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Sars冠狀病毒3cl蛋白酶三維結(jié)構(gòu)模型與抗sars藥物的制作方法

文檔序號:903144閱讀:973來源:國知局
專利名稱:Sars冠狀病毒3cl蛋白酶三維結(jié)構(gòu)模型與抗sars藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用模建藥物作用靶標(biāo)篩選藥物,具體涉及用非典型肺炎冠狀病毒(SARS-CoV)3CL蛋白酶(3CLPro)三維結(jié)構(gòu)模型作為藥物設(shè)計靶標(biāo),以及在分子和細胞水平篩選藥物的方法,還涉及肉桂硫胺衍生物作為SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制劑和抗SARS-CoV病毒藥物用于治療和/或預(yù)防SARS病毒感染。
背景技術(shù)
傳染性非典型肺炎稱為嚴重急性呼吸綜合征(Severe Acute RespiratorySydrome,SARS)。從去年年底今年年初開始,非典型肺炎(severe acuterespiratory syndrome,SARS)病例在我國廣東首次發(fā)現(xiàn),隨后在香港、越南、加拿大等地爆發(fā),目前已蔓延到33個國家和地區(qū);最近SARS又在內(nèi)地的北京、山西、內(nèi)蒙等27省市自治區(qū)爆發(fā)。SASR病毒是一種傳染性強、生存強、致死率高的新型病毒,截至到年5月31日,全球共有8360人感染,死亡人數(shù)達764人。非典型肺炎嚴重影響了人們的日常生活、國家的經(jīng)濟建設(shè)。
研究發(fā)現(xiàn),一種新型的冠狀病毒極可能是SARS的病因,在香港和加拿大的病人和死亡病人的尸體中都分離出了這種病毒,在一些SARS病人的血清中也發(fā)現(xiàn)了抗hMPV的抗體。2003年4月16日,世界衛(wèi)生組織(WHO)正式確認SARS病毒是傳染性非典型肺炎的病因。傳染性非典型肺炎病人中90%以上感染SARS病毒的人能夠自愈,致死率約為10%左右。SARS病人的呼吸道切片和細胞培養(yǎng)物的電子顯微鏡照片顯示,存在冠狀病毒顆粒。這是一種新型的冠狀病毒,與冠狀病毒屬中其他已知的成員不同,該病毒可引起綠猴腎細胞(VERO-E6)發(fā)生病變效應(yīng)。病毒復(fù)制能夠被SARS感染康復(fù)人的血清所抑制,可以利用感染的細胞和康復(fù)病人的血清進行免疫熒光檢測法(Immunofluorescence assays,IFA)檢測培養(yǎng)細胞中細胞感染有SARS病毒的情況,該方法表現(xiàn)出特異性的反應(yīng)。美國、加拿大和香港的研究表明,非SARS病人的血清不能和新冠狀病毒發(fā)生反應(yīng);傳染性腸胃炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)、鼠肝炎病毒(Murine HepatitisVirus,MHV)、貓傳染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis virus,F(xiàn)IPV)、229E人冠狀病毒的超抗血清可以抑制培養(yǎng)的病毒生長。幾個實驗室對病毒的測序表明,新病毒和冠狀病毒屬相關(guān),但不同于同屬的其它冠狀病毒個群,是冠狀病毒的一個新的變種。SARS冠狀病毒在種屬分類上屬于正鏈RNA病毒(ssRNA positivestrand viruses)家系的巢狀病毒(Nidovirales)族中的冠狀病毒(Coronaviridae)系。它是冠狀病毒家族中新出現(xiàn)的一個子類。2003年3月,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致SARS的元兇SARS冠狀病毒(SARS Coronaviruses,SARS-CoV),并且成功地完成了SARS-CoV基因組的完整測序。SARS-CoV基因組由29727個核苷酸、11個開放閱讀框(Opening Reading Frames)組成。它的基因組結(jié)構(gòu)和其他的冠狀病毒非常相似。但通過比較遺傳史和序列比對表明SARS-CoV的特征和以前發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒的特征并不完全相似,它不僅表現(xiàn)有其他冠狀病毒共有的特征,還有SARS-CoV本身特有的特征(Paul A.Rota,M.Steven Oberste,Stephan S.Monroe,W.Allan Nix,Ray Campagnoli,et al.Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratorysyndrome.Science(Sciencexpress)1 May,2003;Marco A.Marra,Steven J.M.Jones,Caroline R.Astell,Robert A.Holt,Angela Brooks-Wilson,et al.Thegenome sequence of the SARS-associated coronavirus.Science 2003,3001394-1398)??茖W(xué)家同時進行了SARS相關(guān)的冠狀病毒加拿大多倫多(Tor2)分離株29751個堿基的基因組測序?;蚪M序列揭示這個冠狀病毒與已知的冠狀病毒(包括人類冠狀病毒HcoVOC43,HCoV-229E)無密切相關(guān)。預(yù)測病毒蛋白的種系分析表明,該冠狀病毒與已知的三族冠狀病毒均非密切相似?;蚪M序列將有助于人類了解SARS病毒感染的機制、潛在動物宿主的診斷檢測(使用PCR和免疫測試法),同時也有助于發(fā)展抗病毒制劑(包括中和抗體)和找出疫苗抗原決定簇(Marco A.Marra,Steven J.M.Jones,Caroline R.Astell,Robert A.Holt,Angela Brooks-Wilson,et al.The genome sequence of the SARS-associatedcoronavirus.Science,2003,3001399-1403)。
基因組測序和生物信息學(xué)分析表明,SARS-CoV病毒主要含有以下功能蛋白聚合酶、穿刺(Spike,S)糖蛋白、小信封(E)蛋白、基質(zhì)(M)蛋白、核衣殼(N)蛋白以及類3C(3CL)蛋白酶。理論上這些蛋白質(zhì)均可以作為抗SARS-CoV病毒藥物設(shè)計和篩選靶標(biāo),但3CL蛋白酶作為靶標(biāo)進行藥物設(shè)計和篩選尤其獨特的優(yōu)勢(1)根據(jù)其他冠狀病毒3CL蛋白酶功能推測,SARS-CoV病毒的3CL蛋白酶在病毒的復(fù)制過程中起重要作用;(2)許多現(xiàn)有的針對其他病毒的3CL蛋白酶抑制劑可以直接嘗試抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的活性和抗SARS-CoV病毒的測試;(3)3CL蛋白酶非常容易表達,可以在短期內(nèi)獲得蛋白質(zhì)進行藥物篩選,本發(fā)明分子水平的篩選模型就是用本發(fā)明者表達的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶建立的,蛋白表達方法已另案申請專利;(4)SARS-CoV病毒3CL蛋白酶與人冠狀病毒和遺傳性腸胃炎病毒的主蛋白酶(Main Proteinase,Mpro)有較高的序列同源性,可以這兩個蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)為模板,建立SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三維結(jié)構(gòu),進行抑制劑的設(shè)計和虛擬篩選。
因此,本發(fā)明的第一個目的是提供SARS-CoV病毒3CL蛋白酶三維結(jié)構(gòu)模型作為篩選治療和/或預(yù)防SARS病毒感染藥物的藥物作用靶標(biāo)。
本發(fā)明的第二個目的是提供用這種藥物作用靶標(biāo)篩選治療和/或預(yù)防SARS病毒感染藥物的方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供用這種藥物作用靶標(biāo)篩選出的治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物。
發(fā)明概述本發(fā)明建立SARS-CoV病毒3CL蛋白酶三維結(jié)構(gòu)作為篩選抗SARS-CoV病毒藥物的作用靶標(biāo),用計算機虛擬篩選方法從現(xiàn)有藥物數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)具有抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶活性并具有抗SARS-CoV病毒的藥物(化合物),進行蛋白酶分子的測試和SARS-CoV感染Vero-E6細胞水平的測試,提供治療和/或預(yù)防傳染性非典型肺炎藥物和藥物組合物。
本發(fā)明提供的抗SARS-CoV病毒藥物作用靶標(biāo)為SARS冠狀病毒3CL蛋白酶,其序列特征為1SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV TCGTTTLNGL WLDDTVYCPR HVICTAEDML NPNYEDLLIR61 KSNHSFIVQA GNVQLRVIGH SMQNCLLRLK VDTSNPKTPK YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG121 SPSGVYQCAM RPNHTIKGSF LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC YMHHMELPTG VHAGTDLEGK181 FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI TLNVLAWLYA AVINGDRWFL NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE241 PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA VLDMCAALKE LLQNGMNGRT ILGSTILEDE FTPFDVVRQC301 SGVTFQ本發(fā)明提供的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制劑和/或治療、預(yù)防SARS病毒感染藥物的篩選方法,包括以下步驟1)SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)模建;2)用分子對接虛擬篩選搜尋現(xiàn)有藥物數(shù)據(jù)庫,獲得與3CL蛋白酶有較強親和力的獲選化合物;3)用表面等離子共振(SPR)技術(shù)得到3CL蛋白酶與上述獲選化合物相互作用的動力學(xué)參數(shù);4)測試獲選化合物對SARS-CoV病毒感染細胞的保護作用。
本發(fā)明還提供SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制劑,所述蛋白酶抑制劑為與所述三維結(jié)構(gòu)模型相結(jié)合的有機分子化合物或多肽化合物。
本發(fā)明提供的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制劑可用于制備治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物。
本發(fā)明進一步提供通式I所示肉桂硫胺及其類似物或其可用藥鹽或其水合物 式中R1為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基、鹵素、乙酰基、C1-C4取代烷基?;籖2為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基、鹵素、乙酰基、C1-C4取代烷基?;籖3為 其中n=1-4,R3和R4為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基、鹵素、乙?;?、C1-C4取代烷基?;籜為O、N和S;Y為O、N、S、亞砜、磺酰基。
通式I所示肉桂硫胺及其類似物或其可用藥鹽或水合物可用于制備治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物。
本發(fā)明更進一步提供治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物組合物,其中包括治療和/或預(yù)防SARS病毒感染有效量的通式I所示肉桂硫胺及其類似物或其可用藥鹽或水合物和至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。


圖1(A)顯示SARS-CoV 3CL蛋白酶三維結(jié)構(gòu)模型(黃色)與TGEV Mpro蛋白晶體結(jié)構(gòu)(紅色)的疊合,圖中僅顯示了Cα原子,整個結(jié)構(gòu)疊合的RMSD為0.34。圖1(B)顯示SARS-CoV 3CL蛋白酶蛋白三維結(jié)構(gòu)模型。底物結(jié)合在結(jié)構(gòu)域(Domain)I和II間的溝槽內(nèi),活性位點位于溝槽的中部,催化殘基H41和C145用球棍模型表示。
圖2為3CL蛋白酶蛋白底物結(jié)合口袋表面圖,表面圖的顏色是靜電勢分布,顏色越深,靜電勢越負。肉桂硫胺(CPK模型表示)契合在結(jié)合口袋中。
圖3為SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白與肉桂硫胺相互作用動力學(xué)測試結(jié)果。所用儀器為BIACORE3000,分析軟件為Application wizard中KineticAnalysis。測定時3CL蛋白酶蛋白固定在CM5芯片上,肉桂硫胺為流動相,濃度依次為0 62.5nM、125nM、250nM、500nM、100nM和2000nM。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過分子模擬獲得了SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三維結(jié)構(gòu);根據(jù)3CL蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)用虛擬篩選方法篩選了現(xiàn)有藥物數(shù)據(jù)庫CMC(Comprehensive Medicinal Chemistry,MDL Information System,Inc.),發(fā)現(xiàn)了10個具有SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制活性的化合物;對其中的肉桂硫胺(Cinanserin,2′-(3-dime-thylaminopropylthio)cinnamanilide,2’-(3-二甲基氨基丙基硫代)肉桂酰苯胺)進行了分子和病毒水平測試,發(fā)現(xiàn)其有較好的抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性;合成了肉桂硫胺及其類似物,進行了分子和病毒水平測試,發(fā)現(xiàn)這類化合物均有抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性。
一.用分子模擬和蛋白質(zhì)同源模建方法建立SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)模型序列分析表明,SARS-CoV病毒3CL蛋白酶與遺傳性腸胃炎病毒的主蛋白酶(Main Proteinase,Mpro)有較高的序列同源性,全序列比較,兩者序列相似性為大于60%、相同性大于43%、序列間隙小于1%。以Mpro蛋白晶體結(jié)構(gòu)(Anand K,Palm GJ,Mesters JR,Siddell SG,Ziebuhr J,et al.EMBO J 2002,213213,PDB號為1LVO)為模板,用同源蛋白模建方法建立了三維結(jié)構(gòu)模型,結(jié)構(gòu)模型及與Mpro蛋白晶體結(jié)構(gòu)比較見圖1。在SARS-CoV病毒3CL蛋白酶三維結(jié)構(gòu)模型中確立了活性中心和活性口袋。
二、虛擬篩選選擇3CL蛋白酶蛋白催化活性殘基H41和C145周圍6范圍內(nèi)的殘基組成底物結(jié)合口袋作為虛擬篩選的模型,結(jié)合口袋的表面圖見圖2。用分子對接(Molecular Docking)虛擬篩選(Virtual Screening)方法,搜尋了MDL公司的藥物數(shù)據(jù)庫CMC,獲得了一批與3CL蛋白酶具有較強親和力的獲選化合物,包括肉桂硫胺(Cinanserin,2′-(3-dimethylaminopropylthio)cinnamanilide,2’-(3-二甲基氨基丙基硫代)肉桂酰苯胺)。肉桂硫胺與3CL蛋白酶蛋白結(jié)合方式見圖2。
三、分子水平篩選將構(gòu)建好的pQE30/SARS 3CL蛋白酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌M15中,以IPTG(濃度0.8mM)誘導(dǎo),在氨芐西林為抗生素,溫度為30℃,表達時間為10小時條件下,表達SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白。以NTA-His柱層析法初步純化SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白,再利用FPLC-凝膠過濾進一步純化SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白。
使用表面等離子共振(SPR)技術(shù)得到SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白與上述虛擬篩選獲得候選物相互作用的動力學(xué)參數(shù)。肉桂硫胺與3CL蛋白酶蛋白結(jié)合的動力學(xué)參數(shù)為ka=3.86×104Ms-1,kd=9.93×10-3s-1,KD=2.57×10-6M,表明SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白與肉桂硫胺有較強的結(jié)合。測定結(jié)果見圖3。
四、病毒細胞水平篩選為了確證肉桂硫胺能否抑制SARS-CoV病毒感染正常細胞,本發(fā)明測試了肉桂硫胺抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6細胞的活性。
測試原理以Vero-E6細胞作為病毒宿主細胞(易感細胞),測試樣品對病毒感染細胞的保護作用,檢測指標(biāo)為細胞變性反應(yīng)(CPE)以及觀察感染細胞保護率。
測試方法把Vero-E6細胞接種于96孔培養(yǎng)板,置37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng),加入不同稀釋濃度的SARS-CoV病毒和肉桂硫胺,觀察CPE,并用中性紅染色測定OD值,計算樣品抗SARS-CoV病毒活性作用。
測試結(jié)果在病毒-細胞水平模型的抗SARS病毒活性實驗中,用不同有效濃度的SARS病毒感染Vero-E6細胞,結(jié)果列于表1,表明肉桂硫胺時有較明顯的抑制SARS-CoV病毒感染Vero-E6細胞的保護活性。
表1.不同濃度肉桂硫胺對防止Vero-E6細胞感染SARS-CoV病毒的保護率濃度(ug/ml) CPE 感染細胞保護率(倍數(shù))100 —— ——*20 + 3.854+ 3.69細胞病變法(CPE)以加號表示細胞病變程度,<25%+,25%~50%++,50%~75+++,>75%++++。
感染細胞保護率通過比較病毒對照、細胞對照和樣品對照的OD值,計算樣品對病毒感染細胞的保護活性,保護率>1.5倍率,初步被認為樣品對病毒感染細胞具有一定的保護活性。
*樣品細胞毒性如果樣品的細胞毒性與細胞對照比>50%時,不做CPE評價和保護率計算。
五、肉桂硫胺及其類似物抗SARS-CoV病毒的新用途肉桂硫胺是二十世紀六十年代初開發(fā)的一個老藥,最初發(fā)現(xiàn)其為5-羥色胺受體的拮抗劑,用于催眠和延長睡眠時間,并具有鎮(zhèn)痛作用(Furgiuele A R,High J P,Horovitz Z P.Arch.Int.Pharmacodyn.Ther,1965,155225-235;Krapcho J,Rubin B,et al.J.Med.Chem.1963,6219;Rubin B,Piala JJ,et al.Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.1964,152132);后發(fā)現(xiàn)肉桂硫胺及其類似物具有免疫抑制作用(Krapcho J,Millonig RC,et al.J.Med.Chem.969,12164);后又發(fā)現(xiàn)這類化合物具有抗炎作用(Millonig RC,Amrein BJ,et al.J.Med.Chem.1974,17772);肉桂硫胺也曾作用抗慢性精神分裂癥藥物用于臨床研究(Holden JMC,Itil T.et al.J.Clin.Pharmacol.New Drugs 1971,11220;Itil TM,Polvan N,Holden JM.Dis.Nerv.Syst.197 132193;Gallant DM,Bishop MP.Curr.Ther.Res.Clin.Exp.1968 10461),90年代肉桂硫胺又被開發(fā)成為治療心肌缺血癥(myocardial ischemia)藥物(EP0596449)。然而,肉桂硫胺及其類似物抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶及抗SARS-CoV病毒的活性卻未見報道。
本發(fā)明涉及肉桂硫胺抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白酶催化活性,并具有抗SARS-CoV病毒活性的新用途。根據(jù)SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白三維結(jié)構(gòu)模型,用虛擬篩選篩選方法篩選出能抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白催化活性的化合物肉桂硫胺,并合成了具有通式I的肉桂硫胺及其類似物,經(jīng)SPR分子水平的活性測試和抑制Vero-E6細胞感染病毒活性測試,發(fā)現(xiàn)通式I所示肉桂硫胺及其類似物可以特異性地與3CL蛋白酶蛋白結(jié)合,并具有較明顯的抑制SARS病毒感染Vero-E6細胞的保護活性,具有用于治療和/或預(yù)防SARS-CoV病毒感染的新用途。
通式I所示肉桂硫胺衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物中各取代基的定義如下 式中R1為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基、鹵素、乙?;1-C4取代烷基?;籖2為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基、鹵素、乙?;?、C1-C4取代烷基?;籖3為 其中n=1-4,R3和R4為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基、鹵素、乙?;1-C4取代烷基?;?;X為O、N和S;Y為O、N、S、亞砜、磺酰基。
本說明書中所述的“可藥用鹽”具體地可列舉與丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、等有機酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再與無機堿形成的鹽,如鈉、鉀、鈣、鋁鹽和銨鹽,或與有機堿形成的鹽,如甲胺鹽、乙胺鹽、乙醇胺鹽等,或與賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸等堿性氨基酸形成酯后的鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸的鹽,或與甲酸、乙酸,苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有機酸的鹽。
本發(fā)明通式I化合物或其藥用鹽或水合物中優(yōu)選的化合物為肉桂硫胺(化學(xué)名為2’-(3-二甲基氨基丙基硫代)肉桂酰苯胺),英文名為Cinanserin(2′-(3-dimethylaminopropylthio)cinnamanilide)。
本發(fā)明另一方面還涉及治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物組合物,其中包括治療和/或預(yù)防SARS病毒感染有效量的通式I所示肉桂硫胺及其類似物或其可用藥鹽或水合物和至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
這里的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括但不限于離子交換劑,氧化鋁,硬脂酸鋁,卵磷脂,血清蛋白如人血白蛋白,緩沖物質(zhì)如磷酸鹽,甘油,山梨酸,山梨酸鉀,飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物,水,鹽或電解質(zhì),如硫酸魚精蛋白,磷酸氫二鈉,磷酸氫鉀,氯化鈉,鋅鹽,膠態(tài)氧化硅,三硅酸鎂,聚乙烯吡咯烷酮,纖維素物質(zhì),聚乙二醇,羧甲基纖維素鈉,聚丙烯酸酯,蜂蠟,羊毛脂。
本發(fā)明還涉及通式I所示化合物或包括通式I所示化合物或者其藥用鹽或其水合物的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療傳染性非典型性肺炎(SevereAcute Respiratory Syndrome,SARS)藥物上的新用途。
所述藥物組合物可以根據(jù)不同給藥途徑而制備成各種劑型。所述這些劑型可以下面方式之一施用口服,噴霧吸入,直腸用藥,鼻腔用藥,頰部用藥,局部用藥,非腸道用藥,如皮下,靜脈、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入,或借助一種外植儲器用藥。其中預(yù)防SARS病毒感染時優(yōu)選口服或肌肉注射,治療SARS病毒感染時優(yōu)選腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。
另外需要指出,本發(fā)明化合物的使用劑量和使用方法取決于諸多因素,包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營養(yǎng)狀況、化合物的活性強度、服用時間、代謝速率、病癥的嚴重程度以及診治醫(yī)師的判斷。
本發(fā)明涉及的阻斷SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白的抑制劑阻斷SARS病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和組裝,阻斷病毒的成熟化和病毒顆粒的形成,3CL蛋白酶蛋白抑制劑阻斷SARS-CoV病毒感染不會對感染SARS病毒的人或動物正常的生理過程產(chǎn)生不良影響,可以用于治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的醫(yī)藥用途。
優(yōu)選實施方案下面的實施例是本發(fā)明說明性優(yōu)選實施方案,但這些實施例絕不是對本發(fā)明的任何限制。
實施例1SARS-CoV病毒3CL蛋白酶三維結(jié)構(gòu)模建對比的序列源自美國國家生物信息中心NCBI,它們分別來自不同地區(qū)的SARS病例標(biāo)本,包括NCBI登錄號為gi|30275668(BJ01)、gi|30027618(Vietnam)、gi|29836495(Tor2)、gi|30023962(CUHKW1)、gi|29837498(GZ01)、gi|30275667(BJ02)、gi|30023953(HKu-39849)、gi|30124074(Canada)、gi|30173234(BJ03)。采用ClustalX(1.8版)的方法進行多重序列對比,結(jié)果表明所有已測序的SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白序列相同。
和遺傳性腸胃炎病毒的主蛋白酶(Main Proteinase,Mpro)有較高的序列同源性,全序列比較,兩者序列相似性為大于60%、相同性大于43%、序列間隙小于1%。以Mpro蛋白晶體結(jié)構(gòu)(Anand K,Palm GJ,Mesters JR,Siddell SG,Ziebuhr J,et al.EMBO J 2002,213213,PDB號為1LVO)為模板,用同源蛋白模建方法建立了三維結(jié)構(gòu)模型。三維結(jié)構(gòu)模建采用InsightII的MODELLER軟件,并用3D-Profile和Prostat軟件評價結(jié)構(gòu)模型的質(zhì)量。獲得復(fù)合物的初始結(jié)構(gòu),再用分子力學(xué)進行優(yōu)化,采用的力場參數(shù)到Amber力場和Kollman-all-atom電荷。,結(jié)構(gòu)模型及與Mpro蛋白晶體結(jié)構(gòu)比較見圖1。
實施例2SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制劑虛擬篩選用分子對接方法DOCK程序?qū)DL公司的現(xiàn)有藥物數(shù)據(jù)庫CMC,共含有8474個已知藥物的信息。分子對接時考慮了小分子化合物的柔性,根據(jù)打分的高低從上述數(shù)據(jù)庫中先挑選10個候選物,用AutoDock的打分函數(shù)和Cscore打分函數(shù)對候選物進行進一步的評價,最后挑選了肉桂硫胺進行分子水平的篩選。
實施例3肉桂硫胺結(jié)合SARS-CoV病毒3CL蛋白酶蛋白動力學(xué)測試通過虛擬篩選和分子水平測試,潛在的3CL蛋白酶蛋白酶抑制劑肉桂硫胺,本實施例肉桂硫胺來說明抑制劑與3CL蛋白酶蛋白酶結(jié)合動力學(xué)測試過程。將3CL蛋白酶蛋白固定在CM5芯片上,肉桂硫胺為流動相。用BIACORE3000測定肉桂硫胺蛋白與3CL蛋白酶蛋白的動力學(xué)行為,3CL蛋白酶蛋白的濃度依次為62.5nM、125nM、250nM、500nM、100nM、和2000nM。用ApplicationWizard/Kinetic Analysis軟件分析數(shù)據(jù)(圖2),獲得上述兩蛋白見的結(jié)合動力學(xué)參數(shù)為ka=3.86×104Ms-1,kd=9.93×10-3s-1,KD=2.57×10-7M。
實施例4肉桂硫胺保護Veto-E6感染SARS-CoV病毒測試以Vero-E6細胞作為病毒宿主細胞(易感細胞),測試樣品對病毒感染細胞的保護作用,檢測指標(biāo)為細胞變性反應(yīng)(CPE)以及感染細胞保護率。
把Vero-E6細胞接種于96孔培養(yǎng)板,置37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng),分別加入SARS病毒和不同稀釋濃度的肉桂硫胺,設(shè)病毒對照、細胞對照和樣品對照。每日鏡下觀察結(jié)果,記錄CPE,并用中性紅染色測定OD值,參照對照進行樣品抗SARS病毒活性作用的計算和評價。測試結(jié)果見表1。
實施例52-(3-二甲基胺基丙基硫代)苯胺的合成將溶于500毫升異丙醇中的54.0克(1.0摩爾)甲醇鈉,加入溶于1000毫升異丙醇的62.5克(0.5摩爾)的2-氨基硫苯酚的混合液中。室溫攪拌30分鐘,然后加入79.0克(0.5摩爾)的3-二甲基胺基丙基氯鹽酸鹽的300毫升甲苯溶液,混合液回流6小時。真空泵蒸去溶劑,加入60毫升水,用乙醚(150ml×2)萃取兩次。合并有機相,無水硫酸鎂干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去溶劑。用硅膠板快速分離,展開劑為乙酸乙脂(1)石油醚(4)/二氯甲烷(10)甲醇(1)得油狀物80.0g(76%)。
實施例62-(3-二甲基胺基丙基硫代)肉桂酰苯胺的合成將溶于10毫升氯仿的5.2克(0.025摩爾)的2-(3-二甲基胺基丙基硫代)苯胺,在15-20℃,約20分鐘,攪拌滴加到的4.1克(0.025摩爾)的肉桂酰氯的30毫升氯仿溶液中。混合物回流1小時,減壓移去溶劑得粘稠物,用丙酮熱溶,置冷,抽濾得無色固體7.5克(88%),m.p.109-111℃。用異丙醇再次重結(jié)晶,產(chǎn)物熔點為142-144℃。
權(quán)利要求
1.抗SARS-CoV病毒藥物作用靶標(biāo),所述藥物作用靶標(biāo)為SARS冠狀病毒3CL蛋白酶,其序列特征為1 SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV TCGTTTLNGL WLDDTVYCPR HVICTAEDML NPNYEDLLIR61 KSNHSFLVQA GNVQLRVIGH SMQNCLLRLK VDTSNPKTPK YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG121SPSGVYQCAM RPNHTIKGSF LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC YMHHMELPTG VHAGTDLEGK181FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI TLNVLAWLYA AVINGDRWFL NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE241PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA VLDMCAALKE LLQNGMNGRT ILGSTILEDE FTPFDVVRQC301SGVTFQ
2.SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制劑和/或治療、預(yù)防SARS病毒感染藥物的篩選方法,其特征在于包括以下步驟1)建立SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)模型;2)用分子對接虛擬篩選搜尋現(xiàn)有藥物數(shù)據(jù)庫,獲得與3CL蛋白酶有較強親和力的獲選化合物;3)用表面等離子共振(SPR)技術(shù)得到3CL蛋白酶與上述獲選化合物相互作用的動力學(xué)參數(shù);4)測試獲選化合物對SARS-CoV病毒感染細胞的保護作用。
3.SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制劑,所述蛋白酶抑制劑為與權(quán)利要求2中所述三維結(jié)構(gòu)模型相結(jié)合的有機分子化合物或多肽化合物。
4.權(quán)利要求3所述SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制劑在制備治療和/或預(yù)防SARS病毒感染藥物上的用途。
5.通式I所示肉桂硫胺及其類似物或其可用藥鹽或其水合物 式中R1為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基、鹵素、乙?;1-C4取代烷基?;?;R2為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基、鹵素、乙酰基、C1-C4取代烷基酰基;R3為 其中n=1-4,R3和R4為H、C1-C4烷基、C1-C4取代烷基、羥基、鹵素、乙?;?、C1-C4取代烷基?;籜為O、N和S;Y為O、N、S、亞砜、磺?;?。
6.如權(quán)利要求5所述的肉桂硫胺及其類似物或其可用藥鹽或水合物,其為肉桂硫胺。
7.通式I所示肉桂硫胺及其類似物或其可用藥鹽或其水合物在制備治療和/或預(yù)防SARS病毒感染藥物上的用途。
8.治療和/或預(yù)防SARS病毒感染的藥物組合物,其中包括治療和/或預(yù)防SARS病毒感染有效量的通式I所示肉桂硫胺及其類似物或其可用藥鹽或水合物和至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
9.權(quán)利要求8所述藥物組合物制備治療和/或預(yù)防SARS病毒感染藥物上的用途。
全文摘要
通過分子模擬獲得SARS-CoV病毒3CL蛋白酶的三維結(jié)構(gòu);以此為藥物靶標(biāo),篩選了現(xiàn)有藥物數(shù)據(jù)庫CMC(Comprehensive Medicinal Chemistry,MDL Information System,Inc.),發(fā)現(xiàn)一系列具有SARS-CoV病毒3CL蛋白酶抑制活性的化合物;對其中的肉桂硫胺進行分子和病毒水平測試,發(fā)現(xiàn)其具有較好的抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性;合成了肉桂硫胺類似物,進行了分子和病毒水平測試,發(fā)現(xiàn)這類化合物均有抑制SARS-CoV病毒3CL蛋白酶和抗SARS-CoV病毒活性,可用于治療和/或預(yù)防SARS-CoV病毒的感染。
文檔編號A61P31/00GK1472336SQ0312907
公開日2004年2月4日 申請日期2003年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者沈建華, 蔣華良, 沈旭, 左建平, 羅小民, 白東魯, 沈競康, 陳凱先, 貴春山, 陳莉莉, 陳靜, 楊以阜, 莊賢韓, 楊一鳴, 何煦昌, 柳紅, 熊斌, 羅海彬, 孫濤, 葉飛 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所, 上海先導(dǎo)藥業(yè)有限公司
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