專利名稱：抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及了一種具有抗體活性的卵黃抗體物質——抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體(抗-EitIgY)產(chǎn)品，并涉及其制備工藝及在獸類藥學和飼料添加劑上的應用。
在現(xiàn)代集約化養(yǎng)豬場，仔豬黃痢、白痢幾乎無所不在，對養(yǎng)豬生產(chǎn)尤其是規(guī)模化養(yǎng)豬威脅較大。朱瑞民(1988)統(tǒng)計表明，臺灣有15％-25％的仔豬因黃痢、白痢病無法育成，每年直接經(jīng)濟損失達3.6-6.9億元。我國大陸目前沒有全面統(tǒng)計仔豬黃痢、白痢的發(fā)病率和造成的損失，但各地在研究對該病的防治方法時，均在小范圍內(nèi)做過統(tǒng)計。金皓如(1986年)對出欄3.5萬頭豬場5年的統(tǒng)計結果表明，仔豬黃痢、白痢發(fā)病率占全群發(fā)病率的40.5％-58％，死亡率占全群死亡的29.5％-45.2％，每年直接經(jīng)濟損失5-10萬元。綜合許多試驗報道表明，在廣東、北京、山西、江蘇、遼寧、吉林等地，觀察近2萬頭試驗空白對照組的仔豬，僅吉林延邊自治州1987年因黃痢、白痢死亡9922頭仔豬，占存欄數(shù)的11.3％。仔豬黃痢、白痢若防治不及時，可造成仔豬體重下降，從而影響后備豬質量，并降低肉豬出欄率，增加藥費，提高養(yǎng)豬成本，從而造成嚴重的經(jīng)濟損失。
仔豬出生后主要從母豬乳中獲得免疫抗體，形成被動免疫力。仔豬由母乳中獲得的抗大腸桿菌的免疫球蛋白在2-3周消耗完，而自身抗體卻從3周齡開始產(chǎn)生。因此3周齡是仔豬從母體獲得抗體與自身產(chǎn)抗體的轉換期，或稱青黃不接期，此時仔豬免疫能力下降，最容易患仔豬白痢。
當前，臨床治療仔豬黃痢、白痢主要使用抗生素、磺胺類藥物及其它化學合成藥物，雖然短期效果明顯，但長期使用后往往會產(chǎn)生嚴重的耐藥性，使以后治療效果大大降低，另有采用中藥制劑方式對仔豬進行該類疾病的防治，但中藥制劑的效果不甚理想，因而疾病在仔豬中無法從根本上得到控制。同時也有許多獸醫(yī)學者致力于大腸桿菌疫苗的研制。而且劑型僅限于針劑。
雞卵黃抗體(IgY)是來自雞血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的結構與IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空間構象。研究表明IgY具有高度的穩(wěn)定性，在熱、酸、堿環(huán)境中具有優(yōu)良的耐受性，同時IgY還具有成本低、易于形成規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點。目前國內(nèi)已有病毒、細菌等顆粒性抗原誘導雞卵黃表達特異性抗體的研究報告。
現(xiàn)有技術中未見有通過采用仔豬黃痢、白痢病原菌(大腸桿菌)作為抗原，免疫健康母雞，收集其所產(chǎn)的卵，再從卵中提取抗-EitIgY報道。
本發(fā)明針對以上問題，研制出一種方便、高效、無毒副作用的非抗生素生物制劑—雞卵黃抗體(抗-EitIgY)，用于因特異性大腸桿菌感染所引起的仔豬黃痢、白痢疾病的防治。針對以往產(chǎn)品只能采取針劑的形式注射使用，使用不便，而加以改進。該抗體穩(wěn)定性較強、耐酸、堿，可以采取口服形式使用，能保持產(chǎn)品的活性與效價，使用方便，易于推廣。因其制備免疫球蛋白的方法較以往的要簡單、快速、易于掌握，提取回收率理想，經(jīng)濟效益可觀，適于產(chǎn)業(yè)化制作。
本發(fā)明通過以仔豬黃痢、白痢病原菌為抗原，免疫健康產(chǎn)蛋母雞，提取活性成分(抗-EitIgY)，為治療仔豬黃痢、白痢感染提供一條新思路和新方法，并為進一步制備抗仔豬黃痢、白痢的免疫生物制劑奠定基礎。
本發(fā)明所要解決的技術問題之一是針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提供一種具有抗體活性的抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體(抗-EitIgY)。
本發(fā)明所要解決的技術問題之二是提供上述抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體(抗-EitIgY)的制備方法。
本發(fā)明所要解決的技術問題之三是提供上述抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體(抗-EitIgY)在制備用于因病原菌引起的仔豬黃痢、白痢的預防或治療的藥物制劑或飼料添加劑應用。
為解決上述技術問題之一，本發(fā)明采用的技術方案是這樣的，即一種抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體(抗-EitIgY)，其特征在于所述抗-EitIgY按SDS-PAGE電泳(7.5％分離膠)檢測，圖譜呈現(xiàn)單一區(qū)帶；經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈藍色；免疫印記Western-blotting檢測中高分子量帶處出現(xiàn)清晰的特異性酶染條帶；采用雙縮脲生化法測定蛋白濃度。
本發(fā)明解決上述技術問題之二是通過采用這樣的技術方案實現(xiàn)的，即一種制備抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體(抗-EitIgY)的方法，其特征在于采用如下的步驟完成1、制備仔豬黃痢、白痢病原菌抗原(1)菌體抗原制備分別將大腸桿菌(08、060、0115、0138、0139、0141)菌株，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h，收集菌體。按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。
(2)菌毛亞單位抗原制備將菌種按1∶100的比例接種營養(yǎng)肉湯中37℃培養(yǎng)72h，然后3000g 4℃離心10min，沉淀的菌體用Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L)，60℃下高速攪拌30min，11000g 4℃離心20min，取上清液重復離心一次，最后上清液為菌毛粗提物。菌毛粗提液中加入1mL氯化鎂溶液，使其濃度為0.1mol/L，于4℃靜置12h以上，4℃ 24000g離心45min，收集菌毛沉淀。
(3)外膜蛋白抗原制備將菌種按1∶50的比例接種營養(yǎng)肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)15h，培養(yǎng)物于4℃、5000r/min離心10min，沉淀懸浮10mmol/L，HPES(pH7.4)中，75w輸出功率超聲波裂解60s，裂解物于4℃、7000r/min離心10min，收集上清液，加入約8倍體積的2％Sarkosyl，室溫作用20min后，于10℃、35000r/min離心1h，沉淀懸浮于10mmol/L，HEPES(pH7.4)，備用。
以上所得按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得免疫抗原。
2、將菌體抗原按以下的步驟制備抗體(1)對產(chǎn)卵母雞的免疫I、基礎免疫選用產(chǎn)卵母雞(健康)隔離飼養(yǎng)，進行雞皮下多點注射復合抗原，0.5ml/只。
II、強化免疫基礎免疫7天后，進行強化免疫，注射不完全福氏佐劑復合抗原0.5ml/只。
III、超強化免疫21天后需超強化免疫1-3次，注射量1ml/只，以保持抗體滴度。
于7天后開始收集雞蛋，4℃儲存?zhèn)溆谩?br> (2)卵黃抗體的提?、?采用水溶法提取卵黃抗體從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調整適當PH值4℃靜置8h，離心取上層清液濃縮、冷凍干燥，得到抗-EitIgY。
或②采用膜過濾法提取卵黃抗體分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為300KD和100KD的膜分別過濾，收集蛋白物質，冷凍干燥得到抗-EitIgY。
本發(fā)明所提供的上述抗-EitIgY產(chǎn)品由仔豬黃痢、白痢病原菌免疫產(chǎn)卵母雞而得，具有特異性，對防治仔豬大腸桿菌感染引起的仔豬黃痢、白痢疾病具有良好的效果。本發(fā)明采用母雞所產(chǎn)雞卵為載體，安全無毒，易于產(chǎn)業(yè)化。
由于解決上訴技術問題，抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體(抗-EitIgY)可制成粉劑、散劑、水劑等劑型，可以口服應用，使用方便。
附圖
的說明附圖給出了本發(fā)明制備方法的工藝流程圖。
實施例2菌體抗原的制備，將病原菌菌株，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h。收集菌體，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。
實施例3菌毛亞單位抗原制備，將菌種按1∶100的比例接種營養(yǎng)肉湯中37℃培養(yǎng)72h，然后3000g 4℃離心10min，沉淀的菌體用Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L)，60℃下高速攪拌30min，11000g 4℃離心20min，取上清液重復離心一次，最后上清液為菌毛粗提物。菌毛粗提液中加入1mL氯化鎂溶液，使其濃度為0.1mol/L，于4℃靜置12h以上，4℃24000g離心45min，收集菌毛沉淀。按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌毛亞單位抗原。
實施例4外膜蛋白抗原制備，將菌種按1∶50的比例接種營養(yǎng)肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)15h，培養(yǎng)物于4℃、5000r/min離心10min，沉淀懸浮10mmol/L，HPES(pH7.4)中，75w輸出功率超聲波裂解60s，裂解物于4℃、7000r/min離心10min，收集上清液，加入約8倍體積的2％Sarkosyl，室溫作用20min后，于10℃、35000r/min離心1h，收集沉淀。按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得外膜蛋白抗原。
實施例5采用如下方式分離提取抗-EitIgY從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調整適當PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-EitIgY。
實施例6分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為300KD和100KD的膜分別過濾，收集蛋白物質，冷凍干燥得到抗-EitIgY。
實施例7取實施例1、5、6中的產(chǎn)品進行IgY純度檢查用PAGE電泳檢測純化的卵黃抗體的純度，電泳中只出現(xiàn)一條電泳帶，即為提純的卵黃抗體。
實施例8取實施例1、5、6中的產(chǎn)品進行IgY濃度檢查將提取的抗體用PBS作5-10倍的稀釋，然后采用雙縮脲生化法測定蛋白濃度。
實施例9取實施例1、5、6中的產(chǎn)品進行IgY效價測定采用奧氏雙擴散方法進行IgY效價測定，IgY效價為1∶160-1∶12800。
實施例10采集抗-EitIgY免疫蛋50個，分離得到800ml蛋黃，加水稀釋至5000ml，離心得到清液4000ml，采用中空纖維超濾提取，最后濃縮至400ml待用，其中含有精提(即指純度在99.5％以上的IgY抗-EitIgY)10克。超濾液按5-10％加入淀粉，混合均勻，冷凍干燥，用于治療和預防仔豬大腸桿菌感染引起的疾病。
實施例11體外實驗①.分子量檢測SDS-PAGE電脈，分離膠濃度7.5％，濃縮膠濃度5％，電流11mA，電壓200V，時間45min，Marker采用低相對分子質量標準蛋白質，取下凝膠用于常規(guī)銀染色法。
②.純度分析雙向免疫擴散法，參照文獻進行。
③.活性檢測ELISA間接試驗，操作方法參照常規(guī)ELISA間接法，所用抗原、抗-EitIgY、酶標抗體均按棋盤滴定法確定工作濃度，抗原濃度為100ug/ml，包被板每孔加樣100ul，被測抗-EitIgY濃度為8ug/ml，每孔加樣100ul，辣板過氧化物酶標抗IgY-IgG(Sigma公司)工作稀釋度為1∶1000，底物為OPD，2ml/濃硫酸終止反應，酶標儀492nm下測定OD值。
實施例12IgY抗體抑制大腸桿菌粘附的作用抗-EitIgY和大腸桿菌、腸上皮細胞一起培養(yǎng)，每1ml添加0.5mg抗體就能觀察到粘附在上皮細胞上的大腸桿菌減少，抗體濃度達到3mg/ml時，效果更好。說明抗-EitIgY抗體能抑制大腸桿菌粘附在腸上皮細胞上，進而阻斷了細菌的繁殖和產(chǎn)生毒素。
實施例13抗-EitIgY體外中和細菌毒素的生物活性實驗抗-EitIgY(50ug-800ug/ml)與大腸桿菌培養(yǎng)上層清液在無菌條件下11混合，37℃24h后，取0.1ml混合物上層清液加入培養(yǎng)腸上皮細胞體系中，發(fā)現(xiàn)IgY濃度在500ug/ml可明顯抑制細菌毒素對培養(yǎng)腸上皮細胞的毒性，其后的系列稀釋，其抑制保護活性亦隨之減低。
實施例14口服抗-EitIgY在體生物學活性觀察參照相關文獻建立小鼠大腸桿菌感染的模型，試驗分為(10mg/Kg和50mg/Kg)兩個治療組、對照組?？诜委?8h后，觀察鼠的大體變化、腸道的病理組織學檢查，組織細菌定量培養(yǎng)、血內(nèi)毒素測定等指標。結果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠感染48h后的精神狀態(tài)差，大都發(fā)生腹瀉，腸道病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)腸粘膜明顯充血，高度水腫，細胞連接有破損，有大量漿性和炎性細胞浸潤；治療組治療后48h的腸粘膜水腫，有漿性和炎性細胞浸潤，細胞連接完整。組織細菌定量檢查發(fā)現(xiàn)對照組和治療組均為陽性，但治療組數(shù)量明顯低于對照組，血中內(nèi)毒素含量治療組亦明顯低于對照組。
權利要求
1.一種抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體(抗-EitIgY)，其特征在于所述抗-EitIgY按SDS-PAGE電泳(7.5％分離膠)檢測，圖譜呈現(xiàn)單一區(qū)帶；經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈藍色；免疫印記Western-blotting檢測中高分子量帶處出現(xiàn)清晰的特異性酶染條帶；采用雙縮脲生化法測定蛋白濃度；經(jīng)體外拮抗細菌生物活性檢測，抗-EitIgY濃度在500μg/ml時，表現(xiàn)出對仔豬黃痢、白痢病原菌(大腸桿菌)有明顯的抑制作用；經(jīng)奧氏雙擴散法對抗-EitIgY進行效價測定效價為1∶160-1∶12800。
2.一種制備抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體，即抗一EitIgY的方法，其特征在于采用如下的工藝步驟(1)制備仔豬黃痢、白痢病原菌抗原①菌體抗原制備分別將大腸桿菌(08、060、0115、0138、0139、0141)菌株，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h，收集菌體。按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原；②菌毛亞單位抗原制備將菌種按1∶100的比例接種營養(yǎng)肉湯中37℃培養(yǎng)72h，然后3000g 4℃離心10min，沉淀的菌體用Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L)，60℃下高速攪拌30min，11000g 4℃離心20min，取上清液重復離心一次，最后上清液為菌毛粗提物。菌毛粗提液中加入1mL氯化鎂溶液，使其濃度為0.1mol/L，于4℃靜置12h以上，4℃24000g離心45min，收集菌毛沉淀；③外膜蛋白抗原制備將菌種按1∶50的比例接種營養(yǎng)肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)15h，培養(yǎng)物于4℃、5000r/min離心10min，沉淀懸浮10mmol/L，HPES(pH7.4)中，75w輸出功率超聲波裂解60s，裂解物于4℃、7000r/min離心10min，收集上清液，加入約8倍體積的2％Sarkosyl，室溫作用20min后，于10℃、35000r/min離心1h，沉淀懸浮于10mmol/L，HEPES(pH7.4)，備用；以上所得按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得免疫抗原。(2)將所得的菌體抗原按以下的步驟制備抗體①對產(chǎn)卵母雞的免疫I、基礎免疫選用產(chǎn)卵母雞(健康)隔離飼養(yǎng)，進行雞皮下多點注射復合抗原，0.5ml/只；II、強化免疫基礎免疫7天后，進行強化免疫，注射不完全福氏佐劑復合抗原0.5ml/只；III、超強化免疫21天后需超強化免疫1-3次，注射量1ml/只，以保持抗體滴度；于7天后開始收集雞蛋，4℃儲存?zhèn)溆?；②卵黃抗體的提取I、采用水溶法提取卵黃抗體從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調整適當PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-EitIgY；或II、采用膜過濾法提取卵黃抗體分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為300KD和100KD的膜分別過濾，收集蛋白物質，冷凍干燥得到抗-EitIgY；
3.抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體，即抗-EitIgY在制備用于因病原菌引起的仔豬黃痢、白痢的預防或治療的藥物制劑或飼料添加劑應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗體活性的抗仔豬黃痢、白痢病原菌卵黃抗體(抗－EitIgY)、制備該抗體的方法及其在制備用于治療因仔豬病原菌(大腸桿菌)感染引起的相關疾病藥物或飼料添加劑中的應用。上述抗－EitIgY按SDS－PAGE電泳(7.5％分離膠)檢測，圖譜呈現(xiàn)單一區(qū)帶；經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈藍色；免疫印記Western－blotting檢測中高分子量帶處出現(xiàn)清晰的特異性酶染條帶；采用雙縮脲生化法測定蛋白濃度。上述方法為制備仔豬黃痢、白痢病原菌抗原，將該抗原免疫健康母雞，收集其所產(chǎn)的卵，再從卵中提取抗－EitIgY。用于制備預防或治療仔豬黃痢、白痢的的藥物制劑或飼料添加劑。
文檔編號A61P31/04GK1438246SQ0311750
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月21日 優(yōu)先權日2003年3月21日
發(fā)明者雁杰, 陳君 申請人:重慶和潤實業(yè)(集團)有限公司