胞浸潤，腺隱窩擴張及隱窩膿腫。
EGF組結腸粘膜可見潰瘍修復跡象，如潰瘍邊緣上皮修復，肉芽組織形成等。
表7 大鼠結腸組織病理評分結果組別 動物數(shù) 病理損傷積分(x±S)模型對照組 10 15.80±3.82生理鹽水對照組 10 9.90±1.85EGF組* 9 6.67±2.29*與模型組比較P＜0.01，*與生理鹽水對照組比較P＜0.054.MPO值(見表8)表8 各組大鼠MPO值(U/mg)組別 動物數(shù) MPO值(x±S)模型對照組 10 2.16±0.39空白對照組 10 1.93±0.63EGF組* 9 0.97±0.12*與模型組比較P＜0.01，*與生理鹽水對照組比較P＜0.01說明書附1本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發(fā)明實施例進一步的說明。
實施例1本實施例羊表皮生長因子的制備工藝如下(1)、取羊頜下腺凍干粉50g，加入0.05N的醋酸，混勻，制成勻漿液；
(2)、將勻漿液置于高速離心機中離心，離心速度為15000rpm，取上清液；(3)、將上清液用0.05N的NH4OH調PH至6.5，置于4℃冰箱8～12小時；(4)、置于高速離心機中，用15000rpm的速度離心，得到沉淀物；(5)、在沉淀物中加入緩沖液Tris.HCL，得到懸浮液；(6)、將懸浮液裝入Sephadex G15層析柱進行層析洗脫，然后用ELISA法檢測活性洗脫峰；(7)、將洗脫液過DEAE Sphacel陰離子交換柱，截留活性峰進行冷凍干燥即得。
實施例2EGF的鑒定將實施例1所得到的EGF進行以下鑒定(一)、ELISA法在有EGF或EGF相同的抗原樣品孔中，ELISA反應顯色較深。結果見表1。
表1 純化的山羊頜下腺EGF不同濃度ELISA測定OD值比較稀釋倍數(shù)1∶11∶21∶41∶81∶161∶32OD值* 0.687 0.577 0.452 0.427 0.3120.254OD值** 0.449 0.489 0.482 0.426 0.4030.304對照組 0.002 0.002 0.002 0.002 0.0020.002*與對照組比較P＜0.01；**為重復測試的OD值，與對照組比較P＜0.01。兩者差異均有顯著性。
(二)、MTT法結果見表2表2 純化的山羊頜下腺對小鼠腎細胞的生長促進率(MTT法)A值(x±S) 促進率(％)空白組 0.141±0.02羊-EGF* 0.265±0.02 87.94h-EGF0.268±0.02 90.07*與對照組比較P＜0.01，差異有顯著性；與h-EGF組比較P＞0.05，差異無顯著性?？瞻讓φ諡闊oELISA反應的洗脫液EGF(三)、小鼠萌齒和睜眼試驗，結果見表3。
表3 山羊頜下腺EGF對新生小鼠睜眼、萌齒試驗的觀察(附

圖1)空白組 EGF組*(170μg/只/天)萌齒時間12天11天睜眼時間14天13天*與對照組比較分別提前1天
權利要求
1.一種治療炎癥性腸病的藥物——羊表皮生長因子的提取、純化工藝，其特征在于包括如下步驟(1)、取羊頜下腺凍干粉，加入稀酸，混勻，制成勻漿液；(2)、將勻漿液置于高速離心機中離心，取上清液；(3)、將上清液的PH值調至6.5，置于4℃冰箱8～12小時；(4)、置于高速離心機中離心，得到沉淀物；(5)、在沉淀物中加入緩沖液，得到懸浮液；(6)、將懸浮液裝入Sephadex G15柱進行層析洗脫，然后用ELISA法檢測活性洗脫峰；(7)、將洗脫液過DEAE Sphacel陰離子交換柱，截留活性峰進行冷凍干燥即得。
2.根據(jù)權利要求1所述的提取、純化工藝，其特征在于所述的稀酸是0.05N的醋酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的提取、純化工藝，其特征在于所述的高速離心機的離心速度為15000rpm。
4.根據(jù)權利要求1所述的提取、純化工藝，其特征在于調PH時用0.05N的NH4OH。
全文摘要
本發(fā)明一種治療炎癥性腸病的藥物——羊表皮生長因子的提取、純化工藝，采用酸抽提法除去羊頜下腺中的絕大部分的雜蛋白，經過離心、Sephadex G15柱進行層析洗脫、DEAE Sphacel陰離子交換柱，截留活性峰進行冷凍干燥得到，本工藝具有工藝簡單、提取純化周期短等優(yōu)點。
文檔編號A61P29/00GK1583791SQ03150438
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月20日 優(yōu)先權日2003年8月20日
發(fā)明者姒健敏, 周雯, 王良靜 申請人:姒健敏, 周雯, 王良靜