專利名稱：生物活性成分和細(xì)胞靶向成分為預(yù)定比例的、基本為均質(zhì)的生物活性材料以及該材料的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明概括地涉及生物活性材料領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及基本為均質(zhì)的蛋白-藥物綴合物及其制備和使用方法。
背景技術(shù)：
在癌癥治療中最致命的兩個(gè)問(wèn)題是藥物毒性問(wèn)題和抗藥性問(wèn)題。藥物毒性使患者身體虛弱，而抗藥性問(wèn)題甚至在更高劑量水平下也常常會(huì)遇到，從而放大了藥物的毒副作用，由此經(jīng)常導(dǎo)致患者死亡。解決藥物毒性問(wèn)題的一個(gè)方法是僅針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向給藥。許多研究者正在致力于開發(fā)用于轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的抗體并取得了可喜的進(jìn)展。但抗體也并非是不存在問(wèn)題的，例如，抗體常常與正常組織結(jié)合，而且它們也會(huì)損傷血管(如血液滲漏綜合癥)或造成嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)(如過(guò)敏)。
如美國(guó)專利5,108,987、5,000,935、4,895714和4,886,780中所述，有關(guān)運(yùn)鐵蛋白和抗癌藥物綴合物之應(yīng)用方面的研究也取得了進(jìn)展。這些專利中描述的發(fā)明沒有采用抗體，而是利用了一種在正常人體血液中存在的蛋白，這種蛋白就是轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的運(yùn)鐵蛋白。正常細(xì)胞很少需要鐵，但腫瘤細(xì)胞需要大量的鐵，以滿足其病態(tài)增加的新陳代謝需要。由于腫瘤細(xì)胞需要更多的鐵，其表面存在著差不多為永久性的運(yùn)鐵蛋白受體，而正常細(xì)胞表面則不存在這種受體。上述發(fā)明利用了這些受體，通過(guò)給藥鍵合在運(yùn)鐵蛋白上的抗癌藥物，將藥物基本上都轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞表面的運(yùn)鐵蛋白受體之上。
靶向給藥繞開了正常細(xì)胞，允許使用更小劑量的藥物，從而明顯緩解了藥物毒性的問(wèn)題。反之，當(dāng)抗癌藥物以非靶向給藥的方式給藥時(shí)，它們同時(shí)殺滅正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。這些藥物對(duì)于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和負(fù)責(zé)血液凝固的系統(tǒng)的毒性特別強(qiáng)，所以癌癥患者在化療期間的主要并發(fā)癥是感染和出血。治療這些并發(fā)癥需要昂貴的設(shè)施、住院、重癥看護(hù)和生命支持系統(tǒng)，對(duì)于患者而言不僅身體不適并且昂貴，而采用靶向給藥系統(tǒng)則可以在很大程度上避免這些問(wèn)題的出現(xiàn)。
藥物毒性問(wèn)題消耗了醫(yī)護(hù)人員大量的時(shí)間，這是癌癥治療的花費(fèi)中的主要組成部分。例如，一般認(rèn)為腫瘤科醫(yī)生中約70％的求救電話與藥物毒性有關(guān)。目前，除了降低藥物用量以外，對(duì)于藥物毒性問(wèn)題尚無(wú)令人滿意的解決辦法。靶向給藥允許使用更小劑量的藥物，因?yàn)榇蟛糠炙幬锟梢员惶禺愋缘剞D(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而不是非特異性地分布于全身。從這一角度看，靶向給藥就象是用來(lái)復(fù)槍射擊，而常規(guī)給藥方法則象是用機(jī)槍進(jìn)行掃射。藥物毒性問(wèn)題的解決將使癌癥患者的化療發(fā)生重大的變革。本發(fā)明的目標(biāo)之一就是降低化療中的毒副作用。
與藥物毒性相比，抗藥性也是同樣嚴(yán)重的問(wèn)題。典型的情況是這樣的，確診患有癌癥的患者接受治療并在數(shù)月的時(shí)間內(nèi)病情好轉(zhuǎn)，無(wú)癥狀出現(xiàn)，但隨后腫瘤重新出現(xiàn)，而且任何已知藥物均不再有效。諸如此類的抗藥性問(wèn)題非常普遍，至今尚無(wú)令人滿意的解決方案。只有采用更大劑量和藥力更強(qiáng)的藥物進(jìn)行治療，但反過(guò)來(lái)這又會(huì)造成更為嚴(yán)重的藥物毒性問(wèn)題，常常會(huì)導(dǎo)致患者死亡?？顾幮詥?wèn)題的解決將大大緩解藥物毒性問(wèn)題。運(yùn)鐵蛋白靶向給藥可以克服抗藥性的問(wèn)題。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是解決痛苦的且經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)沉重的由抗藥性癌癥造成死亡的問(wèn)題。
與生物活性分子綴合的蛋白的療效已經(jīng)得到了證明，并且在上述美國(guó)專利中已經(jīng)作了描述。但是，現(xiàn)已證明在應(yīng)激細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞的治療中，當(dāng)出現(xiàn)綴合物聚集以及生物活性分子與蛋白片斷或者與二至三個(gè)蛋白構(gòu)成綴合物的情況時(shí)，這種綴合物的藥效會(huì)被消弱。而蛋白和生物活性分子的比例接近1∶1時(shí)，綴合物的藥效會(huì)大幅提高。以前為獲得藥效較高的綴合物，需要采用費(fèi)時(shí)、費(fèi)工和昂貴的處理工序，從包含有生物活性分子和蛋白片斷構(gòu)成的綴合物、生物活性分子和多個(gè)蛋白構(gòu)成的綴合物以及多個(gè)生物活性分子和蛋白構(gòu)成的綴合物的樣品中分離得到生物活性分子/蛋白比例理想的綴合物。采用均質(zhì)的蛋白-藥物綴合物可以更為有效地殺滅抗藥性腫瘤細(xì)胞和藥物敏感的腫瘤細(xì)胞，在這種均質(zhì)的蛋白-藥物綴合物中蛋白成分負(fù)載有預(yù)定數(shù)量的生物活性分子。此前，規(guī)?；a(chǎn)有明顯療效的綴合物的方法存在成本高、效率低的問(wèn)題，造成這種綴合物難以商品化和廣泛使用。對(duì)于基本為均質(zhì)的藥物-蛋白綴合物，以及高效、精確和價(jià)廉地制備這種綴合物的方法存在現(xiàn)實(shí)的需要。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是通過(guò)有效的方法提供這種均質(zhì)的綴合物。
1980年，F(xiàn)aulk和他的同事首次報(bào)道了人類腫瘤細(xì)胞中存在運(yùn)鐵蛋白受體(1)。參見下表，以下為運(yùn)鐵蛋白受體存在于不同類型人類腫瘤中的報(bào)道。

存在于正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的運(yùn)鐵蛋白受體現(xiàn)尚無(wú)一項(xiàng)研究去探究是否所有的人類腫瘤均上調(diào)了運(yùn)鐵蛋白受體的數(shù)量，而所有正常細(xì)胞均下調(diào)了運(yùn)鐵蛋白受體的數(shù)量，但分析各方面的數(shù)據(jù)后，對(duì)于這兩個(gè)問(wèn)題的回答是肯定的。例如，未成熟的紅細(xì)胞(即正母紅細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞)在其表面上存在運(yùn)鐵蛋白受體，但成熟紅細(xì)胞中沒有(17)。循環(huán)系統(tǒng)中的單核細(xì)胞也沒有上調(diào)運(yùn)鐵蛋白受體的數(shù)量(18)，而巨噬細(xì)胞(包括肝巨噬細(xì)胞)通過(guò)噬紅細(xì)胞作用以運(yùn)鐵蛋白依賴性的方式獲得所需的大部分鐵(19)。事實(shí)上，體內(nèi)研究表明網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)幾乎不從血漿運(yùn)鐵蛋白中得到鐵(有關(guān)綜述參見文獻(xiàn)20)。細(xì)胞因子(如γ干擾素)下調(diào)了巨噬細(xì)胞運(yùn)鐵蛋白受體的數(shù)量(21)，推測(cè)這種限制鐵吸收的機(jī)制可以作為殺滅細(xì)胞內(nèi)寄生物的一種解釋(22)。
在休眠的淋巴細(xì)胞中，不僅運(yùn)鐵蛋白受體數(shù)量被下調(diào)，而且也檢測(cè)不到運(yùn)鐵蛋白受體的基因(23)。與之相反，受激淋巴細(xì)胞在G1后期上調(diào)了運(yùn)鐵蛋白受體的數(shù)量(24)。隨c-myc原致腫瘤基因的表達(dá)以及隨后的IL-2受體的上調(diào)，出現(xiàn)了運(yùn)鐵蛋白受體的表達(dá)(25)，同時(shí)伴隨鐵調(diào)控蛋白結(jié)合能力的明顯增加(26)，這種增加穩(wěn)定了運(yùn)鐵蛋白受體的mRNA(27)。對(duì)于T型和B型淋巴細(xì)胞這種現(xiàn)象均存在(28)，并且是一種IL-2依賴的響應(yīng)(29)。
眾所周知，造成運(yùn)鐵蛋白受體上調(diào)的細(xì)胞刺激源自所遭受到的刺激，如細(xì)胞受病毒或腫瘤細(xì)胞的入侵。
通過(guò)抗原或凝集素刺激的研究(即受體上調(diào))以及采用視黃酸進(jìn)行的分化模式的研究(即、受體下調(diào))(30-33)，已經(jīng)證明了正常和腫瘤細(xì)胞中運(yùn)鐵蛋白受體數(shù)量的上調(diào)和下調(diào)。這些試驗(yàn)?zāi)Ｐ退玫降幕€數(shù)據(jù)表明大多數(shù)正常、成熟和休眠的人類細(xì)胞的質(zhì)膜上的受體數(shù)量被下調(diào)(34)。例外的是循環(huán)系統(tǒng)中的屏障系統(tǒng)，包括母嬰屏障，其中含有富含運(yùn)鐵蛋白受體的合胞滋養(yǎng)層(35)；血腦屏障，其中含有富含運(yùn)鐵蛋白受體的毛細(xì)內(nèi)皮細(xì)胞(36)；以及血液睪丸屏障，其中含有富含運(yùn)鐵蛋白受體的支持細(xì)胞(37)。
運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物殺滅細(xì)胞的機(jī)制通過(guò)連續(xù)的兩個(gè)反應(yīng)，運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物與質(zhì)膜結(jié)合首先，運(yùn)鐵蛋白成分與運(yùn)鐵蛋白受體結(jié)合，然后主要利用心磷脂和帶電磷酸酯間的相互作用，多柔比星與脂質(zhì)雙分子層結(jié)合(58)。因此，通過(guò)蛋白和磷脂受體的結(jié)合，經(jīng)過(guò)受體二聚、側(cè)面遷移以及胞漿鈣遷移，綴合物被置于激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道上(61)。
運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物殺滅腫瘤細(xì)胞的一種機(jī)制是抑制了質(zhì)膜氧化還原酶的活性，特別是NADH氧化酶的活性(62)。NADH氧化酶的抑制導(dǎo)致了細(xì)胞死亡(63)，多柔比星是這種酶的高效抑制劑(64，65)。運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物抑制NADH氧化酶的活性(66)，以及由NADH氧化所引發(fā)的下游反應(yīng)，如通過(guò)鈉-氫對(duì)向運(yùn)輸?shù)碾娮訂适Ш唾|(zhì)子交換(67)。
運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物殺滅腫瘤細(xì)胞的第二種機(jī)制是運(yùn)鐵蛋白受體的分子控制。例如，微環(huán)境鐵的螯合引發(fā)了腫瘤細(xì)胞凋亡，但是正常休眠細(xì)胞則不存在這種作用(68)，而且這種螯合作用明顯促進(jìn)了胞核嘧啶阿拉伯糖苷的細(xì)胞毒性作用(69)?？顾幮约?xì)胞對(duì)于鐵吸收受限更為敏感，因?yàn)樗鼈儾荒芊€(wěn)定運(yùn)鐵蛋白受體的mRNA，而且與藥物敏感性細(xì)胞相比，過(guò)量的鐵可以更為有效地使運(yùn)鐵蛋白受體的mRNA去穩(wěn)定。
第三種機(jī)制涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)中的氧化還原活性產(chǎn)物(71)。例如，一氧化氮使鐵-硫聚簇解體，允許鐵調(diào)控蛋白結(jié)合和保護(hù)鐵響應(yīng)的元素(72)。過(guò)氧化氫可造成同樣的效果(即上調(diào)運(yùn)鐵蛋白受體的數(shù)量)，但是亞硝根離子可以下調(diào)運(yùn)鐵蛋白受體的數(shù)量，造成鐵-硫聚簇中的巰基亞硝酰化(73)。總之，運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物殺滅腫瘤細(xì)胞的機(jī)制至少有三種。
到目前為止，由于從大部分為非所需成分的反應(yīng)產(chǎn)物中純化出蛋白/藥物比例一定，并且基本上不含蛋白二聚體、多聚體或蛋白片斷的蛋白-藥物綴合物成本高并且費(fèi)時(shí)，所以利用應(yīng)激細(xì)胞的這些機(jī)制以及運(yùn)鐵蛋白受體上調(diào)機(jī)制的治療方案難以推廣。(如其他場(chǎng)合中所提及的那樣，蛋白如運(yùn)鐵蛋白的凝集、分解等將導(dǎo)致不能與運(yùn)鐵蛋白受體正確結(jié)合)。此前的制備方法效能低下，使得利用這些機(jī)制治療腫瘤細(xì)胞以及受病毒感染的細(xì)胞不具有經(jīng)濟(jì)性。
運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的作用運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物的療效在幾種動(dòng)物模型中已經(jīng)被研究。例如，第14天，運(yùn)鐵蛋白-白喉毒素綴合物將小鼠體內(nèi)的異種移植的神經(jīng)膠質(zhì)瘤減少了95％，第30天神經(jīng)膠質(zhì)瘤不復(fù)發(fā)(74)。與僅采用多柔比星治療的動(dòng)物相比，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由戊二醛制備的運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物可以避免接種人類間皮瘤細(xì)胞的小鼠死亡，并顯著延長(zhǎng)了小鼠的存活期(75)。此外，采用生物素-鏈霉抗生物素技術(shù)將運(yùn)鐵蛋白和單純皰疹胸苷激酶偶聯(lián)，這種綴合物可顯著延長(zhǎng)接種有轉(zhuǎn)移K562腫瘤細(xì)胞的小鼠的存活期(76)。最后，小鼠對(duì)人類運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物的最大耐受劑量為20mg/k(iv)，而單體藥物的最大耐受劑量?jī)H為8mg/kg(iv)(41)。
運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物對(duì)于人體的作用有關(guān)運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物的臨床報(bào)道有兩個(gè)。第一個(gè)報(bào)道是一個(gè)初步實(shí)驗(yàn)，發(fā)表于1990年，對(duì)于7例急性白血病患者靜脈給藥由戊二醛制得的運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物5天(1mg/天)。在這種低劑量條件下未出現(xiàn)毒副作用，治療后10天內(nèi)7名患者外周血中白血球數(shù)量下降了86％(77)。此外，通過(guò)治療前后的骨髓切片檢查證明病癥沒有進(jìn)一步發(fā)展。
第二個(gè)報(bào)道來(lái)自NIH，發(fā)表于1997年，對(duì)于15名患有復(fù)發(fā)腦癌的患者采用硫醚鍵合的運(yùn)鐵蛋白綴合物進(jìn)行治療，其中綴合物中鍵合有白喉毒素的基因突變體。通過(guò)高通量隙間微灌注給藥，經(jīng)證實(shí)這種方法可有效地將放射標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白灌注進(jìn)大腦，同時(shí)使炎癥反應(yīng)降至最低(78)。核磁共振成像證明15名患者中有9人腫瘤體積縮小至少50％，其中2人腫瘤完全消失(44)。
在一個(gè)未發(fā)表的臨床研究中，23名患有晚期卵巢癌的患者被隨機(jī)分至試驗(yàn)組(12人)和對(duì)照組(11人)中。在每月的治療周期中的第15至19天，試驗(yàn)組接受運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物治療，劑量相當(dāng)于每天1mg多柔比星。當(dāng)診斷和隨機(jī)分組之間的時(shí)間為18個(gè)月時(shí)，對(duì)于接受運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物治療的患者存活率進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果證明存在顯著性差異。
另外一個(gè)未發(fā)表的臨床研究對(duì)象是一名男性，22歲，其右心房肉瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，采用常規(guī)治療方案無(wú)效。他的肺部充滿了轉(zhuǎn)移性病灶，當(dāng)其主治醫(yī)生得到FDA同意使用運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物進(jìn)行治療的批復(fù)后，于2000年8月開始進(jìn)行治療。到了10月，患者肺部的轉(zhuǎn)移性病灶已基本消除，次年1月采用放射學(xué)方法已檢測(cè)不到腫瘤。到目前(2001年8月)為止該患者仍存活，并且僅采用運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物進(jìn)行治療。
靶向給藥的優(yōu)點(diǎn)在于提高了藥效，同時(shí)降低了用藥量，從而降低了藥物的毒副作用并且減輕了正常細(xì)胞受損的程度，所有這些作用特點(diǎn)均有效地降低了治療費(fèi)用，同時(shí)提高了患者看護(hù)的質(zhì)量。靶向給藥也避免了抗藥性的出現(xiàn)，這是因?yàn)榭顾幮允怯捎谒幬锓翘禺愋赃M(jìn)入細(xì)胞所引發(fā)的(79)。由于運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物通過(guò)受體特異性的途徑特異性地進(jìn)入細(xì)胞(80，81)，它們可繞過(guò)抗藥性機(jī)制，如抗藥性細(xì)胞中的外流泵進(jìn)行傳輸。
1992年就有關(guān)于運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物可有效殺滅多種抗藥性細(xì)胞的報(bào)道(82)。這一發(fā)現(xiàn)在1993年得到了證實(shí)(83)，并在1994年(84)、1996年(85)和2000年(86)被擴(kuò)展到幾種類型的抗藥性細(xì)胞中。
運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物的制備運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物的制備方法的首次報(bào)道發(fā)表于1984年(38)，此后有關(guān)運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物的制備方法有多篇報(bào)道，下表中列舉出其中的部分報(bào)道。

可以利用戊二醛形成Schiff堿制備運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物(56，57)，運(yùn)鐵蛋白中賴氨酸的ω-氨基和多柔比星3’-氨基間形成耐酸的鍵。這種多柔比星綴合物通過(guò)質(zhì)膜介導(dǎo)的機(jī)制殺滅癌細(xì)胞(綜述參見文獻(xiàn)58)。雖然已經(jīng)明確DNA插入是多柔比星殺滅細(xì)胞的機(jī)制，但是固定于載體如葡聚糖上的多柔比星引發(fā)了質(zhì)膜介導(dǎo)的機(jī)制來(lái)殺滅細(xì)胞(59，60)。因此，推測(cè)多柔比星綴合物引發(fā)了包括多柔比星和運(yùn)鐵蛋白受體在內(nèi)的質(zhì)膜介導(dǎo)的機(jī)制來(lái)殺滅細(xì)胞。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)復(fù)合有抗癌藥物的非抗體蛋白如運(yùn)鐵蛋白對(duì)于癌細(xì)胞的靶向能力和殺滅抗藥性細(xì)胞的效能依賴于藥物和運(yùn)鐵蛋白的比例。一般認(rèn)為蛋白如運(yùn)鐵蛋白負(fù)載過(guò)量的生物活性分子會(huì)影響蛋白和受體的對(duì)接能力。負(fù)載量不足又會(huì)造成受體與未負(fù)載藥物的蛋白結(jié)合，即出現(xiàn)屏蔽現(xiàn)象。當(dāng)前制備運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物的技術(shù)不能得到預(yù)定比例的綴合物?，F(xiàn)在所采用的方法得到的是非均質(zhì)的綴合物，其中包含有很大比例的負(fù)載量過(guò)大或負(fù)載量不足的綴合物。從現(xiàn)行工藝所得產(chǎn)品中純化出相對(duì)少量的有效成分，得到適用于臨床的分子的產(chǎn)率低并且成本非常高。如此高的生產(chǎn)成本使得采用這種有效治療癌癥或其他因細(xì)胞受刺激所導(dǎo)致疾病的方法不具有經(jīng)濟(jì)性，從而限制了大多數(shù)患者從該材料中受益。對(duì)于可以大量且廉價(jià)制備這種綴合物的方法存在現(xiàn)實(shí)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
顯而易見，藥物與靶向劑連接后其轉(zhuǎn)運(yùn)特性會(huì)發(fā)生改變，同時(shí)藥物在癌癥患者體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性也會(huì)發(fā)生改變。但是問(wèn)題在于至今尚沒有大量合成均質(zhì)綴合物的方法，其中以每分子蛋白計(jì)，這種均質(zhì)綴合物中含有預(yù)定和恒定數(shù)量的藥物分子。本發(fā)明解決了在現(xiàn)有制備和使用綴合物方法中存在的這一難題，其中，綴合物為蛋白與抗癌藥物(如細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或細(xì)胞毒性劑、光敏劑、熱敏劑、以及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑)所構(gòu)成的綴合物，所述蛋白例如是運(yùn)鐵蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、維生素、維生素結(jié)合蛋白、激素、細(xì)胞因子、低密度脂蛋白和生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明的一個(gè)方面包含一種治療患病細(xì)胞的材料，其中該材料包含基本為均質(zhì)的、預(yù)定比例的與生物活性分子綴合的蛋白，該蛋白能夠和細(xì)胞中的受體結(jié)合，而且所述疾病的發(fā)生能夠?qū)е略撌荏w數(shù)量上調(diào)。
在另一方面中，本發(fā)明包括生物活性分子連接子的形成，其中連接子可以和蛋白進(jìn)一步反應(yīng)，將連接子連接至蛋白分子之上，其中蛋白可以和受病癥刺激的細(xì)胞結(jié)合，而生物活性分子可治療細(xì)胞或使細(xì)胞在造影條件下顯影。在另一方面中，本發(fā)明包括一種治療對(duì)蛋白具有相對(duì)較高親和力的細(xì)胞的方法，其中包括將所述細(xì)胞和該材料接觸。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明優(yōu)選的方法包括將生物活性材料如抗癌藥物連接到連接子之上，使得生物活性材料和每個(gè)連接子分子的連接具有可控的比例。將藥物-連接子以達(dá)到所希望的摩爾比的量添加到蛋白中，如運(yùn)鐵蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、維生素、維生素結(jié)合蛋白、激素、細(xì)胞因子、低密度脂蛋白和生長(zhǎng)因子。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，連接子為戊二醛。將戊二醛選作連接子是因?yàn)槲於┲挥袃蓚€(gè)反應(yīng)位點(diǎn)，并且其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有利于在每個(gè)連接子上僅連接一個(gè)生物活性分子。綴合物形成后，可采用如乙醇胺來(lái)清除過(guò)量的戊二醛。
本發(fā)明涉及均質(zhì)的綴合物，以每分子靶向蛋白計(jì)，綴合物中含有預(yù)定且恒定數(shù)目的抗癌藥物或其他生物活性分子。本發(fā)明的靶向劑包括但不限于運(yùn)鐵蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、維生素、維生素結(jié)合蛋白、激素、細(xì)胞因子、低密度脂蛋白和生長(zhǎng)因子?？拱┧幬锘蚱渌锘钚苑肿影ǖ幌抻诩?xì)胞毒性藥物如多柔比星、甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、6-巰基嘌呤、胞核嘧啶阿拉伯糖苷、以及環(huán)磷酰胺，熱敏劑如血卟啉和低劑量的戊脈安，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑如去鐵胺，光敏劑如porfimer sodium，metatetrahydroxy-phenylchlorin、和血卟啉衍生物，造影成像材料如同位素、熒光分子和射線遮蓋劑。優(yōu)選的靶向劑為運(yùn)鐵蛋白，而抗癌藥物為多柔比星。
在1990年2月23日公開的美國(guó)專利4,895,714和在2001年3月19日公開的美國(guó)專利5,000,935描述了包含造影成像材料的綴合物，此處引用作為參考。適用的同位素包括但不限于碘、鎵、銦和釔，優(yōu)選為125I、131I、111In、90Y和67Ga。
本發(fā)明還涉及基本為均質(zhì)的綴合物的高效和經(jīng)濟(jì)的制備方法，其中以每分子靶向蛋白計(jì)，綴合物中含有預(yù)定且恒定數(shù)目的抗癌藥物或其他生物活性分子。這種方法明顯地減少運(yùn)鐵蛋白多聚體或二聚體的產(chǎn)生，以及運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物的聚集，并且在多數(shù)情況下基本上消除了上述問(wèn)題，因此藥物/蛋白的比例范圍窄。本發(fā)明顯著降低了生產(chǎn)成本并提高了生產(chǎn)效率，從而增加了綴合物在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的效能。本發(fā)明基本為均質(zhì)的綴合物通過(guò)這樣一種方法制備，其中首先形成反應(yīng)性的藥物-連接子復(fù)合體。在方法描述中，生物活性材料為多柔比星，而連接子為戊二醛。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到也可以采用其他的生物活性材料和連接子。
按照化學(xué)計(jì)量量，利用多柔比星(DOX)僅有的一個(gè)氨基，即3＇-氨基和戊二醛(GLU)兩個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)中的一個(gè)反應(yīng)，進(jìn)行具有預(yù)定分子比例的、基本為均質(zhì)的運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物的大量合成。因此，第一步是將DOX的鹽水溶液滴加到GLU的鹽水溶液中，其中GLU的鹽水溶液含有溶劑如DMSO或其他適用的冷凍保護(hù)劑，使得DOX和GLU的最終摩爾比為1∶1。所得DOX-GLU溶液于室溫下避光攪拌3hr。
在上述反應(yīng)中DOX和GLU的摩爾數(shù)相等，使得最終所得的DOX-GLU溶液中既沒有游離的DOX也沒有游離的GLU。但是，如果一分子GLU和兩分子DOX反應(yīng)生成DOX-GLU-DOX，則溶液中可能存在游離的GLU，但通過(guò)向二價(jià)GLU溶液中滴加一價(jià)DOX，利用質(zhì)量作用動(dòng)力學(xué)可以將這種可能性降至最低。對(duì)于反應(yīng)物的體積沒有限制，所以可以制備大量的均質(zhì)的DOX-GLU。
綴合反應(yīng)的第二步是將DOX-GLU滴加至運(yùn)鐵蛋白(TRF)的鹽水溶液中。TRF可以是不含鐵的(脫鐵運(yùn)鐵蛋白)和被鐵飽和的(全鐵運(yùn)鐵蛋白)。通過(guò)適當(dāng)調(diào)整TRF的體積可以得到理想的DOX-TRF摩爾比。所得TRF-GLU-DOX溶液于室溫下避光攪拌20小時(shí)。與DOX和GLU的反應(yīng)不同，DOX-GLU和TRF的反應(yīng)并不僅局限于一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)镈OX-GLU中的GLU成份可以和TRF分子中任何一個(gè)賴氨酸上的ε-氨基反應(yīng)。
結(jié)合至TRF上的DOX分子的數(shù)目由第二步反應(yīng)決定。例如，如果DOX-GLU和TRF的起始比例為7.2∶1.0，最終所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有2.5分子DOX。但是，如果DOX-GLU和TRF的起始比例為4.0∶1.0，最終所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有1.4分子DOX。類似地，如果DOX-GLU和TRF的起始比例為2.5∶1.0，最終所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有0.9分子DOX。以此可根據(jù)需要大量制備DOX/TRF為預(yù)定比例的TRF-GLU-DOX。
綴合反應(yīng)的下一步是添加乙醇胺或其他適用于清除過(guò)量連接子的物質(zhì)，然后離心并進(jìn)行滲析。雖然從理論上講DOX和TRF消耗了所有的GLU，還需向最終的反應(yīng)混合物中加入乙醇胺以結(jié)合所有未反應(yīng)的GLU。避光反應(yīng)30分鐘。最終溶液在2000rpm下離心10分鐘，用100倍過(guò)量的鹽水滲析6小時(shí)，共二次，然后用Hepes緩沖鹽水按同樣配比滲析三次，所得TRF-GLU-DOX備用。
綴合物的生物化學(xué)表征如文獻(xiàn)(39)所述，利用HPLC和聚丙烯酰胺凝膠電泳可以確定TRF-GLU-DOX綴合物的均勻性。同樣，利用文獻(xiàn)(89)所述分光光度法可以確定DOX和TRF的分子比。反復(fù)測(cè)定的結(jié)果表明TRF-GLU-DOX綴合物具有一致的均勻性。此外，在這些綴合物的制備中不必采用色譜法，因?yàn)闆]有出現(xiàn)聚集和分解現(xiàn)象。這樣就允許大量制備均質(zhì)的運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物，從而增加了產(chǎn)量并降低了成本。
在其他類型的運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物中，TRF和DOX損耗所產(chǎn)生的花費(fèi)已經(jīng)成為阻礙其應(yīng)用的一個(gè)因素。例如，采用改變藥物和/或蛋白的方法(如巰基化法)(44)，使得DOX和TRF的產(chǎn)率下降。采用溶劑系統(tǒng)(86)和利用色譜法建立酸穩(wěn)定的和酸敏感的連接(89)，也使得產(chǎn)率下降。DOX和TRF之間的GLU鍵是酸穩(wěn)定的(89)，依據(jù)本發(fā)明所制備的TRF-DOX綴合物中DOX和TRF的產(chǎn)率高。事實(shí)上，與其他方法相比(38，39，40)，TRF的產(chǎn)率幾乎翻了一倍(90％對(duì)50％)，DOX的產(chǎn)率增加了近5倍。
此前已知用于制備運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物的方法都不能大量地制備均質(zhì)且具有預(yù)定藥物分子/運(yùn)鐵蛋白分子比例的綴合物。此外，其他的方法利用色譜來(lái)消除聚集和獲得富含均質(zhì)綴合物的組分。這些方法降低了產(chǎn)率，增加了成本，并且缺乏預(yù)設(shè)分子比例的能力。
另外一種方法是將1ml運(yùn)鐵蛋白(0.5mM)和1ml去鐵胺的鹽水溶液(其中去鐵胺濃度為8.5mM，氯化鈉濃度為150mM)混合4分鐘，然后加入1ml戊二醛的鹽水溶液(其中戊二醛濃度為21.5mM，氯化鈉濃度為150mM)并混合4分鐘。后一反應(yīng)為偶聯(lián)反應(yīng)，加入0.8ml乙醇胺鹽水溶液(其中乙醇胺濃度為37.2mM，氯化鈉濃度為150mM，Hepes緩沖鹽濃度為10mM)(pH8)并渦旋振蕩4分鐘終止反應(yīng)。然后將反應(yīng)混合物(3.8ml)轉(zhuǎn)移至滲析管(截止分子量為12,000-14,000)中，采用0.5L Hepes緩沖鹽水，于5℃下避光滲析3小時(shí)。更換Hepes緩沖鹽水后，至少再滲析一次。此后混合物于4℃下離心(1600g)10分鐘，采用2.6×34cm SepharoseCL-4B柱對(duì)上清液進(jìn)行色譜分離，流速為22ml/小時(shí)，色譜柱用Hepes緩沖鹽水預(yù)平衡，于5℃下用blue dextran、運(yùn)鐵蛋白和細(xì)胞色素C標(biāo)定。洗脫液檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，每3.8ml收集一次。通過(guò)運(yùn)鐵蛋白和去鐵胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每份中運(yùn)鐵蛋白和去鐵胺的濃度，運(yùn)鐵蛋白的檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，而去鐵胺的檢測(cè)波長(zhǎng)為356nm。稍作改動(dòng)后，這種偶聯(lián)方法可用于制備其他鐵螯合藥物的靶向蛋白綴合物，如疏水性逆轉(zhuǎn)的鐵載體的靶向蛋白綴合物。
綴合物的表征純化得到純的藥物-蛋白綴合物之后，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)以確定其分子量，然后測(cè)定每蛋白分子中的藥物分子數(shù)量。利用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，包括但不限于分光光度法，確定一分子運(yùn)鐵蛋白所攜帶藥物分子的準(zhǔn)確數(shù)量。功能藥物/蛋白的比例在約0.1∶1.0至3.0∶1.0之間(Bercil等人，Arch Biochem Biophs 1993；300356)。對(duì)綴合物進(jìn)行檢查以確定其是否與腫瘤細(xì)胞表面上的受體結(jié)合，綴合物是否能殺滅癌細(xì)胞同時(shí)正常細(xì)胞不受損害。選取僅與腫瘤細(xì)胞結(jié)合但與正常細(xì)胞不結(jié)合的綴合物進(jìn)行毒性試驗(yàn)，毒性試驗(yàn)中采用藥物敏感的和抗藥性的細(xì)胞。可采用流式細(xì)胞計(jì)或其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)，并采用微培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行殺滅試驗(yàn)，以確定游離藥物以及藥物-蛋白綴合物半數(shù)殺滅培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的濃度。當(dāng)采用熱敏劑綴合物進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，采用MIT四唑鎓比色法進(jìn)行毒性試驗(yàn)(Vistica等人，CancerRes 1994；512515)。通過(guò)這些毒性試驗(yàn)確定了最有效的運(yùn)鐵蛋白/熱敏劑比例，以及使藥物敏感的和抗藥性的細(xì)胞出現(xiàn)最大熱敏化作用時(shí)綴合物的最佳濃度。與藥物-蛋白綴合物中的藥物相比，需要10倍量的游離藥物方能殺滅同樣數(shù)量的細(xì)胞。
雖然以上描述中以運(yùn)鐵蛋白作為載藥蛋白，眾所周知人體內(nèi)還存在其他可與細(xì)胞受體結(jié)合的蛋白。如果這種受體在腫瘤細(xì)胞中活化而在正常細(xì)胞中無(wú)活性，那么任何可與這種受體結(jié)合的蛋白或其他分子(即配體)均可被用于運(yùn)載本發(fā)明中所采用的藥物。這種蛋白的一個(gè)實(shí)例是運(yùn)鈷胺素蛋白，用于將維生素B12轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞)中的運(yùn)鈷胺素蛋白受體之上(Seetheram，Ann Rev Nutr 1999；19173)。低密度脂蛋白是另外一種配體，現(xiàn)已被用于結(jié)合光敏劑二氫卟酚，并被用于靶向成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤中的低密度脂蛋白受體(Schmidt-Erfurth等人，Brit J Surg 1997；7554)。
當(dāng)藥物-蛋白綴合物被制備、純化、表征并且確認(rèn)具有細(xì)胞結(jié)合和殺滅功能后，并且當(dāng)結(jié)合和殺滅試驗(yàn)表明綴合物僅結(jié)合和殺滅腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)害時(shí)，對(duì)綴合物進(jìn)行分裝和滅菌。此處不作界定，可采用任何適當(dāng)?shù)姆椒?，包括照射，如采用銫放射源，或采用微孔過(guò)濾技術(shù)進(jìn)行滅菌。
本發(fā)明的另一方面提供一種用于治療癌癥的試劑盒，其包含帶有鐵的運(yùn)鐵蛋白以及一種抗癌藥物/運(yùn)鐵蛋白比例為預(yù)定且恒定比例的均質(zhì)綴合物。在給藥該均質(zhì)綴合物前，利用帶有鐵的運(yùn)鐵蛋白飽和運(yùn)鐵蛋白受體，以保護(hù)患者體內(nèi)具有運(yùn)鐵蛋白受體的正常細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種確定腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗腫瘤藥物的敏感性的方法，其包括對(duì)于所述腫瘤細(xì)胞分別、逐份地給藥由多種不同的抗腫瘤藥物構(gòu)成的均質(zhì)運(yùn)鐵蛋白綴合物。為此目的，可以制備出含有多種所述綴合物的試劑盒。對(duì)于本發(fā)明的均質(zhì)綴合物腫瘤細(xì)胞吸收速度非?？?，可以采用由靶向蛋白和多種不同抗腫瘤藥物構(gòu)成的均質(zhì)綴合物進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。這種方法有助于提高隨后所進(jìn)行的化療的效能，在提取出腫瘤細(xì)胞后就可以快速地進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試。
如本發(fā)明所述，“基本為均質(zhì)的綴合物”指可直接使用的綴合物，而不必作進(jìn)一步純化以除去蛋白二聚體、多聚體或聚集體。換而言之，在這種綴合物中沒有蛋白二聚體、多聚體或聚集體或含量很少。
本發(fā)明的基本為均質(zhì)的綴合物按有效劑量對(duì)動(dòng)物進(jìn)行給藥。在癌癥治療中，有效劑量指可有效減小腫瘤尺寸；減慢腫瘤生長(zhǎng)速度；防止和抑制轉(zhuǎn)移；或延長(zhǎng)患病動(dòng)物存活期的劑量。本發(fā)明提供一種治療多種癌癥的方法，包括但不限于白血病、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、消化道癌、鼻咽癌、宮頸癌、骨髓瘤、淋巴瘤/黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星細(xì)胞瘤?？梢愿鶕?jù)患者的年齡、體重和癥狀以及抗腫瘤藥物的藥代動(dòng)力學(xué)確定均質(zhì)綴合物的用藥量。對(duì)于均質(zhì)綴合物而言，治療劑量將小于使用游離抗腫瘤藥物所需的劑量。例如，對(duì)于體重為150磅(68kg)的人來(lái)說(shuō)，運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物的劑量在0.5-50mg/28天之間。在28天期間，可以將這些藥物分為更小的份進(jìn)行給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)多種途徑給藥，包括但不限于口服、局部給藥、直腸給藥、經(jīng)眼給藥、陰道給藥、經(jīng)肺如利用氣溶膠給藥、或非腸道給藥，包括但不限于肌注、皮下給藥、腹膜內(nèi)給藥、動(dòng)脈給藥和靜脈給藥。組合物可單獨(dú)給藥，或與藥學(xué)中常規(guī)的載體或賦形劑復(fù)合。對(duì)于口服給藥而言，組合物可以采取片劑、膠囊、錠劑、藥片、粉劑、糖漿、酏劑、水溶液和混懸劑等制劑形式。對(duì)于非腸道給藥而言，一般要求制備滅菌的均質(zhì)綴合物的水溶液，溶液的pH需作調(diào)整和緩沖。對(duì)于靜脈給藥，應(yīng)控制溶質(zhì)的濃度以達(dá)到等滲的要求。對(duì)于經(jīng)眼給藥，可以采用已知的給藥工具，如涂藥器或滴管將膏劑或滴劑加入。對(duì)于經(jīng)肺給藥，應(yīng)選擇適于形成氣溶膠的稀釋劑和/或載體。優(yōu)選地，本發(fā)明的綴合物采用非腸道給藥，即通過(guò)灌注或注射靜脈給藥或腹膜內(nèi)給藥。
以下描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。顯然，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在閱讀了以下方面描述后可能會(huì)提出改進(jìn)或調(diào)整方案，所有這些改進(jìn)或調(diào)整方案均被認(rèn)為處于本發(fā)明權(quán)利要求所規(guī)定的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1均質(zhì)的運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物的制備按照化學(xué)計(jì)量量，利用多柔比星(DOX)僅有的一個(gè)氨基，即3＇-氨基和戊二醛(GLU)兩個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)中的一個(gè)反應(yīng)，進(jìn)行具有預(yù)定分子比例的、基本為均質(zhì)的運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物的大量合成。因此，第一步是將DOX的鹽水溶液滴加到GLU的鹽水溶液中，其中GLU的鹽水溶液含有溶劑如DMSO，使得DOX和GLU的最終摩爾比為1∶1。所得DOX-GLU溶液于室溫下避光攪拌3小時(shí)。
在上述反應(yīng)中DOX和GLU的摩爾數(shù)相等，使得最終所得的DOX-GLU溶液中既沒有游離的DOX也沒有游離的GLU。但是，如果一分子GLU和兩分子DOX反應(yīng)生成DOX-GLU-DOX，則溶液中可能存在游離的GLU，但通過(guò)向二價(jià)GLU溶液中滴加一價(jià)DOX，利用質(zhì)量作用動(dòng)力學(xué)可以將這種可能性降至最低。對(duì)于反應(yīng)物的體積沒有限制，所以可以制備大量的均質(zhì)DOX-GLU。
綴合反應(yīng)的第二步是將DOX-GLU滴加至運(yùn)鐵蛋白(TRF)的鹽水溶液中。TRF可以是不含鐵的(apo-transferrin)和被鐵飽和的(holo-transferrin)。通過(guò)適當(dāng)調(diào)整TRF的體積可以得到理想的DOX-TRF摩爾比。所得TRF-GLU-DOX溶液于室溫下避光攪拌20小時(shí)。與DOX和GLU的反應(yīng)不同，DOX-GLU和TRF的反應(yīng)并不僅局限于一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)镈OX-GLU中的GLU成份可以和TRF分子中任何一個(gè)賴氨酸上的ε-氨基反應(yīng)。
結(jié)合至TRF上的DOX分子的數(shù)目由第二步反應(yīng)決定。例如，如果DOX-GLU和TRF的起始比例為7.2∶1.0，最終所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有2.5分子DOX。但是，如果DOX-GLU和TRF的起始比例為4.0∶1.0，最終所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有1.4分子DOX。類似地，如果DOX-GLU和TRF的起始比例為2.5∶1.0，最終所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有0.9分子DOX。以此可根據(jù)需要大量制備DOX/TRF為預(yù)定比例的TRF-GLU-DOX。
綴合反應(yīng)的下一步是添加乙醇胺，然后離心并進(jìn)行滲析。雖然從理論上講DOX和TRF的反應(yīng)消耗了所有的GLU，但還需向最終的反應(yīng)混合物中加入乙醇胺以結(jié)合所有未反應(yīng)的GLU。避光反應(yīng)30分鐘。最終溶液在2000rpm下離心10分鐘，用100倍過(guò)量的鹽水滲析6小時(shí)，共二次，然后用Hepes緩沖鹽水按同樣配比滲析三次，所得TRF-GLU-DOX備用。
綴合物的生物化學(xué)表征如文獻(xiàn)(39)所述，利用HPLC和聚丙烯酰胺凝膠電泳可以確定TRF-GLU-DOX綴合物的均勻性。同樣，利用文獻(xiàn)(89)所述分光光度法可以確定DOX和TRF的分子比。反復(fù)測(cè)定的結(jié)果表明TRF-GLU-DOX綴合物具有一致的均勻性。此外，在這些綴合物的制備中不必采用色譜法，因?yàn)闆]有出現(xiàn)聚集和分解現(xiàn)象。這樣就允許大量制備均質(zhì)的運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物，從而增加了產(chǎn)量并降低了成本。
在其他類型的運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物中，TRF和DOX損耗所產(chǎn)生的花費(fèi)已經(jīng)成為阻礙其應(yīng)用的一個(gè)因素。例如，采用改變藥物和/或蛋白的方法(如巰基化法)(44)，使得DOX和TRF的產(chǎn)率下降。采用溶劑系統(tǒng)(86)和利用色譜法建立酸穩(wěn)定的和酸敏感的連接(89)，也使得產(chǎn)率下降。DOX和TRF之間的GLU鍵是酸穩(wěn)定的(89)，依據(jù)本發(fā)明所制備的TRF-DOX綴合物中DOX和TRF的產(chǎn)率高。事實(shí)上，與其他方法相比(38，39，40)，TRF的產(chǎn)率幾乎翻了一倍(90％對(duì)50％)，DOX的產(chǎn)率增加了近5倍。
此前，對(duì)于基本為均質(zhì)且具有預(yù)定藥物/運(yùn)鐵蛋白比例的綴合物尚無(wú)大量制備的方法。此外，其他的方法利用色譜來(lái)消除聚集和獲得富含均質(zhì)綴合物的組分。這些方法降低了產(chǎn)率，增加了成本，并且缺乏預(yù)設(shè)分子比例的能力。
綴合物的體外試驗(yàn)表征本發(fā)明所制備的TRF-GLU-DOX綴合物具有結(jié)合和殺滅腫瘤細(xì)胞的作用，但對(duì)于正常細(xì)胞無(wú)損害。如文獻(xiàn)(39)所述，通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)證明這些綴合物結(jié)合人類腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞，但不結(jié)合正常外周血液淋巴細(xì)胞。同樣，如文獻(xiàn)(39)所述，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)證明TRF-DOX綴合物可殺滅人類腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞，但不殺滅正常細(xì)胞。這些方法也可用于本發(fā)明所述TRF-GLU-DOX綴合物的質(zhì)量控制。
本發(fā)明所述的TRF-GLU-DOX綴合物還具有殺滅抗藥性腫瘤細(xì)胞的作用。早先的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，TRF和抗癌藥物構(gòu)成的其他綴合物通過(guò)運(yùn)鐵蛋白受體結(jié)合可以殺滅多種抗藥性的人類腫瘤細(xì)胞(82)，與藥物敏感細(xì)胞相比，這些抗藥性腫瘤細(xì)胞表面具有更多的運(yùn)鐵蛋白受體(90)。雖然至今試驗(yàn)數(shù)據(jù)尚未發(fā)表和報(bào)道，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述的TRF-GLU-DOX綴合物對(duì)于抗藥性腫瘤細(xì)胞一律具有結(jié)合和殺滅作用。因此，如本發(fā)明所述，具有預(yù)定分子比例的均質(zhì)TRF-GLU-DOX綴合物是一種臨床有效的藥物分子，通過(guò)一致和一貫地結(jié)合運(yùn)鐵蛋白受體，可以殺滅抗藥性和藥物敏感的腫瘤細(xì)胞。
綴合物的體內(nèi)試驗(yàn)表征與采用游離DOX治療相比，對(duì)于異種移植人類抗藥性間皮瘤的小鼠，采用TRF-DOX綴合物治療明顯地延長(zhǎng)了存活期(75)，說(shuō)明在小鼠模型中運(yùn)鐵蛋白-藥物綴合物可以殺滅抗藥性的人類腫瘤細(xì)胞。但是這些結(jié)構(gòu)要依賴于大量生產(chǎn)均質(zhì)TRF-DOX綴合物的能力，在這種綴合物中一分子TRF含有預(yù)定數(shù)目的DOX。
在采用本發(fā)明制備的TRF-DOX綴合物的試驗(yàn)(尚未發(fā)表)中，與采用空白對(duì)照(即白蛋白)、未綴合的TRF或游離DOX治療相比，對(duì)于異種移植致死量的藥物敏感性或抗藥性人類腫瘤細(xì)胞的小鼠，采用TRF-DOX綴合物治療明顯地延長(zhǎng)了存活期。在這些試驗(yàn)中，帶有抗藥性腫瘤的小鼠和帶有藥物敏感性腫瘤的小鼠TRF-DOX的劑量相同。
對(duì)于普通技術(shù)人員而言，顯然可以采用多種連接子和多種連接子/生物活性分子比例制備綴合物，所有這些綴合物均被認(rèn)為處于本發(fā)明權(quán)利要求所規(guī)定的范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種制備具有預(yù)定多柔比星/運(yùn)鐵蛋白比例的運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物的方法，其包括步驟a)將多柔比星加到戊二醛連接子材料中，使得一分子多柔比星連接一分子戊二醛；b)將多柔比星/戊二醛復(fù)合體加到運(yùn)鐵蛋白中，使得所得綴合物具有預(yù)定的多柔比星/運(yùn)鐵蛋白比例，其中所述運(yùn)鐵蛋白-多柔比星綴合物基本不含二聚體、三聚體或聚集體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括清除過(guò)量戊二醛連接子的步驟。
3.一種制備具有預(yù)定藥物/蛋白比例的綴合物的方法，其包括步驟a)將藥物溶液滴加到摩爾過(guò)量的連接子分子溶液中，使一分子藥物和一分子連接子分子連接構(gòu)成藥物/連接子復(fù)合體；b)將藥物/連接子復(fù)合體加到蛋白靶向劑中，制備具有預(yù)定藥物/蛋白比例的綴合物，其中所述綴合物基本不含二聚體、三聚體或聚集體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其還包括清除過(guò)量連接子的步驟。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述連接子為戊二醛。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述藥物選自多柔比星、甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、6-巰基嘌呤、胞核嘧啶阿拉伯糖苷和環(huán)磷酰胺。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述蛋白選自運(yùn)鐵蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、維生素、維生素結(jié)合蛋白、激素、細(xì)胞因子、低密度脂蛋白和生長(zhǎng)因子。
8.一種基本為均質(zhì)的材料，其包含一種按預(yù)定的生物活性分子/蛋白分子比例綴合有生物活性分子的蛋白，其中所述蛋白與靶細(xì)胞上的受體有親和力。
9.如權(quán)利要求8所述的材料，其中所述蛋白為運(yùn)鐵蛋白。
10.如權(quán)利要求8所述的材料，其中所述生物活性分子為多柔比星。
11.如權(quán)利要求8所述的材料，其中生物活性分子/蛋白分子的預(yù)定比例在0.1∶1.0至4∶1.0之間。
12.如權(quán)利要求8所述的材料，其中所述生物活性分子選自抗癌藥物、光敏劑、熱敏劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)材料、抗病毒藥物、抗原蟲藥物和造影成像助劑。
13.如權(quán)利要求12所述的材料，其中所述造影成像助劑為碘、鎵、銦和釔。
14.如權(quán)利要求13所述的材料，其中所述造影成像助劑為125I、131I、111In、91Y和67Ga。
15.一種選擇性治療靶細(xì)胞的方法，其包括使所述細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求8的材料接觸。
16.一種適用于靶向細(xì)胞的均質(zhì)的單體材料，所述材料基本上由單體綴合物組成，所述單體綴合物含有一種可與靶細(xì)胞中富含的受體結(jié)合的蛋白以及以預(yù)定的生物活性分子/蛋白分子比例連接在所述蛋白上的生物活性分子，其中所述材料基本不含二聚體、三聚體或聚集體。
17.如權(quán)利要求16所述的材料，其中生物活性分子/蛋白分子的預(yù)定比例在0.2∶1.0至8.0∶1.0之間。
18.如權(quán)利要求14所述的材料，其中比例在0.1∶1.0至4.0∶1.0之間。
19.一種用于治療腫瘤的試劑盒，其包含帶有鐵的運(yùn)鐵蛋白以及一種抗癌藥物/運(yùn)鐵蛋白比例為預(yù)定且恒定的均質(zhì)綴合物。
20.一種確定腫瘤細(xì)胞對(duì)于抗腫瘤藥物的敏感性的試劑盒，其包含兩種和更多種抗腫瘤藥物/運(yùn)鐵蛋白比例為預(yù)定且恒定比例的均質(zhì)綴合物，其中所述均質(zhì)綴合物含有不同的抗腫瘤藥物。
21.一種治療癌癥患者的方法，所述患者體內(nèi)腫瘤對(duì)抗腫瘤治療敏感，所述方法包括對(duì)患者給藥抗腫瘤有效劑量的如權(quán)利要求8所述的基本為均質(zhì)的材料。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述蛋白為運(yùn)鐵蛋白。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述生物活性分子為多柔比星。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其還包括對(duì)所述腫瘤造影成像。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中采用如權(quán)利要求8所述的基本為均質(zhì)的材料對(duì)腫瘤進(jìn)行造影成像，而生物活性材料選自同位素、熒光分子和射線遮蓋材料。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其中生物活性分子/蛋白分子的預(yù)定比例在0.1∶1.0至4.0∶1.0之間。
27.一種治療抗藥性細(xì)胞的方法，其中對(duì)所述細(xì)胞給藥如權(quán)利要求8所述的基本為均質(zhì)的材料。
28.一種靶向抑制腫瘤細(xì)胞中質(zhì)膜氧化還原酶的方法，其包括對(duì)所述細(xì)胞給藥如權(quán)利要求8所述的基本為均質(zhì)的材料以抑制所述酶。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述酶為NADH氧化酶或NADH還原酶。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述蛋白為運(yùn)鐵蛋白。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述生物活性分子為多柔比星。
32.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞在患者體內(nèi)并且對(duì)所述患者給藥所述基本為均質(zhì)的材料。
33.一種通過(guò)運(yùn)鐵蛋白受體mRNA去穩(wěn)定來(lái)誘導(dǎo)抗藥性腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的方法，其包括對(duì)所述腫瘤細(xì)胞給藥如權(quán)利要求8所述的基本為均質(zhì)的材料。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述蛋白為運(yùn)鐵蛋白。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述生物活性分子為多柔比星。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞在患者體內(nèi)并且對(duì)所述患者給藥所述基本為均質(zhì)的材料。
37.一種在抗藥性腫瘤細(xì)胞內(nèi)使運(yùn)鐵蛋白受體mRNA去穩(wěn)定的方法，其包括對(duì)所述腫瘤細(xì)胞給藥如權(quán)利要求8所述的基本為均質(zhì)的材料以捕捉鐵并由此使運(yùn)鐵蛋白受體mRNA去穩(wěn)定。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述蛋白為運(yùn)鐵蛋白。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述生物活性分子為去鐵胺。
40.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述腫瘤在患者體內(nèi)并且對(duì)所述患者給藥所述的基本為均質(zhì)的材料。
41.一種制備具有預(yù)定藥物/蛋白比例的綴合物的方法，其中包含a)將連接子分子溶液滴加到冷凍保護(hù)劑的溶液中構(gòu)成第一中間產(chǎn)品，b)將藥物溶液滴加到摩爾過(guò)量的所述第一中間產(chǎn)品中，使一分子藥物和一分子連接子分子連接構(gòu)成藥物/連接子復(fù)合體，生成第二中間產(chǎn)品；c)將所述第二中間產(chǎn)品加到蛋白靶向劑中，制備具有預(yù)定藥物/蛋白比例的第三中間產(chǎn)品，d)將連接子清除劑加到所述第三中間產(chǎn)品中，生成第四中間產(chǎn)品；e)對(duì)所述第四中間產(chǎn)品進(jìn)行過(guò)濾，獲得具有預(yù)定藥物/蛋白比例的綴合物，其中所述綴合物基本不含二聚體、三聚體或聚集體。
全文摘要
一種用于靶向和治療患病細(xì)胞的均質(zhì)綴合物及其制備方法，其中綴合物具有預(yù)定比例的藥物/蛋白，所述蛋白可以特異性結(jié)合這些細(xì)胞。制備這種綴合物的方法包括按一定方式將藥物分子加到連接子分子中，使得一分子藥物連接一分子連接子，然后將藥物/連接子復(fù)合體加到蛋白分子中，使得藥物分子/蛋白分子達(dá)預(yù)定比例。
文檔編號(hào)A61K49/04GK1529551SQ02814240
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2002年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月15日
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