專利名稱：重組腺伴隨病毒載體介導(dǎo)的腫瘤壞死因子相關(guān)的細胞凋亡配體肽段及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腺伴隨病毒(adeno-associated virus，簡稱AAV)表達載體攜帶的重組腫瘤壞死因子相關(guān)的細胞凋亡配體(tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand，簡稱TRAIL)肽段及其制備方法、包裝、在體內(nèi)表達及其用途，特別是編碼TRAIL第95至281位187個氨基酸殘基與腺伴隨病毒組成的重組表達載體(TRAIL95-281-AAV)及其用途。本發(fā)明的重組病毒可單獨或與其它抗癌藥物聯(lián)用，用于肝轉(zhuǎn)移癌和肺癌等腫瘤的基因治療。
背景技術(shù)：
TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，Wiley等于1995年克隆并命名。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可迅速誘導(dǎo)乳腺癌、直腸癌、肺癌和前列腺癌等多種人類腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無毒副作用。在動物實驗中已證明TRAIL可非常有效地抑制腫瘤的形成和生長，甚至可通過誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡而導(dǎo)致腫瘤的縮小或消失，但對正常細胞不產(chǎn)生殺傷作用(Nat.Med.，1999，5(2)157-163，這是目前臨床上使用的大多數(shù)化療藥物“敵我不分”、具有強烈的毒副作用所不能比擬的。因此TRAIL具有良好的臨床應(yīng)用前景。
然而，重組表達的TRAIL在臨床應(yīng)用上存在一些限制，例如1)動物實驗表明靜脈給藥后，TRAIL重組蛋白的穩(wěn)定時間只有5小時；2)在體內(nèi)抑制腫瘤形成需要大量的TRAIL重組蛋白，有可能產(chǎn)生免疫原性，等等。因此，改善TRAIL在體內(nèi)的利用度和給藥途徑是提高TRAIL療效的重要研究方向。
自1990年首次進行人類疾病的基因治療試驗以來，基因療法作為一種全新的醫(yī)療手段日益引起了人們的重視，特別是對于那些不能使用傳統(tǒng)醫(yī)療手段，不能徹底治愈的疾病，如糖尿病、癌癥和艾滋病等。目前使用的基因療法載體主要包括病毒類和非病毒類兩種載體。一般來說，病毒類載體在表達強度和時空性方面比非病毒類載體優(yōu)越，特別是副腺病毒(adeno-associated virus，AAV)更為突出。重組AAV載體用于基因治療法具有許多優(yōu)點，首先迄今尚沒有野生型AAV能引起人類相關(guān)疾病的報道，而且它能整合到宿主的染色體，使外源基因長期穩(wěn)定表達。外源基因表達后不僅沒有細胞調(diào)節(jié)反應(yīng)，而且具有廣泛的組織親和性。最近，人們已經(jīng)克服了重組AAV的一些先天性缺陷，如產(chǎn)量低、輔助病毒污染及野生型AAV污染等，能產(chǎn)生重組AAV的細胞株也已獲得成功，為臨床應(yīng)用打下了堅實基礎(chǔ)。目前，重組AAV載體已廣泛地應(yīng)用于癌癥、白血病、艾滋病的治療研究，有的已進入了人體臨床試驗，取得了令人滿意的結(jié)果(Nature，2001，412(6850)914-917)，展示了美好的應(yīng)用前景。
最近，Seol Dai-Wu等申請的美國專利(申請?zhí)枮?0020128438)，構(gòu)建了包括三聚體形成結(jié)構(gòu)域、分泌信號肽和TRAIL(114～281)序列的重組AAV表達載體，認為可用于疾病的基因治療。但其技術(shù)中TRAIL(114～281)重組表達載體制備復(fù)雜，未報告能否在肝臟中特異性地表達并進入血液循環(huán)，也未報告能否用于肝轉(zhuǎn)移癌和肺癌等腫瘤的基因治療。
本發(fā)明涉及與其不同的AAV介導(dǎo)的TRAIL(95～281)重組表達載體的制備、包裝方法及其用途。本發(fā)明中的重組AAV可單獨或與其它抗癌藥物聯(lián)用，用于肝轉(zhuǎn)移癌和肺癌等腫瘤的基因治療。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種氨基酸序列，其特征在于具有如序列表1中所述的序列。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種TRAIL基因序列，特別是人TRAIL95-281的序列，此序列與AAV構(gòu)成的表達載體為pAM-CAG/EGR-1-pL-TRAIL95-281-WPRE-BGH polyA。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種細胞株，其特征在于是使用重組AAV表達載體感染所建立的細胞株。
本發(fā)明的第四個目的在于提供TRAIL95-281在制備抗肝轉(zhuǎn)移癌和肺癌等腫瘤藥物中的應(yīng)用。
在本發(fā)明中還描述了所述重組AAV病毒的體內(nèi)給藥途徑和方法。所述重組AAV病毒進入體內(nèi)后，TRAIL95-281以同源三聚體的活性形式表達并進入血液循環(huán)系統(tǒng)。
所述的重組AAV病毒可以應(yīng)用于肝轉(zhuǎn)移癌和肺癌等腫瘤基因治療。
為了完成本發(fā)明的目的，因此本發(fā)明特別提供一種氨基酸序列，其特征在于具有如序列表1中所述的序列。
發(fā)明還提供一種TRAIL基因表達載體，它包括編碼TRAIL第95至281位氨基酸的基因序列。TRAIL基因表達載體包括pAM(plasmid of anti-ampicilinconstruction)、ITR(adeno-associated virus 2 inverted terminal repeat sequence)、CAG(cytomegalovirus immediated-early enhancer/chicken β-actin hybrid)或EGR-1(promoter of a murine mitogen inducible zinc finger encoding gene)、pL(poly-linker)、TRAIL95-281(編碼TRAIL第95至281位氨基酸的序列)、WPRE(Woodchuck HeptitisVirus Post-transcriptional Regulatory Element)、BGH(Bostaurus growth hormone)、polyA(多聚腺苷酸)和ITR構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。所述的載體優(yōu)選的是pAM/CAG/EGR-1-pL-TRAIL95-281-WPRE-BGH-polyA的AAV重組表達載體。
所述的載體為包裝TRAIL95-281-AAV的三載體系統(tǒng)，該包裝TRAIL95-281-AAV的三載體系統(tǒng)是AAV重組表達載體、H22和pFD6。
本發(fā)明還提供一種使用重組TRAIL95-281-AAV表達載體感染所建立的細胞株在制備抗肝轉(zhuǎn)移腫瘤和肺癌腫瘤藥物中的應(yīng)用。
使用重組AAV表達載體轉(zhuǎn)移到體內(nèi)6小時后病毒的滴度達3～4×106/mL，并能在肝轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中表達TRAIL95-281，直接殺死腫瘤細胞。另外使用重組AAV表達載體轉(zhuǎn)移到體內(nèi)后，可在腫瘤細胞周圍的正常肝細胞中表達TRAIL95-281，并殺死周圍腫瘤細胞。使用AAV重組表達載體轉(zhuǎn)移到體內(nèi)后，TRAIL95-281以三聚體的活性形式表達并分泌到血液中。
在本發(fā)明中，采用基因工程等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和方法，提供了編碼人TRAIL95-281的重組AAV表達載體的制備、包裝、輸入體內(nèi)途徑及其應(yīng)用。通過肌肉、靜脈、肝門靜脈注射或口服途徑，將所述重組病毒輸入體內(nèi)后，重組AAV介導(dǎo)的TRAIL95-281能夠以同源三聚體的活性形式在腫瘤細胞及肝細胞中表達，直接殺滅腫瘤細胞，并分泌到血液循環(huán)系統(tǒng)，對肝轉(zhuǎn)移癌和肺癌等腫瘤的生長和形成起明顯抑制作用，并顯著地延長了荷瘤小鼠的壽命。首次證明所述重組病毒可應(yīng)用于肝轉(zhuǎn)移癌和肺癌等腫瘤的基因治療。
本發(fā)明涉及一種編碼人TRAIL95-281氨基酸殘基的重組AAV表達載體的制備、包裝方法，它包括以下步驟
以從中國正常人外周血淋巴細胞中克隆到的全長TRAIL的cDNA為模板，以人工合成的TRAIL95-281cDNA上、下游寡核苷酸序列為引物，進行PCR擴增，其上、下游引物分別為5’-TAGAATTCACCATGACCTCTGAGGAAACCATT-3’和5’-CCCAAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’；合成的引物分別引入了Kozak序列并在兩端加入限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII的酶切位點；PCR擴增的條件為94℃，45s；58℃，1m；72℃，1m；循環(huán)30次，最后在72℃延伸15m。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后，插入已預(yù)先用相同的內(nèi)切酶消化過的pAM-CAG/EGR-1-pL-WPRE-BGH-polyA的AAV包裝載體，構(gòu)成TRAIL95-281-AAV重組載體；采用三載體輔助病毒缺陷包裝系統(tǒng)(AAV、H22和pFD6)進行包裝，即采用磷酸鈣法將重組載體TRAIL95-281-AAV和輔助質(zhì)粒H22和pFD6共同轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，轉(zhuǎn)染60～72小時后，收獲細胞，分離出的重組病毒顆粒經(jīng)HiTrap Heparin親和層析(Amersham Biosciences，Sweden)純化后，以real-time PCR確定其最終滴度；另分別在轉(zhuǎn)染TRAIL95-281-AAV的不同時間，裂解HEK-293細胞，進行Western印跡檢測，定量測定表達的TRAIL95-281蛋白濃度。按照同樣的方法制備、包裝編碼綠色熒光蛋白(EGFP)的重組AAV病毒載體(EGFP-AAV)作為對照。
重組TRAIL95-281-AAV病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK-293細胞后，運用Vectastain ABC試劑盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)和DAB染色試劑盒(Zymed，South SanFrancisco)分別測定TRAIL95-281的表達。
體外實驗表明TRAIL95-281在HEK-293細胞中高水平表達，并隨著時間的延長而呈增加的趨勢(圖1A)。所表達的TRAIL95-281在細胞中表達，并可最終富集到細胞表面(圖1B)。在轉(zhuǎn)染的293細胞培養(yǎng)基中，也有TRAIL95-281蛋白存在，在轉(zhuǎn)染24小時時，TRAIL95-281的表達量可達15.6±0.31ng/ml(圖1C)，表明該重組病毒可介導(dǎo)TRAIL95-281在胞漿中表達，并可分泌到細胞外。該重組病毒分別感染小鼠淋巴瘤細胞EL-4和人淋巴細胞白血病T-細胞Jurkat后，可引起EL-4和Jurkat細胞發(fā)生明顯凋亡(圖1D)。
經(jīng)C57BL/6小鼠門靜脈注射該重組病毒后，RNA原位雜交的結(jié)果表明TRAIL95-281可在肝小葉等細胞中長期表達(圖2A)，免疫化學(xué)分析進一步肯定了這一現(xiàn)象(圖2B)，并在肝細胞裂解液和濃縮的血清中發(fā)現(xiàn)TRAIL95-281以同源三聚體的活性形式存在，大小約為60kD(圖2C)，而且TRAIL95-281可在肝臟中長期穩(wěn)定地表達(圖2D)。
經(jīng)小鼠門靜脈接種小鼠淋巴瘤細胞EL-4并形成肝轉(zhuǎn)移瘤動物模型后，分別經(jīng)門靜脈注射不同劑量的該重組病毒，進行AAV介導(dǎo)的TRAIL95-281基因治療，表明治療后肝轉(zhuǎn)移瘤顯著縮小(圖3A)，有50％的小鼠的肝轉(zhuǎn)移瘤消失(圖3B)，荷瘤小鼠的生存期明顯延長(圖3C)，表明該重組病毒具有明顯的抗腫瘤活性、安全有效、無毒副作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
同時AAV介導(dǎo)的TRAIL95-281基因治療表明，治療組移植瘤中發(fā)生了重組病毒給藥量相關(guān)的細胞凋亡(圖4A-G)，但不引起正常肝細胞凋亡。進一步分析表明，在此重組病毒介導(dǎo)的細胞凋亡過程中，Bcl-2表達下調(diào)，而caspase-3和caspase-8表達上調(diào)(圖4H)。


圖1是顯示重組AAV-TRAIL和AAV-EGFP載體的構(gòu)建與鑒定。(A)Western blot顯示TRAIL95-281在HEK293細胞中的表達。(B)免疫組化分析顯示TRAIL95-281在HEK293細胞表面表達。(C)ELISA顯示TRAIL95-281可被分泌到培養(yǎng)液中。(D)重組AAV-TRAIL可介導(dǎo)Jurkat和EL-4細胞凋亡。
圖2顯示經(jīng)小鼠門靜脈注射rAAV-TRAIL后，TRAIL95-281可在動物肝細胞內(nèi)及表面和血漿中長期穩(wěn)定表達。
圖3是顯示小鼠肝組織上形成的EL-4轉(zhuǎn)移瘤及使用rAAV-TRAIL治療前后的大小及生存時間。
圖4是顯示rAAV-TRAIL治療引起移植癌細胞凋亡及細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達變化。
具體實施例方式
以下將結(jié)合附圖詳細描述本發(fā)明。
實驗例1以從中國正常人外周血淋巴細胞克隆到的TRAIL全長cDNA為模板，以人工合成的TRAIL95-281cDNA上、下游寡核苷酸序列為引物，建立PCR擴增反應(yīng)。TRAIL95-281cDNA上、下游寡核苷酸引物的核苷酸序列分別為5’-TAGAATTCACCATGACCTCTGAGGAAACCATT-3’和5’-CCCAAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’。在引物中分別引入Kozak序列并在兩端加入限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII的酶切位點。PCR擴增條件為94℃ 45sec，58℃ 1min，72℃1min，循環(huán)30次，最后在72℃延伸15min。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和HindIII酶切后，插入已預(yù)先用EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶消化的pAM/CAG/EGR-1-pL-WPRE-BGHpolyA的AAV表達載體。采用磷酸鈣法將重組TRAIL95-281-AAV表達質(zhì)粒連同輔助病毒缺陷包裝系統(tǒng)(H22和pFD6)共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，轉(zhuǎn)染60～72小時后收獲細胞，分離出的重組病毒(rAAV)顆粒經(jīng)HiTrap Heparin affinity columns(Amersham Bioscineces，Sweden)純化，以real-timePCR確定重組病毒的最終滴度。以編碼綠色熒光蛋白(EGFP)的重組病毒(EGFP-AAV)作為對照。
實驗例2參見圖1A，Western Blot肝組織或細胞經(jīng)裂解液(含1％Nonidet P-40、0.35mg/ml PMSF、9.5μg/ml leupeptin和13.7μg/ml pepstatinA的1×PBS)裂解后，12000rpm離心去沉淀，上清液經(jīng)BCA蛋白分析試劑盒(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)測定蛋白濃度后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后4℃封閉過夜，加一抗(抗TRAIL多克隆抗體，1∶1000稀釋于封閉液中)后，室溫孵育2h、加二抗(HRP標記的兔抗羊抗體1∶3000稀釋于封閉液中)后，室溫孵育1h，徹底洗滌，然后利用ECL系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech Co.)進行蛋白顯色。檢測TRAIL95-281在小鼠血清中的表達情況，經(jīng)小鼠尾靜脈取血清，濃縮10～20倍后，同法進行Western Blot。
實驗例3參見圖1B-D，TRAIL95-281的表達及其生物學(xué)活性測定HEK-293細胞在Dulbecco’s modified essential medium(DMEM)完全培養(yǎng)基(即在DMEM培養(yǎng)基中添加10％的胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中培養(yǎng)6h以上，1×PBS洗滌后加入不同滴度的重組病毒，(培養(yǎng)基為DMEM添加2％的胎牛血清)，8小時后添加DMEM完全培養(yǎng)基。在不同時間點收集重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK-293細胞培養(yǎng)基，真空冷凍濃縮10～20倍，測定蛋白濃度，進行ELISA檢測。將約100μg蛋白經(jīng)0.05M Na2CO3(pH9.6)稀釋后，于37℃包被96孔板。包被2h后，于37℃以封閉液(1×PBS添加0.05％Tween-20和5％脫脂奶粉)封閉0.5h。加入抗TRAIL多克隆抗體(1∶1000稀釋于封閉液中，每孔添加100μl)，37℃溫育2h。加入HRP標記的兔抗羊抗體(1∶1000稀釋于封閉液中，每孔添加100μl)，37℃溫育2h。酶反應(yīng)底物為1，2-benzenediamine(鄰苯二胺，OPD，Sigma)，2mg OPD加入5ml的顯色緩沖液中(檸檬酸0.51g，Na2HPO4·12H2O 1.2g，加水至100ml，pH4.5，溶解后加入7.5μl雙氧水)，每孔添加100μl，室溫放置約30m，加入50μl 1M的H2SO4終止反應(yīng)，于MD/SPECTRA MAX 340分光光度儀上在490nm處讀取吸光值)。用此ELISA檢測重組TRAIL95-281的靈敏度可達16ng/ml。另外采用免疫組化方法檢測重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK-293細胞中TRAIL95-281蛋白的表達，使用Vectastain ABC(Vector Laboratories，Burlingame，CA)和DAB試劑盒(Zymed，South SanFrancisco)，最終的陽性信號呈棕紅色。TRAIL95-281誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的活性采用MTT(Richter A.M.et al.，1900)法檢測，分別取104～106的EL-4、Jurkat和HepG2細胞(體積為100μl)接種到96孔板中，分別加入不同滴度的重組病毒(100μl，1×PBS稀釋)，28小時后加入10mg/ml MTT(每孔20μl)，37℃溫育4h后，每孔添加200μl DMSO終止反應(yīng)，于MD/SPECTRA MAX 340分光光度儀上讀取570nm處光吸收值，計算細胞成活率(細胞成活率＝實驗組光吸收值/對照組光吸收值×100％)。每一組設(shè)定三個樣品孔，每組實驗重復(fù)三次。以重組AAV-EGFP作為陰性對照。
實驗例4參見圖2A、B，小鼠動物模型的建立取7至8周齡、體重約20g的C57BL/6小鼠，門靜脈接種2×105淋巴瘤細胞EL-4(1×PBS懸液200μl)，門靜脈注射1×PBS緩沖液為對照組。以后每周稱量小鼠體重，30～40天后尾靜脈取血，苯巴比妥腹腔注射處死，組織樣品經(jīng)液氮冷凍后貯存在-70℃或在4％paraformaldehyde固定，制備切片，進行肝臟組織的形態(tài)及組織學(xué)分析。
實驗例5參見圖2C、D，原位雜交為鑒定TRAIL95-281蛋白在小鼠肝臟中的表達分布情況，取小鼠的肝臟，經(jīng)4％的paraformaldehyde固定后進行石蠟包埋，制備8μm的組織切片。反義RNA探針選用位于TRAIL95-281基因下游約600bp的WPRE DNA片段為模板進行標記，生物素標記試劑盒和雜交方法參見產(chǎn)品說明書(In vitrotranscription kit and nonisotopic labeling kit，mRNAlocator in situ hybridization kit，Ambion，UK)。PBS對照組的肝臟切片作為陰性對照。
實驗例6參見圖3，荷瘤小鼠的實驗治療與觀察取7至8周齡、體重約20g的C57BL/6小鼠，經(jīng)門靜脈接種2×105淋巴瘤細胞EL-4(1×PBS懸液200μl)。一周后將實驗動物分成三組a)生理鹽水對照組；b)EGFP-AAV對照組；c)不同劑量的TRAIL95-281-AAV重組病毒(病毒滴度1010～1012)治療組。每組6只，通過門靜脈注射。分別觀察不同組動物腫瘤的生長情況和生存時間。做3批重復(fù)實驗。
圖3A顯示小鼠肝組織上形成的EL-4腫瘤治療前后的大小和組織切片鑒定的結(jié)果。A從左至右分別為顯示EGFP-AAV對照組、低劑量和高劑量TRAIL95-281-AAV治療組的小鼠動物模型肝組織大小。B-D從左至右分別為EGFP-AAV對照組、低劑量和高劑量TRAIL95-281-AAV治療組的小鼠動物模型的肝組織切片H&E染色結(jié)果。箭頭指示腫瘤細胞的異型核。CV中央靜脈；PV門靜脈。
圖3B顯示EL-4肝轉(zhuǎn)移瘤小鼠治療前后肝組織切片的免疫組化染色結(jié)果。
圖3C顯示EL-4肝轉(zhuǎn)移瘤小鼠治療前后的生存時間。分別顯示EL-4肝轉(zhuǎn)移瘤小鼠分別用PBS、EGFP-AAV、低劑量和高劑量TRAIL95-281-AAV治療后的存活時間。其實驗結(jié)果是治療組的小鼠壽命明顯延長，證明該重組病毒具有明顯的抗腫瘤活性、安全有效、無毒副作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
實驗例7參見圖4A-G，細胞凋亡測定按照原位細胞死亡試劑盒(Roche MolecularBiochemicals)說明書進行TUNEL標記。肝臟切片經(jīng)脫蠟、脫水、0.1％Trition-X 100和0.1％檸檬酸鈉處理后，在平衡緩沖液中封閉10分鐘，加入含有TdT(terminaldeoxynucleotidyl transferase)和fluorophore標記的dUTP的反應(yīng)緩沖液中，37℃孵育60分鐘，加1×SSC(200μl/切片)，室溫放置15分鐘終止反應(yīng)，用PBS徹底洗滌后，用Vectashield∶DAPI(3∶1)封片鏡檢。
參見圖4H，Western blot按實驗例2的方法進行細胞凋亡相關(guān)蛋白的測定。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>重組腺伴隨病毒載體介導(dǎo)的腫瘤壞死因子相關(guān)的細胞凋亡配體肽段及其用途<160>187<210>1<211>187<212>氨基酸<213>人淋巴細胞Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn1 5 10 15Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala16 20 25 30His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro31 35 40 45Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp46 50 55 60Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu61 65 70 75Arg Asn Glu Gly Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile76 80 85 90Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn91 95 100 105Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr106 110 115 120Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser121 125 130 135Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln136 140 145 150Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser151 155 160 165Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe166 170 175 180Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly181 185 18權(quán)利要求
1.一種氨基酸序列，其特征在于具有如序列表1中所述的序列。
2.一種TRAIL基因序列，其特征在于包括編碼TRAIL第95至281位氨基酸的基因序列。
3.一種TRAIL基因表達載體，其特征在于包括pAM、ITR、CAG或EGR-1、pL、TRAIL95-281、WPRE、BGH、polyA和ITR構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的載體為pAM/CAG/EGR-1-pL-TRAIL95-281-WPRE-BGH-polyA的AAV重組表達載體。
5.如權(quán)利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的載體包裝使用TRAIL95-281-AAV的三載體系統(tǒng)。
6.如權(quán)利要求5所述的三載體系統(tǒng)，其特征在于所述的包裝TRAIL95-281-AAV的三載體系統(tǒng)是AAV重組表達載體、H22和pFD6。
7.一種HEK-293細胞株，其特征在于是使用pAM/CAG/EGR-1-pL-TRAIL95-281-WPRE-BGH-polyA的AAV重組表達載體感染所建立的。
8.TRAIL95-281在制備抗肝轉(zhuǎn)移腫瘤和肺癌腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于使用AAV重組表達載體轉(zhuǎn)移到體內(nèi)6小時后病毒的滴度達3～4×106/mL，并能在肝轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中表達TRAIL95-281，直接殺死腫瘤細胞。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于使用AAV重組表達載體轉(zhuǎn)移到體內(nèi)后可在腫瘤細胞周圍的正常肝細胞中表達TRAIL95-281，并殺死周圍腫瘤細胞。
11.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于使用AAV重組表達載體轉(zhuǎn)移到體內(nèi)后以TRAIL95-281三聚體的活性形式表達并分泌到血液中。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用腺伴隨病毒載體攜帶重組腫瘤壞死因子相關(guān)細胞凋亡配體(TRAIL)的第95至281的肽段，和其在體內(nèi)表達三聚體的活性形式，以及在制備抗肝轉(zhuǎn)移腫瘤和肺癌腫瘤藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK1552734SQ0313835
公開日2004年12月8日 申請日期2003年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月28日
發(fā)明者鄭德先, 許瑞安, 馬宏, 劉彥信, 孔祥復(fù) 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 香港大學(xué)分子生物研究所