專利名稱：含有環(huán)狀聚乳酸的抗腫瘤劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤劑，具體地說，涉及含有以環(huán)狀聚乳酸為主要成分的聚乳酸混合物的抗腫瘤劑。本發(fā)明的抗腫瘤劑可發(fā)揮使腫瘤縮小的效果和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果，可用于癌癥的治療。
背景技術(shù)：
以通過自然發(fā)癌小鼠研究的發(fā)癌抑制效果和通過移植癌組織(路易斯肺癌細胞)研究的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移抑制效果為中心，對含有環(huán)狀聚乳酸的聚乳酸混合物抑制癌細胞的厭氧性糖酵解系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫瘤效果的研究已經(jīng)取得了進展(長戶等第56屆日本癌學會總會、1997年9月；以及高田等第57屆日本癌學會總會、1998年9月)。
關(guān)于聚乳酸混合物的化學預(yù)防(Chemoprevention)效果、與抗癌劑或放射線照射聯(lián)合使用的效果、給藥方法、給藥劑量等也進行了研究，從高劑量給藥試驗中并未見到顯著的抗腫瘤效果。另外，以前使用的聚乳酸混合物中含有環(huán)狀物質(zhì)以外的物質(zhì)(例如鏈狀聚乳酸等)。即表明傳統(tǒng)使用的聚乳酸混合物中含有環(huán)狀物和鏈狀物，它們的聚合度(也稱為縮合度)不同，且對于環(huán)狀物和鏈狀物的比例以及特定聚合度(縮合度)的低聚物也未進行定量。鑒于這樣的狀況，本發(fā)明人嘗試進行只選擇性地合成環(huán)狀聚乳酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的課題是通過對含有環(huán)狀聚乳酸作為主要成分的聚乳酸混合物所顯示的抗腫瘤作用進行評價，提供新型抗腫瘤劑。本發(fā)明的另一個要解決的課題是提供利用上述抗腫瘤劑的飲料食品。
本發(fā)明人為解決上述課題進行了深入的研究，對含有環(huán)狀聚乳酸作為主要成分的聚乳酸混合物(以下實施例中稱為AD-3)和用傳統(tǒng)制法制備的含有環(huán)狀物和鏈狀物的聚乳酸混合物(以下實施例中稱為CPL)的抗腫瘤效果進行了比較實驗，結(jié)果成功地證實了前者的有效性。特別發(fā)現(xiàn)含有環(huán)狀聚乳酸作為主要成分的聚乳酸混合物即使是低劑量也可發(fā)揮充分的抗腫瘤效果。本發(fā)明基于上述認識而完成。
即，本發(fā)明提供含有聚乳酸混合物的抗腫瘤劑，其中聚乳酸混合物含有縮合度3-20的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分。
優(yōu)選本發(fā)明中使用的聚乳酸混合物實質(zhì)上不含有鏈狀聚乳酸。
優(yōu)選含有縮合度3-20的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分的聚乳酸混合物是通過包含下述步驟的制備方法制備的聚乳酸混合物(i)通過加熱使乳酸脫水縮合的第1加熱步驟，所述脫水縮合是在避免餾出丙交酯的同時餾去副產(chǎn)物水的壓力和溫度條件下進行的。
(ii)第2加熱步驟，在比第一加熱步驟高的溫度下，在避免餾出丙交酯的同時餾去副產(chǎn)物水的壓力和溫度條件下將壓力降至100mmHg以下，在該下降了的壓力以及加熱下，使該第1加熱步驟的反應(yīng)產(chǎn)物繼續(xù)反應(yīng)，生成乳酸的脫水縮合物。
本發(fā)明另一方面還提供含有上述本發(fā)明的抗腫瘤劑的飲料食品。
本發(fā)明又一方面還提供含有縮合度3-20的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分的聚乳酸混合物在抗腫瘤劑或抗腫瘤飲料食品的制造中的應(yīng)用。
本發(fā)明另一方面又提供抑制腫瘤的方法，該方法包括將有效量的含有縮合度3-20的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分的聚乳酸混合物給予人等哺乳動物。
附圖簡述

圖1表示合成例1中得到的聚乳酸混合物的質(zhì)譜。
圖2表示合成例2中得到的反應(yīng)產(chǎn)物的MS譜。
圖3表示合成例2中得到的反應(yīng)產(chǎn)物的NMR全圖。
圖4表示圖3的部分放大圖。
圖5表示圖3的部分放大圖。
圖6表示實施例1中腫瘤組織重量的比較。
圖7表示實施例1中AD-3給藥組的腫瘤組織(實質(zhì)、海綿組織)重量。
圖8表示實施例1中AD-3給藥組肺部轉(zhuǎn)移集落數(shù)的比較。
圖9表示實施例2中腫瘤組織比例的比較。
圖10表示實施例2中各組織重量的比較。
實施發(fā)明的最佳方式以下，對本發(fā)明的實施方法和實施例進行詳細說明。
本發(fā)明的抗腫瘤劑和飲料食品采用含有縮合度3-20的環(huán)狀聚乳酸為主要成分的聚乳酸混合物作為有效成分。
本說明書中所述“聚乳酸混合物”是指縮合度3-20的環(huán)狀聚乳酸以任意比例存在的混合物。雖然本說明書為了說明方便使用了“聚乳酸混合物”這個用語，但其中也包括由單一成分的具有一定縮合度的環(huán)狀聚乳酸構(gòu)成的聚乳酸。
縮合度是指聚乳酸中的重復單元——乳酸單元的數(shù)量。例如推測環(huán)狀聚乳酸有下述結(jié)構(gòu)式，式中的m為1時縮合度為3；m為18時縮合度為20。
(式中，m表示1-18的整數(shù))本說明書中，如果單稱為“乳酸”，則該乳酸包括所有L-乳酸、D-乳酸或它們的任意比例的混合物。本發(fā)明中，優(yōu)選乳酸實質(zhì)上由L-乳酸構(gòu)成。這里所說的“實質(zhì)上”是指聚乳酸混合物中L-乳酸單元的比例[即，(L-乳酸單元數(shù)/L-乳酸單元數(shù)+D-乳酸單元數(shù))×100]例如為70％以上，優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選85％以上，進一步優(yōu)選90％以上，特別優(yōu)選95％以上。聚乳酸混合物中L-乳酸單元的比例與作為原料使用的乳酸中所存在的L-乳酸和D-乳酸的比例相關(guān)。
本發(fā)明的抗腫瘤劑可廣泛用于抑制腫瘤。更具體地說，抑制腫瘤包括指防止腫瘤發(fā)生、抑制腫瘤增大、腫瘤消退以及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等，包括所有臨床上癌和/或腫瘤的預(yù)防和/或治療。
對可使用本發(fā)明抗腫瘤劑的癌的種類沒有特別限定，包括所有良性腫瘤和惡性腫瘤。癌的具體例子有惡性黑素瘤、惡性淋巴瘤、消化系統(tǒng)癌、肺癌、食管癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結(jié)腸癌、泌尿道腫瘤、膽囊癌、膽管癌、膽道癌、乳癌、肝癌、胰癌、睪丸腫瘤、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、子宮癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腦瘤、卡波濟氏肉瘤、血管瘤、白血病、真性多血癥、成神經(jīng)細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、骨髓瘤、膀胱瘤、肉瘤、骨肉瘤、肌肉瘤、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚附屬器官癌、皮膚轉(zhuǎn)移癌、皮膚黑素瘤等，但并不限定于此。
(A)本發(fā)明中使用的聚乳酸混合物的制備方法本發(fā)明的抗腫瘤劑含有聚乳酸混合物作為有效成分，所述聚乳酸混合物含有縮合度3-20的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分。
(A-1)制備方法一本發(fā)明中使用的聚乳酸混合物的第一種制備方法有包含下述步驟的方法(i)通過加熱使乳酸脫水縮合的第1加熱步驟，所述脫水縮合是在避免餾出丙交酯的同時餾去副產(chǎn)物水的壓力和溫度條件下進行。
(ii)第2加熱步驟，在比第1加熱步驟高的溫度下，在避免餾出丙交酯的同時餾去副產(chǎn)物水的壓力和溫度條件下將壓力降至100mmHg以下，在該下降了的壓力以及加熱下，使該第1加熱步驟的反應(yīng)產(chǎn)物繼續(xù)反應(yīng)，生成乳酸的脫水縮合物。
本發(fā)明中使用的原料乳酸可以是任意的D-乳酸、L-乳酸和DL-乳酸，可以將它們單獨使用，也可以將2種以上組合使用。
第1加熱步驟是通過加熱使乳酸脫水縮合的步驟，是在避免餾出丙交酯的同時餾去副產(chǎn)物水的壓力和溫度條件下進行脫水縮合的步驟。為了使該反應(yīng)順利進行，第1加熱步驟的反應(yīng)要餾去由乳酸脫水縮合生成的副產(chǎn)物水，但此時要設(shè)定可避免餾去2個分子乳酸的脫水縮合物丙交酯的壓力和溫度。
反應(yīng)壓力可以是常壓也可以是減壓，優(yōu)選減壓。反應(yīng)壓力具體為10-760mmHg，優(yōu)選300～500mmHg，更優(yōu)選350～400mmHg。反應(yīng)溫度隨壓力條件變化而變化，通常為100℃～150℃，優(yōu)選120～140℃的范圍。
對第1加熱步驟的反應(yīng)時間沒有特別限定，通常為3-12小時，優(yōu)選5-6小時。
通過第1加熱步驟的反應(yīng)，生成了以3-23個分子乳酸的脫水縮合物為主要成分的反應(yīng)產(chǎn)物。
上述第1加熱步驟結(jié)束后，為了得到平均聚合度更高的低聚物，在第2加熱步驟中要加熱到比上述第1加熱步驟中的反應(yīng)溫度更高的溫度，例如加熱到145℃以上，優(yōu)選150～180℃，更優(yōu)選150～160℃的溫度，同時使反應(yīng)壓力降到100mmHg以下，優(yōu)選10～80mmHg，更優(yōu)選15～20mmHg的壓力，再繼續(xù)進行脫水縮合反應(yīng)。
該反應(yīng)也與上述第1加熱步驟的反應(yīng)情形相同，為使反應(yīng)順利進行，要在餾去副產(chǎn)物水而避免餾去丙交酯的條件下進行。
為了避免餾出丙交酯且提高反應(yīng)效率，將反應(yīng)壓力降到上述壓力范圍(即100mmHg以下)的速度(減壓速度)需要保持小于5mmHg/分鐘。優(yōu)選減壓速度為0.25mmHg/分鐘以上但小于5mmHg/分鐘，更優(yōu)選0.25mmHg/分鐘以上4mmHg/分鐘以下，進一步優(yōu)選0.5mmHg/分鐘以上3mmHg/分鐘以下，特別優(yōu)選0.5mmHg/分鐘以上1mmHg/分鐘以下的范圍。如果是比上述范圍低的減壓速度，則減壓到預(yù)定壓力所需的時間就將延長，因而不優(yōu)選；如果以5mmHg/分鐘以上的減壓速度減壓，則丙交酯會與副產(chǎn)物水一同餾去，因而不優(yōu)選。
反應(yīng)壓力下降到100mmHg以下的壓力后，在該反應(yīng)壓力下繼續(xù)反應(yīng)。此時的反應(yīng)時間為3～12小時，優(yōu)選5～6小時。
通過上述第2加熱步驟的反應(yīng)，可得到平均聚合度為3～30，優(yōu)選3～23的乳酸低聚物，第2加熱步驟的反應(yīng)產(chǎn)物中，環(huán)狀乳酸低聚物相對于全部乳酸低聚物的比例通常為70％重量以上，例如約為70～80％重量。
優(yōu)選在上述第2加熱步驟結(jié)束后實施第3加熱步驟。第3加熱步驟是在比所述第2加熱步驟更低的的壓力下，通過加熱第2加熱步驟的反應(yīng)產(chǎn)物使反應(yīng)產(chǎn)物中的鏈狀乳酸低聚物環(huán)化，生成環(huán)狀乳酸低聚物的步驟。
優(yōu)選第3加熱步驟的反應(yīng)壓力為0.1～5mmHg，更優(yōu)選0.25～5mmHg，進一步優(yōu)選0.5～3mmHg，特別優(yōu)選0.5～1mmHg。優(yōu)選第3加熱步驟的反應(yīng)溫度為145～180℃，更優(yōu)選150～160℃。
在這樣的壓力和溫度條件下繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)時間為3～12小時，優(yōu)選5～6小時。此時也要餾去生成的副產(chǎn)物水。此時也優(yōu)選避免餾去丙交酯，但由于反應(yīng)產(chǎn)物中幾乎不含丙交酯，因此無需特別減慢減壓速度。
通過第3加熱步驟的反應(yīng)，可生成平均聚合度為3～30，優(yōu)選3～23的環(huán)狀乳酸低聚物。第3加熱步驟的反應(yīng)產(chǎn)物中，環(huán)狀乳酸低聚物相對于全部乳酸低聚物的比例通常為90％重量以上，優(yōu)選99％重量以上。
(A-2)制備方法二本發(fā)明中使用的聚乳酸混合物的第二種制備方法有在下述通式(2)R-Y-Me (2)(式中，R表示脂族基、芳基、-Si(R10)(R11)(R12)、-CH(R20)CONR21R22或-CH(R30)COOR31，其中R10、R11和R12各自獨立表示脂族基或芳基，R20表示脂族基，R21和R22各自獨立表示氫原子、脂族基或芳基，R30表示脂族基，R31表示氫原子、脂族基或芳基；Y表示-O-、-S-或-NR40-，其中R40表示氫原子、脂族基或芳基；Me表示堿金屬。)所示堿金屬化合物存在下使丙交酯聚合的方法。
使用2分子乳酸脫水縮合形成的丙交酯(3，6-二甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮)作為原料，在上述通式(2)所示堿金屬化合物存在下使其反應(yīng)。下面對通式(2)R-Y-Me(2)進行說明。
通式(2)中，R表示脂族基、芳基、-Si(R10)(R11)(R12)、-CH(R20)CONR21R22或-CH(R30)COOR31，其中R10、R11和R12各自獨立表示脂族基或芳基，R20表示脂族基，R21和R22各自獨立表示氫原子、脂族基或芳基，R30表示脂族基，R31表示氫原子、脂族基或芳基。
本說明書中所述脂族基有碳原子數(shù)為1-12，優(yōu)選1-6的直鏈、分支、環(huán)狀或它們的組合的飽和或不飽和脂族烴基，具體有甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、辛基、十二烷基等烷基；環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)辛基、環(huán)十二烷基等環(huán)烷基。脂族基也可以是具有雙鍵或三鍵的不飽和烴基。
本說明書中所述芳基有碳原子數(shù)為6-30，優(yōu)選6-20，更優(yōu)選6-12，進一步優(yōu)選6-10的芳基和芳基烷基。芳基有苯基、甲苯基、萘基等，芳基烷基有芐基、苯乙基、萘甲基等。
脂族基和芳基可以具有1個以上的取代基。對取代基的種類并沒有特別限定，例如有直鏈或支鏈以及鏈狀或環(huán)狀的烷基、直鏈或支鏈11111以及鏈狀或環(huán)狀的烯基、直鏈或支鏈以及鏈狀或環(huán)狀的炔基、芳基、酰氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、氨基甲酰氧基、酰胺基、磺酰胺基、氨基甲?；被酋；?、烷氧基、芳氧基、芳氧基羰基、烷氧基羰基、N-?；被酋；?、N-氨磺?；被柞；?、烷基磺酰基、芳基磺?；⑼檠趸驶被?、芳氧基羰基氨基、氨基、銨基、氰基、硝基、羧基、羥基、磺基、巰基、烷基亞磺?；?、芳基亞磺酰基、烷硫基、芳硫基、脲基、雜環(huán)基(例如至少含有一個以上氮、氧和硫等的3-12元的單環(huán)、稠合環(huán))、雜環(huán)氧基、雜環(huán)硫基、酰基、氨磺?；被⒓坠柰榛Ⅺu原子等。其中烷基、烯基、炔基和烷氧基的碳原子數(shù)通常為1-12，優(yōu)選1-6，芳基的原子數(shù)通常為6-20，優(yōu)選6-10。
通式(2)中，Y表示-O-、-S-或-NR40-，其中R40表示氫原子、脂族基或芳基。優(yōu)選Y為-O-或-S-。R40所示的脂族基或芳基如上所述。
通式(2)中，Me表示堿金屬。堿金屬例如有Li、Na或K，優(yōu)選Li。
通式(2)所示化合物中具有不對稱碳的化合物可以分別是(R)型、(S)型或(R)(S)型的任意形式。
獲得通式(2)所示堿金屬化合物的方法并沒有特別限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可簡便獲得，例如可使R-YH與正丁基鋰等烷基化堿金屬反應(yīng)獲得。
根據(jù)本發(fā)明的方法，當在通式(2)所示堿金屬化合物存在下使丙交酯聚合時，相對于每1摩爾丙交酯，優(yōu)選堿金屬化合物(R-Y-Me)的用量為1-0.1摩爾，更優(yōu)選0.2-0.3摩爾。
只要反應(yīng)可以進行，對于上述反應(yīng)的反應(yīng)溫度沒有特別限定，優(yōu)選-100℃～室溫，更優(yōu)選-78℃～-50℃。優(yōu)選反應(yīng)在-78℃～-50℃的溫度下開始，再緩慢升溫至室溫。
上述方法中的丙交酯聚合反應(yīng)優(yōu)選在反應(yīng)溶劑存在下進行。反應(yīng)溶劑只要是反應(yīng)惰性溶劑即可，并沒有特別限定，優(yōu)選四氫呋喃等環(huán)醚、二乙醚、二甲氧基乙烷等。反應(yīng)氣氛采用氮氣、氬氣等惰性氣體氣氛。反應(yīng)壓力并無特別限定，優(yōu)選常壓。
如上所述方法得到的乳酸低聚物的組成隨作為反應(yīng)助劑使用的堿金屬化合物而變化。例如使用碳原子數(shù)為1～3的烷基醇的堿金屬化合物(優(yōu)選鋰化合物)作為堿金屬化合物時，可得到環(huán)狀乳酸低聚物和鏈狀低聚物的混合物(環(huán)狀乳酸低聚物的比例為80～85％重量)。而使用叔丁醇等碳原子數(shù)為4以上的烷基醇的堿金屬化合物或苯硫酚等堿金屬化合物作為堿金屬化合物時，可以實質(zhì)上選擇性地只得到環(huán)狀乳酸低聚物?；蛘咄ㄟ^使用通式(2)中的R為-CH(R20)CONR21R22，其中R20表示脂族基，R21和R22各自獨立表示氫原子、脂族基或芳基的化合物作為堿金屬化合物，更具體地說，例如使用下述通式(3) 所示乳酰胺，則實質(zhì)上可選擇性地只得到環(huán)狀乳酸低聚物。本說明書中所述“實質(zhì)上可選擇性地只得到環(huán)狀乳酸低聚物”是指反應(yīng)產(chǎn)物中實質(zhì)上不生成鏈狀乳酸低聚物，具體地說，是指鏈狀乳酸低聚物的比例相對于反應(yīng)產(chǎn)物中的全部乳酸低聚物通常為10％重量以下，優(yōu)選5％重量以下，特別優(yōu)選3％重量以下。
上述方法一和方法二制備的環(huán)狀乳酸低聚物的推定化學結(jié)構(gòu)如下所示。
(式中，m表示1-30的整數(shù))上述方法的反應(yīng)產(chǎn)物通常為m表示1-30，例如表示1-28、1-25、1-21或1-18等整數(shù)的環(huán)狀乳酸低聚物的混合物。
根據(jù)優(yōu)選的實施例，可以實質(zhì)上不生成鏈狀乳酸低聚物，而選擇性地制備環(huán)狀乳酸低聚物。這里所述“實質(zhì)上不生成鏈狀乳酸低聚物”是指環(huán)狀乳酸低聚物相對于反應(yīng)產(chǎn)物中的全部乳酸低聚物的比例為80％重量以上，優(yōu)選90％重量以上，更優(yōu)選95％重量以上，特別優(yōu)選99％重量以上。
本發(fā)明的抗腫瘤劑含有聚乳酸混合物作為有效成分，所述聚乳酸混合物含有可由上述制備方法制備的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分。
優(yōu)選本發(fā)明中使用的聚乳酸混合物實質(zhì)上不含有鏈狀聚乳酸。這里所述“實質(zhì)上不含有”是指鏈狀聚乳酸相對于全部聚乳酸的比例為20％重量以下，優(yōu)選10％重量以下，更優(yōu)選5％重量以下，特別優(yōu)選1％重量以下。
(B)本發(fā)明的抗腫瘤劑的制備方法和使用方法本發(fā)明的抗腫瘤劑可以與其它抗腫瘤劑和/或免疫療法劑聯(lián)合使用。其它抗腫瘤劑有絲裂霉素、阿霉素、順鉑、長春地辛、長春新堿、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、博來霉素、培洛霉素或依托泊苷等。其它免疫療法劑有微生物或細菌細胞壁骨骼成分、免疫活性多糖、天然型或基因工程方法獲得的細胞因子、如集落刺激因子的物質(zhì)。上述免疫活性多糖有香菇多糖或裂裥菌素等，細菌細胞壁骨架成分有胞壁酰二肽衍生物等，微生物有乳酸菌等，天然型或由基因重組方法獲得的細胞因子有干擾素等。
本發(fā)明的抗腫瘤劑除上述成分外，還可以根據(jù)需要在不損害本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)任意選擇、聯(lián)合使用藥品類、準藥品類等制劑中使用的成分或添加劑。本發(fā)明的抗腫瘤劑可作為單獨的藥品類使用，除此之外也可以與藥品類或準藥品類等配合使用。
本發(fā)明的抗腫瘤劑的形式并沒有特別限定，可以由經(jīng)口給藥或腸道外給藥的劑型中選擇與目的最適宜的劑型。
適合經(jīng)口給藥的劑型的例子有片劑、膠囊劑、散劑、口服液、顆粒劑、細粒劑、糖漿劑、溶液劑、乳劑、混懸劑、咀嚼劑等，適合腸道外給藥的劑型的例子有注射劑(皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈注射等)、外用劑、滴液劑、吸入劑、噴霧劑等，但并不限于這些。
適合經(jīng)口給藥的液體制劑例如溶液劑、乳劑或糖漿劑等可以用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等糖類，聚乙二醇、丙二醇等二元醇類，芝麻油、橄欖油、豆油等油類，對羥基苯甲酸酯類等防腐劑，草莓香料、薄荷等香料類等來制備。另外膠囊劑、片劑、散劑或顆粒劑等固體制劑的制備可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等賦形劑，淀粉、海藻酸鈉等崩解劑，硬脂酸鎂、滑石粉等潤滑劑，聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等粘合劑，脂肪酸酯等表面活性劑，甘油等增塑劑等。
適合腸道外給藥的注射用或輸液用的制劑優(yōu)選將作為有效成分的上述物質(zhì)以溶解或懸浮狀態(tài)包含在與受藥者的血液等張的無菌水性介質(zhì)中。例如，如果是注射劑，則可用由鹽溶液、葡萄糖溶液或鹽水和葡萄糖溶液的混合物構(gòu)成的水性介質(zhì)等配制溶液。用于腸內(nèi)給藥的制劑可以用例如可可脂、氫化脂或氫化羧酸等載體來配制，作為栓劑提供。另外，在噴霧劑的制備中，可以將作為有效成分的上述物質(zhì)分散為微粒，可以使用不刺激受藥者的口腔和氣道粘膜，且使有效成分容易吸收的載體。載體可具體例舉乳糖或甘油等?？筛鶕?jù)有效成分物質(zhì)和所用載體的性質(zhì)配制成氣霧劑或干粉等形式的制劑。在這些腸道外給藥用的制劑中可以添加1種或2種以上選自二元醇類、油類、香料類、防腐劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑、表面活性劑、增塑劑等的飲料食品。
本發(fā)明的抗腫瘤劑的劑量和給藥次數(shù)可根據(jù)包括給藥目的、給藥形式、攝取者年齡、體重或性別等條件等的各種因素而適當設(shè)定，通常有效成分的劑量為每天1～10,000mg/kg，優(yōu)選10～2000mg/kg，更優(yōu)選10～200mg/kg。優(yōu)選將上述劑量的制劑分為每天1～4次左右給藥。本發(fā)明的抗腫瘤劑的給藥時間并沒有特別限定。
本發(fā)明還涉及含有聚乳酸混合物的飲料食品，所述聚乳酸混合物含有上述縮合度為3～20的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分。即，本發(fā)明中使用的縮合度為3～20的環(huán)狀聚乳酸的混合物不僅以上述單獨的劑型使用，還可以混合到飲料食品中使用。
本發(fā)明的飲料食品只要混合后不使聚乳酸混合物分解即可，對混合形式并沒有特別限定。
本發(fā)明的飲料食品制品的具體例子有清涼飲料、口服液、健康食品、指定保健用食品、功能食品、活性功能食品、營養(yǎng)輔助食品、增補劑、飼料、飼料添加劑等包括飲料在內(nèi)的通常稱為健康食品或輔助食品的制品。另外，本發(fā)明的抗腫瘤劑還可以作為獸藥、餌飼料等使用。
飲料食品的具體例子有香口膠、巧克力、糖果、糖片、果凍、曲奇餅、餅干、酸乳酪等糖果點心類；雪糕、果汁冰棍等的冰點類；茶、清涼飲料(包括果汁、咖啡、可可等)、營養(yǎng)口服液、美容口服液等飲料；面包、火腿、湯、果醬、意大利粉、冷凍食品類等任何飲料食品?；蛘?，也可以將本發(fā)明中使用的環(huán)狀聚乳酸混合物添加到調(diào)味料或食品添加劑中使用。通過攝取本發(fā)明的飲料食品，能夠發(fā)揮抗腫瘤效果，可以提供實質(zhì)上未顯示有害副作用的安全的食品。
本發(fā)明的飲料食品可以將聚乳酸混合物直接混合、分散到用于食品的常用原料中，然后通過公知的方法加工成所需的形式而獲得。
本發(fā)明的飲料食品包括所有形式的飲料食品，對其種類并無特別限定，可以將本發(fā)明的抗腫瘤劑混合到如上所述的各種飲料食物或各種營養(yǎng)組合物例如各種經(jīng)口或經(jīng)腸營養(yǎng)劑、飲料等中作為飲料食品提供。這樣的飲料食品的組成中除了縮合度為3～20的環(huán)狀聚乳酸混合物之外，還可以含有蛋白質(zhì)、脂類、糖類、維生素和/或礦物質(zhì)類等。對飲料食品的形式并無特別限定，只要是容易攝取的形式即可，可以是固體、粉末、液體、凝膠狀、漿糊狀等任何形式。
對飲料食品中的聚乳酸混合物的含量并無特別限定，通常為約0.1～20％重量，更優(yōu)選約0.1～10％重量。
飲料食品中含有的聚乳酸混合物的量優(yōu)選含有可發(fā)揮作為本發(fā)明目的的抗腫瘤作用的量，優(yōu)選在一份攝取的飲料食品中含有約0.1g至10g，更優(yōu)選含有約0.5g至3g。
以下通過實施例進一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的任一點均不受實施例的限定。
實施例合成例1聚乳酸混合物(以下也稱為CPL)的制備將500ml L-乳酸(混有D-乳酸)加入置于加熱套中的分離式燒瓶中。以300ml/分鐘通入氮氣并進行攪拌，一邊將餾出的水通過保溫的下行連接管導入具回流冷凝器的燒瓶，一邊在145℃加熱3小時。再減壓至150mmHg，在同一溫度下加熱3小時，然后減壓至3mmHg，在155℃溫度下加熱3小時，最后在3mmHg減壓下185℃加熱1.5小時，得到反應(yīng)產(chǎn)物聚乳酸。
將得到的聚乳酸保持在100℃，先后加入100ml乙醇和400ml甲醇，然后冷卻。將該液加入500ml甲醇中，充分攪拌、靜置，然后過濾、提純。將該濾液減壓干燥，溶解于乙腈，配制為200ml(原液)。
將該原液過預(yù)先已平衡的反相ODS柱(TSK gel ODS-80TM)，用含0.01M鹽酸的30％、50％和100％乙腈(pH2.0)逐級洗脫，得到100％乙腈洗脫的級分聚乳酸(縮合度3～20)。得到的物質(zhì)的質(zhì)譜如圖1所示。從圖1中有規(guī)律的碎片離子峰可知得到的聚乳酸混合物為環(huán)狀縮合物與直鏈縮合物混存的狀態(tài)。
合成例2環(huán)狀聚乳酸混合物(以下也稱為AD-3)的制備將10.0g(s)-(+)-乳酸裝入100ml容量的茄型燒瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上。將燒瓶內(nèi)的壓力調(diào)節(jié)至350-400mmHg，加熱到140℃，在同一壓力和同一溫度下繼續(xù)反應(yīng)6小時(第1加熱步驟)。餾去該反應(yīng)生成的副產(chǎn)物水。但在上述反應(yīng)條件下，丙交酯幾乎不餾出體系外。
接著將反應(yīng)溫度上升到150-160℃，用6小時將反應(yīng)壓力由400mmHg緩慢下降至15-20mmHg(減壓速度1mmHg/分鐘)。在該減壓速度條件下副產(chǎn)物水被餾去，但幾乎不餾去丙交酯。之后將壓力保持在15-20mmHg，繼續(xù)反應(yīng)6小時(第2加熱步驟)。
接著，用30分鐘將壓力下降至1-3mmHg，在160℃反應(yīng)溫度下繼續(xù)反應(yīng)5小時(第3加熱步驟)。
上述反應(yīng)結(jié)束后分析反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果得到6.80g(收率85％)平均聚合度為3-21的環(huán)狀低聚物。
合成例2中得到的反應(yīng)產(chǎn)物的MS譜如圖2所示。合成例2中得到的反應(yīng)產(chǎn)物的MR全圖如圖3所示，圖3的部分放大圖如圖4和圖5所示。
實施例1(A)材料和方法(1)實驗動物和腫瘤細胞的移植將1.0×104個路易斯肺癌細胞移植到6周齡小鼠(C57BL/6N)右大腿皮下。
(2)被檢物質(zhì)的給予將小鼠分為對照組(溶劑給予組)、AD-3(合成例2中制備的物質(zhì))給予組(本發(fā)明)和CPL(合成例1中制備的物質(zhì))給予組(比較例)。再將AD-3給予組和CPL給予組按照每次給予各個體的量分別分成4組，即0.2mg、0.4mg、1.0mg和4.0mg給予組。
自移植2天后開始對溶劑給予組、AD-3給予組和CPL給予組分別腹腔內(nèi)給予溶劑(甘油和丙二醇的混合液)、懸浮于溶劑的AD-3或CPL，隔天給予，直至第17-19天安樂死。
(3)移植組織的獲取和測量深度麻醉后開胸，從左心室回流PBS。之后將移植的腫瘤組織摘出，測量直徑、短徑和厚度，同時測定重量。將腫瘤組織分成表層腫瘤細胞密集的腫瘤細胞層和深部充滿血液的的海綿組織。測定重量后去除海綿組織，測定表層的腫瘤細胞層的重量。
(4)肺部轉(zhuǎn)移集落的觀察摘取兩肺后，計數(shù)存在于各肺葉表面的轉(zhuǎn)移集落。
(5)移植組織的顯微鏡觀察按照組織學方法制作腫瘤組織的組織切片，進行H·E染色并鏡檢。
(B)結(jié)果及總結(jié)結(jié)果如圖6-圖8所示。
(1)腫瘤組織與對照組相比，CPL組中0.4mg給予組的腫瘤組織重量增加，其它劑量的組沒有變化。與此相對，AD-3給予組與CPL組相比，1.0mg給予組減少為約65％，腫瘤抑制效果顯著(圖6和圖7)。
(2)腫瘤組織觀察觀察組織切片，結(jié)果顯示AD-3給予組在實質(zhì)和海綿組織的邊界區(qū)域或?qū)嵸|(zhì)內(nèi)部存在多數(shù)嗜中性白細胞的浸潤。實質(zhì)內(nèi)的嗜中性白細胞存在于毛細血管周圍。并且，與CPL給予組相比，該AD3組中出現(xiàn)的嗜中性白細胞的浸潤存在于絕大多數(shù)區(qū)域，這種差別是顯著的。該浸潤在AD-3組中最具腫瘤縮小效果的1.0mg給予組中是顯著的，這也顯示了與腫瘤縮小效果的相關(guān)性。
(3)肺部轉(zhuǎn)移集落已知與對照組和CPL組相比，AD-3給予組的肺部轉(zhuǎn)移集落數(shù)少。其中1.0mg給予組為對照組的約1/3。由這些觀察結(jié)果可知，選擇性環(huán)狀乳酸低聚物AD-3對于移植腫瘤組織的增殖和轉(zhuǎn)移的抑制有效，其效果在1.0mg給予組中最顯著(圖8)。
(4)總結(jié)對由選擇性環(huán)狀乳酸低聚物合成方法得到的AD-3的抗腫瘤效果與傳統(tǒng)的加熱縮合法得到的CPL進行了比較。改變劑量進行比較，結(jié)過表明AD-3的腫瘤縮小效果和轉(zhuǎn)移抑制效果比CPL優(yōu)異。
已證實AD-3導致腫瘤組織內(nèi)血原性嗜中性白細胞的浸潤。這顯示AD-3以及CPL的抗腫瘤效果的主要原因是基于厭氧性糖酵解系統(tǒng)得到抑制，不過本次的結(jié)果還顯示除環(huán)狀乳酸低聚物抑制厭氧性糖酵解系統(tǒng)導致的抗腫瘤效果之外，還有經(jīng)由免疫系統(tǒng)的腫瘤抑制效果。
已證實AD-3給予組中1.0mg給予組具有顯著的效果。而傳統(tǒng)的CPL腹腔內(nèi)給予時是4mg有效，由此表明最佳濃度的不同。
實施例2(A)材料和方法(1)實驗動物和腫瘤細胞的移植將1.0×104個路易斯肺癌細胞移植到31只6周齡小鼠(C57BL/6N)右大腿皮下。
(2)給予環(huán)狀聚乳酸混合物移植2天后，將小鼠分為無處置組和AD-3(合成例2中制備的物質(zhì))給予組(0.1mg、0.25mg、0.5mg和1.0mg給予組)。將懸浮于溶劑(丙二醇)的AD-3隔天腹腔內(nèi)給予AD-3給予組，自開始給予后至第16天使其安樂死。
(3)移植組織的獲取和測量深度麻醉后開胸，從左心室回流PBS。之后將移植的腫瘤組織摘出，測量長徑、短徑和厚度以及重量。將腫瘤組織分成表層腫瘤細胞密集的區(qū)域(實質(zhì))和深部充滿血液的海綿組織。測定重量后去除海綿組織，測定表層的實質(zhì)的重量。
(4)厭氧性糖酵解系統(tǒng)的酶活性對去除了海綿組織的實質(zhì)(腫瘤組織)和肺組織中的己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)進行測定。
(5)肺部轉(zhuǎn)移集落的觀察摘出兩肺后，將存在于各肺葉表面的轉(zhuǎn)移集落分類為特大、大、中和小4種，分別計數(shù)數(shù)量。
(5)組織學研究按照組織學方法固定腫瘤組織后，將其包埋于親水性甲基丙烯酸樹脂中，制備薄切片，H-E染色后進行觀察。
(B)結(jié)果及總結(jié)(1)腫瘤組織重量各組的腫瘤組織的重量如表1所示。每組的實質(zhì)和海綿組織的比例匯總于圖9。圖10表示以對照組的重量為100時，給予組的腫瘤重量、實質(zhì)重量和海綿組織重量。
表1腫瘤組織重量的比較

a)平均數(shù)±SDb)p＜0.05c)p＜0.01結(jié)果顯示隨著劑量的增加，腫瘤組織總重量和實質(zhì)重量減少，并顯示實質(zhì)占腫瘤全體的比例減少的傾向。另外AD-3給予組中海綿組織的重量與對照組相比都為200％左右，明顯增加。
(2)厭氧性糖酵解系統(tǒng)的酶活性對各組的腫瘤組織中的厭氧性糖酵解系統(tǒng)的酶活性進行測定，結(jié)果顯示0.1mg、0.25mg和0.5mg給予組中酶活性顯著降低(表2)。但是對肺組織的HK、PFK、PK和LDH活性進行測定，則與對照組相比任何給予組都未見顯著差異。
表2腫瘤組織的酶活性比較

a)平均數(shù)±SDb)p＜0.05c)p＜0.01d)p＜0.01
(3)腫瘤組織的組織學觀察對組織切片進行鏡檢的結(jié)果顯示在實質(zhì)中發(fā)現(xiàn)含有細胞分裂的腫瘤細胞聚集。還顯示海綿組織被壞死細胞占據(jù)、嗜中性白細胞等浸潤。觀察到兩者的交界區(qū)有含較多膨化液泡的細胞。
(4)總結(jié)對AD-3的抗腫瘤作用進行研究的結(jié)果表明了AD-3對移植腫瘤組織的縮小、壞死癌細胞所占比例的增加以及對厭氧性糖酵解系統(tǒng)的抑制的效果。
用傳統(tǒng)的含有CPL的物質(zhì)進行的研究表明發(fā)癌或移植癌組織的增殖受到抑制，且這種現(xiàn)象與癌細胞的厭氧性糖酵解系統(tǒng)的抑制有密切關(guān)系。本次實驗表明通過給予比傳統(tǒng)報告的劑量更低的劑量即可得到抗腫瘤效果。另外還觀察到腫瘤組織內(nèi)細胞壞死區(qū)(海綿組織)的增加，顯示細胞壞死加速。這種現(xiàn)象在腫瘤大小和重量沒有顯著差異的0.25mg和0.5mg給予組中也得到證實?？烧J為這些組中厭氧性糖酵解系統(tǒng)得到抑制，腫瘤組織的活性降低，這種腫瘤內(nèi)海綿組織的增加可成為CPL抗腫瘤作用的重要指標。
產(chǎn)業(yè)可利用性本發(fā)明可提供新型抗腫瘤劑、以及利用該抗腫瘤劑的飲料食品。本發(fā)明的抗腫瘤劑即使低劑量也可以發(fā)揮充分的抗腫瘤效果。本發(fā)明中作為有效成分使用的聚乳酸混合物是來自生物體成分的乳酸低縮合物，因此生物適合性高，副作用小。
權(quán)利要求
1.抗腫瘤劑，該抗腫瘤劑含有聚乳酸混合物，所述聚乳酸混合物含有縮合度3-20的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分。
2.權(quán)利要求1的抗腫瘤劑，其特征在于所述聚乳酸混合物中實質(zhì)上不含有鏈狀聚乳酸。
3.權(quán)利要求1或2的抗腫瘤劑，其中所述含有縮合度3-20的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分的聚乳酸混合物是通過包括下述步驟的制備方法制得的聚乳酸混合物(i)通過加熱使乳酸脫水縮合的第1加熱步驟，所述脫水縮合是在避免餾出丙交酯的同時餾去副產(chǎn)物水的壓力和溫度條件下進行的；和(ii)第2加熱步驟，在比第1加熱步驟高的溫度下，在避免餾出丙交酯的同時餾去副產(chǎn)物水的壓力和溫度條件下將壓力降至100mmHg以下，在該下降了的壓力以及加熱下，使該第1加熱步驟的反應(yīng)產(chǎn)物繼續(xù)反應(yīng)，生成乳酸的脫水縮合物。
4.飲料食品，該飲料食品含有權(quán)利要求1-3的任一項中記載的抗腫瘤劑。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于通過對含有環(huán)狀聚乳酸作為主要成分的聚乳酸混合物所顯示的抗腫瘤作用進行評價，提供新型的抗腫瘤劑。本發(fā)明可提供含有聚乳酸混合物的抗腫瘤劑，其中所述聚乳酸混合物含有縮合度3－20的環(huán)狀聚乳酸作為主要成分。
文檔編號A61K31/765GK1652765SQ0281802
公開日2005年8月10日 申請日期2002年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月18日
發(fā)明者渡邊干夫, 長戶康和, 村山千惠子, 村上正裕, 高田繁生 申請人:天藤制藥株式會社