專利名稱：緩釋可生物降解微球體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備緩釋水溶性活性成分的微球體形式的藥物組合物的方法。本發(fā)明還涉及可以使用這種方法得到的微球體，所述微球體表現(xiàn)出在大于2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，有利地為至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)釋放活性成分。
現(xiàn)有技術(shù)的多種文獻(xiàn)中已描述了許多包含藥理學(xué)活性化合物并設(shè)計(jì)用于控制和緩釋該化合物的可生物降解的基于聚合物和共聚物的微球體形式的藥物組合物。這些藥物組合物對(duì)許多要求連續(xù)和緩釋活性成分的疾病的治療具有巨大的價(jià)值。
但是，迄今研制的用于建立這種類型的組合物的制劑具有許多缺點(diǎn)，且它們當(dāng)中很少有達(dá)到臨床試驗(yàn)階段。
與這些緩釋制劑有關(guān)的一個(gè)主要的問題是在藥物組合物給藥之后的第一小時(shí)內(nèi)釋放大量的活性成分。“突發(fā)”效應(yīng)或“突發(fā)”釋放是常用于指明這種釋放的術(shù)語。這種釋放一般導(dǎo)致藥品血漿濃度的突然釋放，從而在許多情況下導(dǎo)致人不可接受的毒理學(xué)問題。這種“突發(fā)”釋放還導(dǎo)致藥物組合物活性的持續(xù)時(shí)間減少，因?yàn)樵诮M合物給藥之后突然和快速釋放大量的該活性成分。
第二個(gè)問題是使用常規(guī)的微囊化方法一般得不到較充足的膠囊化速率，特別是在活性成分是水溶性藥品的時(shí)候。
在這些制劑的研制中必須解決的第三個(gè)問題是活性成分在面對(duì)生產(chǎn)微球體的劇烈條件，例如高溫或在溶劑蒸步驟活性成分與有機(jī)溶劑長(zhǎng)時(shí)間接觸時(shí)的不穩(wěn)定性。
已完成多種濃度以解決這些不同的問題。因此，已將添加劑如糖、油、蠟、蛋白質(zhì)、聚合物、鹽或酸用于制備微球體形式的藥物組合物。這些用作將藥物保持在微球體中的物質(zhì)的添加劑可以增加微囊化方法的效率，甚至可以通過發(fā)揮穩(wěn)定劑的作用而保持加工期間的活性成分。
但是，微球體中這些添加劑的納入可能導(dǎo)致在添加劑和活性成分或基于聚合物的基質(zhì)之間的相互作用的問題，從而導(dǎo)致毒理學(xué)和藥品的藥理學(xué)活性方面的問題。此外，在生產(chǎn)加工期間將活性成分保持在微球體中的添加劑影響微球體中所含的活性成分的釋放曲線，可能阻止在微球體給藥之后連續(xù)釋放該活性成分。
還研制了其它微囊化方法以嘗試在使用有機(jī)溶劑的混合物的基礎(chǔ)上增加微球體內(nèi)活性成分的微囊化效率，但這種方法導(dǎo)致微球體生產(chǎn)加工過程中活性成分的穩(wěn)定性問題。
因此，需要研制一種設(shè)計(jì)用于緩釋水溶性活性成分的可生物降解的基于聚合物和共聚物的微球體形式的藥物組合物的制備方法，所述方法不具有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)所述的組合物和迄今研制的組合物的缺點(diǎn)。
本發(fā)明滿足這種需求。本申請(qǐng)人已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用快速多乳劑/溶劑蒸發(fā)法，不使用任何如專利FR 2 718 642那樣的添加劑或調(diào)節(jié)劑，研制基于活性成分和具有特定的分子量和特定的乳酸/乙醇酸比例可生物降解的d，l-丙交酯-共-乙交酯基質(zhì)共聚物的微球體，可以獲得表現(xiàn)出在大于2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)和持續(xù)釋放活性成分，同時(shí)表現(xiàn)出有限的“突發(fā)”效應(yīng)的微球體。這種使用溫和并對(duì)藥品相對(duì)不具有侵襲性的條件的微囊化方法，也可以保持該藥品的穩(wěn)定性，并實(shí)現(xiàn)藥品在所得的微球體內(nèi)的均勻分布。
已具體在US專利3 523 906中描述了用于將水溶性活性成分膠囊化的多乳劑的物理原理。一般地，在通過W/O/W多乳劑和溶劑蒸發(fā)的這種類型的方法中，首先將水溶性活性成分溶于第一W/O乳液的內(nèi)部相，然后進(jìn)一步在外部水相中將第一乳液乳化。
申請(qǐng)人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在外部水相中乳化第一乳液的步驟中使用滲透劑可以通過增加聚合物基質(zhì)內(nèi)膠囊包封的活性成分的含量而獲得特別高的膠囊化效力，并影響微球體的尺寸。
本發(fā)明的主題涉及一種快速、非常有效的膠囊化方法，它對(duì)活性成分相對(duì)不具有侵襲性，從而能夠獲得基于水溶性活性成分和d，l-丙交酯-共-乙交酯基質(zhì)共聚物的微球體，所述微球體表現(xiàn)出在大于2個(gè)月，優(yōu)選至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)和持續(xù)釋放活性成分，同時(shí)在組合物給藥后數(shù)小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出小“突發(fā)”效應(yīng)。
因此，本發(fā)明的主題是一種制備緩釋水溶性活性成分的微球體形式的藥物組合物的方法，其特征在于它包括以下的連續(xù)的步驟-將活性成分溶于適量的水中，-用溶于氯化烴的平均分子量為40000-80000且乳酸/乙醇酸比例為50/50-80/20的d，l-丙交酯-共-乙交酯基質(zhì)共聚物的溶液將如此得到的活性成分的水溶液乳化，得到第一微細(xì)和均勻的乳液，所述的乳液的尺寸有利地為低于1μm，-在含有表面活性劑、增粘劑和滲透劑的外部水相中乳化如此得到的該第一乳液，-萃取-蒸發(fā)所述溶劑以得到微球體，將其過濾、洗滌和干燥后回收。
閱讀以下提供的詳述，特別是根據(jù)某些特定的實(shí)施例將顯現(xiàn)其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
可以用于本發(fā)明方法范圍的水溶性活性成分有利地選自肽、蛋白質(zhì)、疫苗、抗生素、抗抑郁藥、止痛藥、抗炎藥和細(xì)胞抑制劑。根據(jù)本發(fā)明更有利的是，所述活性成分為5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt或它的一種鹽。這種活性成分為具有激動(dòng)劑活性的GnRH激素類似物。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的上下文中，用于將活性成分溶于水以形成內(nèi)部水相的第一步驟是在不加入任何保持活性成分的物質(zhì)或穩(wěn)定乳液的試劑，并在不進(jìn)行任何意在增加粘度的操作的情況下完成的。根據(jù)本發(fā)明有利的是，在不加入任何添加劑或助劑的情況下將活性成分溶于內(nèi)部水相。
在本發(fā)明上下文中的內(nèi)部水相中使用的濃度取決于活性成分的水溶性、該活性成分的特征和要獲得的目標(biāo)釋放持續(xù)時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明有利的是，相對(duì)于內(nèi)部水相的總重而言，活性成分存在的濃度為0.01-95wt％，有利地為0.5-40wt％。
第一乳液具體可以使用超聲裝置或勻漿器形成。
根據(jù)本發(fā)明可以用于通過W/O/W制備微球體的基質(zhì)共聚物必須能夠溶于適宜的揮發(fā)性溶劑，例如鹵代烷烴。根據(jù)本發(fā)明有利的是，所述溶劑為氯化烴如二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷或三氯乙烷。根據(jù)本發(fā)明甚至更優(yōu)選，所述氯化烴為二氯甲烷。
可以用于本發(fā)明的方法的d，l-丙交酯-共-乙交酯基質(zhì)共聚物具有不溶于水、可生物降解(這種共聚物在不在重要器官蓄積的情況下被吸收，并最終被完全消除)、與器官生物相容和完好地對(duì)它耐受并最終具有最小的炎癥反應(yīng)的累積優(yōu)點(diǎn)。
在本發(fā)明方法的上下文中，通過在不加入任何釋放調(diào)節(jié)劑的情況下將共聚物溶于氯化烴如二氯甲烷而得到d，l-丙交酯-共-乙交酯-基質(zhì)共聚物的溶液。實(shí)際上，已發(fā)現(xiàn)釋放調(diào)節(jié)劑的使用不適于生產(chǎn)設(shè)計(jì)用于在大于2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)釋放的微球體。
因此，在本發(fā)明主題方法中選擇具有特定分子量和特定乳酸/乙醇酸比例的共聚物，并結(jié)合作為本發(fā)明主題的不使用釋放調(diào)節(jié)劑的事實(shí)，提供了獲得表現(xiàn)出在大于2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，優(yōu)選至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)和持續(xù)釋放活性成分，同時(shí)在組合物給藥后的數(shù)小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出有限的“突發(fā)”效應(yīng)的微球體的優(yōu)點(diǎn)。
溶于二氯甲烷的有機(jī)溶液的聚合物的濃度取決于活性成分和目標(biāo)釋放速率。根據(jù)本發(fā)明主題方法有利的是，相對(duì)于由溶于氯化烴的共聚物組成的溶液的總重而言，基質(zhì)共聚物存在的濃度為5-50wt％。
根據(jù)本發(fā)明主題方法，外部水相包含表面活性劑如聚山梨酸酯80，增粘劑如聚乙烯吡咯烷酮和滲透劑如甘露醇或氯化鈉。根據(jù)本發(fā)明主題方法有利的是，外部水相包含聚山梨酸酯80、聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇或氯化鈉的溶液。根據(jù)本發(fā)明甚至更有利的是，外部水相包含聚山梨酸酯80、聚乙烯吡咯烷酮和氯化鈉的溶液。
根據(jù)本發(fā)明主題方法有利的是，相對(duì)于外部水相的總重而言，表面活性劑存在的濃度為0.1-0.5wt％，增粘劑存在的濃度為1-25wt％，而滲透劑存在的濃度為0.1-10wt％。外部水相的組成決定第二乳液的形成(乳化第一乳液)，因而決定了微球體的產(chǎn)生。因此，它有助于快速穩(wěn)定微球體，影響活性成分膠囊化效率，并構(gòu)成控制最終微球體的尺寸和它們的形態(tài)的基本因素。
在由萃取-蒸發(fā)溶劑組成的步驟中，根據(jù)由足夠長(zhǎng)斜面組成的連續(xù)蒸發(fā)系統(tǒng)，溶劑在室溫和大氣壓下快速消除，在此期間微球體的懸浮液流入薄層。
這種用于連續(xù)蒸發(fā)有機(jī)溶劑的系統(tǒng)，增加和促進(jìn)乳液與空氣的接觸，能夠?qū)崿F(xiàn)快速穩(wěn)定聚合物基質(zhì)，其效果是增加活性成分的穩(wěn)定，同時(shí)在微球體內(nèi)截留高百分率的該成分(膠囊化效率)；并導(dǎo)致快速蒸發(fā)溶劑，其效果是減少方法實(shí)施的總時(shí)間。在這個(gè)用于萃取-蒸發(fā)有機(jī)溶劑的步驟中實(shí)現(xiàn)聚合物基質(zhì)的快速穩(wěn)定，還可以實(shí)現(xiàn)活性成分在整個(gè)微球體內(nèi)的均勻分布(因而能夠獲得低濃度的緊挨微球體表面膠囊化的活性成分)，從而有助于減少在微球體給藥之后發(fā)生“突發(fā)”釋放。此外，在室溫和大氣壓下實(shí)施所述方法能夠避免在萃取-蒸發(fā)步驟中使用真空時(shí)發(fā)生諸如不耐熱產(chǎn)物改變或微球體破裂的問題。
更為詳細(xì)地，生產(chǎn)本發(fā)明的微球體的方法包括以下步驟將一定量的活性成分溶于25體積的水。用超聲波儀器，例如在1體積的含有平均分子量為40000-80000道爾頓且乳酸與乙醇酸的比例為50/50-80/20的聚(丙交酯-共-乙交酯)共聚物的二氯甲烷中將此溶液乳化。其中得到的第一乳液應(yīng)該是微細(xì)而均勻的，因而能夠?qū)⒒钚猿煞謹(jǐn)U散到整個(gè)聚合物基質(zhì)上，確保不同批次的再現(xiàn)性，并不需使用表面活性劑或其它助劑。一旦形成第一乳液，進(jìn)一步在由作為表面活性劑的聚山梨酸酯80、作為增粘劑的聚乙烯吡咯烷酮和作為滲透劑的甘露醇或NaCl的水溶液組成的外部相中將其乳化，并作短時(shí)間攪拌。在此步驟之后，用水稀釋雙乳液，然后在大氣壓下將懸浮液通過由足夠長(zhǎng)的斜面組成的連續(xù)蒸發(fā)系統(tǒng)，在此期間微球體的懸浮液流入薄層。此系統(tǒng)能夠促進(jìn)乳液和大氣的接觸，從而減少蒸發(fā)有機(jī)溶劑的時(shí)間，并增加活性成分的穩(wěn)定。然后通過過濾回收以這種方式得到的微球體，用水洗滌，并進(jìn)行凍冷干燥。
根據(jù)本發(fā)明主題方法得到的微球體是具有高含量活性成分的微球體，允許在體內(nèi)在大于2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，優(yōu)選至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)釋放藥品，并且在微球體的腸胃外給藥之后的“突發(fā)”效應(yīng)小。
本發(fā)明的主題也是可以通過實(shí)施本發(fā)明的方法而獲得的微球體，它表現(xiàn)出在大于2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，有利地為至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)釋放活性成分。
根據(jù)本發(fā)明有利的是，相對(duì)于微球體的總重而言，活性成分存在的濃度為0.5和20wt％，有利地為5-15wt％。
根據(jù)本發(fā)明有利的是，微球體的尺寸小于250μm，甚至更有利的是小于90μm。這種尺寸適于微球體給藥。
根據(jù)本發(fā)明的微球體有利地進(jìn)行腸胃外給藥，甚至更有利以肌內(nèi)、皮下或動(dòng)脈內(nèi)注射或者在腫瘤部位注射的形式進(jìn)行腸胃外給藥。對(duì)于適宜的給藥，優(yōu)選用分散劑和滲透劑將微球體分散在標(biāo)準(zhǔn)水介質(zhì)中。
以下的實(shí)施例(體內(nèi)和體外研究)以非限制性規(guī)模提供，并例示本發(fā)明。
實(shí)施例1(比較)根據(jù)出版物Advanced Drug Delivery Reviews，28，(1997)，43-70所述的不同于本發(fā)明主題方法的生產(chǎn)方法制備基于5-Oxopro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽的微球體的批次。通過以下方法制備微球體將適量的活性成分溶于水，然后用在二氯甲烷中的平均分子量為15000的聚丙交酯(100％丙交酯)的溶液將如此得到的活性成分的水溶液乳化。用攪拌器劇烈攪拌完成乳化。一旦形成第一W1/O乳液，用聚乙烯醇(0.25％)水溶液并使用高速攪拌器將其進(jìn)一步乳化，以得到W1/O/W2乳液。然后將如此形成的雙乳液緩慢攪拌數(shù)小時(shí)，以蒸發(fā)有機(jī)溶劑。然后洗滌微球體，通過離心回收并凍干。含藥品的微球體的最終載量為9-11wt％。
根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)中所述的方法得到的微球體和根據(jù)本發(fā)明主題方法得到的微球體之間的主要差別在于-聚合物的選擇。在實(shí)施例1中，所用的聚合物為平均分子量為15000的聚丙交酯(100％丙交酯)。根據(jù)該文獻(xiàn)，它是一種標(biāo)準(zhǔn)聚合物，用于在3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)緩釋5-Oxopro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽；-外部水相的組成，在實(shí)施例1中它由聚乙烯醇(0.25％)組成；-蒸發(fā)有機(jī)溶劑的系統(tǒng)。在實(shí)施例1中，將雙乳液攪拌數(shù)小時(shí)。
實(shí)施例2根據(jù)本發(fā)明主題生產(chǎn)方法，將5-Oxopro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽溶于水，然后用超聲裝置，在包含15％的平均分子量為63 000道爾頓(固有粘度大約為0.6dl/g)而乳酸與乙醇酸的比例為75/25的d，l-丙交酯-共-乙交酯共聚物的二氯甲烷溶液中將活性成分的水溶液乳化。一旦已形成第一乳液，進(jìn)一步用由0.25％的聚山梨酸酯80、7％聚乙烯吡咯烷酮和5％甘露醇組成的水溶液乳化，并使用漿式葉片攪拌器攪拌。在此步驟之后，在大氣壓下將雙乳液通過由足夠長(zhǎng)的斜面組成的連續(xù)蒸發(fā)系統(tǒng)，在此期間微球體的懸浮液流進(jìn)薄層。使用這種蒸發(fā)系統(tǒng)，有機(jī)溶劑快速蒸發(fā)，導(dǎo)致快速穩(wěn)定聚合物基質(zhì)。微球體最終通過過濾回收，用水洗滌，然后冷凍干燥。微球體中藥品的最終載量為9-11wt％。
實(shí)施例2a根據(jù)實(shí)施例2所述的方法生產(chǎn)微球體，使用在外部水相中的5％氯化鈉作為滲透劑代替5％甘露醇。
實(shí)施例3在磷酸鹽緩沖液中研究根據(jù)實(shí)施例1和2制備的微球體中5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽的體外釋放。
將25mg微球體形式的各制劑懸浮在由5ml磷酸鹽緩沖液(pH7.4)組成的釋放介質(zhì)中，然后在37℃下攪拌(旋轉(zhuǎn))4天。在不同的時(shí)間，通過高壓液相色譜法(HPLC)測(cè)定肽釋放量。
此研究結(jié)果由表1給出。它們證明根據(jù)本發(fā)明主題方法(實(shí)施例2)制備的組合物表現(xiàn)的“突發(fā)”效應(yīng)大大小于根據(jù)實(shí)施例1的現(xiàn)有技術(shù)方法制備的組合物的“突發(fā)”釋放。因此，在研究開始后4天，實(shí)施例2的微球體僅釋放微球體中存在的肽總量的3.4％，而實(shí)施例1的微球體釋放多至肽總量的22.6％。
表1
實(shí)施例4研究大鼠體內(nèi)釋放根據(jù)實(shí)施例1、2和2a制備的微球體中的5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽。
對(duì)于此研究，將三種類型的微球體(實(shí)施例1、2和2a)懸浮在標(biāo)準(zhǔn)水賦形劑中，然后在事先剃毛的背部區(qū)域?qū)Υ笫筮M(jìn)行皮下給藥。每只動(dòng)物的給藥劑量為3.6mg微膠囊化5-Oxopro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽。在給藥后3天處死某些大鼠，而且其它大鼠在給藥后7天處死。一旦大鼠死亡，則切除注射部位，然后將保留在注射部位的微球體和鄰近結(jié)締組織一起回收。接著萃取保留的5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽，然后通過高壓液相色譜法(HPLC)進(jìn)行定量。
此研究的結(jié)果由表2提供?？梢钥闯?，3天后實(shí)施例1的微球體已釋放微球體中存在的肽總量的35.3％，而實(shí)施例2的微球體僅釋放20.6％。
表2
因此可以斷定，此體內(nèi)研究的結(jié)果與體個(gè)研究(實(shí)施例3)得到的結(jié)果一致，并證明根據(jù)本發(fā)明的方法制備的制劑表現(xiàn)的“突發(fā)”釋放大大小于根據(jù)實(shí)施例1的現(xiàn)有技術(shù)方法制備的組合物的“突發(fā)”釋放。
實(shí)施例5為了完成前面的結(jié)果(實(shí)施例3和4)，在微球體給藥后第一個(gè)24小時(shí)期間進(jìn)行關(guān)于活性成分的體內(nèi)釋放的徹底研究。
在此試驗(yàn)中，在進(jìn)行根據(jù)實(shí)施例1和2制備的微球體形式的制劑的皮下給藥之后，通過液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法(LC/MS/MS)評(píng)價(jià)大鼠的5-Oxopro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽的血清含量。因此，將3.6mg膠囊化5-Oxopro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽注射到大鼠，并在給藥后不同的時(shí)間取血樣以評(píng)價(jià)血清中的5-Oxopro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽的含量。
此研究的結(jié)果由

圖1提供。因此，在實(shí)施例1的微球體給藥后1小時(shí)，血清中的肽濃度為107.8μg/l，而關(guān)于實(shí)施例2的微球體，血清中的肽濃度為51.8μg/l。在2、3、4、8和24小時(shí)后，實(shí)施例1的微球體分別表現(xiàn)出103.7、50.1、30.3、9.5和3.8μg/l的血清濃度，而實(shí)施例2的微球體分別表現(xiàn)28.0、5.5、4.5、9.3和1.0μg/l的值。
因此，此研究的結(jié)果與實(shí)施例3和4所得的結(jié)果一致，因?yàn)樽⒁獾綄?shí)施例2的微球體比實(shí)施例1的微球體在第一個(gè)24小時(shí)(“突發(fā)”效應(yīng))內(nèi)釋放較少的肽。可以斷定，如果微球體包含根據(jù)本發(fā)明的聚合物基質(zhì)，并且如果它們使用根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)，則在體內(nèi)給藥之后它們表現(xiàn)的“突發(fā)”釋放基本上小于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)方法制備的微球體。
實(shí)施例6在大鼠上研究根據(jù)實(shí)施例2制備的微球體中的5-Oxopro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽的完全釋放曲線。此研究的目標(biāo)是證明，在發(fā)生“突發(fā)”釋放現(xiàn)象(它系統(tǒng)性地發(fā)生，但比現(xiàn)有技術(shù)所述的微球體較低)之后，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的微球體在數(shù)個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)釋放肽。
以與實(shí)施例4類似的方式，將微球體懸浮在標(biāo)準(zhǔn)水賦形劑中以使它們可以在大鼠的事先已剃毛的背部區(qū)域進(jìn)行皮下給藥。每只動(dòng)物的給藥劑量為3.6mg膠囊化5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt乙酸鹽。
在3個(gè)月內(nèi)的不同時(shí)間，處死大鼠小組，切除注射部位，然后回收保留在所述部位的微球體以及鄰近的結(jié)締組織。隨后萃取保留在注射部位的5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt乙酸鹽，然后通過高壓液相色譜法(HPLC)進(jìn)行定量。
此研究的結(jié)果由圖2給出。因此它們表明所述微球體在至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)釋放肽。
實(shí)施例7這里研究根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例2a制備的微膠囊于微球體中的5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽的體內(nèi)生物活性。
S-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-ProNHEt乙酸鹽是一種作為強(qiáng)力LH-RH激素激動(dòng)劑并在急性劑量下刺激垂體分泌促性腺激素和生殖器官類固醇生成的類似物。但是，如果它作慢性給藥，則它反常地產(chǎn)生對(duì)垂體促性腺激素和睪丸與卵巢類固醇生成的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽的最初給藥導(dǎo)致促性腺激素和性激素的血漿水平的突然增大，但在與藥品連續(xù)接觸的情況下，這些激素水平明顯降低，直至在給藥后數(shù)天它們達(dá)到小于最初基線值以下的水平，且這種現(xiàn)象持續(xù)治療期間。
因此，為了證明根據(jù)實(shí)施例2和2a生產(chǎn)的制劑的小“突發(fā)”釋放不改變它的藥理學(xué)活性，給大鼠皮下注射3.6mg微膠囊化于這些微球體中的5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽，并在給藥后不同的時(shí)間取血樣以通過放射免疫試驗(yàn)評(píng)價(jià)血清睪酮。
此研究的結(jié)果由圖3給出。因此，這些結(jié)果表明適宜的血清睪酮曲線在第一天內(nèi)突然釋放，然后抑制血漿睪酮濃度，因此它們證明從根據(jù)本發(fā)明的制劑中釋放的肽的正確的生物活性。
實(shí)施例8-10的目的在于顯示根據(jù)本發(fā)明的主題方法制備的微球體與根據(jù)專利FR 2 718 642所述的方法制備的微球體相比表現(xiàn)出許多優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明和專利FR 2 718 642所述的發(fā)明之間存在的主要差別如下●本發(fā)明的方法中不使用釋放調(diào)節(jié)劑。
●將作為滲透劑的甘露醇或NaCl加到第一乳液被乳化的外部水相。
●關(guān)于本發(fā)明d，l-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)共聚物的分子量范圍(40000-80000)和乳酸/乙醇酸比例范圍(50/50-80/20)的選擇。
實(shí)施例8釋放調(diào)節(jié)劑在體外釋放時(shí)的作用根據(jù)實(shí)施例2所述的生產(chǎn)方法制備微球體，使用含有30％的平均分子量為34 000道爾頓(固有粘度大約為0.4dl/g)而乳酸與乙醇酸的比例50/50的d，l-丙交酯-共-乙交酯共聚物的二氯甲烷的溶液作為有機(jī)相，還使用不同數(shù)量(實(shí)施例8.1、8.2和8.3)的平均分子量2000道爾頓(PLA 2000)的聚(d，l-丙交酯)。
實(shí)施例8.10％的PLA 2000.
實(shí)施例8.22.5％的PLA 2000.
實(shí)施例8.35％的PLA 2000.
外部水相為由0.25％的聚山梨酸酯80、4％聚乙烯吡咯烷酮和5％甘露醇組成的水溶液。
在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行根據(jù)實(shí)施例8.1、8.2和8.3制備的微球體中的5-Oxopro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽的最初的體外釋放。
將25mg的各制劑懸浮在由5ml磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)組成的釋放介質(zhì)中，然后在37℃下攪拌(旋轉(zhuǎn))7天。在不同的時(shí)間，通過高壓液相色譜法(HPLC)測(cè)定釋放的肽的數(shù)量。結(jié)果由下表3給出。
表3
以下關(guān)于3種情況8.1、8.2和8.3的結(jié)果表明非常小的“突發(fā)”釋放，并表明釋放調(diào)節(jié)劑(PLA)具有加速活性成分釋放的作用，即使在低濃度(2.5％)的PLA下，表明使用這種試劑可能不適于生產(chǎn)設(shè)計(jì)用于緩釋(在3個(gè)月的時(shí)間內(nèi))的微球體。
實(shí)施例9釋放調(diào)節(jié)劑對(duì)藥效曲線的作用和用于在3個(gè)月內(nèi)緩釋的聚合物的選擇在大鼠上進(jìn)行藥效研究中研究微球體的聚合物組成對(duì)活性成分的釋放的作用。根據(jù)實(shí)施例2所述的生產(chǎn)方法制備微球體，使用不同類型的聚合物
實(shí)施例9.197.5％的平均分子量為34000道爾頓且乳酸與乙醇酸的比例為50/50的d，l-丙交酯-共-乙交酯共聚物和2.5％的平均分子量為2000道爾頓的聚(d，l-丙交酯)(釋放調(diào)節(jié)劑)的混合物。
實(shí)施例9.2平均分子量為34000道爾頓且乳酸與乙醇酸的比例為50/50的d，l-丙交酯-共-乙交酯共聚物。
實(shí)施例9.3平均分子量為63000道爾頓且乳酸與乙醇酸的比例為75/25的d，l-丙交酯-共-乙交酯共聚物。
微球體中5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt乙酸鹽的體內(nèi)釋放研究依據(jù)其對(duì)血漿睪酮水平抑制的藥理學(xué)作用。
此研究的結(jié)果由圖4提供。因此結(jié)果證明釋放調(diào)節(jié)劑的存在加速活性成分的釋放，因而釋放調(diào)節(jié)劑不可能用于長(zhǎng)期非常長(zhǎng)時(shí)間釋放的制劑(睪酮水平抑制5周)。
結(jié)果還表明平均分子量為34000道爾頓且乳酸與乙醇酸的比例為50/50的d，l-丙交酯-共-乙交酯共聚物可以將睪酮水平抑制作用保持8周，而平均分子量為63000道爾頓且乳酸與乙醇酸的比例為75/25的d，l-丙交酯-共-乙交酯共聚物可以將去勢(shì)保持至少3個(gè)月。
實(shí)施例10滲透劑加到外部水相的作用制劑10.1根據(jù)實(shí)施例2所述的生產(chǎn)方法制備微球體，使用由0.25％聚山梨酸酯80和4％聚乙烯吡咯烷酮組成的溶液作為外部水相。
制劑10.2
根據(jù)實(shí)施例10.1所述的生產(chǎn)方法制備微球體，將2.5％-5％的甘露醇加到外部水相作為滲透劑。
實(shí)施例10.3根據(jù)實(shí)施例10.1所述的生產(chǎn)方法制備微球體，將2.5％-5％的氯化鈉加到外部水相作為滲透劑。
所述研究結(jié)果表明外部水相中的滲透劑的影響的研究的結(jié)果由下表4給出。
表4
因此，微球體的尺寸和肽含量取決于外部水相中滲透劑的存在。外部水相中作為滲透劑的甘露醇或NaCl的加入增加膠囊化效率，即活性成分微膠囊化的百分率(含量)。所加入的滲透劑的類型和數(shù)量還可以控制顆粒的尺寸。在本發(fā)明的上下文中，NaCl有利地用作滲透劑，因?yàn)橐呀?jīng)證明在相同的攪拌和粘度條件下氯化鈉比甘露醇更大地減小顆粒的尺寸，但不導(dǎo)致膠囊化效率的降低。
實(shí)施例11外部水相中在在的增粘劑(粘劑改性劑)的濃度對(duì)顆粒尺寸的作用制劑11.1根據(jù)實(shí)施例2的生產(chǎn)方法制備微球體，但不包含活性成分，使用由0.25％聚山梨酸酯80、5％甘露醇和6.8％聚乙烯吡咯烷酮組成的溶液作為外部水相。
制劑11.2根據(jù)實(shí)施例2的生產(chǎn)方法制備微球體，但不包含活性成分，使用由0.25％聚山梨酸酯80、5％甘露醇和8.0％聚乙烯吡咯烷酮組成的溶液作為外部水相。
所述表明外部水相中的粘度改性劑的影響的研究的結(jié)果由下表5給出。
表5
用由0.25％聚山梨酸酯80、5％甘露醇和4％聚乙烯吡咯烷酮組成的外部水相產(chǎn)生的實(shí)施例10.2，能夠獲得43.8μm的粒徑。通過增加粘度改性劑的濃度，可以觀察實(shí)現(xiàn)粒徑的顯著減小，如上表5所示。因此，微球體的尺寸取決于外部水相中粘度改性劑的存在及其濃度。
權(quán)利要求
1.一種制備緩釋水溶性活性成分的微球體形式的藥物組合物的方法，其特征在于它包括以下連續(xù)步驟-將活性成分溶于適量的水中，-用溶于氯化烴的平均分子量為40000-80000且乳酸/乙醇酸比例為50/50-80/20的d，l-丙交酯-共-乙交酯基質(zhì)共聚物的溶液將如此得到的活性成分的水溶液乳化，得到第一微細(xì)和均勻的乳液，-在含有表面活性劑、增粘劑和滲透劑的外部水相中乳化如此得到的該第一乳液，-萃取-蒸發(fā)所述溶劑以得到微球體，將其過濾、洗滌和干燥后回收。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述活性成分選自肽、蛋白質(zhì)、疫苗、抗生素、抗抑郁藥、止痛藥、抗炎藥和細(xì)胞抑制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述活性成分為5-OxoPro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-PrONHEt或它的一種鹽。
4.如權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于將活性成分溶于水以形成內(nèi)部水相的第一步驟是在不加入任何保持活性成分的物質(zhì)或穩(wěn)定乳液的試劑，并在不進(jìn)行任何意在增加粘度的操作的情況下完成的。
5.如前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于相對(duì)于內(nèi)部水相的總重而言，所述活性成分存在的濃度為0.01-95wt％，有利地為0.5-40wt％。
6.如前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述氯化烴為二氯甲烷。
7.如前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于相對(duì)于由溶于氯化烴的共聚物組成的溶液的總重而言，所述基質(zhì)共聚物存在的濃度為5-50wt％。
8.如前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述外部水相包含聚山梨酸酯80、聚乙烯吡咯烷酮和甘露醇或氯化鈉的溶液，有利地為聚山梨酸酯80、聚乙烯吡咯烷酮和氯化鈉的溶液。
9.如前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于相對(duì)于外部水相的總重而言，所述表面活性劑存在的濃度為0.1-0.5wt％，所述增粘劑存在的濃度為1-25wt％，而所述滲透劑存在的濃度為0.1-10wt％。
10.如前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于由萃取-蒸發(fā)溶劑組成的步驟中，所述溶劑在室溫和大氣壓下，按照由足夠長(zhǎng)度的斜面組成的連續(xù)蒸發(fā)系統(tǒng)快速消除，在此期間微球體的懸浮液流入薄層。
11.一種微球體，所述微球體可以通過實(shí)施權(quán)利要求1-10之任一項(xiàng)所述的方法而得到，表現(xiàn)出在大于2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，有利地為至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)釋放活性成分。
12.如權(quán)利要求11的所述的微球體，其特征在于相對(duì)于微球體的總重而言，所述活性成分存在的濃度為0.5-20wt％，有利地為5-15wt％。
13.如權(quán)利要求11和12之任一項(xiàng)所述的微球體，其特征在于其尺寸小于250μm，有利地為小于90μm。
14.如權(quán)利要求11-13之一所述的微球體，其特征在于它通過腸胃外給藥，有利地為肌肉內(nèi)、皮下或動(dòng)脈內(nèi)注射，或者在腫瘤部位注射的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備緩釋水溶性活性成分的微球體形式的藥物組合物的方法。本發(fā)明的特征在于它包括以下連續(xù)步驟將活性成分溶于適量的水中；用溶于氯化烴的平均分子量為40000－80000且乳酸/乙醇酸比例為50/50－80/20的d，l－丙交酯－共－乙交酯基質(zhì)共聚物的溶液將如此得到的活性成分的水溶液乳化，得到第一微細(xì)和均勻的乳液；在含有表面活性劑、增粘劑和滲透劑的外部水相中乳化如此得到的該第一乳液；萃?。舭l(fā)所述溶劑以得到微球體，將其過濾、洗滌和干燥后回收。本發(fā)明還涉及通過實(shí)施這種方法得到的微球體，所述微球體在大于2個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，有利地為至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)連續(xù)釋放。
文檔編號(hào)A61K9/10GK1602186SQ02824575
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2002年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月10日
發(fā)明者E·費(fèi)雷, M·A·阿辛, J·加西亞, P·塔蘭, R·阿羅拉, M·拉特蘭, A·佩雷 申請(qǐng)人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司